Sunteți pe pagina 1din 39

Curs- C10

APLICAREA GENOMICII IN STUDIUL ONCOGENEZEI SI IN CLASIFICAREA TUMORILOR NEOPLAZICE

CUPRINSULCURSULUI
ONCOGENEZA
MODIFICARI FIZIOPATOLOGICE GENE IMPLICATE IN ONCOGENEZA

SEMNALIZAREA INTRA SI INTERCELULARA MODIFICATA

PATOLOGIC MODIFICARI EPIGENETICE IN NEOPLAZII CLASIFICAREA TUMORILOR MALIGNE


CLASIFICAREA CLASICA A TUMORILOR STADIALIZAREA CLINICA CLASICA

UTILIZAREA GENOMICII IN CLASIFICAREA SI

STADIALIZAREA TUMORILOR MALIGNE

ONCOGENEZA
GENOMICAC10

MODIFICARI FIZIOPATOLOGICE
Bolile neoplazice reprezinta un grup de afectiuni a caror caracteristici esentiale sunt:
cresterea celulara anormala invazia la distanta fata de tesutul tinta.

Leziunea primara este la nivel genic dar modificarile epigenetice sunt aproape intotdeauna

prezente. Dupa Rudon principalele modificari genice sunt urmatoarele:

1. 2. 3. 4. 5.

6. 7. 8.

exprimarea in exces a proteinelor oncogene datorita translocarii, amplificarii sau mutatiile cromozomiale. pierderea proteinelor de supresie a tumorilor produsi de gene datorita deletiilor sau mutatiilor. alterarea pattern-ului de metilare a ADN-ului. erori de imprinting genetic care duc la supraproductia de substante de crestere (IGF-2 = insulin growing factor 2). cresterea sau reglarea la un nivel crescut a factorilor de crestere (eg TGF- =transforming growth factor- ), factori tumorali de angiogeneza, PDGF= platelet-derived growth factor, factori de crestere hematopoetica (eg, CSFs= colony stimulating factor, interleukine). instabilitatea genomica care duce la pierderea progresiva a reglarii proliferarii celulare, cresterea invazivitatii, si cresterea potentialului metastatic. nivele mari de enzime implicate in sinteza acizilor nucleici si nivele ridicate de enzime litice (eg, proteaze, colagenaze, glicozidaze). exprimarea in exces a genelor de oncodezvoltare de tipul antigenelor oncofetale (eg, antigen carcinoembrionic), hormoni placentari (eg, human chorionic gonadotropin).

REPARAREA ADN
PROCESUL NORMAL DE REPARARE A ADN-ul Structura ADN-ul este din cand in cand modificata de diferiti factori exogeni (carcinogeni chimici, lumina UV, etc) sau endogeni (reactii de tip oxidativ, deaminarea citozinei, etc). In aceste momente intervin mecanismele de reparare a ADN-ului care realizeaza: (1) Indepartarea dimerilor de pirimidina indusi de radiatii UV (2) Excizia zonei in care s-a produs o ruptura a lantului si refacerea lungimii secventei normale (3) Repararea exciziei bazelor care a dus la formarea unor locusuri apurinice sau apirimidinice (4) Repararea prin excizie a nucleotidelor (5) Recunoasterea si indepartarea fragmentelor alchil de dimensiuni mici (alkyl adducts) din lantul de AND cu ajutorul unei enzime (O6-alkilguanine-ADN alkiltransferaza)

PUNCTE DE CONTROL ALE CRESTERII CELULARE


o celula normala care a suferit o alterare a ADNului normal datorata radiatiei ultraviolete (UV) sau radiatiei X, este blocata in G1 astfel incat leziunea ADN sa fie reparata inaintea replicarii celulare. Un alt punct de control (checkpoint) este in faza G2 si acesta permite repararea rupturilor cromozomiale (chromosome breaks) inainte ca cromozomii sa fie segregati in mitoza. Celulele canceroase, care au putine sau nu au de loc puncte de control, continua sa isi replice ADN-ul modificat; in acest mod mutatiile persista si se acumuleaza progresiv. http://www.cancerquest.org/images/FLV/fullDo cumentary/English/fullDocInterfaceEng.swf http://www.hhmi.org/coolscience/resources/SP T--FullRecord.php?ResourceId=37

REPARAREA ADN ROLUL p53


In celulele normale, nivelul proteinei p53 este mentinut scazut prin legare de alte proteine (MDM2, COP1, PIRH2 sau JNK) care promoveaza degradarea p53 pe calea ubiquitin/proteazomilor . Cele mai multe gene ale acestei cai sunt reglate de p53, formand o bucla de feedback negativa. Dupa un stres genotoxic sau non-genotoxic, activarea p53 se produce in doua etape: initial nivelul proteinei p53 creste prin inhibarea interactiuni ei cu mdm2 si alti reglatori negativi. Supra-translatia ARN-ului pentru p53 va asigura apoi acumularea p53. In al doilea rand, o serie de modulatori (kinaze, acetilaze) activeaza activitatea transcriptionala a p53. Multiple proteine se leaga de diferite regiuni ale p53 pentru a-i regla activitatea. Micsorarea semnalului include un numar mare de gene care sunt activate de proprietatile de transactivare a p53. Aceasta se petrece prin legarea specifica de DNA a proteinei p53 de un element de raspuns (p53 RE) care se gaseste fie in regiunea promoter sau in intronii genelor tinta Indiferent de tipul de stres, rezultatul final al activarii p53 este fie blocarea ciclului celulei si repararea DNA, fie apoptoza; nu se stie inca in ce mod se alege una sau alta din aceste cai.

Calea p53 a fost impartita in mod conventional de Levine in 5 componente: Semnalul stresor care activeaza calea Mediatorii upstream care detecteaza si interpreteaza semnalele upstream Reglarea p53 prin interactiunile ei cu diferite proteine care ii moduleaza stabilitatea Evenimentele downstream, in special activarea transcriptiei si interactiunile proteina-proteina Rezultatul final: blocarea cresterii, apoptoza sau repararea ADN.

TELOMERI

Celulele umane normale parcurg un numar finit de diviziuni celulare in culturi si, in final, nu se mai divid, fenomen numit senescenta replicativa. Numarul de diviziuni celulare atins inainte de senescenta este de aproximativ 50. O diferenta intre celulele tinere care se replica si cele senescente este lungimea cozilor/capetelor/ tails specializate ale capetelor cromozomilor, numite telomere. Telomerele sunt alcatuite in medie din 5,000 -15,000 de perechi de baze repetate ce contin secventa (TTAGGG)n impreuna cu proteinele care leaga telomerul. Celulele tinere au telomere mai lungi. In timpul fiecarei diviziuni, 50-100 de perechi de baze sunt pierdute si se emite un semnal celular de oprire a diviziunii. Celulele mentin lungimea telomerelor prin activitatea unui complex enzimatic complex numit telomeraza. Aceasta este un complex ribonucleoproteic care contine mai multe proteine si ARN. Componentul catalitic al acestui complex este o reverse transcriptaza, hTERT, care foloseste ARN-ul continut in complex ca pe o matrice pentru reverse transcriptie pentru a replica secventele de ADN din telomere. Celule germinale si celulele pluripotente au activitate telomerazica; telomeraza isi inceteaza activitatea in celulele din majoritatea tesuturilor, pe masura ce acestea se diferentiaza. Cele mai multe cancere umane par a fi capabile sa reactiveze activitatea telomerazica, reluandu-si capacitatea proliferativa; totusi 10%-15% din cancere nu exprima telomeraza si, aparent, mentin lungimea telomerului printr-un mecanism diferit.

http://www.youtube.com/ watch?v=AJNoTmWsE0s

MODIFICARI FENOTIPICE IN ONCOGENEZA


(Stephen J. McPhee si Garry D Hammer):
1. instabilitatea genomica: alterarea repararii ADN-ului, controlul aberant al punctelor de control ale ciclului celular 2. cresterea proliferarii: crestere autonoma, anomalii ale controlului ciclului celular, raspunsul exagerat la factorii de stimulare a cresterii sau a celor hormonali, lipsa de raspuns la factorii de contact sau inhibitori sau la factorii de inhibare a cresterii 3. evitarea raspunsului imun: modulare sau mascare antigenica, sinteza de molecule antagoniste raspunsului imun 4. invazia tisulara si a stromei: atasare de matricea extracelulara, secretia de enzime proteolitice, recrutarea de celule mezenhimale care sa secrete enzime proteolitice, pierderea adezinii celulare 5. dobadirea capacitatii de a trece in sange si sistemul limfatic: cresterea motilitatii celulare, recunoasterea secventelor proteinelor endoteliale, modificari ale citoscheletului 6. formare de metastaze: adeziune celulara si atasare celulara, tropism specific de tesut 7. abilitatea de neoformare vasculara pentru sustinerea cresterii tumorii primitive si a celor secundare 8. rezistenta la medicatie: metabolism alterat al medicamentelor, inactivarea medicamentelor, cresterea sintezei enzimelor tinta, cresterea efluxului de medicamente. Modificarea procesului de reparare a ADN-ului

INSTABILITATEA GENOMICA

Instabilitatea genomica este generata de pierderea controlului normal asupra activitatii genelor, ducand la pierderea controlului asupra ciclului celular si la proliferare aberanta. In mod normal proliferarea este programata prin modul de exprimare a genelor in diferite momente ale ciclului celular si reglata de 3 categorii de factori:
factorii de crestere, factorii de inhibitie a cresterii

hormoni.

Proliferarea celulara necesita prezenta unor anume proteine intr-o succesiune si interrelatie definita pentru a permite cresterea, diferentierea, apoptoza, altfel spus pentru a parcurge intregul ciclu celular in conformitate cu programarea initiala si cu mediul in care se gaseste celula. Controlul genetic se realizeaza prin factorii de transcriptie, proteine care se leaga de multiplele locuri de legare situate in genomul normal: unele situate inaintea situsului de unde incepe transcrierea, continand structuri de legare a ARN-polimerazei (promotorii) altii situate la distanta variate (uneori la mare distanta) de gena tinta a transcrierii (amplificatorii = enhancers). Exista factori de transcriere universali, care se leaga specific de un enhancer in toate celulele din organism si factori de transcriere cu specificitate de actiune celulara, care actioneaza doar in anumite tipuri particulare de celule.

GENE IMPLICATE IN ONCOGENEZA


Genele implicate in oncogeneza se numesc:
tumor supressor genes = gene care confera un avantaj competitiv de crestere a celulelor

neoplazice printr-o alterare care duce la pierderea unor functii normale a celulei protoncogene = gene care confera un avantaj competitiv prin castigarea unei functii inexistenta in celula de provenienta.
In absenta fenomenului de imprinting, in cazul tumor supressor genes ambele alele trebuie sa

prezinte modificarea, in timp ce pentru oncogene mutatia este de obicei la nivelul unei singure alele.
Protooncogenele pot fi activate prin: mutatii amplificare genica sau supra- exprimare translocare cromozomiala insertia unui material viral in genom

Tumor supressor genes pot fi inactivate prin: frame-shift mutation deletia unei parti sau a totalitatii genei prin silencing-ul genei secundar metilarii

COMPARARE INTRE ONCOGENE SI GENELE SUPRESOARE


Din perspectiva descoperirii unui tratament eficient, care sa restabileasca starea

fiziologica initiala, oncogenele trebuie inactivate si tumour supressor genes activate prin interventia terapeutica

TUMOR SUPRESSOR GENES


Tumor supressor genes pot fi inactivate prin:
frame-shift mutation, deletia unei parti sau a totalitatii genei, prin silencing-ul genei prin metilare. p53 are rol in reglarea ciclului celular:

Exemple de tumor supressor genes :

Gena care codifica p53 permite recunosterea ADN-ului modificat si apoi declanseaza activarea mecanismului de moartea programata a celulei (apoptoza). In absenta acestei functionalitati, celula cu ADN modificat se poate inmulti teoretic la infinit formand astfel linia celulara maligna. Mutatiile p53 apar in peste 50% din cancerele umane.
BRCA1 si 2 cu rol in repararea ADN dublu catenar (DNA ds-break repair). Mutatii ale lor

sunt responsabile de majoritatea cancerelor de san familiale (5-10% din cancere la san) si ovariene familiale (8% din totalul cancerelor ovariene). Transmiterea este autosomal dominanta.
prostata sau pentru cel de vezica biliara, de 4 pentru cancerul pancreatic si un RR de 3 pentru melanomul malign si cancerul de stomac.

BRCA2 se asociaza cu un RR intre 50 si 100 pentru cancerul la san la barbati, de 5 pentru cancerul de

GENA p53

Gena pentru P53 este localizata pe cromozomul 17 (bratul scurt, 17p13), o regiune care sufera frecvent deletii in cancer. Organizarea genei p53 umane: - 22 000 bp - 11 exoni (albastru ) codificand un ARN m de 2.2 Kb. Translatia incepe la exonul 2. Dimensiunile exonilor si intronilor sunt reprezentati in bp.

GENELE BRCA1 SI BRCA2


BRCA1 este situata pe cromozomul 17q21 iar BRCA2

pe cromozomul 13q12. Ele codifica proteine mari, cu 1,863 si respectiv 3,350 de amino acizi, continand fiecare din ele peste 20 de exoni. Elemente comune cu alte gene: domeniul BRCT al capatului C-terminal al BRCA1, un domeniu intalnit in peste 40 de alte gene si asociat raspunsului la alterarea/damage ADN-ului. Rol biologic: Un semnal al alterarii ADN Un efector al repararii ADN sau al punctelor de control ale diviziunii celulare Un reglator al proteinelor implicate in reparare (complexul BASC = BRCA1-associated genomesurveillance complex) prin reglare atat a transcriptiei cat si post translatie sau prin implicarea in remodelarea cromatinei site-urile ADN alterate care permite accesul proteinelor efectoare.

G1- Gap 1- celula creste S- faza de sinteza a ADN G2 Gap 2 celula se pregateste de diviziune M- mitoza (diviziunea celulara)

MODEL AL CASCADEI DE SEMNALE MEDIATE DE ATM SI ATR DUPA ALTERAREA ADN (A.Tutt si A. Ashworth)
ATM = gena mutata a bolii ataxie-teleangiectazie ATR = gena ataxie teleangiectazie si legata de Rad3 ATM si ATR au si roluri distincte si roluri care se suprapun. ATM regleaza raspunsul punctului de control G1-S prin cresterea activitatii p53, fie prin forsforilare directa, fie indirect prin fosforilarea reglatorului sau negativ , MDM2, sau a punctului de control a ciclului celular reprezentat de kinaze CHK1 Si CHK2. Acestea determina o crestere a transcriptiei inhibitorului p21 dependent de ciclin kinaza (CDK) si in final blocarea celulei. Fosforilarea CHK1 si CHK2 influenteaza punctul de control al fazei S. Aceasta e mediata prin Cdc25C fosfataza. Blocarea punctului de control G2M este mediata de activarea transcrierii de catre p53 a 14-3-37 si GADD45 sau via CHK1 si CHK2 kinazelor,care inhiba Cdc25 fosfataza (care ar activa complexului Cdc2-B1-ciclina). ATM si ATR fosforileaza si BRCA1 care are rol atat in repararea rupturilor lanturilor duble de ADN prin recombinare omologa si blocarea celulei in punctul de control G2-M, posibil prin stimularea GADD45. ATM fosforileaza NBS1 care este implicat in repararea DS8 (cand formeaza un complex cu MRE11 si RAD50) si ar putea fi implicata in controlul punctului de control al fazei S. ATM poate fosforila si c-BL-kinaza, care fosforileaza apoi RAD51 (un efector de reparare omolog), c-ABL si PKADN-dependenta se fosforileaza reciproc influentand interactiunea PK-AND cu proteinele de reparare DS8 implicate in jonctiunile terminale non omologe. (NHEJ).

IDENTIFICAREA IMPLICARII GENELOR BRCA


Epidemiologia observationala a cuantificat contributia factorilor genetici si predictia asupra felului in care acesti factori vor actiona separat sau impreuna in cresterea riscului. Modelarea genica (analiza de segregare) care presupune prefigurarea de scenarii despre posibilitatile de aparitie a bolii datorita unor combinatii ale genelor cunoscute sau ipotetice cu un risc, prevalenta si mod de mostenire cunoscut. Pattern-urile de cancere prezise sunt apoi comparate cu frecventa observata a bolii si in acest fel modelul cel mai bun este validat. Analiza de linkare: In urma Studiului Cancer and Steroid Hormone s-a definit initial modelul genetic autosomal dominant cu penetranta mare validat prin analiza de linkare si identificat ca BRCA 1 si 2 sunt gene predispozante la cancer la san cu penetrare mare. Analizele de segreagare ulterioare, mai complexe, au evidentiat si alte gene, favorizand modelul poligenic in care factori genetici multipli actioneaza independenti. Componentul poligenic al riscului este log normal distribuit, are o varianta care scade liniar cu varsta si se aplica similar purtatoarelor de mutatii BRCA si nepurtatoarelor. Aceste observatii sunt consistente cu observatiile ca excesul de cancer de san familial este distribuit in multe familii, fiecare cu un numar redus de cazuri mai degraba decat in putine familii cu multe cazuri. Studiile de linkaj sunt folosite pentru a mapa un locus al unei boli prin analiza cosegreagarii markerilor genomici cu un fenotip specific de boala utilizand probe ale mai multor membrii ale familiilor numeroase. Regiunea din genom din jurul markerilor linkati este integrata pentru posibilitatea de a contine gene cauzatoare (determinante) celor care poarta mutatia. Daca corelatia dintre o gena cu penetranta redusa si cancer este mica, status-ul mutatiei la familiile cu mutatia respectiva pozitiva ar putea fi insuficienta pentru a genera un semnal mutagen. Screeningul mutatiilor genelor candidate: deoarece frecventa mutatiilor de acelasi tip este redusa, doar studierea intregii secvente de codificare a genei la un numar foarte mare de cazuri si de controale a permis identificarea genelor implicate. Studiile de asociere genomica; pentru demonstarea unei asocieri statistice este necesara depasirea pragului de 5% de variatie a frecventei in cele doua populatii celulare comparate. Pentru a permite evitarea erorii de asociere, a fost necesar studiului comparativ a zeci de mii de probe. Posibilitatea maparii de mare densitate, la nivel de polimorfism nucleotidic unic (single nucleotid polimorphism) precum si a linkajului dezechilibrat (linkage dezechilibrium) a permis identificarea de asocieri semnificative.

GENELE BRCA1 SI BRCA2

In urma parcurgerii acestor etape s-au putut identifica 3 profile de risc:


alele rare cu penetranta mare (BRCA 1 si BRCA2), alele rare cu penetranta intermediara si

alele comuna cu penetranta joasa.

Genele BRCA 1 si 2 sunt gene la care pot apare multiple mutatii: unele mutatii au fost identificate in anumite populatii cu origine comuna ( de ex BRCA1185delAG, BRCA1 5382insC, and BRCA2 6174delT in populatia Askenaza si BRCA2999del5 la populatia islandeza. Totusi cele mai frecvente mutatii sunt foarte rare, aparand intro singura familie. Mutatiile sunt de tip mutatii non sense, deletii/mutatii ce modifica succesiunea citirii, si mutatii ce afecteaza situs-urile de splice sau deletii/duplicatii de exoni. Unele mutatii missense au acelasi efect de abrogare a functiei de reparare a catenelor ADN-ului dublu catenar. Fiind gene cu inalta penetranta, mutatiile la nivelul lor se asociaza cu un risc de cancer la san de 87% pentru BRCA 1 si 84% pentru BRCA2 in familii si de 65% si respectiv 45% in populatia generala. Patternul de distributie pe grupe de varsta a BRCA2 este asemanator cu cel al populatiei generale, doar incidenta este mai ridicata; mutatiile BRCA 1 confera un risc mult mai mare pentru varste sub 40 de ani, riscul fiind asemanator pentru femeile peste 40 ani. Analiza de linkaj arata ca mutatiile BRCA 1 si BRCA 2 sunt responsabile pentru aparitia bolii in proportie de 2/3 la familiile numeroase cu un cancer la san site specific (> de 4 cazuri), dar aceasta cifra (2/3) scade mult in focarele familiale mici. Mutatiile BRCA 1 confera un risc mai mare de cancer ovarian, in special la femeile sub 50 de ani, dar Mutatii care au loc la regiunea centrala a genei se asociaza mai des fenotipic cu asocierea cancer de san/cancer de ovar decat mutatiile in portiunile 5 sau 3. Riscul relativ de cancer de san este crescut de mutatiile ambelor gene, in special de cea a BRCA2, asociere mai bine exprimata in grupa de varsta < 65 de ani.

PROTO-ONCOGENELE
Sunt gene ce confera un avantaj competitiv de crestere a celulelor neoplazice printr-un mecanism de castigare de functii suplimentare O gena non latenta (non quiescent) care in mod normal promoveaza cresterea celulara poate fi dizlocata in timpul translocarii cromozomiale langa un enhancer; in acest fel ea poate deveni activa (in mod patologic, deoarece rolul ei era sa fie inactiva); in acest fel controlul cresterii celulare este pierdut.

Exemple: mutatii ale factorul de crestere: EGFR/HER1 apar in gliobalstom, cancer pulmonar sau de san;

fenomenul de amplificare genica a HER2/Neu in cancerul de san, ovarian sau gastric. Receptorul factorului de crestere epidermic (EGFR) in colaborare cu omologul lui HER1 semnalizeaza caile proliferative si respectiv pe cele apoptotice. Activarea lor in exces duce la alterarea cresterii celulare, cu favorizarea proliferarii in detrimentul apoptozei.

Oncogenele pot apare si prin insertia unui material viral in genom:

virusul HLTV 1 pentru leucemiile cu celule T sau limfoame, a virusului hepatitei B pentru carcinomul hepatocelular sau HPV pentru cancerul de col uterin. In cazul retrovirusurilor (virusuri ARN), o oncogena este transferata celulei gazda dupa ce a suferit o modificare: de

exemplu in timpul transferului genei src (virusul sarcomului Rous) care codifica protein tirozin kinaza, se pierd secventele 3 ale genei si rezultatul este cel al unei proteine a carei sinteza celulara nu mai este controlata strict, devenind foarte activa si favorizand multiplicarea celulara necontrolata. Virusurile ADN pot contine oncogene care sintetizeaza proteine ce inactiveaza semnalizatorii reglatori negativi ai celulei, cum ar fi p53 sau Rb.

SEMNALIZAREA INTRA SI INTERCELULARA MODIFICATA PATOLOGIC


Genomica C10

NOTIUNI GENERALE
Cele mai multe mecanisme fiziopatologice in oncogeneza presupun modificarea la un anumit nivel a

cailor de semnalizare intracelulara. In mod normal, semnalizarea intra celulara este un proces generat de variate influente externe:

factori de crestere proteine din matricea extracelulara hormoni citokine factori care influenteaza mobilitatea factori care influenteaza adeziunea celulara.

In principiu activarea unui receptor:

Nu genereaza un singur efect biologic, ci o cascada de evenimente celulare cu exprimari fenotipice

diferite. Aceste fenomene distincte sunt reglate in interiorul celulei de un adaptor de cele mai multe ori o proteina cu multe domenii de interrelatie cu alte proteine dar si cu structuri lipidice. In celule diferite, acelasi ligand poate avea efecte diferite. Un semnal al unei cai metabolice poate afecta rezultatul unei alte cai metabolice, fenomen descris ca cross talk. Activarea unui receptor duce la activarea simultana a cailor de inactivare a cailor activate, dupa o anumita perioada de la semnalul initial.

RECEPTORII TIROZINKINAZEI (RTK)


includ 90 de membrii, dintre care cei mai bine caracterizati sunt receptorii

pentru:

factorul de crestere derivat din plachete (platlet derivated growth factor =

Structura generala a RTK include 3 componente:

PDGF), factorul de crestere epidermic (epidermal growth factor = EGF) efrina (ephrin) factorului de crestere hepatocitar factorului de crestere pentru fibroblasti (FGF) insulina.

un lant polipeptidic extracelular (monomeric pentru cei mai multi), o structura hidrofoba transmembranara o portiune citoplasmatica ce contine atat domeniul kinazic (un set distinct de

residuuri de tirozina) cat si alte secvente care regleaza reciclarea si/sau turnover-ul receptorului si interactiunea cu moleculele semnalizatoare.

CALEA RECEPTORULUI FOSFOKINAZEI


In general, activarea lui presupune dimerizarea portiunii extracitoplasmatice juxtapunerea a doua domenii catalitice transfosforilarea reziduurilor tirozinei din bucla de activare a domeniului kinazic (autofosforilarea) + altor zone din domeniul intracelular. Fosforilarea initiaza modificari conformationale care favorizeaza legarea ATP de receptor si substrat; fosfotirozinele folosesc ca situsuri de legare pentru alte proteine implicate in semnalarea RTK mediata. Reziduurile fosforilate ale portiunii tirozinei citosolice a receptorului activat interactioneaza cu proteine adaptor ce contin grupari SH2 si situsuri de legare proteica. Aceste proteine cupleaza RTK activati cu alte componente ale caii de semnalizare dar nu au ele insele proprietati de semnal. De ex. GRB2 (o proteina citoplasmatica) este un astfel de adaptor. Este o proteina care contine doua domenii SH2. Legarea ei de reziduul tirozinic specific este urmata de legarea si activarea Sos, proteina ce functioneaza ca o proteina schimbatoare de guanin nucleotid, convertind RAS intr-o forma activa. RAS (o familie de 3 proteine H-, N-, and KRas cu rol in mentinerea integritatii citoscheletului actinic, proliferare, diferentiere, adeziune celulara, apoptoza si migrare celulara) este legata de ADP in forma inactiva si devina activa sub actiunea unui factor de schimb guanin nucleotid; forma activa se transforma in cea inactiva prin hidroliza GTP. Recrutarea si fosforilarea proteinei adaptor Shc, impreuna cu legarea subiacenta a Grb2/Sos, permite caii Ras/MAPK sa devina activa. MAPK fosforileaza multe proteine, inclusiv factori de transcriere

ACTIVAREA RAS
RAS activata stimuleaza mai multe cai de semnalizare:
Recruteaza serine/threonine kinaza Raf din membrana citoplasmatica, care apoi, tot prin fosfolirare, va

activa MEK 1 si 2, kinaze care fosforileaza specific reziduurile threonina si tyrosina ale MAP kinazei, activandu-le capacitatea catalitica (ERK este un alt acronim pentru MAP.) MEK se leaga de domeniul C-terminal catalitic al Raf si este forsforilat de Raf serine/ threonine kinaza; aceasta fosforilare declanseaza activitatea catalitica a MEK. In acest fel, activarea Ras induce o cascade kinazica ce include Raf, MEK, si MAP kinaza. O alta importanta clasa recrutata este clasa IA PI 3-K, care se asociaza direct cu receptorul prin intermediul domeniului SH2; cele 3 clase de IA PI 3-K sunt implicate in sinteza celulara, declansarea ciclului celular, supravietuirea celulara, proliferare, metabolism, autofagie, geneza ribozomala, translatia ARNm. Alte semnale efectoare mai selective pentru RTKs cum sunt PDGFr includ fosfolipaza Cg, protein adaptor Nck, si tirozin fosfataza Shp2, ca si reglatorii negativi Ras-GAP si Cbl.
In functie de tipul celular malign, RAS prezinta mutatii in 40-90% din neoplazii: frecventa cea mai

mare de mutatii se intalneste in cancerele pancreatice (90%). Proteinele mutante din neoplazii permit legarea guanin nucleotidului de RAS dar nu si hidroliza acestuia, determinand in consecinta o stare de continua activare care duce la transformarea neoplazica prin proliferare celulara in absenta stimulului generat de factorii de crestere. In unele forme de cancere au fost identificati RTKs asociati cu forme mutante de receptori pentru factorii de crestere care trimit un semnal de proliferare la celule in absenta factorului de crestere. Un astfel de mutant, codificat intr-un nou locus, contribuie la proliferarea necontrolata a unor cancere la san.

MODIFICARI EPIGENETICE
GENOMICAC10

NOTIUNI GENERALE

Loci genetic activi sunt eucromatine, in timp ce heterocromatina (compacta) e inactiva. DNA are o lungime de 1.8 m si este comprimat la scara 1:400000 in nucleu. Cromatina este organizata in nucleosomi de catre histone. Fiecare nucleosom, contine un octamer de histone inconjurate de ADN. Un nucleozom, impreuna cu

legaturile lui, impacheteaza 200 de perechi de baze (66 nm). Nucleosomii sunt infasurati prin rasucire in cromatina, ca o funie cu grosimea de 30 nm. Pentru ca informatia genetica sa poata fi copiata, zona de cromatina trebuie sa fie spatiata (relaxed). Modificarile conformationale pot duce la modificari ale promotorilor, enhacerilor sau la modificari de exprimare a unor gene. http://www.youtube.com/watch?v=bwVjYxcDQ5I

MODIFICRI EPIGENETICE
Metilarea ADN Deacetilarea histonelor Imprinting Metilarea DNA la nivelul cytosinei in insulele CpG este un alt mecanism de reglare a expresiei genice. In general,dar nu in mod obligatoriu, secventele hipermetilate ale ADN-ul sunt mai putin exprimate iar secventele hipometilate sunt mai bine exprimate. Insulele CpG sunt secvente scurte bogate in dinucleotide CpG si se gasesc in zonele reglatoare 5din aproximativ jumatate din genele umane. Alterarea in patternul de metilare a ADN a fost observata in liniile celulare tumorale, pe modele de tumori la animale, si in cancerele umane. Hipermetilarea ADN duce la pierderea functiei genelor implicate in supresia tumorilor. Hipermetilarea secventelor de reglare a unor gene cum ar fi p53, p15, p16, E-cadherin, vhl, and hmlh1, a fost observata in cancere, dar nu este sigur ca acesta este singura cauza a tacerii (silencing ) genelor supresoare tumorale. Secvente CpG metilate aberant au fost detectate in ser si in tesuturile pacientilor cu cancer colorectal, pulmonar, hepatic si de prostata.

Insulele CpG = regiuni ADN cu minimum 200 bp si cu o proportie CG > 50% si cu un raport CpG observat/asteptat > 60%. unde raportul CpG observat/asteptat este egal cu: Nr. de CpG__ Nr. total de nucleotide din secventa Nr de C Nr de G CpG reprezinta citozina guanina legate prin punti fosfo-diesterice (legaturi covalente) care mentin bazele strans legate. Se gasesc intr-o proportie mare in 70% din regiunile promoter

MODIFICARI EPIGENETICE ACETILAREA HISTONELOR


http://www.teachersdomain.org/asset/biot09_vid_epigenetics/ http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/control/

Acetilarea-dezacetilare histonelor: In conformatiile in care histonele impacheteaza strans ADN-ul,

ADN transcriptia in mRNA) este inhibata. Initierea transcriptiei genelor necesita o desfasurare partiala a miezului octameric, care este reglat de modificari biochimice ale histonelor centrale.

gene implicate in acetilarea/ deacetilarea histonelor :


2 categorii de gene asociate acetilarii: hat1 and hat2. De ex. Acetilarea histone H4 reduce afinitatea cozii

aminoterminale a ADN si permite o reducere a infasurarii ADN-ului in jurul octamerului format de histone. In acest fel scade densitatea impachetarii nucleozomului. Aceasta face ca mai multe secvente ale ADN sa fie disponibile pentru transcriptie. Deacetilarea histonei H4 de catre deacetilaza (HDAC1 and HDAC2), pe de alta parte, creste afinitatea H4 pentru DNA si duce la o mai stransa infasurare a nucleozomilor si o reducere a transcriptiei. Membrii ai familiilor de gene HDAC1 and HDAC2 apartin unei retele de gene reglate in mod coordonat, gene care sunt implicate in remodelarea cromatinei in timpul diferentierii celulare.
Unele evenimente de amutire a genelor necesita atat deacetilare cat si metilarea ADN

PIERDEREA IMPRINTING-ului GENOMIC


In mod normal, Genomic imprinting este o modificare epigenetica a genomului care permite sa fie

exprimata numai o singura alela (fie doar cea materna, fie doar cea paterna).

Pana in prezent sunt aproximativ 30 de gene de mamifere care pot suferi fenomenul de imprinting. Intr-un numar de cancere umane, apare pierderea imprinting-ului (LOI), care permite exprimarea

ambelor alele (si a celei materne si a celei paterne). Daca acest fenomen apare pentru un factor de crestere, cum ar fi insulin-like growth factor-2 (IGF-2), celule dobandesc o doza dubla de semnal de stimulare a cresterii. LOI al IGF-2 a fost observat in aproximativ 45% din pacientii cu cancer colorectal. Este de remarcat faptul ca acest LOI a putut fi detectat si in leucocitele circulante ale acestor pacienti sugerand ca este o alterare care precede inceputul neoplaziei si ca ar putea fi folosita ca un test de screening al susceptibilitatii pentru cancer. metiltransferazelor ADN-ului, cum este 5-aza-2-deoxycytidine, sugerand ca LOI este idus de un eveniment de metilare a ADN-ului aberant. LOI al genei igf2 pare sa fie implicata in progresia tumorii, ducand la un fenotip mai invaziv.

In mod paradoxal, LOI este reversibil prin efectul unor medicamente care sunt inhibitori ai

CLASIFICAREA TUMORILOR MALIGNE


Genomica C10

CLASIFICAREA CLASICA A TUMORILOR


Tumorile se clasifica in: tumori benigne tumori maligne. Caracterele de benignitate sunt date de: asemanarea morfologica cu celulele normale ale tesutului respectiv, lipsa de mitoze aberante si modificari cromozomiale lipsa de metastazare si existenta chiar a unei capsule care o delimiteaza foarte bine (element care nu e insa obligatoriu).

Practic o tumora benigna este un tesut normal care si-a pierdut capacitatea de reglare a proliferarii, se reproduce in exces, dar este compus in continuare din celule normale. Complicati majora a tumorilor benigne este fenomenul de compresie pe care il exercita asupra structurilor din proximitatea lor. Histologic, tumorile benigne sunt compuse din celule asemanatoare cu celulele mature ale tesutului respectiv Cu cat apar modificari fata de celulele normale cu atat celula ce compune tumora maligna este mai agresiva; de aceea se vorbeste de grade de malignitate. Intreagul efort de clasificare al tumorilor are ca scop stabilirea locului tumorii respective pe scara dintre benign si malign.

TUMORILE MALIGNE
Histologic, tumorile maligne sunt compuse din celule: care pastreaza doar in mica masura structura si functiilor tesutului de provenienta (cu cat sunt mai apropiate de celule mature cu atat gadul lor de malignitate este mai redus), se divid mult mai repede (un raport intre nucleu si citoplasma in favoarea nucleului), prezinta nucloli vizibili la microscopul optic, ca marker al multiplelor mitoze, prezinta relativ putine structuri de celula matura. dau metastaze la distanta; uneori, chiar si pe sectiunile histologice clasice se constata ruperea membranelor bazale sau extravazarea lor ca prim pas spre metastazare. Pe baza originii embriologice primitive ( in stadiile initiale ale dezvoltarii embrionului, se

disting trei straturi: ectodermul, mezodermul si endodermul) tumorile se clasifica in:


Carcinoame: Neoplaziile dezvoltate din celule ce apartin ectodermul si endodermul Sarcoame: Neoplazii dezvoltate din celule derivate din mezoderm. Malignitatile celulelor sanguine desi ar trebui sa apartina sarcoamelor, sunt clasificate separat in

malignitati ale sangelui (leucemii si limfoame).

Dupa gradul de invazivitate: Carcinoamele se impart in:


carcinoame in situ (nu depasesc membrana bazala a tesutului respectiv) carcinom invaziv depasesc membrana bazala, dar nu sunt leziuni la distanta si carcinom metastazat exista tumori secundare.

Sarcoamele sunt claisficate dupa polimorfismul nuclear si rata mitotica (care determina gravitatea

leziunii: un grad mai mare este corelat cu o tendinta mai mare la invazie la distanta).

STADIALIZAREA CLINICA CLASICA


Stadializarea tumorilor presupune:
Stabilirea sediului leziunii primare Stabilirea dimensiunii si a numarului

tumorilor Stabilirea afectarii sau nu a ganglionilor limfatici Stabilire tipului celular si a gradului de diferentiere fata de celula normala Prezenta sau absenta metastazelor

Cel mai important element este gradul de diferentiere histologica a celulei neoplazice, impreuna cu consecintele ce decug de aici: exprimarea sau nu a unor receptori de suprafata, a unor proprietati imunologice, a formarii unor proteine. Metodele clasice de histologie au fost suplimentate cu metode de imunohistochimie, determinari de receptori, etc.

Tumora primara (T) TX - Tumora primitiva nu poate fi stabilita T0 - Nu exista o tumora primara evidentiata Tis - Carcinom in situ (CIS) T1, T2, T3, T4 - Dimensiunea si/sau extensia tumorii primitive Ganglioni limfatici regionali (N) NX - Ganglionii limgatici regionali nu pot fi evaluati N0 - Nu exista ganglioni regionali invadati N1, N2, N3 - Invadarea ganglionilor regionali (in functie de numarul statiilor ganglionare si /sau a extensiei) Metastaze la distanta (M) MX - Metastazele la distanta nu pot fi evaluate M0 - Nu exista metastazele la distanta M1 - Exista metastaze la distanta

UTILIZAREA GENOMICII IN CLASIFICAREA SI STADIALIZAREA TUMORILOR MALIGNE


Identificarea unor mutatii, cum este cea de tip BRCA1 sau 2. Pe baza ei, se pot subclasifica mai

departe tumorile in tumori fenotipic diferite: invazive, cu un triplu fenotip negativ:

De exemplu, tumorile BRCA1 sunt in mod tipic carcinoame ductale de grad inalt de malignitate,
nu se coloreaza pentru ER (receptor estrogenic), Nu se coloreaza pentru PR (receptor progesteronic), si Si nu se coloreaza nici pentru HER2 (ERBB2) (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) Aceste tumori se coloreaza pozitiv pentru un subset de keratine bazale exprimate in mod normal in

mioepiteliul normal al sanului.

In functie de profilului genomic al celulei maligne se pot face predictii adecvate privind evolutia si prognosticul. malign.

Inclusiv modul de selectie al tratamentelor s-a modificat prin contributia adusa de analiza genomului

CONTRIBUTII SPECIFICE GENOMICII IN ONCOLOGIE


Genomica C10

TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARA UTILIZATE IN ONCOLOGIE

Modificarile mari de aranjare a unor gene cunoscute a fi modificate in boala respectiva ex (LMC)

ADN analiza citogenetica prin hibridizarea in situ cu fluoresceina: analiza citogenetica a cromozomilor in metafaza in cazul in care alterarea genetica este suficient de mare (cum ar fi o deletie importanta)

Analiza ADN prin electroforeza si Southern blotting pentru analiza citogenetica detecteaza

modificari mai mici in structura genelor, pe care studiile de cariotip nu le detecteaza.

Polymerase chain reaction (PCR) poate detecta alterari in structura ADN cu o foarte mare

sensibilitate. O particularizare a acestei tehnici este si tehnica de secventiere prin chip-uri (chip sequencing technique) utilizata in localizarea, izolarea si identificarea secventelor de ADN ocupate de proteine celulare de legare a ADN-ul in mod specific.
Aceste site-uri de legare pot indica functii ale unor variati reglatori ai transcriptiei si ajuta la identificarea

genelor lor tinta in timpul dezvoltarii si evolutiei bolii. Tipurile de elemente functionale identificate in acest mod includ promotori, amplificatori, represori si factori silencing, izolatori (insulators), elemente de legatura si secvente care controleaza replicarea ADN.

PROFILLING TUMOURS

tehnica monitorizeaza patternul de expresie globala al genelor si a permis dezvoltarea taxonomiei moleculare a cancerului. Se bazeaza pe sondele de ADN colorate in 2 culori si evalueaza simultan mii de transcripti ai genelor si exprimarea lor relativa furnizand o imagine snapshot a transcriptomului

Transcriptom = intregul complement de transcripturi ARN produse la un anumit moment

Stabilirea profilului transcriptional prin utilizarea microsondelor implica screening-ul exprimarii mRNA din doua surse (tumora si celule normale), folosind cDNA complementar sau biblioteci (baze de date) de oligonucleotide aranjate intr-o extrem de mare densitate microchip-uri. Acestea sunt studiate cu o mixtura de cDNAs marcat fluorescent generat din probele provenite din tumora si din celulele normale, care duce la o colorare diferita a fiecarei gene (reprezentata in final printr-un punct). Intensitatea relativa a celor doua culori diferite reflecta nivel de exprimare a RNA a fiecarei gene din fiecare proba asa cum ar fi analizata cu un scanner laser focalizat. Utilizand microsonde, se pot monitoriza sistematic si individualizat gene care constituie marker de diagnostic, prognostic, sau relevanti terapeutic. Alternativ, intregul set de gene exprimate poate fi analizat colectiv prin utilizarea unor metode statistice pentru a clasifica tumorile pe baza profilului lor transcriptional. Tehnica microsondelor a permis explorarea modificarilor genetice care sunt asociate etiologiei si dezvoltarii cancerului si ofera noi instrumente pentru evaluarea diagnosticului si al prognosticului.

SAGE

Analiza seriata a exprimarii genice (SAGE= Serial analysis of gene expression) permite o evaluare simultana si comprehensiva a multiplelor specii mARN. Spre deosebire de analiza microarray, SAGE nu necesita cunoasterea anterioara a genelor de interes si furnizeaza date cantitative si calitative teoretic (potential) a tuturor secventelor transcrise intr-un tesut specific sau intr-o celula. Mai mult de cat atat, SAGE poate cuantifica transcripturi in cantitate mica (low-abundance transcripts) si poate sa detecteze in mod pertinent concentratii relativ mici ale diferentelor de concentratii de transcripti intre populatiile celulare. Metoda SAGE genereaza o secventa tag care functioneaza ca un unic identificator al transcrierii, derivat dintr-o locatie bine definita a transcriptului. Multe tinte ale transcrierii (transcript tags) sunt concatenate intr-o singura molecula si apoi secventiate, relevand identitate a multiple tinte simultan. Prezentarea relativa a fiecarui membru a unei baze de date (library) SAGE este proportionala cu corespondentul de abundenta a mRNA in populatia de transcriere originala. Profilele de expresie comparativa pot fi deduse prin compararea abundentei tintelor individuale din fiecare set de probe. Aceasta permite modificari in profilele de expresie globale a tesuturilor normale sau maligne in conditiile terapeutice diferite care trebuie rapid evaluate.

DEMETILAREA ADN
Metilarea ADN la nivelul citosinei din insulele CpG este un alt mecanism de reglare a exprimarii

genelor. In general, desi nu intotdeauna, secventele hipermetilate ale ADNA sunt mai putin exprimate, iar cele hipometilate mai exprimate.

Alterarea pattern-ului metilarii ADN a fost observata pe linii de celule tumorale, pe modele

tumoreale animale, si in cancerele umane (o scadere in medie de 8%-10% in continutul genomic de 5-methylcytosine in adenoamele si adenocarcinoamele de colon. Pacientii cu continutul cel mai mare de 5-methylcytosine in colonul lor normal par sa aibe o linie germinala predispozanta la cancer (sindromul Lynch).

Hipermetilarea ADN se presupune ca este implicata in pierderea functiei supresoare a tumorii. A fost

observata hipermetilarea secventelor reglatoare ale unor astfel de gene, incluzand genele p53, p15, p16, E-cadherin, vhl, si hmlh1. celule maligne umane.

Activitatea DNA metiltransferazei a fost exprimata in exces (overexpressed) intr-un numar de linii