Sunteți pe pagina 1din 33

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI FACULTATEA DE CHIMIE

CATEDRA DE CHIMIE ANALITIC

TEZ DE DOCTORAT
- rezumat -

CONTROLUL ANALITIC AL UNOR PRODUSE FARMACEUTICE DE UZ UMAN

Conductor tiinific: Prof. dr. Vasile Magearu Doctorand: Ana Maria Hossu

Bucureti -20071

Cele mai alese gnduri de recunotin i mulumire se ndreapt spre domnul profesor dr. Vasile Magearu, care ma sprijinit constant n activitatea mea postuniversitar i cruia i datorez n bun msur formaia mea de cercettor chimist. Pe parcursul elaborrii lucrrii m-am bucurat de sprijinul unor specialiti de excepie, crora vreau s le mulumesc. Astfel, mulumesc doamnei dr. fiz. Mihaela Ilie, de la Catedra de Toxicologie a Facultii de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila Bucureti, pentru sprijinul constant i devotamentul extraordinar pus n slujba realizrii acestei lucrri. Colectivului Disciplinei de Toxicologie al Facultii de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila Bucureti, cu precdere domnului profesor dr. Dan Bllu i mulumesc pentru sprijinul pe care mi l-a acordat n efectuarea prii experimentale a lucrrii. Colectivului Catedrei de Biochimie din Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila Bucureti, doamnei profesor dr. Niculina Mitrea, i mulumesc pentru sprijinul acordat n realizarea unei pri importante a determinrilor. Alese mulumiri adresez doamnei profesor dr. Tana Setnescu i domnului profesor dr. Radu Setnescu, le mulumesc pentru sprijinul acordat n realizarea experimentelor. Alese mulumiri adresez colectivului Laboratorului de Cromatografie, IRCOF, Universitatea Rouen, Frana, domnului

profesor dr. Jean-Claude Combret, pentru ajutorul acordat n realizarea determinrilor lichid cromatografice. Aceeai adnc recunotin se ndreapt ctre doamna lector dr. Cristiana Rdulescu pentru sprijinul constant acordat pe tot parcursul perioadei de doctorat. Alese mulumiri adresez colectivului Catedrei de Chimie Analitic a Facultii de Chimie, Universitatea din Bucureti, pentru sprijinul acordat. ntreaga mea recunotin i consideraie se adreseaz tuturor celor care mi-au fost alturi, care m-au susinut i ncurajat n toat perioada de doctorat, n special prietenului meu, Daniel, bunicii mele i prinilor mei. CUPRINS
Pag. rezumat/ tez CAPITOLUL I. Prezentarea general a vitaminelor liposolubile A, D i E I.1. Introducere I.2. Vitamina A I.3. Vitamina D I.4. Vitamina E CAPITOLUL II. Validarea metodelor analitice II.1. Introducere II.2. Consideraii generale asupra validrii metodelor analitice CAPITOLUL III. Identificarea i cuantificarea semicantitativ a vitaminelor A, D i E prin cromatografie n strat subire III.1. Introducere III.3. Analiza calitativ (identificare) 8/37 8/37 8/41 5/2 5/2 5/4 6/10 6/18 7/26 7/26 7/27

III.4. Evaluarea semicantitativ a concentraiilor de vitamine A, D2 i E prin CSS CAPITOLUL IV. Determinarea vitaminelor A, D i E prin metode spectrofotometrice de absorbie UV/VIS IV.1. Evaluare critic a metodelor de determinare a vitaminelor A, D i E din diverse forme farmaceutice IV.2. Determinarea vitaminelor A, D2 i E din forme farmaceutice IV.2.1. Metod de determinare prin spectrofotometrie de absorbie UV i validarea metodei pentru vitamina A din capsule gelatinoase IV.2.2. Metod de determinare prin spectrofotometrie de absorbie UV i validarea metodei pentru vitamina D2 din capsule gelatinoase IV.2.3. Metod de determinare prin spectrofotometrie de absorbie UV i validarea metodei pentru vitamina E din capsule gelatinoase IV.2.4. Analiza unor preparate farmaceutice care conin vitaminele A, D2 i E prin metodele UV-VIS validate anterior CAPITOLUL V. Determinarea vitaminelor A i E prin fluorescen V.I. Introducere V.2. Metod spectrofluorimetric de determinare a vitaminei A din preparatele farmaceutice V.3. Metod spectrofluorimetric de determinare a vitaminei E din preparatele farmaceutice V.4. Metod spectrofluorimetric de determinare a vitaminei E prin extracie din ser CAPITOLUL VI. Metode HPLC de determinare a vitaminelor A, D i E VI.1. Studii prin HPLC de determinare a vitaminelor liposolubile VI.2. Studiu de stabilitate prin HPLC a preparatelor farmaceutice care conin vitaminele A i E CONCLUZII GENERALE BIBLIOGRAFIE SELECTIV 24/122 25/127 28/131 22/107 24/115 24/115 20/100 18/92 16/87 17/92 17/92 15/78 14/70 13/60 12/54 13/60 12/54 11/49

innd cont de importana deosebit a vitaminelor, prezenta tez de doctorat i propune investigarea comparativ a unor metode de determinare a vitaminelor liposolubile A, D i E din preparate farmaceutice i ser, precum i procedurile de validare a metodelor spectrofotometrice de absorbie UV-VIS pentru determinarea acestor vitamine. Teza este structurat pe o prim parte teoretic (Capitolele I i II), ce cuprinde date din literatura de specialitate i o a doua parte experimental (Capitolele III-VI) care se refer la contribuiile originale n domeniul abordat. Primul capitol prezint o scurt caracterizare a vitaminelor liposolubile A, D i E luate n studiu, fiecare cu structura sa chimic, stare natural, proprieti, rol biologic, necesiti nutriionale, tulburri de aport vitaminic. Capitolul al doilea realizeaz o sintez a cerinelor privind validarea metodelor de analiz implicate n controlul pe flux i al produselor finite n industria farmaceutic. Capitolul al treilea a urmrit elaborarea unor metode de identificare i determinare semicantitativ a vitaminelor A, D i E, avnd n vedere faptul c metoda cromatografie n strat subire este uor de aplicat i necesit un minim de aparatur destul de simpl. Capitolul al patrulea, dup o evaluare critic a metodelor de determinare a vitaminelor A, D i E n diverse forme farmaceutice, prezint trei metode spectrofotometrice de absorbie UV/VIS validate pornind de la indicaiile farmacopeelor, elaborate pentru fiecare vitamin n parte. Capitolul al cincilea prezint o metod spectrofluorimetric de determinare a vitaminei A din preparate farmaceutice, precum i alte dou metode spectrofluorimetrice de determinare a vitaminei E din forme farmaceutice i ser, aceasta din urm fiind o metod extractiv. Capitolul al aselea prezint o serie de metode cromatografice cu detecie UV utilizate pentru determinarea vitaminei D din produse farmaceutice, precum i un studiu de stabilitate a unor preparate ce conin vitaminele A i E, bazat tot pe o metod cromatografic (cromatografie de lichide de nalt performan). Rezultatele promitoare obinute cu aceste metode, conduc la posibilitatea utilizrii lor n laborator. Experimentele au fost efectuate n cadrul laboratoarelor de la Catedra de Biochimie i Catedra de Toxicologie, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila Bucureti, precum i n Laboratorul de Cromatografie al IRCOF, Universitatea din Rouen, Frana, i prezentate la unele manifestri tiinifice naionale i internaionale. Unele rezultate au fost publicate n reviste de specialitate. 6

CAPITOLUL I. PREZENTAREA GENERAL A VITAMINELOR LIPOSOLUBILE A, D I E


I.1. INTRODUCERE Istoria vitaminelor, unul dintre cele mai importante episoade din istoria biochimiei, a avut un impact profund asupra sntii i a strii de confort, ca i asupra nelegerii proceselor catalitice ce au loc n metabolismul organismelor vii. nc din antichitate se tia c ntre alimentaie i boli exist o legatur direct. Cercetrile actuale n legatur cu aceste micronutrimente au condus la modificarea noiunii de aport nutriional, sftuind i contribuind la ameliorarea global a sntii populaiilor. [1] Vitaminele sunt componente ale alimentelor, necesare organismului n cantiti mici. Organismul animal nu poate sintetiza vitamine. Lipsa lor din hran provoac mbolnviri grave, avitaminoze, care pot duce la moartea animalului. Simptomele bolii dispar dac se introduc din nou n hrana animalului substanele care i lipsesc. n afar de cele patru grupe de materii alimentare cunoscute de fiziologia clasic, hidraii de carbon, grsimile, proteinele i substanele anorganice, mai sunt necesare i unele materii organice acionnd n cantiti extrem de mici. Numele de vitamine, dat acestor substane de ctre Casimir Funk (1911), dateaz dintr-o epoc n care structura lor nu era cunoscut, n realitate numai unele dintre vitamine conin azot. I.2. VITAMINA A Vitaminele A sunt cunoscute i ca vitamine antixeroftalmice, antiinfecioase, vitamine de cretere liposolubile, vitamine de aprare a epiteliilor, axeroftoli. Cea mai important vitamin A este vitamina A1 numit i retinol, dar exist i vitamina A2 (izomer al vitaminei A1), vitamina A3 i neovitamina A1, dar i retinal, acid retinoic, precum i diferii izomeri ai vitaminelor A. S-a observat c vitamina A are rol n creterea organismelor (alturi de ali factori), n mecanismul vederii, n meninerea strii normale a epiteliilor, la formarea

smalului i a dentinei, la meninerea fertilitii i a strii morfo-funcionale a organelor de reproducere, n diviziunea celular, stimularea secreiei de mucus, stimularea imunitar i nedemonstrat experimental n stimularea biosintezei citocromului P450 i n reglarea metabolismului hormonilor steroizi. [15] I.3. VITAMINA D Descoperirea vitaminelor D este un exemplu de cercetare sistematic complex. Vitaminele D au fost descoperite dup anul 1900, cnd medicii nemi au nceput lupta mpotriva rahitismului, boal cunoscut i descris nc din 1650. n timp, s-a demonstrat c aceast boal este rezultatul unei alimentaii necorespunztoare i este asemntoare cu scorbutul sau beri-beri. Rolul biologic primordial al vitaminelor D i al derivailor acestora l constituie intervenia n metabolismul mineral i mai ales n metabolismul calciului unde mpreun cu hormonul paratiroidian, faciliteaz absorbia acestuia. Calciferolii stimuleaz activitatea osteoblatilor, micoreaz oxidarea citratului, influeneaz absorbia fosforului, activeaz fosfataza alcalin precum i ATP-aza, regleaz desfurarea ciclului acizilor tricarboxilici prin inhibarea aconitazei, fapt ce conduce la acumularea de citrat n esuturile n care acioneaz vitaminele D. I.4. VITAMINA E Vitaminele E (tocoferolii) sunt substane liposolubile destul de rspndite, mai ales n regnul vegetal. Existena acestui factor liposolubil important pentru organismele animale a fost presupus pentru prima dat n 1922 de ctre Evans i Bishop, pentru ca doi ani mai trziu, Sure s propun denumirea de vitamina E. n perioada 1922 - 1927 s-a crezut c vitamina E are rol numai n reproducere, dar civa ani mai trziu s-a observat la animalele avitaminizate c apare o distrofie muscular primar. Folosind germenii de gru bogai n vitamina E, s-au obinut rezultate bune la tratarea distrofiei musculare i a degenerrii neurologice. Datele tiinifice acumulate pn n prezent, au artat c tocoferolii au o aciune multipl i divers. O serie de efecte constatate in vivo sau in vitro rmn n mare parte ipotetice.

n mod artificial efectele vitaminei E pot fi clasificate n efecte antioxidante i de stabilizare a membranelor, dar mai exist i o serie de efecte mai selective cum ar fi: autohemoliza, agregarea plachetelor i a diverilor compui enzimatici etc.

CAPITOLUL II. VALIDAREA METODELOR ANALITICE

II.1. INTRODUCERE Metodele de control al calitii pe fluxul de fabricaie sunt componente cheie ale procesului de producie n industria chimic n general i n cea farmaceutic n special. Aceste metode asigur, n situaia n care sunt validate, c n urma procesului de producie va rezulta o entitate chimic cu valori ale parametrilor (compoziie chimic, concentraie, puritate, omogenitate, etc.) situai ntr-un domeniu bine precizat. De aceea, fiecare proces trebuie s fie analizat separat i clasificat n conformitate cu cerinele ghidului Q7A al ICH (International Conference on Harmonization) [39]. Aceast sarcin este important deoarece un anume pas al reaciei de producere a unui ingredient activ poate genera impuriti care pot fi transportate cu ingredientul farmaceutic activ dorit pn la produsul finit. II.2. CONSIDERAII GENERALE ANALITICE Validarea este o metodologie care are drept scop s demonstreze c o metod de analiz corespunde utilizrii pentru care a fost elaborat i c performanele metodei, stabilite prin studii de laborator, satisfac cerinele de aplicabilitate n practica de laborator curent. Validarea metodelor analitice utilizate n industria farmaceutic se face pe baza unei strategii generale stabilit prin norme ISO (International ASUPRA VALIDRII METODELOR

Standardisation Organisation) cuprinse n nota explicativ a Comisiei de specialitate a CE, n Ghidul privind metodologia de validare a procedeelor analitice 3AQ14a [46,47] elaborat de ICH pentru nregistrarea medicamentelor de uz uman, ce cuprinde opt parametri de validare i n USP 27-NF22 [43], n care este inclus un 9

ghid de linii directoare specifice pentru validarea metodelor utilizate pentru determinarea unor componeni. Datele cuprinse n nota explicativ a Comisiei CE se aplic tuturor metodelor de analiz care sunt utilizate n domeniile documentrii chimice, farmaceutice i biologice; aceste date sunt aplicabile n domeniile cercetrii tiinifice chimice, farmaceutice, medicale, agronomice, etc.

CAPITOLUL III. IDENTIFICAREA I CUANTIFICAREA SEMICANTITATIV A VITAMINELOR A, D I E PRIN CROMATOGRAFIE N STRAT SUBIRE
III.1. INTRODUCERE Dei este o metod mult mai puin precis dect celelalte metode recomandate n monografii, metoda cromatografiei n strat subire (CSS) i gsete locul binemeritat printre metodele de analiz, atunci cnd nu se dispune de aparatura relativ costisitoare pe care o implic alte metode. Este cea mai utilizat, se folosete la separrile componenilor unei probe utiliznd ntreaga gam de procese fundamentale ale cromatografiei: adsorbie, repartiie, excludere difuzie i schimb ionic. [52] III.3. ANALIZA CALITATIV (IDENTIFICARE) ncercrile de cromatografie pe strat subire (CSS) au urmrit elaborarea unei metode de identificare i cuantificare semicantitativ a substanelor luate n lucru, avnd n vedere faptul c metoda CSS este uor de aplicat, este robust i necesit un minim de aparatur destul de simpl. S-au realizat iniial experimente preliminarii pentru a gsi un sistem (faz fix i faz mobil) pentru care se obine cea mai bun separare. Cele mai bune rezultate au fost obinute folosind ca faz staionar silicagel 60 F254 pe folie de plastic de la Merck i ca faz mobil, dou sisteme: sistemul 13 hexan/eter (9:1, v:v)

10

sistemul 12 benzen/cloroform (1:1, v:v) [80]. Figurile III.3. i III.4. prezint cele mai bune separri obinute pentru

substanele luate n studiu (sistemele cromatografice utilizate i valorile Rf sunt redate n Tabelul III.3.). S-a realizat, de asemenea, o cromatogram cu vitamina A palmitat, vitamina A+D2 capsule, vitamina A acetat i vitamina A soluie (form farmaceutic). Se constat (Figura III.5.) c, aa cum era firesc, vitamina A acetat i vitamina A palmitat migreaz n mod diferit.

D2

M1

D2

M2

Figura III.3. Cromatograma pentru vitaminele A, D2 i amestec (M1) n sistemul 13

Figura III.4. Cromatograma pentru vitaminele D2, E i amestec (M2) n sistemul 12

11

A(V)

A+D2

A(IV) vit. A

Figura III.5. Cromatograma pentru vitamina A palmitat (A V), vitamina A+D2, vitamina A acetat (A IV) i vitamina A (produs farmaceutic)

Tabel III.3. Rf-urile obinute pentru vitaminele A, D2 i E (cromatogramele prezentate n Figurile III.3. i III.4.) Sistem 13 Sistem 12 Vitamina A 0,463 Vitamina D2 0,065 0,186 Vitamina E 0,703

Au mai fost realizate i alte cromatograme cu rezultate satisfctoare folosindu-se vitamina A acetat, vitamina D2, produs farmaceutic vitamina A+D2 (capsule gelatinoase), produs farmaceutic ulei de pete (capsule gelatinoase), vitamina E i soluia de produs farmaceutic vitamina E.

12

III.4.

EVALUAREA

SEMICANTITATIV

CONCENTRAIILOR

DE

VITAMINE A, D2 I E PRIN CSS Pentru fiecare plac pe care s-au spotat cantiti diferite de prob s-au realizat curbele de nnegrire obinute pentru fiecare spot n parte. Cu valorile maximelor nnegririlor obinute pentru fiecare din cele trei substane luate n lucru s-au trasat drepte de regresie nnegrire cantitate de substan pipetat, reprezentate n Figurile III.9 i III.10. Pentru vitamina A s-a obinut o ecuaie polinomial de gradul II, cu un coeficient de corelaie de R = 1, p = 0,0159 (formula III.1.): Y = 5,8 + 3,91 x mA 0,02 x (mA)2 spotat, exprimat n g. Pentru vitaminele D2 i E s-au obinut cte o ecuaie de gradul I (formulele III.2. i III.3.): Y = 41,49 + 9,2 x mD2 (coeficient de corelaie R = 0,98994, p = 0,01006) (III.2.) Y = 71,87 + 0,9 x mE (coeficient de corelaie R = 0,98191, p = 0,01809) (III.3.). (III.1.) unde Y este nnegrirea (exprimat n uniti relative), iar m A este masa de vitamin A

Figura III.9. Curb polinomial de regresie obinut la evaluarea semicantitativ a vitaminei A (acetat) prin CSS

13

Figura III.10. Dreptele de regresie obinute la evaluarea semicantitativ a vitaminelor D2 i E prin CSS

CAPITOLUL IV. DETERMINAREA VITAMINELOR A, D I E PRIN METODE SPECTROFOTOMETRICE DE ABSORBIE UV/VIS


IV.1. EVALUARE CRITIC A METODELOR DE DETERMINARE A VITAMINELOR A, D I E DIN DIVERSE FORME FARMACEUTICE Pentru dozarea vitaminei A din forme farmaceutice, Farmacopeea European indic urmtoarele metode: - pe baza spectrului UV, utilizndu-se o formul de corecie de calcul n care apar valorile absorbanei citite la 310, 325 i 334 nm; - metoda cromatografic HPLC pentru separare cuplat cu absorbia n UV ca metod de detecie, calculul se face innd cont de valoarea absorbanei la 326 nm, se lucreaz n soluie de 2-propanol.

14

Pentru dozarea din forme farmaceutice a vitaminei D, Farmacopeea European indic metoda cromatografic HPLC pentru separare, cuplat cu absorbia n UV ca metod de detecie, calculul se face innd cont de valoarea absorbanei la 254 nm, se lucreaz n soluie de toluen. Condiiile cromatografice sunt urmtoarele: coloan de oel de 0,25 m lungime i 4,6 mm diametru intern, umplut cu silicagel pentru cromatografie i dimensiunea porilor de 5 m, pentanol/hexan (3:97) ca faz mobil i detecie UV la 254 nm. Pentru dozarea din forme farmaceutice a vitaminei E, Farmacopeea European indic metoda prin gaz-cromatografie folosind dotriacontan ca standard intern.

IV.2. DETERMINAREA VITAMINELOR A, D2 I E DIN FORME FARMACEUTICE

IV.2.1. Metod de determinare prin spectrofotometrie de absorbie UV i validarea metodei pentru vitamina A din capsule gelatinoase S-a dezvoltat o metod de dozare a vitaminei A n cloroform prin absorbie n UV la 330 nm, care este specific (excipentul nu interfer spectral cu analitul), este liniar n domeniul 1,8 72,3 g/mL (R=0,99991, p<0,0001), avnd limita de detecie 0,02 g/mL i limita de cuantificare 0,08 g/mL. Metoda este exact (coeficientul de regsire cuprins n domeniul 99 101%), repetabil i reproductibil (RSD < 2%). Soluiile nu sunt stabile n timp, chiar meninute la frigider i la ntuneric, de aceea pentru determinri trebuie preparate soluii proaspete.

15

Figura IV.5. Spectre UV ale soluiilor etalon de vitamina A n domeniul 1,8 72,3 g/mL, ale soluiilor de excipient (ulei de floarea-soarelui) i ale soluiei de vitamina A+D2 (produs farmaceutic) 1,25 mg/mL

IV.2.2. Metod de determinare prin spectrofotometrie de absorbie UV i validarea metodei pentru vitamina D2 din capsule gelatinoase S-a dezvoltat o metod de dozare a vitaminei D2 n cloroform prin absorbie n UV la 274 nm, care este specific (excipentul nu interfer spectral cu analitul), este liniar n domeniul 0,2 20,8 g/mL (R=0,99996, p<0,0001), avnd limita de detecie 0,01 g/mL i limita de cuantificare 0,04 g/mL. Metoda este exact (coeficientul de regsire cuprins n domeniul 99 101%), repetabil i reproductibil (RSD < 2%). Soluiile nu sunt stabile n timp, chiar meninute la frigider i la ntuneric, de aceea pentru determinri trebuie preparate soluii proaspete.

16

Figura IV.9. Spectre UV ale soluiilor etalon de vitamina D2 n domeniul 2,1 20,8 g/mL, ale soluiei de excipient (ulei de floarea-soarelui), ale soluiei de vitamina A+D2 (produs farmaceutic) 1,25 mg/mL i ale soluiei de ulei de pete (produs farmaceutic) 2,694 mg/mL

IV.2.3. Metod de determinare prin spectrofotometrie de absorbie UV i validarea metodei pentru vitamina E din capsule gelatinoase S-a elaborat o metod de dozare a vitaminei E n cloroform prin absorbie n UV la 287 nm, care este specific (excipentul nu interfer spectral cu analitul), este liniar n domeniul 2,1 211,3 g/mL (R=0,99998, p<0,0001), avnd limita de detecie 0,01 g/mL i limita de cuantificare 0,03 g/mL. Metoda este exact (coeficientul de regsire cuprins n domeniul 99 101%), repetabil i reproductibil (RSD < 2%). Soluiile sunt stabile n timp, putnd fi pstrate timp de o sptmn la frigider.

17

Figura IV.14. Spectre UV ale soluiilor etalon de vitamina E n domeniul 2,1 211,3 g/mL, ale soluiei de excipient (ulei de floarea-soarelui) i ale soluiei de vitamina E (produs farmaceutic) 97,36 g/mL IV.2.4. Analiza unor preparate farmaceutice care conin vitaminele A, D2 i E prin metodele UV-VIS validate anterior S-a verificat aplicabilitatea metodelor descrise anterior i validate la produsele farmaceutice vitamina A+D2 (capsule gelatinoase moi), vitamina E (capsule gelatinoase moi) i ulei de pete (capsule gelatinoase moi). [117] S-a testat stabilitatea produselor farmaceutice pstrnd soluiile diluate la frigider timp de o sptmn. Rezultatele sunt prezentate n Figura IV.16. Se observ c pentru vitamina A+D2 i pentru uleiul de pete, absorbana scade, deci soluia nu este stabil n timp. Trebuie realizat soluie proaspt, pentru fiecare determinare.

18

Figura IV.16. Probele farmaceutice n cloroform

CAPITOLUL V. DETERMINAREA VITAMINELOR A I E PRIN FLUORESCEN


V.I. INTRODUCERE Multe aplicaii ale acestei tehnici sunt ntlnite la determinarea unor compui organici sau a unor molecule de importan biologic, cum ar fi: tiamina, riboflavina, adrenalina, colesterolul, parafinele, sau a unor medicamente i droguri. Datorit specificitii i sensibilitii, fluorimetria i gsete largi aplicaii n enzimologie, ca de exemplu, la determinarea activitii enzimatice sau determinarea cantitativ a dehidrogenazelor.

19

V.2. METOD SPECTROFLUORIMETRIC DE DETERMINARE A VITAMINEI A DIN PREPARATELE FARMACEUTICE Necesitatea monitorizrii vitaminei A n diferite maladii a determinat cercettorii s caute o metod simpl de dozare a acesteia din probe biologice (cu precdere din ser i plasm). S-a dezvoltat o metod spectrofluorimetric de dozare a acestei vitamine liposolublile A din capsule gelatinoase [117]. n practic este nevoie de o metod simpl, eficient i sigur de dozare a vitaminei A din formele farmaceutice i din fluidele biologice. S-au trasat spectrele de excitaie i emisie utiliznd parametrii instrumentali din Tabelul V.1. Lungimea de und de excitaie a fost aleas ca fiind maximul de absorbie al vitaminei A n cloroform (Cap. IV), la 330 nm. Se observ c la aceast lungime de und de excitaie (330 nm), n zona 400 nm apare banda Raman a solventului, ceea ce impune corecia de fond pentru spectrele de emisie obinute. n aceste condiii, maximul de emisie al vitaminei A a fost stabilit la 480 nm i a fost utilizat ulterior n analiz. Se remarc, de asemenea, faptul c are loc o deplasare a maximului de emisie cu circa 30 nm de la concentraii mici spre concentraii mari n cazul vitaminei A. De asemenea, se poate pune n eviden un efect de inhibiie a fluorescenei cu creterea concentraiei. Tabel V.1. Parametrii instrumentali folosii la trasarea spectrelor de excitare i emisie Parametru Lungimea de und fix Fante Domeniul nregistrat Viteza de trasare a spectrului Excitare 330 nm 10 nm Emisie 10 nm 345 600 nm 600 nm/min

20

500

400

300

INT
200

100

0 400 0,513 g/mL 1,027 g/mL 1,54 g/mL

500 2,054 g/mL 4,108 g/mL 6,162 g/mL

600 14, 37 g/mL 41,08 g/mL 102, 7 g/mL

nm

Figura V.3. Spectre de fluorescen corectate utilizate pentru curba de calibrare

21

600 500 400 300 200 100 0 1 10 100 Concentratia de vitamina A g/mL

Figura V.4. Curba de calibrare a vitaminei A n cloroform, utiliznd valori corectate ale intensitii de emisie

V.3. METOD SPECTROFLUORIMETRIC DE DETERMINARE A VITAMINEI E DIN PREPARATELE FARMACEUTICE S-au trasat spectrele de excitaie i emisie utiliznd parametrii instrumentali din Tabelul V.4. Se observ c la lungimea de und de excitaie (290 nm), n zona 315 nm apare banda Raman a solventului (n-hexan), ceea ce impune corecia de fond pentru spectrele de emisie obinute. n aceste condiii, maximul de emisie al vitaminei E a fost stabilit la 306 nm i a fost utilizat ulterior n analiz. Tabel V.4. Parametrii instrumentali folosii la trasarea spectrelor de excitare i emisie Parametru Lungimea de und fix Fante Domeniul nregistrat Viteza de trasare a spectrului Excitare 290 nm 2,5 nm Emisie 2,5 nm 300 410 nm 600 nm/min

Intensitate (u.r.)

22

800

600

INT

400

200

0 300 2,32 g/mL 4,65 g/mL 23,24 g/mL 46,5 g/mL

nm

350 92,99 g/mL 232, 4 g/mL Proba

Figura V.8. Spectre de emisie fluorescent pentru vitamina E n nhexan (excitare la 290 nm, cu corecie de fond)

23

700 600 500 Intensitate (u.r.) 400 300 200 100 0 0 50 100 150 200 250 Concentratie vitamina E (g/mL)

Figura V.9. Curba de etalonare a vitaminei E n n-hexan, utiliznd valori corectate ale intensitii de emisie

V.4. METOD SPECTROFLUORIMETRIC DE DETERMINARE A VITAMINEI E PRIN EXTRACIE DIN SER S-au trasat spectrele de emisie utiliznd parametrii instrumentali din Tabelul V.8., pentru seriile de etaloane preparate, pentru blanc i pentru probele de vitamina E n etanol. Se observ la 316 nm banda Raman a solventului (hexan) care poate influena determinrile. De aceea, spectrele au fost corectate cu proba blank, obinnd n aceste condiii o band de emisie cu maxim la 307 nm, care a fost utilizat ulterior la trasarea curbelor de calibrare. [142]

24

Tabel V.8. Parametrii instrumentali folosii la trasarea spectrelor de excitare i emisie Parametru Lungimea de und fix Fante Domeniul nregistrat Viteza de trasare a spectrului Excitare 290 nm 3 nm Emisie 3 nm 300 410 nm 1000 nm/min

500

400

300

INT
200

100

0 -17,1 300 2,45 g/mL 3,07 g/mL 4,91 g/mL

12,28 g/mL 24,56 g/mL 61,42 g/mL

nm

350 Proba 1 Proba 2


L

Figura V.12. Spectre de fluorescen corectate utilizate pentru dreapta de etalonare

25

CAPITOLUL VI. METODE HPLC DE DETERMINARE A VITAMINELOR A, D I E


VI.1. STUDII PRIN HPLC DE DETERMINARE A VITAMINELOR LIPOSOLUBILE Cromatografia reprezint o metod de separare bazat pe repartiia difereniat a componenilor unui amestec de separat ntre dou faze n contact i situndu-se ntrun raport de micare relativ una fa de cealalt (generic definite prin termenii de faz staionar, respectiv faz mobil). Metodele HPLC reprezint metode de nalt performan aplicate n laboratoarele de analize din industria farmaceutic. Fiind att o metod de separare, ct i de cuantificare a compuilor separai, metoda HPLC reprezint varianta optim de analiz a vitaminelor din amestecuri (inclusiv din forme farmaceutice). Totui, datorit diversitii tipului de faze staionare i mobile folosite n HPLC, aceste metode sunt departe de a fi standardizate, practic fiecare productor elaborndu-i metoda proprie, convenabil din punctul de vedere al tipului de preparat investigat, dotare i necesiti (analize de materii prime, analize pe flux sau n faze intermediare de producie, analize de produse finite, etc.). S-au investigat prin metoda HPLC, folosind diferite sisteme cromatografice, vitaminele A, D, E, precum i metabolii ai vitaminei D mono- i dihidroxilai. Compuii investigai sunt bine separai i cuantificabili n condiiile date. VI.2. STUDIU DE STABILITATE N TIMP I LA DIFERITE TEMPERATURI PRIN HPLC A PREPARATELOR FARMACEUTICE CARE CONIN VITAMINELE A I E S-a realizat un studiu de stabilitate normal i n condiii accelerate a vitaminelor A i E din produsul farmaceutic Biosol (Turcia), investignd prin HPLC evoluia n timp (30 luni) a concentraiei celor dou vitamine. Pe o perioad de 2 ani, acestea s-au dovedit a fi stabile atunci cnd produsul este stocat la temperatura camerei (<21C) i protejat de lumin. n condiii de temperatur ridicat (37C), preparatul i modific culoarea, iar vitaminele se degradeaz (lucru evideniat prin scderea concentraiei celor dou vitamine cu circa 36% n cazul vitaminei A i 24% n cazul vitaminei E).

26

60000 50000 40000 U.I./mL 30000 20000 10000 0 0 6 luni 12 luni 18 luni 24 luni 30 luni Luni 5 C 15 C 21 C 37 C

Figura VI.5. Variaia n timp a coninutului de vitamin A la diferite temperaturi

35 30 25 mg/mL 20 15 10 5 0 0 6 luni 12 luni 18 luni 24 luni 30 luni Luni 5 C 15 C 21 C 37 C

Figura VI.6. Variaia n timp a coninutului de vitamin E la diferite temperaturi

CONCLUZII GENERALE
Avnd n vedere amploarea i diversitatea preparatelor farmaceutice i a aditivilor alimentari care conin vitamine, teza i-a propus investigarea unor metode de analiz a vitaminelor liposolubile A, D i E din cteva forme farmaceutice existente n ara noastr. Metodele CSS de identificare i dozare semicantitativ sunt, n general, robuste, necesit un minim de echipament i reactivi i pot fi adaptate uor n laboratoare mici de analize. S-au investigat 13 sisteme faz fix faz mobil pentru separarea i identificarea vitaminelor A, D i E din forme farmaceutice (vitamina A+D2 capsule gelatinoase moi, vitamina A soluie, vitamina E capsule gelatinoase moi i ulei de pete capsule gelatinoase moi). Sistemele cu 27

care s-au obinut cele mai bune rezultate au fost: faz staionar silicagel 60 F254 pe folie de plastic de la Merck i hexan/eter (9:1, v:v) sau benzen/cloroform (1:1, v:v) ca faz mobil, care au fost fotodocumentate n UV la 254 nm. Analiza semicantitativ a vitaminelor, realizat pe baza curbelor de nnegrire ale spotului corespunztor ca funcie de masa de substan spotat, a condus la o funcie polinomial de gradul II pentru vitamina A acetat i la drepte de regresie pentru vitaminele D2 i E acetat. Metodele spectrofotometrice de absorbie UV-VIS sunt robuste, precise i unanim acceptate n practica de laborator de analize farmaceutice. Acestea trebuie validate din punctul de vedere al specificitii, liniaritii, exactitii, preciziei, limitei de detecie i de cuantificare, precum i al robusteii, pentru a fi acceptate i incluse ulterior n documentaia de autorizare a medicamentului. A fost dezvoltat o metod de dozare a vitaminei A n cloroform prin absorbie n UV la 330 nm, care este specific, liniar n domeniul 1,8 72,3 g/mL, avnd limita de detecie 0,02 g/mL i limita de cuantificare 0,08 g/mL, exact, repetabil i reproductibil. Soluiile nu sunt stabile n timp, chiar meninute la frigider i la ntuneric, de aceea pentru determinri trebuie preparate soluii proaspete. S-a dezvoltat o metod de dozare a vitaminei D2 n cloroform prin absorbie n UV la 274 nm, care este specific, liniar n domeniul 0,2 20,8 g/mL, avnd limita de detecie 0,01 g/mL i limita de cuantificare 0,04 g/mL, exact, repetabil i reproductibil. Soluiile nu sunt stabile n timp, chiar meninute la frigider i la ntuneric, de aceea pentru determinri trebuie preparate soluii proaspete. S-a elaborat o metod de dozare a vitaminei E n cloroform prin absorbie n UV la 287 nm, care este specific, liniar n domeniul 2,1 211,3 g/mL, avnd limita de detecie 0,01 g/mL i limita de cuantificare 0,03 g/mL. Metoda este exact, repetabil i reproductibil. Soluiile sunt stabile n timp, putnd fi pstrate timp de o sptmn la frigider.

28

Metodele spectrofluorimetrice sunt practicate deoarece asigur specificitate, selectivitate i limite coborte de detecie, fiind, totui, mai puin comune n laboratoarele de analize. Au fost dezvoltate metode spectrofluorimetrice de dozare a vitaminelor A i E din formulri farmaceutice (vitamina A+D2 capsule gelatinoase moi i vitamina E capsule gelatinoase moi) i din ser. S-a dezvoltat o metod spectrofluorimetric de dozare a vitaminei A n cloroform folosind spectre de emisie corectate de fond, cu excitare la 330 nm i emisie la 480 nm. Metoda este specific, este liniar n domeniul 1 14 g/mL, avnd limita de detecie 0,513 g/mL i limita de cuantificare 1,027 g/mL. n afara domeniului de liniaritate a putut fi pus n eviden un efect de inhibiie a fluorescenei cu concentraia. Deoarece fluorescena vitaminei E nu a putut fi evideniat n cloroform, a fost dezvoltat o metod spectrofluorimetric de dozare a vitaminei E n hexan folosind spectre de emisie corectate de fond, cu excitare la 290 nm i emisie la 306 nm. Metoda este specific, este liniar n domeniul 1 100 g/mL, avnd limita de detecie 2,32 g/mL i limita de cuantificare 2,32 g/mL. n afara domeniului de liniaritate a putut fi pus n eviden un efect de inhibiie a fluorescenei cu concentraia. S-a elaborat o metod de dozare a vitaminei E prin extracie din ser, folosind etanol i hexan, spectre de emisie corectate de fond, cu excitare la 290 nm i emisie la 307 nm. n acest scop s-a elaborat un procedeu de extracie, determinarea fiind fcut fa de o prob blank, extras n mod similar, al crei spectru a fost sczut din spectrul de emisie al etaloanelor i probelor, asigurndu-se astfel specificitatea metodei. Metoda este liniar n domeniul domeniul 2,45 61,42 g/mL, avnd limita de detecie 2,45 g/mL i limita de cuantificare 2,45 g/mL. Metodele HPLC sunt metode de nalt performan aplicate n laboratoarele de analize din industria farmaceutic, reprezentnd varianta optim de analiz a vitaminelor din amestecuri (inclusiv din forme farmaceutice). Totui, datorit diversitii tipului de faze staionare i mobile folosite n HPLC, aceste metode sunt departe de a fi standardizate, practic fiecare productor elaborndu-i

29

metoda proprie, convenabil din punctul de vedere al tipului de preparat investigat, dotare i necesiti. S-a realizat un studiu de stabilitate normal i n condiii accelerate a vitaminelor A i E din produsul farmaceutic Biosol (Turcia), investignd prin HPLC evoluia n timp (30 luni) a concentraiei celor dou vitamine. Acestea s-au dovedit a fi stabile pe o perioad de 2 ani, atunci cnd produsul este stocat la temperatura camerei (<21C) i protejat de lumin. Preparatul i modific culoarea n condiii de temperatur ridicat (37C), iar vitaminele se degradeaz. Analiza comparativ a metodelor elaborate conduce la urmtoarele concluzii: metodele CSS i de absorbie n UV sunt uor de aplicat, nu necesit timp mare de preparare a probelor i nu conduc la interferene n cazul formelor farmaceutice vitamina A+D2 capsule gelatinoase moi, vitamina A soluie i vitamina E capsule gelatinoase moi, fiind mai greu de aplicat i interpretat atunci cnd sunt utilizate pe amestecuri mai complexe, cum ar fi ulei de pete capsule gelatinoase moi. metoda spectrofluorimetric necesit aparatur mai puin uzual n laboratoarele de analize, dar determinrile, n cazul n care pot fi efectuate (compuii prezint fluorescen) au un grad mai mare de sensibilitate i precizie. metoda optim de analiz a vitaminelor A, D i E din produse este HPLC, care permite cu att separarea, ct i la acestora, pretndu-se, aparatele moderne, farmaceutice determinarea

automatizare i standardizare la nivelul laboratorului de analize, dar presupune aparatur mai costisitoare, personal cu grad mai nalt de calificare i faze preliminare de preparare a probelor.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. A.L. Lehninger, Biochimie vol.1 (ediia a doua), Ed. Tehnic, 317, 1987. 23. A.-M. Hossu, V. Magearu, V., Roumanian Biotechnological Letters, Vol. 9, No. 1, 1497-1504, Bucureti, 2004.

30

24. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, I. Ioni, E.-I. Moater, Scientific Study & Research, Vol VII, No. 1, 225-233, Alma Mater Publishing House, University of Bacu, 2006. 25. A.-M. Hossu, M. Scripcariu, C. Rdulescu, E.-I. Moater, I. Ioni, Scientific Study & Research, Vol VII, No. 1, 233-239, Alma Mater Publishing House, University of Bacu, 2006. 26. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, I. Ioni, E.-I. Moater, Spectrophotometric and chromatographic methods for the determination of Vitamin C - poster, Le Quatrime Colloque Franco-roumain De Chimie Applique, 28 juin 2 julliet 2006, Clermont-Ferrand, France 27. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, E.-I. Moater, I. Ioni, Chromatographic, spectrophotometric and titrimetric determinations of Vitamin C from pharmaceuticals - poster, Le Quatrime Colloque Franco-roumain De Chimie Applique, 28 juin 2 julliet 2006, Clermont-Ferrand, France 39. *** International Conference on Harmonization (ICH), ICH Quality Guidelines: Good Manufacturing Practice Guidance for Active Pharmaceutical Ingredients Q7A ICH, Geneva, Switzerland, 2001. 40. ***ICH, ICH Harmonised Tripartite Guideline Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), 2005. 41. ***ICH, ICH Quality Guidelines Validation on Analytical Procedures: Methodology Q2B ICH, Geneva, Switzerland, 1996. 42. *** USP 26, NF21, 2002. 43. *** USP 27, NF22, 2004. 44. *** US Food and Drug Administration, Guidance Document for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, FDA, Rockville, MD, 2000. 45. *** Guidance for Industry.Analytical Procedures and Methods Validation. Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), 2000. 49. *** European Pharmacopoeia 4-th edition 2003. 50. M. Boji, L. Roman, R. Sndulescu, R. Oprean, Analiza i controlul medicamentelor, vol. 1. Bazele teoretice i practice, Editura Intelcredo, 439 480, 2002. 31

80. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, M. Ilie, D. Bllu, V. Magearu, Revista de Chimie, 57(11), 1188-1189, 2006. 81. A.-M. Hossu, M. Ilie, C. Rdulescu, International Symposium for High Performance Thin-Layer Chromatography, Poster, 9 11 October 2006, Berlin, Germany. 82. C. Baloescu, M. Sterescu, Metode spectrofotometrice de absorbie aplicate la controlul medicamentelor, Ed. Medical, Bucureti, 1975. 99. A.-M. Hossu, V. Magearu, Ovidius University Annals of Chemistry, 14, 12-15, Constana, 2003. 109. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, I. Ioni, V. Magearu, Actes du Troisime Colloque Franco-Roumain De Chimie Applique, 262-264, Slnic-Moldova, Bacu, 2004. 118. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, M. Ilie, N. Mitrea, D. Bllu, Metode validate de analiza prin absorbtie UV si spectrofluorimetrie a vitaminelor A, D si E din preparate farmaceutice - Poster, A XXIX-a Conferina Naional de Chimie, 4-6 October 2006, Calimneti-Cciulata, Romania. 119. I.G. Tnase, Analiz Instrumental, partea a 2-a, Bucureti, 1991. 120. G.G. Guilbault, Practical Fluorescence, Second Edition, New York, 1990. 121. F. Rouessac, A. Rouessac, Analyse chimique. Mthodes et techniques instrumentals modernes, 5e edition, Dunod, Paris, 2000. 143. A.-M. Hossu, M. Ilie, N. Mitrea, V. Magearu, Revista de Chimie, 2007, aprobat pentru publicare. 144. A. Medvedovici, F. Tache, Noiuni fundamentale i mrimi caracteristice n cromatografie, Editura Universitii Bucuresti, 77, 1997. 145. V. Dalmeyda, C. David, Chromatographie en phase liquide, Stage Cacemi, Johnson and Stevenson, 1999. 146. R. Rosset, M. Caude, A. Jardy, Chromatographies en phases liquide et supercritique, Masson, 1991. 151. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, Elemente de Chimie Anorganic i Analitic, Vol. 1 i 2, Editura Electra, ISBN 973-7728-80-7, 2006. 152. C. Rdulescu, A.-M. Hossu, I. Ioni, Chimia apei si a solului, Editura Bibliotheca, Targoviste, ISBN 973-8413-86-9, 2004. 153. I. Ioni, C. Rdulescu, A.-M. Hossu, Chimie Tehnic. Aplicaii practice i numerice, Editura Bibliotheca, Targoviste, ISBN 973-712-002-7, 2004. 32

154. I. Ioni, C. Rdulescu, A.-M. Hossu, Chimie General, Editura ICPE, Bucureti, ISBN 973-7728-27-0, 2004. 181. M. Scripcariu, A.-M. Hossu, V. Magearu, Analele Universitii Bucureti Chimie, Anul XIII (serie nou), vol I-II, 111-115, Bucureti, 2004. 182. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, I. Ioni, Valahia University Annals of Trgovite section Fundamental Science, 13, 64-66, Trgovite, 2003. 183. A.-M. Hossu, I. Ioni, C. Rdulescu, C., Valahia University Annals of Trgovite section Fundamental Science, 14, 2004, Trgovite, 2004. 184. A.-M. Hossu, C. Rdulescu, I. Ioni, D. Hossu, D., Ovidius University Annals of Chemistry, vol. XVI, nr. 2, 218-220, Constana, 2005.

33