C2 - Noiuni generale privind metodele moleculare de analiza a acizilor nucleici.

Adrian Onu, Dr. St. Nat.

Facultatea de Bioinginerie Medical. Institutul Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie Cantacuzino.

C2 - Noiuni generale privind metodele moleculare de analiza a acizilor nucleici.

SCOP

C2.1 nelegerea structurii i a funciilor acizilor nucleici. C2.2 Corelarea noiunilor de biologie molecular i celular cu distribuia acizilor nucleici. C2.3 Descrierea i nelegerea metodelor de studiu i de caracterizare a acizilor nucleici.

C2.1 - nelegerea structurii i a funciilor acizilor nucleici - History of Genetics Timeline.

Dupa Lane, Jo Ann (1994). History of Genetics Timeline. (http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/WWC/1994/ geneticstln.html)

Bazele.
An 1858 Om (Oameni) de tiin Descoperire

Charles Darwin, Anunul comun al teoriei seleciei naturale, prin Alfred Russel care membrii unei populaii care sunt mai bine Wallace adaptai la mediu supravieuiesc prin trsturile lor adecvate. Charles Darwin Gregor Mendel Carl Correns, Hugo de Vries, Erich von Tschermak Publicarea crii Originea speciilor. A publicat rezultatele studiilor sale privind motenirea de "factori" la mazre. Principiile de Mendel au fost descoperite i verificate independent, marcnd nceputul geneticii moderne.

1859 1866 1900

Cromozomi, gene, modele

An 1902 Om (Oameni) de tiin Walter Sutton Theodor Boveri Nettie Stevens Edmund Wilson Descoperire A subliniat interdependenta dintre citologie i Mendeliansm, fcnd legtura dintre morfologia celulelor i ereditate. Au descris independent comportamentul cromozomilor de sex cromozomii XX-determin sexul feminin; XY determin sexul masculin. A propus teoria prin care unele boli umane sunt cauzate de "erori nnscute de metabolism", care rezult din lipsa unei enzime specifice. A propus o teorie, a motenirii legate de sex pentru mutaia ochiului alb descoperita n musculia de oet, Drosofila malanogaster.

1905

1908

Archibald Garrod

1910

Thomas Hunt Morgan

Mutatii si transfer de caractere.

An 1927 Om (Oameni) de tiin Hermann J. Muller Descoperire A folosit raze X pentru a provoca mutaii genetice artificiale n Drosofila. A propus ca un "principiu"necunoscut, a transformat tulpina R inofensiv de Diplococcus la tulpina virulenta S. A adus dovada citologica de transconjugare la porumb. Au iradiat mucegai de pine rou, Neurospora, i a demonstrat c gena produce efectul prin reglarea enzime specifice.

1928

Fred Griffith

1931

Harriet B. Creighton Barbara McClintock

1941

George Beadle Edward Tatum

ADN este responsabil de caracteristici

An 1944 Om (Oameni) de tiin Descoperire

Oswald Avery Au purificat principiul de Colin MacLeod transformare n experimentul lui Maclyn McCarty Griffith i c acela a fost ADN-ul. Max Delbrck A organizat un curs de fagi de la Laboratorul Cold Spring Harbor, care a fost predat de 26 de ani consecutivi. Acest curs a fost teren de antrenament din primele dou generaii de biologi moleculari A imaginat ipoteza elementelor transpozabile pentru a explica variaiile de culoare din porumb. A descoperit raportul egal intre adenina i guanina / timin si citozina n mostre de ADN dintr-o varietate de organisme.

1945

1940

Barbara McClintock Erwin Chargaff

1950

ADN se replica consevativ

An Om (Oameni) Descoperire de tiin A obinut fotografii clare de difracie cu raze X de ale ADN-ului. Folosirea bacteriofagilor n care proteina a fost etichetate cu 35S i ADN-ul cu 32P pentru dovada final c ADN-ul este molecula de ereditate. Rezolvat structura tridimensionala a moleculei de ADN. Izotopi utilizate de azot pentru a dovedi replicarea ADN-ului de semiconservative. A purificat ADN-polimeraza I din E. coli, care a devenit prima enzima ADN-ul intr-un tub de testare.

1951 Rosalind Franklin 1952 Martha Chase Alfred Hershey 1953 Francis Crick James Watson 1958 Matei Meselson Frank Stahl 1958 Arthur Kornberg

ADN etse un dublu helix

An 1951 1952 Om (Oameni) de tiin Rosalind Franklin Martha Chase Alfred Hershey Descoperire A obinut fotografii clare de difracie cu raze X de ale ADN-ului. Folosit bacteriofagilor n care proteina a fost etichetate cu 35S i ADN-ul cu 32p pentru dovada final c ADN-ul este molecula de ereditate. Rezolvat structura tridimensionala a moleculei de ADN.

1953 1958

Francis Crick James Watson Matei Meselson Frank Stahl

Izotopi utilizate de azot pentru a dovedi replicarea ADN-ului de semiconservative.

A purificat ADN-polimeraza I din E. coli, care a devenit prima enzima ADN-ul intrun tub de testare.

1958

Arthur Kornberg

ADN pate fi caracterizat

An 1966 Om (Oameni) de tiin Marshall Nirenberg H. Gobind Khorana Descoperire Au spart codul genetic. Un codonii ARNm triplet este specific pentru fiecare dintre cele douzeci de aminoacizi. Au zolat enzima de restricie n Hind II, care taie molecule de ADN la secvente de recunoatere specifice. A condus echipa de la Cold Spring Harbor Laboratory, unde a dezvolta electroforeza ADN, folosind gel de agaroz i colorare cu bromur de etidiu. A imaginat metode de secventiere bazate pe ntreruperea sintezei lanului ADN-ului prin metoda dideoxi.

1970

Hamilton Smith Kent Wilcox Joseph Sambrook

1973

1977

Fred Sanger

ADN poate fi manipulat

An 1972 1973 Om (Oameni) Descoperire de tiin Paul Berg Herb Boyer Annie Chang Stanley Cohen A produs primele molecule de ADN recombinant. Au aratat ca o molecula de ADN recombinant pot fi meninute i replicate n E. coli. Reuniunea internaional de la Asilomar, California, a cerut adoptarea de orientri de reglementare experimentare ADNului recombinant. Prima companie de inginerie genetic (Genentech) este fondat, folosind metode de recombinare ADN pentru a face medicamente medical importante. Somatostatina a devenit primul om hormon produs folosind tehnologia ADN-ului recombinant.

1975

1977

1978

C2.1 - nelegerea structurii i a funciilor acizilor nucleici .

Structura acizilor nucleici

Structura acizilor nucleici

Acizii nucleici reprezint lanuri polinucleotidice, formate din nucleotide. Acestea la rndul lor sunt formate dintr-un radical fosfat, o pentoz (un zahar) i o baz azotat. Lanturile polipatidice sunt bazate pe legturi covalente in interiorul lantului i legturi de hidrogen ntre lanuri. Ele se formeaz intre 2 nucleotide diferite, de ex.: ntre adenin i timin/uracil sau ntre citozin i guanin)

Purine

Un compus purinic este un compus heterociclic aromatic organic, constnd dintr-un inel de pirimidin legat cu un inel de imidazol. Inelul imidazolic este o strucura biologica importanta fiind elementul constitutiv al unui aminoacid important ca histidina. Imidazolul este amfoteric putand servi ca baz i ca un acid slab.

Pirimidine

Pirimidinele sunt compusi heterociclici aromatici organic similar cu benzen i piridin, care conin doi atomi de azot de la poziiile 1 i 3 ale inelului aromatic

ATP

Adenozina Adenina

Adenozin trifosfat

GTP

Guanosina Guanina

Guanosin trifosfat

CTP
NH2
4 5 6 3

N O

N H
Citidina Citozina

Citidin trifosfat

dTTP

Dezoxi Timidina Timina

Dezoxi Timidin trifosfat

UTP

Uridina Uracil

Uridin trifosfat

Baze azotate

Adenina

Guanina

NH2
4 5 6 3

N O

N H
Uracil Timina Citozina

Tipuri de nuclotide
Baza Adenina (A) ADN Guanina (A) Citiozina (C) Timina (T) Adenina (A) ARN Guanina (A) Citiozina (C) Uracil (U) Nucleozid Deoxiadenozina Deoxiguanozina Deoxicitidina Deoxitimidina Aednozina Guanozina Citidina Uridina dAMP dGMP dCMP dTMP AMP GMP CMP TMP Nucleotid dADP dGDP dCDP dTDP dADP GDP CDP TDP dATP dGTP dCTP dTTP ATP GTP CTP TTP

Strucura ADN

Structura ARN

Particularitatile structurii ARN

O caracteristic important structural a ARN-ului, prin care se distinge de ADN-ul este prezena unei grupri hidroxil la poziia 2' a ribozei. Prezena acestui grup funcional face ca helix-ul s adopte mai degrab o geometrie de forma A dect de forma B cum este mai frecvent observat in ADN. Acest lucru duce formarea unei caneluri mari, foarte nguste i adnci alturi de o scobitura minor mai puin adnc i larg. A doua consecin a prezenei grupului de 2'-hidroxil este c, n regiunile conformaional flexibile ale unei molecula de ARN (care nu este implicat n formarea de un dublu helix) poate fi ataca chimic iar legtura fosfodiester rupta i lanul ntrerupt.

Trasele matabolice

De unde vin structurile vietii

Experimentul MillerUrey

Acesta utilizeaz metan, amoniac i hidrogen, inchise ermetic n interiorul unei incinte sterile de sticl i cu tuburi conectate ntr-o bucl pentru a simula efectele din atmosfera primordiala. n numai o zi, amestecul devine roz, i la sfritul unei o sptmni de funcionare continu, Miller si Urey au observat c 10-15% din carbon n cadrul sistemului a fost transformat in compui organici. Doi la sut din acestia au fost amino-acizi, care sunt strucura de baza a proteinelor din celulele vii. Zaharurile i lipidele s-au format de asemenea in experiment.

Pasi ulteriori

C2.2 Corelarea noiunilor de biologie molecular i celular cu distribuia acizilor nucleici

Structura celulelor

Structura celulei eucariote

1. Nucleosol 2. Nucleu 3. Ribosom 4. Vezicle 5. Reticul endoplasmic rougos 6. Apparat Golgi 7. Citoschelet 8. Reticul endoplasmic neted 9. Mitocondrie 10. Vacuole 11. Citosol 12. Lizozom 13. Centriole

Nucleul celulei eucariote

1. Membrana nuclera. 1.a. Membrana externa. 1.b. Membrana interna 2. Nucleoli 3. Nucleoplasma. 4. Chromatina. 4.a. Heterochromatina. 4.b. Euchromatina. 5. Ribozmies. 6. Por nuclear.

Impachetarea ADN
Nucleu Cromozom

Impachetarea ADN pe histone

Lant dublu catenar

Structura celulei procariote

Structura unui virus

Ribozomi (ARN ribozomal)

Tip Procarioate Eucariote

Marime 70S 80S

Subuntatea mare 50S (5S, 23S) 60S (5S, 5.8S, 28S)

Subunitatea mica 30S (16S)

40S (18S)

ARNt

Acidul ribo-nucleic de transfer (numit i ARN de transfer sau ARNt) este un complex de molecule mici (n jur de 7495 nucleotide) care transfer un aminoacid activat unui lan polipeptidic n cretere sntetizat n timpul procesului de translaie.

C2.3 Descrierea i nelegerea metodelor de studiu i de caracterizare a acizilor nucleici.

Pai necesari purificrii

Omogenizare

Solubilizare

Extracie

Suspensie celule, material, sediment Resuspensie celule, material, sediment

Solubilizare diferenial. Solubilizare complet.

Partiie in solventi organici. Precipitare difenial.

Sediementare

Purificare

Analiza

Depunere prin centrifugare sau ultracentrufugare. Sedimentare diferenial prin centrifigare sau ultracentrifugare.

Cromatografie de adsobie Cromatografie de schimb ionic Cromatografie de excluziune molecular.

Electroforeza pe gel Reacie de polimerizare in lan si dervele ei. Secveniere Hibridizare

Solubilzare elementelor celulei eucariote

1. Nucleosol detergeni ionici 2. Nucleu detergeni neionici 3. Ribosom - detergeni ionici tari 4. Vezicule mediu apos 5. Reticul endoplasmic rougos detergeni neionici 6. Aparat Golgi - detergeni neionici 7. Citoschelet mediu apos, ioni divalenti 8. Reticul endoplasmic neted detergeni neionici 9. Mitocondrie - detergeni neionici 10. Vacuole mediu apos 11. Citosol mediu apos 12. Lizozom mediu apos 13. Centriole mediu apos

Centrifugare
Centrifugarea este un proces care implic utilizarea forei centrifuge pentru sedimentarea amestecurilor. Componente dense ale amestecului migreaz mai departe de axa de centrifuge, n timp ce mai puin dense componente ale amestecului raman spre axa. In final in apartea de jos a tubului se adun sedimantul iar solua rmas este numit supernatant.

Fc = m r Forta centripeta
2

F = S v Forta de vscozitate Fa = Vg Forta arhimedic

Partiie in solveni organici.

Extracia cu fenolcloroform este o tehnica de extracie bazata pe partitia lichid-lichid utilizat pe scar larg n biologie molecular pentru izolarea ADNului, ARN i proteine. amestecate, formnd un amestec bifazic.

Cromatografie de adsobie
Aceast metod se bazeaz pe faptul c acidul nucleic poate lega (adsorbie), la faza solida (dioxid de siliciu sau de alt natur), n funcie de pH-ul i coninutul de sare din tampon si elua in condiii de molaritate redus.

Electroforeza

Electroforeza n gel este o metod utilizat n biochimie si biologie moleculara pentru a separa o populaie mixt de fragmente de ADN sau ARN de lungime diferita i pentru a estima dimensiunea ADN-ului sau a fragmentelor de ARN. Acestea sunt separate depinzand de ncrcare i mrime, prin aplicarea unui cmp electric.

Electroforeza pe gel de agaroz