Sunteți pe pagina 1din 28

Curs- C12

GENOMICA UTILIZATA IN SINTEZA VACCINURILOR

CUPRINSULCURSULUI
VACCINURI CONVENTIONALE NOTIUNI DE REVERSE VACCINOLOGY

UTILIZAREA GENOMICII IN SINTEZA VACCINULUI

MENINGOCOCIC

VACCINURI CONVENTIONALE
GENOMICAC13

VACCINUL IDEAL
Cerinte esentiale:
Vaccinul trebuie sa fie sigur, chiar si la persoane cu imunitatea deprimata. O

mortalitate > 1/106 nu este acceptabila nu trebuie sa existe sechele la distanta Vaccinul trebuie sa fie foarte eficace si, in mod ideal, sa induca o imunitate capabila sa sterilizeze gazda la contactul cu patogenul respectiv. Altfel spus, vaccinarea trebuie sa asigure ca, la contactul ulterior cu tulpina salbatica, boala sa nu se produca.
Cerinte secundare:

Costul sa permita utilizarea lui pe scara larga Sa fie administrat fara pregatire prealabila (ex intra-nazal, oral) Stabilitate termica foarte buna Multivalent pentru a economisi costurile de administrare Sa fie necesare cat mai putine rapeluri

G.L.Ada, World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 7, Number 2 (1991), 105-109, DOI: 10.1007/BF00328978

ABORDAREA CONVENTIONALA/VACCINURI OBTINUTE PRIN RECOMBINARE


Abordarea conventionala a dezvoltarii unui vaccin presupune studierea unui patogen pentru a

identifica factorii care pot determina imunitatea protectoare; acestor factori sunt purificati si utilizati in vaccin. Limitari:
factori care determina un nivel de imunitate protector nu confera siguranta vaccinului uneori este imposibil sa fie obtinute astfel de vaccinuri pe scara industriala.

Vaccinurile obtinute prin tehnologii de recombinare ADN au permis, odata identificati factorii ce

declanseaza mecanismele de protectie, clonarea genelor corespunzatoare in alte organisme care devin fabrici de vaccinuri. Primul vaccin obtinut prin recombinare a fost vaccinul anti hepatitaB. Protectia fata de aceasta boala se bazeaza pe prezenta anticorpilor fata de antigenul de surprafata a virusului (AgHBs). AgHBs circula in sange in cantitati mari. Vaccinul, produs pe celule fungice si de mamifere este foarte eficace: induce nivele seroprotectoare de anticorpi (> 10 mIU/ml) la > 95% din subiecti si previne dezvoltare hepatitei cronice la cel putin 75% din copiii vaccinati nascuti din mame HBeAgpozitive. Vaccinul anti HVB este si primul vaccin anticancer, reducand semnificativ incidenta cancerului hepatocelular la copii.

TIPURI DE VACCINURI CONVENTIONALE


Tip de vaccin
Germeni omorati

Descriere
Ag.cauzal omorat prin mtd chimice sau fizice

Avantaje
Eficacitate buna

Dezavantaje
Nu poate fi aplicat pt germenii care se cultiva greu pt a obtine cantitati suficiente de vaccin In prezent cerintele de siguranta post vaccinare nu pot fi total indeplinite Ca mai sus

Exemple

vaccin (Salk) vaccin vaccin vaccin

anti- Polio antigripal anti Rabic anti holeric oral

Germeni viu atenuati

Germene viu, care si a pierdut capacitatea de a produce imbolnavire

Eficacitate buna, induce un raspuns imun protector

vaccin anti- Polio (Salk) vaccin antigripal


intra-nazal trivaccinul anti rubeola, rujeolos, si oreion

Vaccinuri subunitare

Contin portiuni ale agentului patogen

Subunitati conjugate

Un polizaharid al agentului cauzal este legat de un carrier proteic

Nu exista risc de a produce boala Daca vaccinul e produs prin recombinare nu este nevoie ca germenele sa fie cultivat Polizaharidul care este slab imunogenic devine imunogenic prin conjugare

Identificarea moleculelor protectoare este complexa si consumatoare de timp

Toxoid difteric Toxoid Pertussis Vaccinul impotriva hepatites B


Haemophlius influenzae Meningococcus A, C, Y, W135 Pneumococcus

Necesita cresterea patogenului in vitro pentru a obtine capsula polizaharidica Nu intotdeauna capsula e imunogenica Sunt prea multe tipuri de capsule

Cultiva Microorganismul

Test area serul de convalenscent selecteaza antigenul

Testarea imunogenicitatii

5-15 ani

Purificarea componentelor Identificarea componentelor

5-15 Years

Cloneaza gene

Testarea imunogenicitatii pe modele animale

DEZEVOLTAREA VACCINULUI

Vaccin

NOTIUNI GENERALE DE REVERSE VACCINOLOGY


GENOMICAC13

MODELUL DE ABORDARE GENOMICA PENTRU REVERSE VACCINOLOGY

G. Grandi, Genomics, Proteomics and Vaccins

STRATEGIILE PRINCIPALE IN IDENTIFICAREA CANDIDATILOR PENTRU OBTINEREA VACCINURILOR


Secventierea intregului genom al unei bacterii (sau virus) se poate face uneori in cateva zile.

Adnotation se realizeaza de obicei in cateva luni. Sunt 3 abordari posibile in selectia de candidati pentru vaccinuri:

1)

Adnotarea genomica:
defineste lista tuturor proteinelor si le grupeaza in diferite familii pe baza functiei prezise furnizeaza informatii privind posibila localizare a proteinelor in interiorul celulei bacteriene. pentru majoritatea patogenilor extracelulari antigenele declansatoare ale raspunsului imun

protector sunt secretati si/sau sunt asociate membranei analiza in silico reprezinta prima strategie importanta in selectia pool-ului initial de candidati pentru vaccin.
identificat prin sonde de ADN. Aceasta permite realizarea unei imagini a intregii activitati transcriptionale si permite compararea expresiei in diferite medii de cultura sau conditii de crestere. In mod specific prin analiza profilului trascris in interactiunea dintre bacterie si gazda putem obtine indicatii asupra reglarii genelor in perioada de evolutie a infectiei.

2)

Analiza transcriptomului bacterian:

3)

Metode proteomice care caracterizeaza atat calitativ cat si cantitativ proteinele componente ale celulei bacteriene.

PASI IN IDENTIFICAREA CANDIDATILOR PENTRU OBTINEREA VACCINURILOR


selectarea unui pool de genes/proteine cu un interes potential pentru dezvoltarea vaccinului: in general este vorba de 20-30% din genele genomului bacterian. Dupa identificare, grupul de candidati este exprimat si purificat pentru a fi testat intr-un mod din care sa reiasa capacitatea lor protectoare. Exprimarea high-throughput si sistemele de purificare disponibile in prezent permit izolarea unui mare numar de proteine recombinante si a unor cantitati suficient de mari intr-un timp relativ scurt.

Ultimul pas este testul de screening. Este cel care consuma cel mai mult timp dar este un pas critic al intregului proces pentru ca: Nu poate fi automatizat prea mult: cele mai multe teste se bazeaza pe imunizarea animalelor cu fiecare din proteinele purificate. Supravietuirea animalelor vaccinate dupa administrarea dozei de patogen, si urmarirea calitatii si cantitatii raspunsului imun produs (productia de celule T antigen specifice si anticorpi), este folosita pentru a defini potentialitatea fiecarui antigen de a deveni un vaccin. Aceste testari necesita multe animale si mai multe luni pentru a fi finalizate. In general, durata screeningului primar depinde strict de numarul de animale pe care echipa de cercetare o poate urmari simultan si de obcei dureaza 1 an. Calitatea testului de screening, care ar trebui sa mimeze cat mai bine ce se intampla la om atat din punctul de vedere al bolii cat si corelarii cu protectia.

Genomic halo Strain-specific

pan-genome species

OPEN pan-genome species

1. Acces la foarte multe gene 2. versatilitate si adaptabilitate 3. multiple cai de evitare a raspunsului gazdei, al vaccinarii si de dezvoltare a rezistentei la antibiotice 4. Contribuie la mobilitatea elementelor genetice si la transferul lateral al genelor 5 . Identifica candidati pentru noi vaccinuri

Testarea imunogenicitatii pe modele animale


Express recombinant proteins

DEZVOLTAREA VACCINULUI

Vaccin

1-2 ani

DNA vaccine preparation

In silico vaccine candidates

Comparative genomics and antigen predictions

Start from the whole genome sequence

COMPARAREA CELOR 3 ABORDARI NOMICS LA SELECTIA ANTIGENULUI


Avantaje Dezavantaje

Analiza in silico

Foarte rapida. Fara munca experimentala pentru selectia genei Predictia antigenelor de suprafata si a factorilor de virulenta
Date semi-cantitative privind nivelul de expresie al genelor Identificarea genelor probabil implicate in virulence

Se bazeaza pe algoritmi care nu sunt in intregime optimizati inca Lipsa de informatii privind exprimarea genelor

Microsonde DNA

Fara indicatii privind localizarea proteinelor necesita multa munca si este scump Cantitati relativ mari de celule bacteriene necesare pentru analiza (108109) necesita multa munca si este foarte scumpa Necesita un numar mare de celule bacteriene pentru analiza

Proteomica

Date cantitative privind expresia antigenica Identificarea antigenelor de membrana asociate

VACCINURI OBTINUTE DIN PEPTIDE DE SINTEZA


Caracteristici/Avantaje:

Chimic bine definite, selective si sigure Stabile la temperatura ambientala

Nu necesita un lant al frigului ceea ce le face foarte cost efective


Productie simpla si standardizata

VACCINUL ANTIMENINGOCOCIC
ABORDAREA GENOMICA
GENOMICAC13

DATE GENERALE DESPRE INFECTIA MENINGOCOCICA


Neisseria meningitidis , o bacterie incapsulata gram negativa, produce meningita meningococica si

septicemie.
Dupa colonizarea mucoasei nazo-faringelui meningococcul invadeaza tractul respirator. Din motive

inca necunoscute, in putine cazuri patogenul penetreaza epiteliul mucoasei si ajunge in circulatie. La indivizii cu imunitate redusa fata de meningococci, proliferarea acestuia in sange duce la septicaemie, caracterizata prin colaps circulator, insuficienta multipla de organ si coagulopatie. Prin sange, patogenul ajunge la nivelul compartimentului subarachnoid si initiaza meningita (Nassif et al., 1999).
Exista 5 serogrupuri patogenice majore (A, B, C,Y si W135) pe baza compozitiei chimice a capsulei polizaharidice (Gotschlich, Liu and Artenstein, 1969) Transmiterea bolii este una de la om la om; nu exista rezervor animal pentru aceasta bacterie

5-15% din persoane sunt purtatori sanatosi de N.Meningitidis in nasofaringe


In situatii normale (endemice): incidenta este de 1-5 cazuri/100000 locuitori; in epidemii incidenta

poate ajunge la 15/100000


Mortalitatea este ridicata: de 5-10% din pacientii infectati

10-20% din persoanele care supravietuiesc bolii pot prezenta sechele (afectare cerebrala, surditate)

VACCINURI DEJA EXISTENTE


Exista deja vaccinuri eficiente antimeningita C (care se bazeaza pe capsula polizaharidica), un

vaccin anti-meningococcic trivalent (A,C,W) si unul tetravalent (A/C/Y/W). Eficacitatea lor la copilul mic este redusa. Dar nu exista vaccinuri care sa previna boala data de meningococul B (MenB) care determina 32 -80% din toate meningitele meningococice. (Schotten et al., 1993).
Vaccinuri conjugate: vaccinuri in care structura polizaharidica este legata de o proteina

transportatoare: pentru Men B, Jennings et al. au substituit grupurileN-propionyl (N-Pr) cu grupuri N-acetyl si au conjugat polizaharidul N-Pr al meningococcului B cu un carrier proteic. Vaccinul conjugat rezultat a fost foarte imunogenic pe animalele dar a dus si la formarea de autoanticorpi, ceea a diminuat semnificativ sansele de utilizare la om.
Vaccinuri care sa nu se bazeze pe derivate din capsula includ:
Veziculele din membrana externa (outer membrane vesicles)
Proteine din membrana externa (PorA, transferrin binding protein, Opa si Opc ) Lipozaharidele detoxificate

DATE PRIVIND GENOMUL DE NEISSERIA MENINGITIDIS SEROGRUP B TULPINA MC58


Dimensiunea genomului : 2,272,351 bp
Regiuni codante prezise : 2158

Adnotari functionale: 1158 (53.7% din totalul genelor prezise)


au fost identificate 3 insule majore de transfer orizontal :
2 contin gene ce codifica proteine implicate in patogenicitate
1 contine o proteina ipotetica

Contine mai multe gene care prezinta variatii de expresie in functie de momentele si fazele

infectiei decat alti patogeni studiati, un mecanism particular care le controleaza expresia si care contribuie la evitarea raspunsului imun al gazdei.

Transferul orizontal reprezinta una din modalitatile de adaptare a bacteriei la mediul extern (inclusiv la actiunea antibioticelor) si se realizeaza prin: transductie realizata de un fag, conjugare bacteriana prin contactul direct al peretilor celulelor bacteriene sau prin transformare (introducerea de material genetic dinafara celulei)

Capsula polizaharidica
Self-antigen, raspuns slab Risc de autoimunitate

Proteinele descoperite prin metode

conventionale
Variabilitate antigenica Protectie inconstanta in studii clinice

GASIREA CANDIDATULUI PENTRU VACCINUL ANTI-MENINGOCOCIC


identificarea antigenelor care determina reactii protectoare (AC bactericizi) si care

sunt constante la diferiote tulpini si in diferite faze ale infectiei.

Etapele de identificare a candidatului la vaccin au fost: secventierea intregului genom si evidentierea diferentelor majore intre tulpinile claisificate pe baza celor 5 serotipuri majore: Ic, Ib, III, IV, V. Pangenomul (totalitatea genelor apartinand speciei) a fost impartit in doua:
genomul miez (core) care cuprinde genele prezente la toate tulpinile si genomul dispensabil (dispensable genom) gene unice unei tulpini sau care apar la mai multe tulpini, insa

niciodata in toate tulpinile.

Algortimul informatic de selectie a genelor din cele doua categorii de genomuri care au fost presupuse a

codifica proteinelor de suprafata si proteinele secretate de streptococ. Au fost obtinute 396 de gene core si 193 de gene variabile

Exprimarea a aproximativ jumatate din aceste gene a produsilor solubili obtinuti prin recombinarea in E.Coli Proteinele obtinute au fost testate pentru a se vedea capacitatea lor protectoare fata de tulpinile de streptococ

B. Din cele 28 de proteine cu activitate bactericida, au fost in final selectate doar 4 antigene care au fost capabile sa creasca semnificativ rata de supravietuire la soarecii in contact cu agentul infectios. Dintre acestia, numai unul singur (proteina Sip) fusese anterior identificat ca un antigen potential pentru vaccin.
experiumental ca unul din acesti antigene este capabil sa formeze cu epiteliile structuri pilus-like care favorizeaza aderenta si colonizarea, reprezentand unul din factorii de virulenta ai acestor tulpini.

Administrarea ca vaccin a tuturor celor 4 antigene, protectia a fost cvasiuniversala. S-a dovedit apoi si

600 candidati potentiali pentru vaccin identificati 350 proteine exprimate in E.coli 344 proteine purificate si folosite la imunizarea soarecilor 91 proteine noi exprimate pe suprafata identificate WB, ELISA, FACS

28 noi proteine au activitate bactericida

Studii Clinice

5 vaccine candidates

ANALIZA GENOMICA ALTE POSIBILE UTILIZARI ALE PROTEINELOR


Analiza genomului bacterian permite descoperirea unui numar mare de noi proteine care nu

sunt doar candidati pentru vaccinuri ci si factori de virulenta importanti. De aceea este esentiala intelegerea functiei acestor proteine si a rolului lor in virulenta. Printre antigenele noi descoperite in procesul de selectie a candidatilor la vaccinul antiMen B se numara GNA33, care a fost apoi caracterizat din punct de vedere biochimic, imunologic si functional. GNA33 (genome derived Neisseria Antigen) este o lipoproteina foarte bine conservata in serogrupurile tulpinilor de meningococ B. GNA 33 are in proportie de 33% o structua identica cu transglicozilaza legata de membrana E.Coli. Analiza biochimica a confirmat ca molecula este o hidrolaza din clasa transglicozilazei litice care este capabila sa degradeze atat sacculii mureinici insolubili cat si lanturile de glicani. S-a aratat de asemenea c a molecula de GNA33 recombinata declanseaza producerea de anticorpi bactericizi si este capabila sa confere protectie pasiva la modele de soareci fata de serotipul P1.2 prin mimarea unui epitop de suprafata identificat ca un motiv scurt prezent in GNA33 si care este esential pentru recunosterea bacteriei de catre anticorpi. Acelasi motiv scurt a fost prezent si in bucla 4 a Por A (o proteina specifica a membranei externe bacteriene) si s-a devedit esential dar nu suficient pentru legarea anticorpilor monoclonali la PorA. Descoperirea unei proteine care mimeaza antigenul este interesanta si pentru dezvoltarea vaccinului. Desi AC anti GNA33 recunosc numai P1.2.PorA, acest serogrup apare in 8% din tulpinile de N.meningitidis izolate clinic si de aceea ar putea fi un candidat pentru un vaccin combinat. Avantajul enorm este acela ca, GNA33 (spre deosebire transglicozilaza legata de E.Coli) poate fi usor purificat intr-o forma solubila.

REVERSE VACCINOLOGY
Folosind tehnici genomice, sunt in faza de investigare vaccinuri pentru:
S. pneumoniae

(Wizemann et al., 2001), Streptococcus agalactiae (Tettelin et al., 2002), Staphylococcus aureus (Etz et al., 2002), Porphyromonas gingivalis (Ross et al., 2001), Chlamydia pneumoniae, (Montigiani et al., 2002) Plasmodium falciparum (Smooker et al., 2000).

Gene ipotetice: progresele in secventierea genomica au permis o acumulare sequencing has rapida in GenBank de gene necarcaterizate, numite ipotetice. Aceste gene, care nu au fost caracterizate experimental si a caror functii nu pot fi deduse prin simpla comparare a secventei lor, reprezinta in prezent un procent semnificativ din bazele de date publice.

MENINGOCOC- ABORDAREA PRIN ANALIZA TRANSCRIPTOMULUI


Pentru a elucida evenimentele moleculare care duc la colonizarea bacteriana, se folosesc sonde DNA care

urmaresc modificarile in expresia profilelor genice in timp ce N. meningitidis interactioneaza cu celulele epiteliale umane (Grifantini et al., 2002). Bacteriile au fost incubate impreuna cu celule epiteliale umane. Bacteriile aderente la celule au fost recuperate si RNA total a fost purificat la momente diferite. Intr-un experiment in paralel, RNA a fost preparat din bacterii care au crescut in absenta celulelor epiteliale. Dupa marcare cu diferiti fluorochromi, cele doua probe de ARN au fost amestecate si au fost folosite in experiment de hibidrizare pe sonde DNA ce contineau intreaga colectie de gene MenB PCR-amplificate (2152 gene). Intensitatea relativa a emisiilor celor 2 fluorocromi dupa excitarea laser a fiecarui spot (gena) a fost utilizata pentru evaluarea activitatii de transcriptie a fiecarei gene din cele doua conditii experimentale diferite. Din astfel de experimente, s-a aratat ca adeziunea celulelor epiteliale altereaza expresia mai multor gene, inclusiv a genelor de adeziune, genelor crosstalk gazda-patogen (gene ce codifica mecanismele de transport pentru amoniu, aminoacizi, clor, sulfat si fier), genele de biosinteza a aminoacizilor si selenocisteinei, genele metabolismului DNA (metilaze, nucleaze, transpozaze, helicaze si ligaze) precum si a unor gene ipotetice (107 gene). 12 proteine a caror transcriptie a fost in mod special gasita foarte activata in timpul adeziunii au fost exprimate in E. coli, purificate si folosite pentru a produce antiser la soareci. Serurile au fost in final testate pentru capacitatea lor de a media distrugerea dependenta de complement a MenB. 5 din aceste seruri (impotriva produsilor genelor ipotetice NMB0315 si NMB1119, adezin MafA, the MIP related protein si N-acetylglutamate synthetase) au aratat o activitate bactericida semnificativa fata de diferite tulpini meningococcice.

THE NOMICS FLOWCHART FOR VACCINE DISCOVERY 1.Identify highly expressed genes by DNA microarrays 50- 60% of the genome (approx. 1000 genes)

2. Remove non-membrane-associated proteins as defined by in silico analysis (use several algorithms) 2030% of the genome (approx. 400 genes) 3. Add new membrane-associated proteins as defined by membrane proteome analysis 2535% of the genome (approx. 500 genes) 4. Add in vivo up-regulated genes as defined by DNA microarrays 3035% of the genome (approx. 600 genes)

Figure 2.5 A proposed nomics approach for vaccine candidate identification. A DNA microarray is first used to identify highly transcribed genes (.5 mRNA copies/cell) by analysing the gene transcription profile from bacteria grown in liquid culture. Highly transcribed genes are then subjected to in silico analysis to predict their localization, and membrane-associated proteins are selected. Most of the existing vaccine candidates are expected to be included in this pool of selected genes. However, a few candidates belonging to the following classes would be lost: (1) membrane-associated proteins erroneously predicted as cytoplasmic; (2) relatively abundant membrane proteins with low RNA levels (protein concentration does not always correlate with RNA expression); (3) proteins poorly expressed when bacteria are grown in liquid culture but up-regulated under in vivo simulating conditions. To rescue candidates belonging to classes (1) and (2), membrane protein identification is carried out by using proteomic technologies and newly identified membrane-associated proteins are added to the pool of candidates. Finally, DNA microarray technology is used to identify new in vivo up-regulated antigens belonging to class (3)
G. Grandi, Genomics, Proteomics and Vaccins