STERILIZAREA SI DEZINFECTIA

• Sterilizarea – distrugerea sau indepartarea
tuturor microorganismelor, inclusiv a sporilor.

• Dezinfectia – distrugerea formelor

vegetative ale microorganismelor, dar nu in mod necesar si a sporilor.

STERILIZAREA
• Agenti fizici:
- Caldura - Frigul - Uscarea - Radiatiile - Ultrasunetele - Presiunea mecanica - Presiunea osmotica

DEZINFECTIA / ANTISEPSIA
• Agenti chimici:

- Substante chimice elementare - Compusi anorganici - Compusi organici

STERILIZAREA PRIN CALDURA
• Punctul termic mortal – cea mai scazuta
temperatura care distruge in 10 minute toate bacteriile unei specii in conditii standard (1 – 2 ml. suspensie bacteriana in concentratie de 50.000 UFC/ml., in tampon fosfat, pH = 7

STERILIZAREA PRIN CALDURA
• Timpul termic mortal – cel mai scurt

interval de timp necesar pentru ca toate bacteriile unei populatii microbiene sa fie distruse la o temperatura data

STERILIZAREA PRIN CALDURA
• Caldura umeda:
Autoclavarea Fierberea Tindalizarea Pasteurizarea

• Caldura uscata:
Cuptoare speciale cu aer cald (pupinele sau etuve) Aducerea la incandescenta Flambarea Incinerarea

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA AUTOCLAVAREA

• Caldura umeda distruge bacteriile mai

repede decat caldura uscata la aceeasi temperatura deoarece este mai penetranta. • Sterilizarea prin caldura umeda utilizeaza vaporii de apa sub presiune in autoclav. • 121 °C – 15 min. • 134 °C – 3 min.

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA AUTOCLAVAREA

• Bacteriile in forma vegetativa sunt distruse
la temperaturi cu 10 – 15 °C mai mari decat temperatura lor maxima de dezvoltare. • Majoritatea bacteriilor in forma vegetativa mor in timp de 10 minute la 50 – 60 °C.

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA AUTOCLAVAREA
• Majoritatea sporilor bacterieni sunt distrusi in 10 • • •
minute la 100 °C. Sporii de Clostridium botulinum pot rezista 8 ore la 100°C. Cel mai rezistent – sporul de Bacillus stearotermophilus, acesta necesita pentru distrugere 15 – 18 minute la 121°C si 40 minute la 115°C. Sporii de B. stearotermophilus – indicator in aprecierea eficientei sterilizarii prin caldura umeda.

materiale infecte). .Instrumentar medical . - halate etc. tampoane pentru recoltari prelevate.STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA • Ce se poate steriliza prin autoclavare? .) Solutii perfuzabile Materiale de laborator (medii de cultura. campuri operatorii.Material moale (pansamente.

. virusurile si fungii. dar rezista unii spori bacterieni.STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA FIERBEREA • Prin fierbere timp de 30 minute se distrug bacteriile in forma vegetativa.

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA TINDALIZAREA • Sterilizare fractionata prin mentinerea substantelor la temperaturi de maximum 100 °C timp de 30 – 60 minute succesiv timp de mai multe zile (3 – 8). timp in care eventualii spori prezenti in preparat vor trece in forma vegetativa si astfel vor fi distrusi la incalzirea ulterioara. In intervalele dintre incalziri recipientele se mentin la temperatura camerei. • .

85°C pe perioade de timp • • variabile este o metoda de conservare a unor produse alimentare. la 85°C .Joasa: 30 min. la 62 . In functie de temperatura se disting 3 tipuri de pasteurizare: .Inalta: 8 – 15 sec.65°C .Mijlocie: 40 – 45 sec. dar rezista sporii si enterovirusurile. la 71 – 74 °C .STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA PASTEURIZAREA • Prin incalziri la 62 . Sunt distruse formele vegetative ale bacteriilor si fungii.

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA CUPTOARE CU AER CALD (ETUVE) • Formele vegetative ale bacteriilor sunt distruse prin caldura uscata in 10 minute la 60 – 80 °C. • Sporii cei mai rezistenti de B. • 1 ora – 180 °C . stearotermophilus in 20 minute la 180 °C.

Unele instrumente medicale .Obiecte de portelan .Solutii neapoase .STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA CUPTOARE CU AER CALD (ETUVE) • Ce se poate steriliza prin caldura uscata? .Sticlarie de laborator .Substante sub forma de pulbere .

deoarece se pot degrada. ace).STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA ADUCEREA LA INCANDESCENTA • Se sterilizeaza ansa bacteriologica si spatula pentru folosire unica. . • Nu se indica utilizarea acestei metode pentru instrumente medicale (foarfeci. pense.

). partea efilata a pipetelor Pasteur etc. .STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA FLAMBAREA • Trecerea prin flacara timp de cateva secunde a obiectului de sterilizat (gura eprubetelor. flacoanelor.

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA INCINERAREA • Se foloseste pentru materialele infectate care nu se recupereaza: . .Animale de experiente .Pansamente .Deseuri biologice rezultate din laboratoarele de microbiologie etc.Siringi de unica folosinta .

carbonizare. .STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA • Mecanismul distrugerii bacteriilor prin caldura uscata consta in: .asfixie .accelerarea fenomenului de oxido – reducere .coagulare .

in general. . mai bine temperaturile scazute decat pe cele ridicate. • La temperaturi sub cea minima de crestere metabolismul si inmultirea bacteriilor inceteaza. majoritatea trecand in stare de latenta.FRIGUL • Bacteriile suporta.

+10 ° C majoritatea bacteriilor rezista luni si ani de zile cu conditia eviatarii uscarii.FRIGUL REFRIGERAREA • La +4 . • Unele bacterii care se intalnesc numai la om (meningococii. . gonococii) nu sunt rezistente si mor repede la temperaturi sub cea optima.

• Moartea bacteriilor se produce prin inghetarea apei de solvire cu formarea de pungi cu solutii hiperconcentrate care au efect toxic si/sau producerea de cristale de gheata.FRIGUL CONGELAREA • In general. . la 0°C efectul temperaturii este bactericid.

• Efectul bactericid este mai puternic prin repetarea operatiunilor de inghetare si dezghetare.FRIGUL CONGELAREA • La temperaturi mult sub 0°C. . de -30°C pana la .70°C nu se constata un efect bactericid deoarece la aceste temperaturi nu se formeaza pungi cu slotii hiperconcentrate sau cristale de gheata.

• Formele vegetative sunt mai sensibile. fiind distruse prin concentrarea sarurilor si denaturarea fizico – chimica a proteinelor. .USCAREA • Actiunea uscarii difera in functie de forma de viata a bacteriilor.

bacilii Gram (-) cu 20% lipide rezista doar 1 – 2 saptamani .pneumococul moare in cateva ore in conditii de uscaciune .micobacteriile care au in compozitia lor 40% • lipide rezista timp de 6 – 8 luni in praf.gonococul se distruge imediat. cu atat pierderea de apa se produce mai incet. Ex: . . .USCAREA • Pentru formele vegetative rezistenta la uscare depinde de continutul in lipide al invelisurilor celulare: cu cat cantitatea de lipide este mai mare.

metoda de uscare in stare de congelare sub vid. .USCAREA • Pentru conservarea bacteriilor in laborator se intrebuinteaza liofilizarea. • Prin liofilizare bacteriile pot supravietui timp indelungat chiar pastrate la temperatura camerei.

Lumina solara constituie factorul principal de reducere a florei microbiene a aerului. datorita continutului in U. Timpul de distrugere este variabil in functie de specia bacteriana: 1h pentru E. efect influentat de permeabilitatea atmosferei.RADIATIILE U.V.V. putin adanci. – LUMINA SOLARA • Lumina solara. .coli. 2 – 3 h pentru Salmonella typhi si 5 – 7 ore pentru Mycobacterium tuberculosis. de pe suprafata solului si in apele limpezi. are • • efect bactericid.

compusi care nu au actiune antibacteriana. absorbtie urmata de rupturi ale legaturilor chimice cu formarea de noi legaturi intre pirimidine si pe de alta parte indirect prin modificari ale mediului – producerea de ozon in aer si peroxizi in ape.V.RADIATIILE U. (240 – 280 nm.V.) distrug bacteriile pe de o parte direct prin absorbtia lor de catre acizii nucleici si proteinele bacteriene. • U. .

RADIATIILE U. cu lungimea de unda de 400 nm.V. In aceste conditii se activeaza o enzima care desface dimerii pirimidinici formati sub actiunea U. se folosesc pentru • • decontaminarea suprafetelor si a aerului in incaperi de policlinica si spital. Fotoreactivarea – fenomenul prin care bacteriile au fost “distruse” prin U.V. sunt reactivate prin expunere la lumina puternica.V. • In practica U. in Sali de operatie si laboratoare.V. .

• Radiatiile ionizante se folosesc indeosebi pentru sterilizarea produselor termolabile (ex. instrumentar medical din material plastic de unica folosinta).RADIATIILE RADIATIILE IONIZANTE • Radiatiiile X si gamma au efect bactericid prin ionizare cu formare de radicali de oxigen bactericizi. .

ULTRASUNETELE • Efectul bactericid se exercita datorita fenomenului de cavitatie prin activarea gazelor dizolvate in citoplasma. • In medicina ultrasunetele se folosesc la sterilizarea unor instrumente medicale. urmata de ruperea peretelui celular. .

PRESIUNEA MECANICA • Majoritatea bacteriilor in forma vegetativa rezista bine la 3. pierderea viabilitatii producandu-se dupa 14 ore la 6.000 – 20.. .000 atm.000 atm. necesitand pentru inactivare 12.000 atm. • Sporii bacterieni sunt mult mai rezistenti.

citoplasma se retracta impreuna cu membrana citoplasmatica care se desprinde de peretele bacterian. Hiperosmolaritatea se foloseste in conservarea alimentelor prin concentratii mari de sare sau de zahar. in mediu hipertonic se produce “uscarea osmotica” a bacteriilor prin trecerea in stare de latenta sau moartea lor. Apa iese din celula. • .PRESIUNEA OSMOTICA • La o presiune osmotica mai mare.

.PRESIUNEA OSMOTICA • In medii hipotone celula bacteriana se hidrateaza . devine turgescenta. se rup invelisurile obtinandu-se moartea celulei.

. Cu.DEZINFECTANTE • Substante chimice elementare: • Compusi anorganici: .metale grele: Ag.baze: NaOH .O2. HCl. bicromat de potasiu. .acizi: acid boric. clorura de Hg. sulfat de cupru .saruri: AgNO3. permanganat de potasiu.. H2SO4.. Hg.. acid salicilic. . H2.

Fenoli.DEZINFECTANTE • Compusi organici: .Aldehide .Coloranti . eteri . alcooli.Detergenti – anionici si cationici .

TEMA PENTRU STUDENTI • Continuati prezentarea Power Point cu detalii despre dezinfectante si antiseptice • Clasificarea lor • Mecanisme de actiune • Cateva notiuni despre fiecare dintre ele • Trimiteti pe mail la adresa: .

Sterilizarea .

cu radiatii ionizante.Sterilizarea -distrugerea tuturor microorganismelor patogene/nepatogene de pe o suprafata/din interiorul unor obiecte -se poate face prin: caldura .Dezinfectia -distrugerea UNOR microorganisme in special patogene -se face prin:caldura.substante chimice . prin filtrare 2.radiatii.DEFINITII 1. cu substante chimice .

cu actiune reversibila .Antisepsie -distrugerea/indepartarea temporara a formelor vegetative microbiene de pe substraturile vii(mucoase.bacteriostatica asupra microorganismelor .plagi)cu ajutorul antisepticelor 5. 4.3.Asepsia -ansamblul masurilor luate pentru prevenirea contaminarii unor materiale si organisme cu microorganisme.Antiseptic -substanta chimica netoxica pentru tesuturile vii.tegumente.

calitatile fizice si chimice ale materialului supus sterilizarii .sensibilitatea microorganismelor fata de actiunea unor factori de mediu externi 2.In alegerea metodelor folosite pentru sterilizare trebuie sa se tina cont de: 1.

sterilizare cu aer supraincalzit b.incalzire la incandescenta 2.Sterilizare prin caldura : a.uscata 1.umeda 1.sterilizare prin vapori sub presiune(autoclavare) .I.

dupa care se lasa sa se raceasca la temperatura camerei.180°C .Incalzirea la incandescenta -mentinerea obiectului in flacara pana devine rosu.1h Determina carbonizarea : -microorganismelor -formelor vegetative /spori Se aplica pentru obiecte din sticla/ portelan NU se aplica obiectelor cu parti metalice. -se aplica pentru ANSA BACTERIOLOGICA inainte si dupa fiecare folosire -microorganismele sunt carbonizate 2. a celor din cauciuc. lichide .in cuptorul Pasteur (sau Poupinel) .Sterilizarea cu aer supraincalzit Se realizeaza.Metode de sterilizare prin caldura uscata 1.

Cuptorul cu aer cald (Poupinel) .

.

.Controlul sterilizarii se urmareste prin: -controlul temperaturii interioare cu termonetrul -culoarea hirtiei / dopurilor din vata care trebuie sa fie galbuie.

120°C In autoclav se sterilizeaza : -medii de cultura -material infectios -obiecte de cauciuc -casete cu material chirurgical NU se sterilizeaza-lichide alterabile peste 100°C .3.p=1 atm.Autoclavarea -cea mai sigura metoda de sterilizare -formele vegetative si sporii sunt distrusi -h=30min.

Autoclave .

.

teste chimice . de topire a acestor substante. dupa deschiderea autoclavului se va observa ca sint solidificate in bloc.teste biologice -termometre Testele chimice: -se folosesc tuburi din sticla ce contin substante sub forma de pulbere cu punct de topire cunoscut in jur de 120°C (parachinona. Teste biologice: -se folosesc culturi sporulate de Bacillus anthracis cu care se impregneaza fire de bumbac -se introduc in tubusoare -daca s-a atins 120°C sporii sunt distrusi iar reinsamantarea lor pe medii de cultura nu va fi urmata de o dezvoltare a culturii de bacili carbunosi .Controlul sterilizarii in autoclav Se realizeaza prin:. acid benzoic) -se aseaza in autoclav odata cu obiectele de sterilizat -daca in autoclav s-a ajuns la temp. sulf.

II.este termostatat si poate ficonsiderat steril daca in 24-48 de ore nu se dezvolta nici o colonie)  .Filtrarea -metoda de sterilizare la rece -microorganismele sunt retinute de o substanta poroasa -este aplicata solutiilor denaturabile termic -dupa filtrare este obligatoriu controlul sterilitatii solutiei (filtratul este insamantat pe medii de cultura adecvate .

.

A typical set-up in a microbiology laboratory for filtration sterilization of medium components that would be denatured or changed by heats sterilization of medium components .

filtratul este steril . Controlul calitatii -insamantari din filtrat pe medii de cultura adecvate -daca in 3-4 zile de mentinere la termostat nu se dezvolta microorganisme.

Sterilizarea cu substante chimice      Substantele folosite pot fi: Glutaraldehida Peroxid de hidrogen stabilizat Acid peracetic Timpul de contact al substantei cu substratul tratat difera in functie de produs :vor trebui respectate recomandarile producatorului privitoare la conditiile de lucru atat pentru o sterilizare corecta cat si pentru evitgarea accidentelor .

Sterilizarea cu oxid de etilena –se foloseste numai cand nu exista alt mijloc de sterilizare adecvat  -metoda este delicata iar erorile de procedura pot sa conduca fie la o sterilizare ineficienta fie la accidente(toxice)  .

instrumentar confectionat din material degradabil termic . Sterilizarea prin radiatii ionizante -razele gama sunt cele mai penetrante Razele gama pot fi obtinute dintr-o sursa de cobalt 60 cesiu 137 Este o metoda de sterilizare la rece folosita pentru medicamente .

pasteurizarea tindalizarea ) . substante chimice .radiatii . Dezinfectia se poate face prin :caldura uscata(flambarea).caldura umeda(fierberea.

eprubetelor -inainte si dupa utilizare NU se flambeaza obiecte de metal .Dezinfectia prin caldura uscata Flambarea -trecerea repetata.rapida a obiectelor sau a unor parti a obiectelor prin flacara -se sterilizeaza–pipete -orificiul baloanelor.

din momentul inceperii fierberii -se foloseste pentru sterilizarea instrumentelor ce se utilizeaza imediat.sterilizare incompleta deoarece nu actioneaza asupra tuturor sporilor -timpul de sterilizare =minimum 30 min. ..Metode de dezinfectie prin caldura umeda Fierberea .

Aceasta metoda: -reduce nr. alcoolice).PASTEURIZAREA -sterilizare partiala (sunt distruse doar formele vegetative prin coagularea proteinelor la temp. 70-75°C timp de 15 min. 85-90°C timp de citeva secunde urmata de racirea brusca la 4°C.opreste trecerea sporilor in forme vegetative -se utilizeaza in special pt conservarea unor produse alimentare ( produse lactate. microorganismelor . .<100°C) -incalzirea se face in baia de apa 60-65°C timp de 30 min.

Equipment for the high-temperature short-time pasteurization of milk. .

-la temperatura laboratorului sporii(eventual prezenti)fermineaza iar formele vegetattive vor fi distruse de o noua incalzire Aceasta metoda: . Tindalizarea -sterilizare fractionata/discontinua -solutia se incalzeste in baia de apa 1-3 pe zi. -dupa ultima incalzire se raceste brusc la 4ºC.este aplicata in special pt lichidele care peste 100°C se altereaza ( unele medii de cultura).3-8 zile consecutiviar intre incalziri se pastreaza la temperatura laboratorului(21ºC). .

cu tuburi de UV intre 15-30W  .aerul din boxele de lucru  Este o metoda complementara masurilor de curatenie si dezinfectie chimica  Sunt folosite lampi fixe sau mobile .Dezinfectia cu radiatii ultraviolete:este indicata pentru suprafetele de lucru .

dezinfectie de nivel mediu .DEZINFECTIA CHIMICA Poate fi clasificata in : – dezinfectie de nivel inalt .dezinfectie de nivel scazut .

Dezinfectia de nivel inalt Distruge toate microorganismele cu exceptia unui numar redus de spori bacterieni  Timpul de contact trebuie sa fie de cel putin 20 minute  Substantele utilizate sunt :  glutaraldehida  peroxidul de hidrogen stabilizat  acidul peracetic  .

virusuri.fungi.iodofori.forme vegetative ale bacteriilor .compusi pe baza de clor  .Dezinfectia de nivel mediu Distruge Mycobacterium tuberculosis .alcooli.  NU distruge sporii bacterieni  Tipul de contact necesar este de 10 minute  Substantele utilizate sunt:fenolii.

unele virusuri si unii fungi  NU distruge sporii bacterieni  NU distruge Mycobacterium tuberculosis  Substante utilizabile:fenoli.Dezinfectia de nivel scazut Distruge majoritatea bacteriilor in forma vegetativa .iodofori.hipoclorit de sodiu  .

baze alcooli b.peroxid de hidrogen c.AGENTI CHIMICI Substatele antiseptice si dezinfectante: -au actiune antimicrobiana neselectiva -antisepticele sunt utilizate pe tegumente si mucoase -dezinfectantele sunt utilizate numai pe structuri inerte Aceiasi substanta chimica in raport cu concentratia poate fi antiseptic sau dezinfectant In functie de mecanismul de actiune antisepticele si dezinfectantele se clasifica in substante care: a.Lezeaza membranele celulare:clorhexidina.violet de gentiana.Denatureaza proteinele(efect bactericid):acizi.Blocheaza gruparile chimice libere ale enzimelor:azotat de Ag.Altereaza acizii nucleici:rivanol.Oxideaza gruparile chimice libere ale enzimelor:hipermanganat de potasiu.oxid de etilen d.fucsina bazica .albastru de metil.detergenti e.

Studiul morfologiei bacteriene Coloratia simpla Coloratia Gram .

Dintre metodele folosite in acest scop.Examinarile bacteriologice urmaresc: -evidentierea -identificarea bacteriilor din produse patologice. studiul caracterelor morfologice este o etapa foarte importanta. .

Microscopia electronica permite cunoasterea structurii bacteriilor.   . Microscopia optica permite evidentierea formei si a dimensiunilor bacteriilor. Morfologia bacteriana se refera la forma. dimensiunile si asezarea bacteriilor.

 Bacteriile avind dimensiuni de ordinul µm. de aceea examinarea lor se efectueaza cu ajutorul microscopului. nu pot fi vazute cu ochiul liber. .

.

.

Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a studiat bacterii si alte microorganisme la microscop  .

cu germeni omoriti . - Examenul microscopic se executa : direct din produsele patologice (examen microscopic direct) din culturi pure.preparat nativ-cu germeni vii .  Preparatele microscopice sint de 2 feluri: .frotiu / preparat colorat.

marimea . spirili) .existenta eventuala a formatiunilor neobligatorii ( cili.Examenul microscopic da indicatii asupra: 1.forma (bacili.mobilitatea ( in preparatul nativ ) . prezentei microorganismelor in preparat 2. proprietatilor morfotinctoriale: . capsula. spori) . coci.

asezarea in frotiu ( lant. etc) . tetrade. ciorchine. diplo-.proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea ) ..

.

stafilococ ) . bacil tuberculos.Examenul microscopic .constituie o etapa esentiala in identificarea bacteriana.direct din produsele patologice -permite in unele infectii stabilirea diagnosticului ( gonococ. .

  Forme fundamentale bacteriene COCII  Au in general diametrul de 1µ  Prezinta forma rotunda doar unele bacterii:stafilococi. micrococi . putand ramane in urma diviziunii asociate fie pe verticala fie pe orizontala .  Majoritatea bacteriilor au forma ovoida.  Dispozitia bacteriilor rezulta in urma diviziunii lor.

acestia putand avea si dizpozitie de diplococi sau de lanturi scurte .diplo:diplococi Ex:Pneum ococii :coci ovoizi cu aspect de flacara de lumanare Neisserii :coci cu aspect reniform II. diviziune ordonata pe orizontala Tetrade:Micrococi:4 coci reuniti Octade:Sarcina:8 coci reuniti Gramezi:Stafilococi :aglomerari neordonate de coci cu aspect de ciorchine de strugure(staphylos=ciorchine).lanturi: Streptococi :coci.         Cocii pot prezenta dispozitia in: I.

Y.W)  Mycobacterium tuberculosis (aspect de majuscule Corynebacterium diphteriae(aspect de litere chinezesti) Bacili uniti in palisade:Bacilii pseudodifterici .  BACILII Sunt bacterii de forma cilindrica de bastonas  Dispozitia in frotiu: izolati:Enterobacterii :bacilul coli  Diplobacili: Bacilul carbunos  Streptobacili:reprezentantii genului Bacillus:Bacilul carbunos Bacili uniti la capete: X.

COCOBACILII  Sunt bacili scurti si subtiri Ex: Haemophilus Bordetella Brucella  .

mobile prin aparata locomotor  Ex:Treponema pallidum  .ulcer duodenal  2.FORME SPIRALATE  1. cu aspect de virgula  Helicobacter:mai multi bacili incurbati uniti la capete – produc gastrita .mobil. lungi.Bacterii spiralate  Spirochete : bacterii spiralate.Bacili incurbati:  Vibrionul holeric – bacil incurbat.

Dichotomous keys .

bacil tuberculos. stafilococ ) .direct din produsele patologice permite in unele infectii stabilirea diagnosticului ( gonococ. .Examenul microscopic .constituie o etapa esentiala in identificarea bacteriana.

sediment urinar. sau mediu de cultura lichid -a produsului patologic (singe. .Preparatul nativ ( cu germeni vii ) Ex. lcr). microscopic al preparatului nativ reprezinta examinarea directa intre lama si lamela : -a unei suspensii de germeni vii intr-o picatura de ser fiziologic.

. nativ -are implicatii restrinse -nu da informatii asupra tuturor proprietatilor morfologice ale bacteriilor Este obligatorie completarea lui cu examinarea preparatului colorat.Examinarea prep.

cu germeni omoriti . .Examenul microscopic al unui preparat colorat (frotiu)  Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot fi studiate mai detailat pe preparate fixate si colorate.  Mai rar se folosesc coloratii vitale. in reactia de umflare a capsulei . spre ex.

alcool -eter. acid acetic ) .uscarea 3.. .. etilic.fixarea ( procedee fizice : prin incalzire procede chimice: cu alcool metilic.etalarea = intinderea frotiului 2.Timpii de executie a preparatului colorat Timpi pregatitori: 1.

Fixarea Scopul fixarii este multiplu: .preparatul adera mai bine de lama .microorganismele sint omorite=preparat neinfectios .prin omorirea microorganismelor se mareste permeabilitatea peretelui celular si se produc modificari ale citoplasmei. care cresc afinitatea fata de coloranti = detalii fine de strucura .

in care colorantii se combina cu constituenti celulari. unde are loc formarea unei combinatii stabile. facindu-i vizibili la microscop. care se lasa sa actioneze un timp limitat.  .  Colorarea se executa de obicei prin acoperirea suprafetei frotiului fixat cu colorant. la cald sau la rece.Coloratia Procedeu fizico-chimic complex. apoi se dizolva si difuzeaza in continutul celular .  Colorantul se absoarbe.

pentru formatiuni morfologice celulare si extracelulare: corpusculi. cili.se executa cu un singur colorant Coloratia combinata-care se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a mai multor coloranti. spori.Tipuri de coloratii Coloratia simpla. capsula . fiecare colorant actionind independent si fixindu-se pe anumite elemente Coloratii speciale.

 se spala cu apa si se usuca  in coloratia cu albastru de metilen toate elementele se coloreaza in albastru  in coloratia cu fuxina. timp de 1-2 min. toate elementele se coloreaza in rosu  .frotiul fixat  .Coloratia simpla .se acopera complet cu un singur colorant: albastru de metilen sau fuxina.

Coloratia simpla Permite stabilirea unor proprietati morfotinctoriale ca: -forma si marimea microorganismelor -existenta unor elemente celulare Este utila in diagnosticul prin examenul microscopic direct din produsul patologic in: .gonoree -meningita cerebrospinala epidemica .

.Coloratii combinate: coloratia Gram -larg utilizata in microbiologie -deosebeste germenii gram pozitivi de cei gram negativi -orienteaza cercetarea in directia identificarii lor.

Hans Christian Gram (medic danez) .

3. 4.Coloratia Gram Tehnica de colorare 1. (Se spală cu apă). 2 min. pina nu se mai dizolva colorant. Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare. Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec. . 2. Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2 min. 2 min.Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina . (Se spală cu apă).( Se spala cu apa ) Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie. (Se spală cu apă de la robinet ).

.

.Germenii gram + -rezista la decolorare -isi mentin culoarea albastru violet initiala Germenii gram – -se decoloreaza si se recoloreaza in rosu cu fuxina/safranina.

.

Coloratia Gram stanga:bacterii gram + dreapta:bacterii gramcolorate-violet colorate-rosu .

.

.

 Diferenta de comportament in coloratia Gram se explica prin structura si compozitia chimica diferita a peretelui celular la bacteriile gram+ si gram -. .

inducand anticorpi specifici de specie (anticorpii pemit identificarea bacteriilor .  Peretele celular la bacteriile Gram pozitive Este gros de 15-50 nm .dar are structura mai simpla  Este format din pana la 40 de straturi suprapuse de peptidoglican dar si acizi teichoici atasati de peptidoglican  Acizii teichoici au rol in aderarea bacteriilor de celule epiteliale ale mucoaselor si sunt antigene de suprafata ale bacteriilor gram pozitive.diagnosticul indirect al bolilor infectioase si protectie fata de reinfectia cu bacteria respectiva) .

proteine in cantitate mare  Este multistratificat:detine peptidoglica.membrana externa .glucide. lipopolizaharid(LPS)  .Peretele celular la bacteriile Gram negative Este subtire dar are o structura mai complexa  Compozitie chimica:peptidoglican in proportie redusa .strat lipoproteic .lipide.

scaderea tensiunii arteriale Lanturile oligozaharidice laterale – proemina la suprafata bacteriei ca spini si sunt in numar mare Reprezinta Antigenul O responsabil de specificitatea bacteriilor Gram negative .lipidul A si o componenta polizaharidica si lanturi oligozaharidice la exterior Lipidul A este endotoxina la bacteriile Gram negative Este responsabila de toxicitate . greturi varsaturi.     Lipopolizaharidul – este format dintr-o componenta lipidica.diaree. de fenomene toxice care apar in infectiile cu bacterii Gram negative:febra.

Christian Gram recognized two different types of bacteria based on reaction to certain staining procedure. .

.

: M eningococ Gonococ BACILI GRAM+ : difteric) Bacillus antracis ( bacilul carbunos). Corynebacterium diphteriae ( bacilul Clostridium botulinum ( bacilul botulinic) Clostridium tetani ( bacilul tetanic) .Coloratia Gram permite constituirea urmatoarelor grupe de bacterii: - COCI GRAM+ : Streptococi Stafilococi Pneum ococi COCI GRAM .

Haem ophilus influenzae .Brucela .E.: . BACILI GRAM .K lebsiella -P seudom onas ( bacilul piocianic) -Salm onella typhi ( bacilul tific )  COCOBACILI GRAM .: .Bordetella pertusis . Coli ( bacilul coli ) .

Coci Gram +. dispusi in gramezi .

COCI GRAM+ STAPHYLOCOCCUS AUREUS(coci.ciorchine de strugure) .asezare in gramezi.

COCI GRAM + STREPTOCOCCUS PNEUMONIE coci lanceolati . in diplo . capsula unica pentru ambii coci .

Coci Gram+. dispusi in lanturi(streptoccocus pyogenes)) .

Coli (bacil cu capete rotunjite) .Bacili Gram – E.

Haemophilus infuenzae Cocobacili gram- .

Bacili gram(diplobacili) Klebsiella .

bacili cu capetele taiate drept .Frotiu lcr colorat Gram bacilul carbunos gram+.

Bacil carbunos-prezenta endosporilor  Baci gram+  .

Solutie de lugol 3.Alcool-acetona 4.Violet de gentiana 2.Trusa comerciala pt coloratia Gram 1.Fuxina diluata/safranina .

.

PREPARATE MICROSCOPICE CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP 2 .

microscopia cu fond negru.cu luminiscenta.cu contrast de faza sau . . microscopul este indispensabil. • Microscopia uzuala o facem cu fond luminos. • Numai in circumstante speciale recurgem la: . .• In microbiologia clinica.

protozoarele le urmarim: in produse patologice sau in culturi fie in stare nativa. vie (preparate umede). fie dupa fixare si colorare (preparate colorate).Microscopia optica pe fond luminos • Bacteriile. fungii. .

lichid duodenal etc. .depistarea rapida si .observarea rapida a mobilitatii microorganismelor . materii fecale.depistarea si identificarea unor elemente celulare si necelulare in expectoratie. secretie vaginala.identificarea spirochetelor.Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice umede • Indicatii: . urina. fungilor sau protozoarelor . lavaj bronsiolo – alveolar.

24/24 mm.17 mm. 20x si 40x. grosime 0.lame de sticla: 76/25 mm. grosime 1 – 1.laméle de sticla: 18/18. .1mm.0. 20/20.1 . 22/22.. 10x.. .microscop optic: obiective uscate de 4x.Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice umede • Materiale necesare: . .

.Miscarea browniana determina oscilatia pe loc a particulelor.Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice umede • Interpretare: . Curentii de fluid antreneaza o multime de particule care traverseaza campul microscopic in aceeasi directie.

.Un microorganism este mobil cand isi modifica pozitia fata de un reper din vecinatate. .Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice umede .Bacteriile peritriche au miscari oscilatorii. .Bacteriile monotriche sau lofotriche au miscari rapide de rostogolire.

coloranti bazici de anilina etc.) pe structurile protoplastului mareste refringenta microorganismelor si permite observarea detaliilor morfologice. .Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate • Principiu: Fixarea colorantilor (ex.

.Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate • Structuri speciale asociate peptidoglicanului bacterian determina anumite afinitati tinctoriale care apar dupa coloratii diferentiale: Gram. Ziehl – Neelsen etc.

Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate • In coloratiile negative particulele insolubile ale colorantului (carbonul din tusul de India. . capsula unor microorganisme ca: pneumococii. nigrozina) formeaza fondul negru al campului microscopic pe care se observa usor. ca un halou incolor. Cryptococcus neoformans etc.

Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate • Indicatii: identificarea microscopica a microorganismelor. .

Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate • Procedura: 1. Efectuarea frotiului: Frotiul este materialul microbian etalat in strat subtire pe suprafata unei lame de microscop marcata cu indicativul produsului examinat. .

Fixarea frotiului pentru bacterioscopie .Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate • Frotiul se efectueaza in 3 timpi: .Uscarea rapida a frotiului in aer cald .Etalarea .

Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate • 2. Colorarea frotiului • 3. Protejarea frotiului prin montarea in balsam de Canada .

de I2 in KI) – 1’.1’. 3. Colorare cu sol. Lugol (sol. Colorare cu sol. alcool – acetona – 30” – 1’ Spalare cu apa de robinet. Mordantare cu sol. . Safranina (fucsina bazica diluata) – 1’. Spalare cu apa de robinet.Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate Coloratia Gram 1. 2. 4.. Violet de gentiana (cristal violet) 1% . Spalare cu apa de robinet. Decolorare cu sol. Spalare cu apa de robinet.

Coloratia Gram .

Coloratia Gram .

htm • http://serc.com/diamonddove/01_Content s/Contents.ntlworld.html • http://homepage.ht m • http://www.ac.uk/dental/oralbiol/oralenv/tutorials/chris tian_gram.ncl.carleton.htm • http://www.com/morphology.edu/bugdrug/antibiotic_manual/g ram.edu/microbelife/research_methods/mi croscopy/gramstain.com/LabWork/LabWork.upenn.php .microbiologybytes.htm • http://micro.digitalproteus.Link-uri • http://www.uphs.

• Desenati in caietul de lucrari bacteriile pe care le-ati gasit. .TEMA PENTRU STUDENTI • Cautati si alte link-uri despre coloratia Gram (“staining Gram”) si imagini cu bacterii Gram (+) si Gram (-).

PREPARATE MICROSCOPICE CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP 3 .

colorarea la cald a micobacteriilor din prelevate patologice sau culturi .NEELSEN INDICATII: .COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA ZIEHL .

NEELSEN • Reactivi: 1. Solutie decoloranta: amestec acid – alcool (H2SO4 + alcool etilic 95°) 3. Solutie recoloranta: albastru de metilen .COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA ZIEHL . Solutie de fucsina fenicata Ziehl 2.

COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA ZIEHL .NEELSEN Procedura: 1. Se acopera frotiul din abundenta cu sol. Se lasa 15’. . astfel incat sa incalzim colorantul pana la emitere de vapori. de fucsina fenicata 3. timp in care se fac 3 treceri cu flacara becului de gaz Bünsen pe sub lama de sticla. Se aseaza lama cu frotiul fixat pe un suport metalic 2.

NEELSEN • Atentie! Colorantul nu trebuie sa ajunga la fierbere! • Daca colorantul se evapora sau se usuca pe lama. Se spala frotiul din abundenta cu apa de robinet .COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA ZIEHL . trebuie sa adaugam colorant proaspat! 4.

Se decoloreaza frotiul cu amestec acid – alcool – 2’ 6.NEELSEN 5.COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA ZIEHL . Se spala cu apa de robinet 7. albastru de metilen – 1’ . Recolorare cu sol.

celulele inflamatorii.bacilii acido – alcoolo . bacteriile neacido – alcoolo – rezistente – se vor colora in nuante de albastru .NEELSEN • Citire si interpretare: . celulele de descuamare sau celulele tisulare.rezistenti (BAAR) – apar rosii stralucitori .COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA ZIEHL .

COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA KINYOUN • INDICATII: Coloratie la rece a micobacteriilor din prelevate patologice sau culturi .

Solutie decoloranta de acid – alcool (HCl + alcool etilic 95°) C. Solutie de fucsina fenicata Kinyoun B. Solutie recoloranta: albastru de metilen .COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA KINYOUN • Reactivi: A.

Colorare la rece cu sol.COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA KINYOUN Procedura: 1. . Spalare cu apa de robinet. de fucsina fenicata Kinyoun – 5’ 2. Spalare cu apa de robinet 3. Recolorare cu albastru de metilen – 1’ 6. Spalare cu apa de robinet 5. Decolorare cu amestec acid – alcool – 30” 4.

COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA KINYOUN • Citire si interpretare: . bacteriile neacido – alcoolo – rezistente – se vor colora in nuante de albastru .celulele inflamatorii.bacilii acido – alcoolo . celulele de descuamare sau celulele tisulare.rezistenti (BAAR) – apar rosii stralucitori .

varianta Wayson: 10” .COLORATII SIMPLE • Coloratia cu albastru de metilen: 2’ • Coloratia cu albastru de metilen.

COLORATII NEGATIVE 1. depistarea capsulei bacteriene in primoculturi. Coloratia negativa cu tus de India Principiu: particulele colorate nu pot penetra capsula bacteriilor sau levurilor. care apare necolorata pe fondul colorat al preparatului Indicatii: depistarea Cryptococcus neoformans. . urmarirea reactiei de umflare a capsulei etc.

COLORATII NEGATIVE • Citire si interpretare: Bacteriile si levurile capsulate apar inconjurate cu un halou clar pe fondul uniform intunecat al preparatului. .

COLORATII NEGATIVE 2. Coloratia negativa cu nigrozina .

Bacteriile care nu poseda asemenea structuri sunt decolorate si trebuie recolorate pentru a putea fi observate. lipoidice. Cryptosporidium) sunt de asemenea acidorezistenti gratie invelisurilor lor. chistele unor protozoare (ex. . • Endosporii bacterieni. asociate peretelui unor bacterii confera rezistenta la decolorarea protoplastului prin solutii de acizi sau/si alcool.COLORATII FLUORESCENTE Coloratia cu auramina – rhodamina Principiu: • Structuri speciale. ascosporii.

care trebuie sa actioneze in solutii concentrate fie la cald.) sunt impermeabile si pentru colorant.COLORATII FLUORESCENTE • Invelisurile unor microorganisme (micobacterii. fie in prezenta unor detergenti. chiste de Cryptosporidium etc.endospori. .

.COLORATII FLUORESCENTE Indicatii: Triajul frotiurilor din prelevate patologice pentru depistarea rapida a bacililor tuberculozei.

Solutie coloranta cu Auramina O – Rhodamina B 2.COLORATII FLUORESCENTE Reactivi: 1. “Contracolorant”: KMnO4 . Solutie decoloranta (HCl conc. + alcool etilic 95°) 3.

Spalare cu apa de robinet 5. “Contracolorare” cu KMnO4 – 2’ 6. Decolorare cu acid – alcool – 2’ 4.COLORATII FLUORESCENTE Procedura: 1. Spalare cu apa de robinet . Spalare cu apa de robinet 3. Colorare cu sol. Auramina O – Rhodamina B– 15’ 2.

asociate cu oculare de 10x. .COLORATII FLUORESCENTE • Examinare la microscopul cu fluorescenta cu obiectivele de 20x si 40x.

. “Contracolorarea“ cu KMnO4 face fondul frotiului negru eventual numai cu resturi celulare cu fluorescenta galbena slaba.COLORATII FLUORESCENTE Citire si interpretare: Bacilii acido – alcoolo – rezistenti se coloreaza fluorescent stralucitor in galben – portocaliu cu Auramina O – Rhodamina B.

(hemosiderina.ALTE TIPURI DE COLORATII 1. Coloratia PAS (depistarea fungilor – se coloreaza in rosu) 4. Coloratia pentru Fe. sangerari tisulare) 3.jirovecii) . Coloratia cu albastru de toluidina (pentru Pneumocystis carinii. Coloratia May – Grünwald – Giemsa (aprecierea celularitatii) 2. P.

ALTE TIPURI DE COLORATII 5. Coloratia cu SUDAN III – pentru lipide 6. Coloratii imunocitochimice. reactii peroxidaza – antiperoxidaza etc. .

MEDII DE CULTURA CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP 4 .

• Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop:  izolarea bacteriilor din prelevatele patologice  identificarea bacteriilor  testari pentru initierea si monitorizarea terapiei antimicrobiene. .

necesare pentru izolarea tuturor microorganismelor cu semnificatie clinica din prelevatul examinat . microbiologul trebuie sa hotarasca:  mediile de cultura si metodele indicate pentru izolare  atmosfera. temperatura si intervalul de timp.• Prelevatele patologice odata receptionate si triate calitativ.

. izolatele cu semnificatie clinica. algoritmul si stadiul pana la care conduce identificarea acestora  daca antibiograma este indicata si care din rezultatele ei se impun communicate.

. gelificata sau gata turnate in placi Petri sau pot fi manufacturate in multe laboratoare. • Ingredientul de baza al mediilor de cultura este geloza sau agar – agar. sub forma liofilizata. • Ele se comercializeaza ca atare.• Mediile de cultura sunt folosite pentru cultivarea bacteriilor.

• se prezintă sub formă de fâșii semitransparente de culoare cafeniegălbuie. din care este extras cu ajutorul apei fierbinți.• agar-agarul (numit și geloză) este un produs organic.coloidal ce se întâlnește într-o serie de alge marine – alge rosii (agarofite). hidro . .

5–4% substanțe minerale. • este format din resturi galactozidice esterificate la C6 cu o grupare sulfonică. • are o putere de gelificare foarte mare. . 10–20% apă și 1.• conține: 70–80% polizaharide.

• Agarul este folosit la prepararea mediilor de cultura pentru ca asigura suprafata solida pe care cresc bacteriile si fungii. • Cresterea bacteriilor nu distruge structura gelului deoarece cele mai multe bacterii sunt incapabile sa utilizeze agarul pentru metabolism. .

indicatori de pH sunt adaugati in mediul cu agaroza.• Agarul este comercializat sub forma de pulbere. • Alte ingrediente. . nutrienti. iar pe masura ce se raceste la 40 °C se gelifica. factori de crestere. care in amestec cu apa si incalzit la 100 °C ramane lichid. • Mediul cu agar este un mediu relativ inert.

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE • Din punct de vedere a starii de agregare:  medii lichide  medii solide  medii semisolide .

biopsii tisulare prin ac . aspiratii din colectii purulente profunde. sange. exsudate din seroase.MEDII DE CULTURA CLASIFICARE • Medii lichide – bulioane Au utilizare restransa:  izolarea din prelevate necontaminate (ex.

volumul prelevatului insamantat poate fi crescut)  neutralizeaza prin dilutie factori antimicrobieni din prelevatul examinat .MEDII DE CULTURA Medii lichide • Izolarea in medii lichide: Avantaje:  cea mai sensibila metoda de izolare in vitro (cultura poate fi initiata de un numar redus de bacterii.

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE Mediile solide pot fi:  neselective  diferentiale  selective .

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE • Medii neselective:  agarul imbogatit cu 5% sange de berbec – mediul neselectiv cel mai folosit pentru insamantarea prelevatelor necontaminate si a unora din cele contaminate Ex.puroi .: .exsudate din caile respiratorii si din cavitatile conecte .exsudat conjunctival .

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE • Medii diferentiale – contin substratul pentru o anumita enzima sau citotoxina bacteriana si un indicator de pH Ex.geloza – sange: diferentiaza bacteriile hemolitice de cele nehemolitice . diferentiaza enterobacteriile care fermenteaza lactoza (lactozo – pozitive) de cele care nu fermenteaza lactoza (lactozo – negative) .medii lactozate. cu variati indicatori de pH.: .

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE • Medii selective – contin substante care inhiba dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor. . • Exista o diversitate de medii selective.

.mediul Mac Conkey (agenti inhibitori: saruri biliare si cristal violet) .MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE • Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate exista medii cu trei niveluri de selectivitate:  slab selective: .mediul EMB (Levin) (agenti inhibitori: eozina Y si albastru de metilen) Inhiba bacteriile Gram (+).

mediul Salmonella – Shigella .mediul Istrati – Meitert Agenti inhibitori: saruri biliare si verde briliant Inhiba bacteriile Gram (+) si o parte din bacilii Gram (-) comensali.MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE  moderat selective: .mediul XLD .mediul Hektoen .mediul ADCL (Agar Dezoxicholat Citrat Lactoza) . .

mediu Wilson – Blair Agent inhibitor: verde briliant Inhiba o gama larga de bacterii pentru a facilita izolarea salmonelelor. .MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE  medii inalt selective: .

.MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE • Agarul – sange poate fi facut selectiv pentru izolarea unor patogeni pretentiosi nutritiv prin adaos de antibiotice:  colimicina si acidul nalidixic: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (–) si favorizeaza dezvoltarea celor Gram (+)  bacitracina: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (+) si favorizeaza izolarea hemofililor  kanamicina si vancomicina: favorizeaza izolarea bacililor Gram (-) anaerobi  etc.

Ex. favorizeaza izolarea salmonelelor. fara a intarzia insa intrarea anumitor patogeni in faza exponentiala. la 37°C in acest mediu.: bulion cu selenit acid de Na.: preincubarea materiilor fecale 18 h.medii lichide. .MEDII DE CULTURA • MEDII DE IMBOGATIRE: . care prin anumite substante inhibitoare prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare.

. Listeria monocytogenes) 42°C – altele: Campylobacter jejuni / coli Se foloseste pentru incubare termostatul. pseudotuberculosis. Y.temperatura: 37°C – majoritatea bacteriilor 20 .30°C – unele bacterii (Yersinia enterocolitica.INCUBAREA CULTURILOR .

INCUBAREA CULTURILOR • Atmosfera:  in prezenta O2 – bacterii aerobe si facultativ anaerobe  in mediu cu 5 – 10 % CO2 – bacterii carboxifile  in mediu cu O2 (5 – 7 %). CO2 (8 – 10%). N2 (85%) – bacterii microaerofile .

INCUBAREA CULTURILOR  in mediu anaerob: Procedee chimice: bulioane cu ingrediente reducatoare (acid thioglicolic sau thioglicolat de Na. tehnica OTT: incinta etansa in care O2 este indepartat prin reactia cu pirogalolul in mediu alcalin. rinichi) . Procedee biologice: procedeul Tarozzi: utilizeaza tuburi cu bulion nutritiv in care agent reducator sunt fragmente de organe proaspete de animal prelevate aseptic (ficat.

CARACTERE DE CULTURA • • • • • Exigente de cultivare Intervalul necesar pentru obtinerea culturii Aspectul si consistenta coloniilor Modificari ale mediului Mirosul degajat de cultura Aceste caractere orienteaza identificarea izolatelor! .

CARACTERE DE CULTURA Exigente de cultivare • Bacterii nepretentioase • Bacterii cu anumite exigente nutritive: Strict aerobe Strict anaerobe Facultativ anaerobe Microaerofile Carboxifile .

(frecvent peste noapte) • Microorganisme cu crestere lenta: necesita zile sau saptamani pentru aparitia culturii .CARACTERE DE CULTURA Intervalul necesar pentru aparitia culturii • Microorganisme cu crestere rapida: cultura apare dupa 18 – 24 h.

)  microcolonii (vizibile numai cu stereomicroscopul)  colonii mari (Ø > 2 mm. Dimensiune: mm.) 2.CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor 1.  colonii mici (Ø < 1 mm. Forma:  punctiforme  circulare  neregulate (“in harta geografica”)  filamentoase  dendritice  lenticulare .)  colonii mijlocii (Ø ~ 1 mm.

Relieful:  plane  aplatizate  convexe  bombate  acuminate  pulvinate  ombilicate .CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor 3.

Marginile:  intregi  ondulate  lobate  zimtate  filamentoase  cu valuri succesive de invadare a mediului .CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor 4.

uscata. lucioasa – forma de cultura S – conditionata de hidrofilia si incarcatura electronegativa a structurilor microbiene de invelis • Mata. rugoasa – forma de cultura R a microorganismelor cu hidrofilie si incarcatura electronegativa reduse . umeda.CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor • Neteda.

cu striuri radiare .catifelata .pufoasa .CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor • Alte aspecte: .suprafata papilata .prafoasa .zbarcita .lanoasa .

CARACTERE DE CULTURA Densitatea optica Colonii: • transparente • semitransparente • opace .

in functie de varietatea pigmentilor produsi sau a virajului de culoare a unor indicatori introdusi in mediu.CARACTERE DE CULTURA • Irizatii ale suprafetei unor colonii: pot fi surprinse anumite unghiuri de iluminare • Culoarea coloniilor: alba galbena aurie neagra. .

CARACTERE DE CULTURA • Modificari ale mediului din jurul coloniilor: pot fi produse de citotoxine. enzime sau pigmenti difuzibili.  Hemoliza pe agar – sange  Reactii pe medii diferentiale zaharate  Reactii pe mediul cu galbenus de ou  Pigmentogeneza .

din cauza hemolizei complete • alfa – prim: halou de hemoliza incompleta cu inverzire. completa • gamma: absenta hemolizei • cald – rece: zona clara de hemoliza completa (aparuta dupa incubare la 37°C) inconjurata cu o zona de hemoliza mai putin clara.CARACTERE DE CULTURA Hemoliza pe agar . imediat inconjurat cu o zona de hemoliza clara. dar fara modificare de culoare a mediului (aparuta dupa incubarea in continuare la frigider) . incolora.sange • alfa: zona de inverzire a mediului cu numeroase hematii intacte din cauza hemolizei partiale • beta: zona complet clara.

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii diferentiale zaharate • Virajul de culoare a mediului • Culoarea coloniilor in functie de indicatorii de pH • Fermentarea / Nefermentarea substratului .

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii cu galbenus de ou • Lecitinaza: precipitat opac in jurul coloniilor • Lipaza: film circular cu irizatie perlata in imediata vecinatate a coloniilor • Proteoliza: clarificarea mediului din jurul coloniilor .

CARACTERE DE CULTURA Pigmentogeneza • Pigmenti hidrosolubili difuzeaza si coloreaza progresiv mediul: .melanina .piocianina .fluoresceina .

CARACTERE DE CULTURA Mirosul degajat de cultura • Pseudomonas aeruginosa: aroma asemanatoare florilor de iasomie • Proteus: socolata arsa • Clostridii: putri. de corn ars • Prevotella melaninogenica: acru • Nocardiile si streptomicetele: de subsol mucegait . fecaloid.

CARACTERE DE CULTURA Consistenta coloniilor • • • • • • • untoasa mucoasa – filanta “albusului de ou bine batut spuma” friabila cretoasa pasloasa pieloasa .

CARACTERE DE CULTURA Aderenta la mediu • neaderente (antrenate de ansa aluneca pe suprafata mediului) • putin aderente • aderente • incastrate in mediu .

MEDII DE CULTURA .

 suporturi materiale si nutritive care servesc la cultivarea bacteriilor  amestecuri de substante care asigura cultivarea microorganismelor .

alimente) . tratament Producerea industriala a unor substante (prepararea vaccinurilor)  Controlul sterilitatii sau incarcarcaturii microbiene a unor elemente de mediu (apa.Scopuri     Izolarea in cultura pura Identificare Diagnostic.

factori de crestere 2. Aero/anaerobioza 4. pH optim. Surse de C. temperatura optima 3. N.Conditii 1. energie. apa. substante minerale. substante nutritive. Sterile .

Ingrediente  Peptona  Extracte sau infuzii de carne  Agenti de solidificare: agar  Indicatori de pH: turnesol. rosu fenol  Agenti selectivi  Zaharuri .

Prepararea mediilor de cultura  Amestecul ingredientilor: proportie. ordinea indicata  Ajustarea pH-ului  Repartizarea in recipiente adecvate  Sterilizarea  Controlul sterilizarii si al calitatii mediului .

Clasificarea mediilor de cultura Dupa consistenta: lichide solide semisolide Dupa provenienta: naturale sintetice Dupa compozitie si scop: simple complexe speciale .

uzuale .Clasificarea mediilor de cultura  Medii complexe  de utilitate generala: .cu proteine native  Medii speciale     selective de imbogatire anaerobi teste biochimice .

Medii simple: Apa peptonata Bulion simplu Geloza simpla Medii complexe: bulion sange geloza sange geloza chocolatie .

bulion simplu Categoria: Mediu de bază Componente: macerat de carne + peptonă + NaCl 0.Medii lichide.5% Utilizare: pentru germeni nepretenţioşi .

Geloza simpla  Categoria: Mediu de bază  Componente: bulion simplu + agar-agar .

Geloza simpla  Categoria: Mediu de bază  Componente: bulion simplu + agar-agar .

Geloza lactozata  Categoria: Mediu diferenţial Componente: geloză simplă + lactoză + albastru bromtimol  Utilizare: studierea fermentării lactozei .

Geloza sange  Categoria: Mediu compus  Componente: geloză simplă răcită la 45°C + sânge defibrinat 1020% .

Geloza socolatie  Categoria: Mediu special  Componente: geloză simplă răcită la 60-80°C + sânge  Utilizare: cultivarea neisseriilor. hemofililor .

Mediul Chapman Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial (evidentiaza o proprietate biochimica a tulpinii) Componente: geloză simplă + NaCl 7.5% + manitol + roşu fenol Utilizare: selectiv pentru stafilococ .

.

.

α Hemoliza .

PROPRIETATI DE CULTURA ATMOSFERA DE CO2 5-10% .

Medii folosite pentru enterobacterii     (agar. lactoza. indicatori de pH) Drigalski Istrate McConkey Levine Bacteriile care degradeaza lactoza din mediu = lactozo pozitive Bacteriile care nu degradeaza lactoza din mediu = lactozo negative .

.

.

coli) .Mediul Levine  Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial  Componente: geloză simplă + eozină + lactoză + albastru de metilen  Utilizare: cultivarea enterobacteriilor (E.

COLI LEVINE E.COLI DRIGALSCHI .GENUL ESCHERICHIA E.

ADCL (Leifson)  Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial  Componente: geloză simplă + săruri biliare + lactoză + roşu neutru  Utilizare: cultivarea shigelelor şi salmonelelor .

COLI-ADCL .E.

Fermentarea lactozei pe geloză lactozată .

KLEBSIELLA GELOZA-SANGE COLONII MUCOASE KLEBSIELLA ADCL COLONII MUCOASE .

INVAZIE .PROTEUS.

GENUL SALMONELLA ADCL-H2S HECTOEN .

Mediul Lowenstein-Jensen: bacilul TBC ..Mediul OCST: bacilul difteric .Mediul BSA: vibrionul holeric .Mediul Sabouraud: fungi .Mediul Chapman : stafilococi .

Mediul Chapman .

Hinton  Categoria: Mediu special  Utilizare: Efectuarea antibiogramelor .Mediul Muller .

.

Mediul OCST  Categoria: Mediu de îmbogăţire (favorizeaza X bacteriilor. mai ales cand acestea sunt in concentratie mica)  Componente: ou + cisteină + ser + telurit de potasiu  Utilizare: cultivarea bacililor difterici .

Mediul Sabouraud  Categoria: Mediu special  Componente: geloză simplă + maltoză/glucoză + antibiotice  Utilizare: cultivarea levurilor .

Mediul Lowenstein-Jensen .

Tarozzi (mediu lichid.Medii pentru anaerobi: .Bulion cu acid thioglicolic (mediu lichid. cu albus de ou. la suprafata se adauga ulei de parafina) . realizate prin incorporare) Tehnica Ott (se insamanteaza pe mediu solid. la suprafata se adauga ulei de parafina . agenti reducatori si se sigileaza cu parafina) .Geloza Veillon (se obtin culturi in profunzimea mediului.

 Izolare = repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultura cu scopul de a obtine cultura pura  Cultura bacteriana = totalitatea bacteriilor crescute in/pe suprafata unui mediu de cultura .Metode de insamantare  Insamantare = punerea in contact a unei culturi bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile de cultura.

Tehnici de insamantare  Tehnica insamantarii prin epuizare:  Scop: obtinerea coloniilor izolate  Insamantarea prin intepare (pe medii solide aflate in tuburi)  Insamantarea in panza .

.

.

.

.

.

.

piocianic . carbunos .Tulburare uniforma a mediului: E.Tulburare + pelicula la suprafata: b.Mediu limpede + pelicula: b.Grunji: streptococul . coli .Caracterele culturii microbiene  In mediu lichid se descrie:  Turbiditatea  Culoarea Formarea de depozite Suprafata  Medii lichide .

emulsificabilitatea .mirosul culturii  Colonii S (smooth)  Colonii R (rough) .marimea .consistenta .forma coloniei .margini .Caracterele culturii microbiene pe medii solide  Colonia= ansamblu localizat.culoarea .suprafata . alcatuit din populatie pura de bacterii provenite dintr-un singur parental. Pe mediu solid se descrie: .

.

.

GELOZA SIMPLA .CARACTERE DE CULTURA BACILLUS.

CARACTERE DE CULTURA BACILLUS GELOZA SANGE .

GENUL CORYNEBACTERIUM CORYNEBACTERIUM “FLOARE DE MARGARETA” .

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PE MEDIUL LOWENSTEIN .

PIGMENT .

Pigment .

HEMOLIZA STAFILOCOC .α INCOMPLETA VERZUIE .α COMPLETA β α .β CALD-RECE (se clarifica la 4°C) STREPTOCOC .β COMPLETA .

Clasificare – hemoliza pe geloza sange  hemoliza β: = streptococi β hemolitici  hemoliza α incompleta. . verzuie  streptococi γ nehemolitici.

CORYNEBACTERIUM TINSDALE .

.

.

.

PRELUCRAREA PRELEVATELOR PATOLOGICE TEHNICI DE INSAMANTARE PENTRU IZOLAREA SI IDENTIFICAREA BACTERIILOR CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP5 .

se realizeaza: • direct sau • dupa o prealabila prelucrare (concentrare. decontaminare. in functie de natura lor.• Insamantarea prelevatelor patologice. omogenizare. inactivarea unor substante antimicrobiene) .

puroi • Prelevatele emulsionabile . fluide – sange. exsudate seroase prelevate pe anticoagulant.se pot insamanta direct .materii fecale .• Prelevatele omogene.

sputa .CONCENTRAREA PROBELOR • Centrifugare – probele fluide • Omogenizare .

DECONTAMINAREA PROBELOR • Spalare in solutie salina izotona – utila pentru: • sputa muco – purulenta. • portiunile muco – sangvinolente din scaun • Tratarea cu NaOH: • decontamineaza probele pentru izolarea micobacteriilor • fluidifica si omogenizeaza sputa .

OMOGENIZAREA PROBELOR • Omogenizarea sputei pentru izolarea bacteriilor neacido – alcoolo – rezistente: • se realizeaza cu N – acetil – cisteina. • Omogenizarea tesuturilor: • se realizeaza prin mojarare in tub Griffith .

Epuizarea inoculului cu ansa pe placi cu mediu agarizat si obtinerea culturilor pure necesare identificarii . este necesara “uscarea placilor”. prin mentinerea placilor ~ 30 min.initial. la 37°C. cu capacul Intredeschis – pentru evaporarea condensului de pe suprafata mediului .TEHNICI DE INSAMANTARE 1.

uzuala este izolarea prin epuizare semicantitativa a inoculului in 4 cadrane. .metoda permite aproximarea relativa a cresterii.TEHNICI DE INSAMANTARE Epuizarea inoculului . cu arderea ansei cand schimbam directia striurilor de insamantare.pe placile cu medii agarizate neselective. .

.

se etaleaza in aria A una sau mai multe anse cu inocul ori inocul prelevat pe tampon.TEHNICI DE INSAMANTARE Epuizarea inoculului .epuizam apoi inoculul. . . iar epuizarea mai putin drastica. .pentru izolari pe medii selective. prin 3 serii de striuri: B. C. D. cantitatea de inocul trebuie sa fie mai mare.initial. fara sterilizari intermediare ale ansei.

.

cantitatea de fluid prelevata in ansa difera cu pozitia de scufundare si retragere a ansei:  cantitate minima si constanta .TEHNICI DE INSAMANTARE Epuizarea inoculului .la scufundarea si retragerea verticala  cantitate maxima – la scufundare cat mai oblica si retragerea ansei prin “smulgere” din fluid .

TEHNICI DE INSAMANTARE Epuizarea inoculului • Cultura pura – acea cultura formata din descendentii unei singure colonii rezultate dupa o epuizare a materialului microbian. care duce la cresterea sub forma de colonii bine izolate pe un mediu neselectiv. .

TEHNICI DE INSAMANTARE Epuizarea inoculului • Ideal. ar fi ca asemenea crestere sa porneasca de la indivizi izolati. • Practic ea porneste de la unitati formatoare de colonii (UFC) – poate indivizi. . poate o mica grupare de organisme asemanatoare.

direct cu seringa de prelevare (hemoculturi) .TEHNICI DE INSAMANTARE 2. Insamantarea in medii lichide se face: .cu ansa incarcata cu prelevat patologic monomicrobian ori cultura pura .cu pipeta (sedimentul LCR) .

inoculul ajunge submers si difuzeaza in mediu.TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea in medii lichide • inclina tubul si descarca ansa pe peretele tubului • cand readucem tubul la pozitia verticala. .

Izolarea bacteriilor sporulate de cele nesporulate pe baza termorezistentei sporilor. .TEHNICI DE INSAMANTARE 3.

. produsul microbian suspensionat in solutie salina izotona. timp de 10 min..TEHNICI DE INSAMANTARE Izolarea bacteriilor sporulate • Mentine in baia de apa la 80 °C. apoi epuizeaza suspensia pe o placa cu mediu agarizat.

2 saptamani) a culturilor pure (ex.mentinerea pe durata limitata (cateva zile / 1 . Insamantarea cu ansa a mediilor solidificate in panta. Indicatii: . tulpini de referinta) .TEHNICI DE INSAMANTARE 4.: tulpini de identificat.

.preleva cu ansa inocul din mai multe colonii ale culturii purificate pe placa cu mediu agarizat. imediat deasupra apei de condens si retrage ansa spre partea superioara a pantei descriind miscari in “S” pe suprafata mediului.TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu ansa a mediilor solidificate in panta .depune inoculul in partea inferioara a pantei. .

• singura. . cultura de Proteus va invada prin “catarare” suprafata pantei de mediu. • descarca o ansa din prelevatul patologic strict in apa de condens a tubului.TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu ansa a mediilor solidificate in panta • izolarea in cultura pura a tulpinilor de Proteus din prelevate contaminate. • incubeaza tubul in pozitie verticala.

conservarea pe durate mai lungi (1 – 6 luni) a tulpinilor bacteriene . Insamantarea cu firul drept a coloanei de agar nutritiv moale.testarea mobilitatii bacteriilor .TEHNICI DE INSAMANTARE 5. Indicatii: .

• la testarea mobilitatii retrage acul cat mai exact pe acelasi traiect pentru a evita dilacerari suplimentare ale mediului in care cresterea poate da impresia falsa de mobilitate a bacteriei.TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu firul drept a coloanei de agar nutritiv moale • incarca firul cu inocul din cultura pura si inteapa central coloana de agar nutritiv pana aproape de fundul tubului. .

6. Indicatii: .testarea unor activitati biochimice .TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu firul drept a mediilor solidificate in coloana si panta. Insamantarea cu firul drept a mediilor solidificate in coloana si panta.

TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu firul drept a mediilor solidificate in coloana si panta.
• Incarca firul cu inocul din cultura pura si procedeaza mai intai la insamantarea prin intepare a coloanei, apoi retrage acul, insamanteaza prin miscari in “S” pana in partea sa superioara.

TEHNICI DE INSAMANTARE

7. Insamantarea uroculturilor se realizeaza cu ansa calibrata de 10 µl. pentru a estima semicantitativ concentratia bacteriana / ml. urina

Recoltarea produselor patologice
CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP6

Recoltarea produselor patologice
Diagnosticul etiologic al unei boli infectioase depinde in mare masura de recoltarea corecta a produsului patologic, care trebuie organizata si controlata de medic, fiind o problema de responsabilitate medicala.  Produsele patologice sunt probe in care se banuieste prezenta microorganismelor.

Produsele patologice pot fi:
produse normale, care prezinta modificari in caz de boala (singe, fecale, urina, l.c.r.) sau  produse care apar in urma unei imbolnaviri (puroi, lichid peritoneal, lichid articular, sputa etc.).

Produsele patologice se pot recolta de la bolnavi, convalescenti, purtatori sanatosi (personal spitalicesc, sector alimentar), cadavre.  Mai pot fi analizate: probe de apa, aer, alimente.

Reguli generale:
A. Pentru fiecare boala infectioasa trebuie cunoscut: 1. de unde se pot obtine prelevatele patologice cele mai reprezentative, in ce loc se afla agentii etiologici in cursul bolii. 2. cand este momentul cel mai potrivit pentru recoltare in raport cu perioada de evolutie a bolii.

3. cum trebuie recoltat (tehnica) 4. cat trebuie recoltat (cantitatea necesara)

B. Stabilirea acestor parametri se face in raport cu natura infectiei si a produsului patologic recoltat.

Prelevarea trebuie facuta steril, aplicand metodele de asepsie si antisepsie. Instrumentarul si recipientele vor fi sterilizate prin caldura, fara urme de antiseptice. Produsul trebuie etichetat corespunzator si insotit de un bilet de trimitere care sa cuprinda:
       

numele si prenumele bolnavului varsta diagnosticul prezumtiv data, ora si locul recoltarii natura produsului examinarile cerute se noteaza daca s-a facut tratament antibiotic numele persoanei care a recoltat

bine inchise  Transportul probelor se realizeaza in cutii / genti de transport corespunzatore. inscriptionate cu pictograma “BIOHAZARD” pentru a preveni deteriorarea lor si eventualele accidente (contaminarea mediului.Produsul se va ambala corespunzator. a omului).  . in recipiente de unica folosinta.

PICTOGRAMA BIOHAZARD  Daca se expediaza la distanta se specifica : “material infectios” si sunt inscriptionate .

In cursul transportului se asigura conditii de temperatura corespunzatore:    uneori e necesara o temperatura de 37° C (meningococ).  Transportul probelor se va face cat mai repede. intarzierea scazand posibilitatea evidentierii germenilor existenti initial si permitand inmultirea celor contaminanti. . alteori temperaturi scazute (4°C) in lazi izoterme sau recipiente speciale (virusuri).

 . Insamantarea se face cat mai repede dupa recoltare. care asigura supravietuirea germenilor. daca este posibil chiar la patul bolnavului. Pentru transport la distanta se pot adauga lichide conservante sau medii speciale de transport.

 .Recoltarea produselor patologice din tractul respirator  Secretiile respiratorii se recolteaza in raport cu localizarea infectei. In interpretarea rezultatelor se tine cont de microorganismele normal intalnite in tractul respirator superior.

inainte de igiena cavitatii bucale. rosteste vocala “A”. Recoltarea se face dimineata. iar medicul / asistenta sterge cu tamponul de vata peretele posterior al faringelui si amigdalele (!! recoltare de pe zonele inflamate. depozite purulente!!). in cazul in care produsul nu ajunge imediat in laborator). deschide cavitatea bucala cat mai larg. cu gatul in extensie. leziuni. . cu retinerea de la fumat.Secretia faringiana   Se recolteaza cu tampon faringian. inainte de masa. Pacientul asezat pe scaun. Se introduce tamponul in tubul protector din plastic (cu mediu de transport Amies sau Stuart.

scarlatina.Secretia faringiana Secretia faringiana se recolteaza in:      angine. infectii virale respiratorii etc. difterie. .

.

.

.

.

.

Se recolteaza in: sinuzite. folosind cate un tampon pentru fiecare nara.   .  rinite etc.Secretia nazala  Se recolteaza asemanator.

dupa igiena cavitatii bucale sau dupa clatirea gurii cu ser fiziologic steril. cand bolnavul isi face “toaleta bronsiilor”. tuberculoza de preferinta dimineata.Sputa  Se recolteaza in:     bronsite. inainte de alimentatie. Recoltarea se face dimineata. nu saliva! . Important este sa se obtina secretie din bronsii. pneumonii bronhopneumonii.

 .Secretiile traheobronsice recoltare prin cateter (aspirate traheo bronsice).  dau informatii fidele asupra microorganismelor prezente in infectiile tractului respirator inferior.

Cultura . Ziehl etc.DIAGNOSTICUL INFECTIILOR DE TRACT RESPIRATOR INFERIOR Sputa  Secretii traheo .bronsice  Frotiu colorat Gram.

.

.

.

.

Frotiu din sputa (coloratie Gram pneumococi) .

.

se realizeaza cu tampoane sterile (similare celor faringiene) cu mediu de transport.Secretia conjunctivala Secretia otica  Recoltarea secretiei conjunctivale in conjunctivite secretiei otice in otite. si  recoltarea .

 . virusologice.    Materiile fecale: se recolteaza pentru examinari bacteriologice. fie cu tampon rectal la copii mici). Recoltarea si insamintarea fecalelor in scopul cultivarii germenilor.Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului digestiv  Lichidul de varsatura se recolteaza in:   toxiinfectii alimentare. fie scaun dupa purgatie salina (pentru detectarea purtatorilor de germeni). se numeste coprocultura. biochimice etc. parazitologice. De obicei se recolteaza 2 .3 g fecale (pe “lingurita”coprorecoltorului) in coprorecoltoare de unica folosinta din material plastic cu mediu de transport Carry-Blair. Prelevarea se face fie din scaun emis spontan. fie pe sonda Nélaton direct din rect. gastro-enterite acute etc.

. gastroenterite. trebuie facut in lazi izoterme la 4°C. dizenterie. iar transportul in laboratoare aflate la distanta. enteroviroze etc.Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului digestiv    Insamintarea materiilor fecale trebuie facuta cat mai repede dupa recoltare (mai ales in dizenterie). Coprocultura se practica in:      salmoneloze. holera.

DIAGNOSTICUL ENTERITELOR Materii fecale Examen pentru digestie Coprocultura Examen coproparazitologic .

.

coli (jos) Salmonella (mediu ADCL) Salmonella Mediu Hektoen .Mediu Leifson Salmonella (sus) E.

Examinarea bacteriologica a bilei se numeste bilicultura. . dupa clatirea gurii cu ser fiziologic steril. Bilicultura se indica:   in colecistopatii. biochimic etc.  Bila: se recolteaza dimineata cu sonda Einhorn. pentru detectarea purtatorilor de salmonele etc. Se poate examina si parazitologic.

Momentul recoltarii: prima urina de dimineata / recoltare dupa cel putin 3 ore de la mictiunea anterioara.Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului uro-genital  Urina: pacientul trebuie educat (trebuie explicat pe intelesul fiecarui bolnav) cum sa recolteze proba si sa evite contaminarea ei. .

se elimina prima portiune de urina. apoi mictiunea se intrerupe si urmatoarea portiune se recolteaza intr-un recipient steril denumit urocultor. pentru evitarea contaminarii urinii cu secretii vaginale). .Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului uro-genital  Recoltarea se face dupa toaleta riguroasa a organelor genitale externe cu apa si sapun (la femei se recomanda utilizarea unui tampon intravaginal.

Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului uro-genital   Cantitatea necesara: min. probele trebuie pastrate la 4°C imediat dupa recoltare.    . Se mai poate preleva urina prin punctie suprapubiana sau prin cateter. Indiferent de prelevare. Pentru nou-nascut se folosesc pungi recoltoare sterile din material plastic. 10-20 ml. examenul microbiologic al urinei trebuie efectuat in cel mult 2 ore de la prelevare Daca acest interval nu poate fi respectat.

cantitativa) Preparat colorat Gram. rar ) Preparat nativ din sedimentul urinar .DIAGNOSTICUL INFECTIILOR URINARE Urina Examen sumar de urina Determinari biochimice Urocultura (semicantitativa. MGG (f.

materii fecale.Dish for sampling .Containere pentru recoltat: urina.Dish for sputum . alte lichide  Dish for urine .Dish for feces . sputa.

.

.

Leucocite in sediment urinar .

Bacili (in sedimentul urinar) .

.

.

.

E.coli Mediul Levin Mediul CLED .

Staphylococcus saprophyticus (din urina. pe agar-singe) .

.

.

. cu tampon steril care apoi se introduce in tubul cu mediul de transport.Secretiile genitale feminine Secretia vaginala (in vaginite): se recolteaza din fundul de sac vaginal Douglas.

Secretia endocervicala Cervicite:  cu un tampon steril se indeparteaza mucusul de la nivelul cervixului.  cu alt tampon se recolteaza produsul patologic prin introducerea si rotirea in canalul cervical. .

.la fetite:  tamponarea secretiei de la nivelul vulvei.  cu ajutorul unui cateter se introduc in vagin 2 ml ser fiziologic steril.  apoi se colecteaza lichidul de spalatura Atentie! Probele nu se pastreaza la frigider! Neisseria gonorrhoeae foarte sensibil la frig!.

.

.

DIAGNOSTICUL INFECTIILOR GENITALE FEMININE Secretia vaginala Preparat nativ Cultura Frotiu (colorat MGG etc.) .

.

Trichomonas vaginalis .

Candida spp. (levuri si pseudohife) .

 .Secretiile genitale masculine la barbati in uretrite: se recolteaza secretie uretrala cu tampon steril. ejaculat in recipient steril.  in prostatite: se recolteaza secretie prostatica dupa masaj prostatic. primul jet.  se poate recolta urina. care se introduce in mediu de transport.

IN SECRETIE URETRALA GONOREE .

Neisseria gonorrhoeae .

HEMOCULTURA  Recoltarea singelui examen bacteriologic: hemocultura examen serologic: testarea anticorpilor examinari parazitologice examinari hematologice examinari biochimice .

14 zile intre probe). .Recoltarea  se face dimineata pe nemancate. se recolteaza probe perechi:     proba de singe in perioada de stare a bolii si o proba in starea de convalescenta. (interval de 10 . pentru hemocultura (se presupune lipsa tratamentului antibiotic). prin venopunctie la nivelul plicii cotului (vena antecubitala) se folosesc recipiente speciale cu sau fara anticoagulant in functie de specificul analizei / determinarii.

 Daca bolnavul a fost tratat cu antibiotice se adauga la mediul de cultura substante neutralizante:  PABA (acid para-aminobutiric) pentru sulfamide  penicilinaza pentru peniciline  cisteina pentru streptomicina  MgSO4 pentru tetraciclina. .

.

Flacoane pentru hemoculturi .

.

.

proba pozitiva se insaminteaza pe medii corespunzatoare flaconului in care s-a recoltat: pentru bacterii aerobe sau anaerobe. . daca intr-un interval de 7 zile in mediu se dezvolta germeni: atentionare => proba pozitiva. daca in acest interval nu se dezvolta germeni => proba negativa.Hemocultura     Detectarea prezentei germenilor se face automat (incubare la 37°C intr-un termostat special cu agitare continua.

Pentru examinari parazitologice si hematologice, sangele se recolteaza prin intepare cu ac de unica folosinta, din pulpa degetului, dupa dezinfectie cu alcool . Prima picatura se indeparteaza, urmatoarele se intind pe lama sub forma de frotiu (examen hematologic, bacteriologic direct) sau ca picatura groasa (malarie).

Lichidul cefalo-rahidian
 

Se recolteaza prin punctie lombara sau suboccipitala. Se insaminteaza cat mai repede, daca este posibil chiar la patul bolnavului, mai ales cand se suspecteaza meningita meningococica. Transportul se face rapid asigurand mentinerea la 37°C (eprubeta cu LCR se tine strins in palma sau in buzunar la piept). LCR – ul se poate incuba ca atare la 37 °C.

DIAGNOSTICUL MENINGITELOR
Lichidul cefalo-rahidian

Frotiu colorat Gram, MGG, Ziehl etc. Reactii de latex aglutinare Cultura

Neisseria meningitidis

Exudate din seroase

Lichidul pleural, peritoneal, sinovial, se recolteaza in pleurezii, respectiv, peritonite, sinovite, dupa asepsie locala prin punctie de partea decliva a regiunii. De obicei recoltarea se face pe citrat, deoarece continutul ridicat de fibrina determina o coagulare rapida.

Puroi
   

Este format din leucocite, microorganisme, resturi celulare, fibrina, etc. Din colectii inchise (abcese) se recolteaza prin punctie cu o seringa sterila cu ac gros, sau cu pipeta Pasteur. Puroiul din leziuni inchise profunde va fi studiat si in conditii de anaerobioza. Din colectii deschise se recolteaza dupa curatirea plagii cu ser fiziologic steril si eliminarea primei cantitati care iese. Se poate recolta cu tamponul sau cu ansa.

COLECTIE PURULENTA

DIAGNOSTICUL INFECTIILOR DE PLAGA Puroi (secretii din plagi) Frotiu colorat Gram Cultura .

Frotiu dintr-un abces (infectie cu anaerobi) .

Staphylococcus aureus (Mediu Chapman) .

Pseudomonas aeruginosa. Enterobacter aerogenes pe EMB (Levine) . Klebsiella pneumoniae.Escherichia coli.

fie tesut hepatic etc. fie tesut medular (medulocultura). Examinarea va fi bacteriologica si histopatologica. . fie tesut ganglionar (adenopunctura).Fragmente de tesuturi     Se recolteaza prin punctie sau biopsie.

apoi toracele si abdomenul. . Pentru fiecare produs se foloseste alt set de instrumente si alt recipient steril.Produse de necropsie      Recoltarea se face cat mai rapid dupa deces. dupa o prealabila aplicare pe locul punctiei a unei spatule inrosite in flacara. singe. Se deschide cutia craniana. urina. respectind masurile de asepsie. Inainte de deschiderea cadavrului se face dezinfectia tegumentelor cu tinctura de iod si alcool. Continutul intestinal se recolteaza prin prelevarea unui fragment de intestin de 10 cm intre doua ligaturi. continut intestinal. Prelevarea singelui din cord sau a lichidelor din cavitati se face prin punctie cu seringa sau pipeta Pasteur. recoltand fragmente de organe.

secretia vaginala. urina) Cultura Identificarea bacteriilor Antibiograma . lcr. secretia uretrala) Preparat colorat (Frotiu) (Sputa.Schema de prelucrare a produselor patologice Produs patologic Preparat nativ (urina. lcr.

EXAMENUL MICROSCOPIC .

intre lama si lamela  examinarea microscopica se realizeaza cu microscopul optic. microscopul cu contrast de faza Tehnica de lucru. microscopul cu fond intunecat.suspensie de germeni vii intre lama si lamela .EXAMENUL MICROSCOPIC • I. condensator coborat.obiectiv mic (10x. PREPARATUL NATIV permite studierea – Mobilitatii germenilor – Morfologiei bacteriene  este un preparat microscopic umed. 20x. 40x).

COLORATIA NEGATIVA – METODA BURRIpermite studierea – Germenilor greu colorabili – Germenilor cu capsula (Klebsiella spp.pneumoniae) Coloranti : tus de China. S. safranina ..EXAMENUL MICROSCOPIC • II.

EXAMENUL MICROSCOPIC • III. PREPARATE COLORATE permit studierea – Morfologiei germenilor – Dispozitiei germenilor – Afinitatii tinctoriale (colorabilitatea) BAZA PREPARATELOR COLORATE CONSTA IN EFECTUAREA UNUI FROTIU Etapele realizarii frotiurilor  etalarea  uscarea  fixarea colorarea .

COLORATII COMPUSE  COLORATIA GRAM  COLORATIA ZIEHL-NEELSEN  COLORATII SPECIALE EXAMENUL MICROSCOPIC . uscare  examinare la microscop cu obiectiv de imersie 2.• TIPURI DE PREPARATE COLORATE 1.COLORATII SIMPLE  se utilizeaza un singur colorant  se inlatura colorantul in exces  spalare.

Examinare ls microscop cu obiectiv de imersie . Spalare cu apa 6. Spalare cu apa 3.COLORATIA GRAM DIFERENTIAZA BACTERIILE GRAM POZITIVE DE CELE GRAM NEGATIVE ETAPE 1. Colorare cu violet de gentiana (2 min). Inlaturare colorant 2. Mordantare cu lugol (2 min). Uscare. Recolorare cu fuxina (2 min) 5. Decolorare cu alcool-acetona (10-15 sec) 4.

• COCOBACILI  GRAM NEGATIV Haemophilus spp. Acinetobacter spp. ..EXEMPLE DE BACTERII GRAM POZITIVE SI GRAM NEGATIVE • COCI  GRAM POZITIV Staphylococcus spp. Streptococcus spp  GRAM NEGATIV Neisseria spp.

. Salmonella spp. Proteus spp. . Pseudomonas spp. Shigella spp... Bacillus spp.EXEMPLE DE BACTERII GRAM POZITIVE SI GRAM NEGATIVE • BACILI  GRAM POZITIV Clostridium spp.. coli. Corynebacterium spp  GRAM NEGATIV E.

.

.

.

.

.

• Bacil carbunos-prezenta endosporilor • Baci gram+ .

REACTII ANTIGEN-ANTICORP .

nu este recunoscută ca proprie şi determină apariţia unui răspuns imun. ajunsă în organism. ce vizează neutralizarea şi eliminarea ei. care.Antigen • (greacă: anti=contra şi geano=a naşte. . a genera) • este termenul care defineşte orice substanţă de origine endogenă sau exogenă.

. bacteriile. parazitii si celulele alterate ale organismului (infectate cu un germene sau tumorale) reprezinta antigene.• Virusurile.

care le recunosc specific. Sinteza de molecule de anticorpi.Odată pătrunse în organism antigenele pot determina: • 1. Apariţia eventuală a unor reacţii imune aberante: reacţii alergice. autoimune . • 2. Instalarea memoriei imunologice ("amintirea" organismului despre întâlnirile anterioare avute cu acelaşi antigen). • 3.

parazitii etc. virusurile. .Anticorpii • substante chimice produse de organism ca raspuns la patrunderea in sange a numeroase substante straine organismului (antigene) asa cum sunt : bacteriile.

REACTIA DE AGLUTINARE DEFINITIE Reactie Ag-Ac de agregare in care antigenul este reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene in suspensie (antigen particulat) => retele tridimensionale  agregate vizibile .

REACTIA DE AGLUTINARE .

REACTIA DE AGLUTINARE SCOP  identificarea unor bacterii pe baza proprietatilor antigenice  evidentierea Ac aglutinanti in serul de bolnav .

REACTIA DE AGLUTINARE Aglutinarea pe lama Aglutinarea in tuburi Aglutinarea pasiva Inhibarea hemaglutinarii pasive .

AGLUTINAREA PE LAMA SCOP  identificarea rapida pe baza proprietatilor antigenice a unor tulpini izolate din produsul patologic TEHNICA ser imun (Ac) + colonie bacteriana  grunji fini ser fiziologic + colonie bacteriana  susp.omogena .

AGLUTINAREA PE LAMA

AGLUTINAREA PE LAMA

AGLUTINAREA PE LAMA

AGLUTINAREA IN TUBURI
PRINCIPIUL REACTIEI
In dilutii crescande de ser se adauga aceeasi cantitate de antigen.

Titrul reactiei este reprezentat de dilutia cea mai mare de ser la care se mai observa aglutinarea

AGLUTINAREA IN TUBURI
SCOP  identificarea unui microorganism (Ag)  diagnosticul serologic al unei infectii pentru evidentierea Ac din serul de bolnav fata de un Ag standard

AGLUTINAREA IN TUBURI
TIPURI
Aglutinarea “O”- somatica- polara - Ag “O”= endotoxina- perete bacteriilor Gram - natura glico-lipido-polipeptidica - termostabil - alcoolorezistent - distrus de formol

AGLUTINAREA IN TUBURI
Aglutinarea “H”- flagelara - Ag prezent la bacteriile mobile - natura proteica - termolabil - distrus de alcool - rezistent la formol

AGLUTINAREA IN TUBURI
EXEMPLE RC. WIDAL S.typhi, S.paratyphi A,B RC. WRIGHT bruceloze RC. WEIL-FELIX tifos exantematic

AGLUTINAREA IN TUBURI
TEHNICA

Ser cercetat Antigen

1
x

1/2
x

1/4
x

1/8
x

1/16
x

1/32
x

DILUTIA CEA MAI MARE DE SER LA CARE MAI APARE AGLUTINARE

AGLUTINAREA IN TUBURI

AGLUTINAREA PASIVA
DEFINITIE Reactie Ag-Ac in care Ag este reprezentat de o solutie moleculara. In urma fixarii pe un suport particulat acesta devine aglutinabil in prezenta serului imun. SCOP Identificarea unui Ag cat si pentru cercetarea anticorpilor corespunzatori folosind un Ag cunoscut.

AGLUTINARE PASIVA
PARTICULE - INERTE: latex, colodiu, bentonita - HEMATII DE OM grp. “O” HEMAGLUTINARE - HEMATII DE ANIMAL PASIVA Ag - PROTEIC adsorbit pe hematii native - POLIZAHARIDIC adsorbit pe hematii tanate (tratate cu acid tanic)

Evidentierea Factorului Reumatoid (FR) .Detectarea Ag de Haemophylus. ser .dg. WaalerRose) . Tiroiditei Hashimoto . Poliartritei reumatoide (Rc. meningococ in LCR.Cercetarea Ac anti-ADN in dg.dg. pneumococ.AGLUTINAREA PASIVA EXEMPLE Ag adsorbit pe particule de latex . LES Ag adsorbit pe hematii .

TIROIDITA HASHIMOTO .

POLIARTRITA REUMATOIDA .

LUPUS ERITEMATOS SISTEMIC .

TEHNICA I. (urina + ser imun anti-gonadotrofina) II.INHIBAREA HEMAGLUTINARII PASIVE SCOP Diagnosticul imunologic al sarcinii. (…) + suspensie de hematii tanate Gonadotrofina (+) => hematii in suspensie Gonadotrofina (-) => hematii aglutinate .

Punerea in contact a Ag corespunzator duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipita atunci cand elementele ce participa in reactie se gasesc in proportia optima . in care antigenul este reprezentat de macromolecule in solutie coloidala.REACTIA DE PRECIPITARE DEFINITIE Reactie Ag-Ac de agregare.

DIFUZIA IN CAMP ELECTRIC IMUNELECTROFOREZA CONTRAIMUNELECTROFOREZA .SIMPLA DIFUZIE .REACTIA DE PRECIPITARE EXEMPLE PRECIPITAREA INELARA REACTIA DE FLOCULARE PRECIPITAREA IN GEL .DUBLA DIFUZIE .

identific.identificarea originii petelor de sange .Rc.meningitei cerebrospinale .IN DG.infectiei carbunoase . de grp.Ascolidg.Rc Vincent-Bellotdg.REACTIA DE PRECIPITARE INELARA SCOP . a streptococilor (grp.IN MEDICINA LEGALA.Lancefield) . BOLILOR INFECTIOASE .

REACTIA DE PRECIPITARE INELARA INEL OPALESCENT DE PRECIPITARE .

REACTIA DE FLOCULARE --TITRAREA TOXINEI DIFTERICE-- .

PRECIPITAREA IN GEL DEFINITIE Reactie Ag-Ac care utilizeaza gel de agar sau agaroza ca mediu in care unul sau ambele elemente care intra in reactie (Ag/Ac) difuzeaza. PRINCIPIU Vizualizarea unei zone opace de precipitare la intalnirea in proportie optima a celor doua elemente (Ag/Ac) . diametrul moleculelor de Ag si Ac fiind mai mic decat diametrul porilor gelului.

Este o reactie de mare sensibilitate si specificitate.PRECIPITAREA IN GEL SCOP Evidentierea fractiunilor antigenice multiple dintr-un amestec antigenic. Utilizeaza cantitati mici de reactanti. .

OUDIN .PRECIPITAREA IN GEL SIMPLA DIFUZIE—RC.

MANCINI .PRECIPITAREA IN GEL SIMPLA DIFUZIE – RC.

PRECIPITAREA IN GEL SIMPLA DIFUZIE-RC MANCINI .

OUCHTERLONY .PRECIPITAREA IN GEL DUBLA DIFUZIE RC.

PRECIPITAREA IN GEL DUBLA DIFUZIE TESTUL ELEK .

PRECIPITAREA IN GEL DUBLA DIFUZIE TEST ELEK .

TESTAREA REZISTENTEI MICROBIENE LA ANTIBIOTICE ANTIBIOGRAMA CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP10 .

ANTIBIOTIC • substanta de origine: • biologica • semisintetica • sintetica (chimioterapic) cu activitate SELECTIVA impotriva bacteriilor potential utilizabil in tratamentul infectiilor .

SUBSTANTE TEST • reprezentanti ai unui grup de antibiotice care sunt in mod special potrivite pentru investigatii in vitro • reprezinta in mod optim spectrul de activitate al grupului • permit utilizarea unui numar minim de substante pentru testare .

in aproape toate cazurile . • dar rezultatele obtinute prin testarea altor antibiotice poate fi utila in identificarea mecanismelor de rezistenta (citire interpretativa) si identificarea tendintelor epidemiologice. • aceasta este posibil numai daca clinicienii pe care ii serveste laboratorul au o politica restrictiva. .SUBSTANTE TEST • ideal. trebuie sa testam antibioticul care va fi utilizat in terapie.

.1. pentru care s-a demonstrat ca raspund unui regim terapeutic standard atunci cand sunt implicate intr-o infectie.2.CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN a. Susceptibil (S) – sensibil a. Sensibilitate microbiologica: bacteriile sensibile sunt cele care apartin celei mai sensibile subpopulatii si carora le lipsesc mecanismele de rezistenta. uneori denumite populatie bazala (sensibila) a. Sensibilitate clinica: bacteriile sensibile sunt acele bacterii. definite prin parametrii in vitro.

v. care desi prezinta un mecanism de rezistenta de nivel jos.CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN . raspund de obicei la regimuri terapeutice standard. microbiologic) .p.bacterii sensibile la limita (“border – line”) sau moderat sensibile. .d.bacterii integral sensibile (sensibile d.

In cazul rezistentei la macrolide demonstrate in prezenta unei lincosamine). Termenul utilizat poate fi “moderat sau inalt rezistent” sau “rezistenta de nivel jos sau inalt”. Rezistent b.CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN b. . Rezistenta microbiologica: acele microorganisme care poseda orice mecanisme de rezistenta demonstrate fenotipic sau genotipic. Rezistenta disociata poate fi demonstrata fenotipic numai in prezenta unui al – II – lea antibiotic (ex.1. Rezistenta de nivel inalt este asociata cu lipsa sinergiei intre antibioticele β – lactam si aminoglicozide pentru enterococi.

CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN b. .2. Rezistenta clinica: apare cand este foarte putin probabil ca infectia sa raspunda chiar la doze maxime la un anumit antibiotic.

macrolide etc. β – lactamine. se aplica antibioticelor din aceeasi clasa chimica (ex.CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN b. aminoglicozide. mecanismele de rezistenta cum sunt cele care rezulta ca urmare a impermeabilitatii sau efluxului pot afecta mai multe clase chimice.3. In sens strict. . fenomen denumit uneori “rezistenta asociata”.). Rezistenta incrucisata: absenta completa sau partiala a sensibilitatii la un grup de antibiotice. Totusi.

Infectiile cauzate de astfel de bacterii raspund variabil sau indeterminat la chemoterapie. Intermediar: bacterie care apartine grupului de tulpini care se situeaza intre tulpinile clinic sensibile si clinic rezistente.CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN c. dar pot fi eliminate daca antibioticul este concentrat la locul infectiei sau daca se creste doza. .

un astfel de microorganism poate fi descris prin antibiograma RRRS pentru secventa predefinita de antibiotice. Ex.CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN d.: o bacterie rezistenta la: penicilina streptomicina tetraciclina. Profilul de sensibilitate / rezistenta si antibiograma: Acestea descriu pattern –ul de sensibilitate la o serie de antibiotice. . dar sensibila la: eritromicina poate fi descrisa ca avand profilul de rezistenta PST. Optional.

Citire interpretativa: citirea interpretativa a datelor de sensibilitate este deductia mecanismelor biochimice de rezistenta sau a interferentei sensibilitatii sau rezistentei clinice pe baza fenotipului observat.CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN e. .

facultativ – anaerobi. pattern-ul de sensibilitate care defineste spectrul original. strict anaerobi • Rezistenta dobandita poate modifica.SPECTRU • caracterizeaza profilul activitatii unui agent antibacterian asupra unor variate specii bacteriene sau grupuri de specii ex: Gram (+). . Gram (-). aerobi. din timp in timp si din loc in loc.

pe baza carora bacteriile pot fi incadrate in categoriile clinice: “susceptibil (sensibil)” “intermediar” “rezistent”. . Desemnarea ca “intermediar” ofera de asemenea un spatiu de joc din punct de vedere tehnic.PUNCTE DE RUPTURA (BREAKPOINTS) • valori specifice ale unor parametri cum sunt: concentratiile minime inhibitorii (CMI) sau zonele de inhibitie. care minimizeaza confuzia intre microorganismele cu CMI apropiat de punctul de ruptura.

de obicei exprimata in µg/mg. • Concentratia: cantitatea dintr-un agent antimicrobian intr-un volum definit de lichid. preferabil de exprimat in mg/l sau intr-o masa definita dintr-un solid.PROPRIETATILE ANTIBIOTICELOR • Potenta: cantitatea de agent antibacterian activ dintr-o substanta test determinata cu ajutorul unui test biologic. exprimata in µg/g. .

9% (3 log. exprimata in mg/l. care. exprimata in mg/l.) numarul de microorganisme dintr-un mediu continand un numar definit de microorganisme. .ACTIUNE ANTIBACTERIANA • Concentratia minima inhibitorie (CMI): cea mai joasa concentratie. previne cresterea bacteriilor intr-o perioada definita de timp. in conditii in vitro definite. • Concentratia minima bactericida (CMB): cea mai mica concentratie de antibiotic. intr-un interval definit de timp. care in conditii definite in vitro reduce cu 99.

. • Farmacodinamica: studiul relatiei intre parametri farmacocinetici si magnitudinea si durata raspunsului patogenului.PROPRIETATILE ANTIBIOTICELOR • Farmacocinetica: studiul concentratiilor unui antibiotic in timp si in diferite compartimente ale organismului. dupa administrarea unei doze date din acel antibiotic.

• Efect aditiv al unei combinatii de antibiotice este acela in care efectul combinatiei este egal cu acela al sumei efectelor componentelor individuale. .EFECTUL COMBINATIILOR DE ANTIBIOTICE in vitro • Efect indiferent al unei combinatii de antibiotice sau de antibiotice si substante inactive este acel efect egal cu efectele celui mai activ component.

. • Antagonismul este prezent daca se observa reducerea efectului unei combinatii de antibiotice in comparatie cu efectul individual al celei mai active substante.EFECTUL COMBINATIILOR DE ANTIBIOTICE in vitro • Actiunea sinergica a unei combinatii de antibiotice sau de antibiotice si substante inactive este prezenta daca efectul combinatiei depaseste efectele aditive ale componentelor individuale.

TULPINI DE REFERINTA • bacterii catalogate. caracterizate. cu fenotipuri de sensibilitate la antibiotice stabile. definite. • se utilizeaza pentru controlul intern de calitate. .

dar concentratiile de antibiotic sunt crescatoare (de obicei. – volume identice de solutie de antibiotic. Micrometoda: placute de microtitrare – volum < 500 µl . in progresie geometrica) – un inocul definit Scop: determinarea celei mai joase concentratii care inhiba cresterea bacteriana (CMI) Macrometoda: tuburi .METODE DE TESTARE A SENSIBILITATII • Dilutie in bulion: tehnica in care se introduc in recipiente: – volume identice de bulion inoculat.volum minim de 2 ml.

.METODE DE TESTARE A SENSIBILITATII • Dilutie in agar: incorporarea unui agent antimicrobian in mediu cu agar solid sau semisolid. in progresie geometrica a concentratiilor si aplicarea unui inocul bacterian definit pe suprafata mediului cu agar. Scop: determinarea celei mai joase concentratii care inhiba cresterea bacteriana (CMI).

METODE DE TESTARE A SENSIBILITATII • Metoda difuziei in agar: difuzia antibioticului din discuri. tablete. . strip-uri (benzi) in medii solide inoculate cu cultura bacteriana da nastere unor zone de inhibitie ale caror diametre sunt in corelatie cu CMI ale bacteriei.

metoda E – test. .TEMA PENTRU STUDENTI • Pregatiti pentru ora viitoare o prezentare in format Power Point. despre antibiograma difuzimetrica cu discuri de antibiotice.ppt. metoda dilutiilor! .

ANTIBIOGRAMA Tipuri de antibiograme .

. • Astfel se caracterizeaza capacitatea acestora de a opri dezvoltarea microbiana si da informatii pentru selectarea celui sau celor mai active antibiotice fata de microorganismul testat.DEFINITIE • Prin antibiograma se intelege testarea sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolate dintr-un produs patologic fata de diverse antibiotice.

• Termenii de antibiotic si chimioterapic se folosesc ca sinonimi. cerind respectarea unor conditii bine determinate: . • Introducerea unui antibiotic in terapie este o mare responsabilitate medicala.

prin izolarea in cultura pura si prin identificarea agentului patogen. .1. se poate administra un antibiotic (inainte de efectuarea antibiogramei) dar numai dupa recoltarea produselor patologice. In cazuri de extrema urgenta. Antibiograma se face dupa stabilirea diagnosticului etiologic.

2. alegind antibioticul cel mai eficace. adica fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate. . Tratamentul se realizeaza in functie de rezultatele date de antibiograma.

Apoi in cursul tratamentului datorita dezechilibrului din populatiile microbiocenozelor. Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul cu antibiotice este de durata mai lunga.3. . aceasta deoarece agentul patogen poate sa cistige rezistenta fata de antibioticul utilizat. poate sa se produca o infectie supraadaugata cu o bacterie din aceste microbiocenoze.

. fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic.• Principiul antibiogramei consta in capacitatea antibioticelor de a impiedica multiplicarea bacteriana. • Unele antibiotice au in anumite concentratii si proprietatea de a omori bacteriile: efect bactericid.

Metode folosite pentru testarea sensibilitatii in vitro la antibiotice metode calitative – metoda difuzimetrica Kirby Bauer . Franta .clasica – metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid – kit-ul comercial ATB Biomerieux.moderna • metode cantitative moderna – metoda dilutiilor in mediu lichid . Suedia – .clasica – metoda Etest – AB BIODISK .

pe care s-a insamintat in pinza cultura bacteriana. apoi pe suprafata mediului se dispun discuri cu antibiotice astfel ca in jurul acestora se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a antibioticului ( in imediata vecinatate a discului realizindu-se o concentratie mai mare de antibiotic care descreste pe masura indepartarii de acesta ).Metoda difuzimetrica(Kirby-Bauer) • Aceasta se efectueaza pe medii solide. . in placi Petri.

Metoda difuzimetrica(Kirby-Bauer) • Metoda difuzimetrica. cu toate ca nu stabileste concentratia minima infibitorie (CMI). . da informatii pretioase asupra sensibilitatii speciei testate fata de antibioticele utilizate si este folosita mai frecvent in laboratorele clinice.

. pentru Streptococcus pyogenes se foloseste geloza singe ). • Pentru bacterii cu necesitati de cultura speciale. se utilizeaza medii adecvate ( de ex.Tehnica de lucru • Mediul de cultura indicat este geloza Müller-Hinton deoarece are o valoare nutritiva care permite dezvoltarea optima a unei mari varietati de bacterii si nu contine inhibitori ai actiunii unor antibiotice.

se determina turbiditatea culturii corespunzatoare etalonului 0. . se insaminteaza in bulion.5 McFarland ( cu ajutorul scariiMcFarland cu sulfat de bariu sau automat pe densitometru ).Tehnica de lucru • Coloniile izolate (5 colonii) obtinute din produsul patologic. care se incubeaza la 37 °C ( ~ 5-10 min.).

de la etalonare .Tehnica de lucru • Se insaminteaza placile in maxim 15 min. (niciodata mai mult de 15 min. se lasa placa insamintata 3-5 min. .) pentru adsorbtia inoculului. mai bine un dispersor automat de discuri. • Se depun discurile cu substante antibicrobiene la distanta de minimum 15 mm de marginea placii si 30 mm intre centrele a doua discuri vecine folosind o pensa sau.

. • Control de calitate : testeaza pe alta placa.Tehnica de lucru • Se incubeaza placile la 37° C pentru 16-18 ore. in aceleasi conditii . tulpina de referinta adecvata.

tuburi cu discuri impregnate cu antibiotice in diferite concentratii.Dispersor de discuri pentru antibiograme. placa cu agar Müller-Hinton pentru realizarea antibiogramei difuzimetrice .

pe fond negru mat.Citirea si interpretarea • Se masoara cu sublerul sau cu rigla gradata in mm . in lumina reflectata. iar in cazul mediilor cu singe pe suprafata agarului. . • In cazul mediilor transparente se masoara pe spatele placilor. diametrul zonelor de inhibitie completa .

.

Antibiograme pe mediu Müller-Hinton .

.

Antibiograma pe geloza singe .

• In situatia in care se observa chiar si o singura colonie in interiorul zonei de inhibitie.• Aspectul Zonei de Inhibitie trebuie sa fie clar si cu contur net. indiferent de diametrul zonei de inhibitie (vezi figura ) . se va considera rezistenta la acel antibiotic.

.

.

.

cu conditia verificarii diametrelor si la 16-18 ore. • Se verifica daca diametrele zonelor de inhibitie ale fiecarei substante antimicrobiene sint cuprinse in limitele variatiei admise conform tabelelor de interpretare furnizate impreuna cu discurile. .• In caz de urgenta . se poate citi antibiograma dupa 5-6 ore de incubare.

.INTERPRETARE • Se interpreteaza astfel : Sensibil S • Intermediar I • Rezistent R • in functie de valorile din tabelele de interpretare.

.

Metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid – kit-ul comercial ATB Biomerieux. din care 2/4 nu conţin antibiotice/antifungice şi sunt martori de creştere. • Celelalte perechi de godeuri conţin diferite antibiotice în cite două concentraţii (c = concentratie mai mica şi C = concentratie mai mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpină testată ca fiind sensibilă. Franta • Principiu • Galeria ATB permite determinarea sensibilităţii microbiene la un set de agenti antibacterieni / antifungici . . Este alcătuită din 16 perechi de godeuri. intermediară sau rezistentă. incorporate într-un mediu semisolid.

daca exista creştere numai în godeul cu concentraţia mai mică c înseamnă sensibilitate intermediară.Din tulpina de testat este preparată o suspensie care este transferată în mediul de cultură cu care este inoculată galeria ATB.Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa 2448 ore de incubare la 37°C. Franta . . • Citire si Interpretare .Dacă nu există creştere la nici o concentraţie înseamnă tulpină sensibilă.Metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid – kit-ul comercial ATB Biomerieux. . daca exista creştere în ambele godeuri (c şi C) semnifică rezistenţă la respectivul agent antimicrobian.

.

cu 15 dilutii intre 0.016 si 256 µg/ml sau 0. iar pe cealalta suprafata este marcata scala de lectura in µg/ml corespunzatoare CMI . neporos.E-Test • E -Testul imbina acuratetea testarii cantitative si simplitatea testarii difuzimetrice cu mare economie de timp . . • Pe suprafata unei langhete/bandelete de 5 mm/50 mm din plastic inert. este fixat un gradient exponential de antibiotic . desicat si stabilizat.002 si 32 µg/ml.

CMI este indicata de intersectia dintre zona eliptica de inhibitie a culturii si scala de gradiente a langhetei . Dupa incubare corespunzatoare.E-Test • Pe suprafata unei placi cu mediu agarizat preinsamintata cu tulpina testata in conditii standardizate sint depuse radiar langhetele/bandeletele cu antibiotic.

fata de ampicilina in meningitele determinate de H. a enterococilor fata de aminoglicozide cu depistarea rezistentei cu nivel inalt. reproductibil si permite determinarea concomitenta. supravegherea pacientilor pe parcursul terapiei antimicrobiene pentru a surprinde selectarea de clone rezistente ( ex. testarea pneumococilor fata de β-lactamine. testul este fiabil. a CMI ale mai multor antibiotice pentru bacterii aerobe sau anaerobe. pe aceeasi placa. a enterobacteriaceelor producatoare de βlactamaze cu spectru extins ). influenzae. .E-Test • Desi scump.

.

.

.

. In acest fel se determina ceea ce se cunoaste sub denumirea de concentratie minima inhibitorie ( CMI ). indicind concentratia de chimioterapice sau antibiotice necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale.Metoda dilutiilor in medii lichide • Aceasta urmareste determinarea limitei de sensibilitate a germenului fata de substanta data.

• Pentru fiecare antibiotic se fac dilutii de pornire.Tehnica de lucru • In dilutii crescinde de chimioterapice si antibiotice facute direct din mediul de cultura lichid se insaminteaza cantitati egale din cultura de cercetat. stabilindu-se dilutia maxima a substantelor in prezenta careia tulpina este inhibata. .

etc. cea pentru streptomicina de 100 µg/ml. Mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat 2% preparat fara peptona daca se testeaza actiunea sulfamidelor. pentru cloramfenicol 50 µg/ml. .Tehnica de lucru • Concentratia initiala pentru penicilina este 100 UI/ml.

care se insaminteaza in cantitati egale ( cite o picatura ) in toate dilutiile de antibiotic. fiecare se repartizeaza cite 1 ml bulion glucozat. • Pentru dilutii se utilizeaza 10 tuburi.Tehnica de lucru • Microorganismul testat se cultiva in bulion glucozat. iar din cultura de 18-20 ore se face o dilutie de 1/100. .

Tehnica de lucru • In primul tub se adauga 1 ml din solutia de antibiotic. Dupa omogenizare se trece 1 ml in al doilea tub si asa mai departe pina la tubul 9 de unde se indeparteaza 1 ml de solutie. • Citirea se face dupa o incubare la 37° C . timp de 18-20 ore. . Tubul 10 este proba martor care serveste pentru controlul dezvoltarii tulpinii in mediul utilizat . Se insaminteaza tuburile cu cite o picatura din cultura testata.

Citire si interpretare • Ultimul tub limpede indica limita sensibilitatii germenului. fata de substante sau concentratia minima inhibitorie activa ( CMI). Adaugind la mediu un indicator de ph ( rosu fenol ) se poate reduce timpul de citire a rezultatelor la 3-6 ore intrucit virarea culorii mediului in urma modificarii ph-ului datorita dezvoltarii microbiene ( ph acid ) apare mai rapid decit tulburarea lui. .

½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 .•Metoda dilutiilor succesive in mediu lichid • Citire si interpretare Dilutia din ultima eprubeta in care nu exista crestere bacteriana (mediul este limpede) reprezinta valoarea CMI.

Discutii • Metoda dilutiilor in medii lichide este tehnica cea mai precisa de determinare a sensibilitatii microorganismelor la antibiotice si chimioterapice si in plus permite determinarea concentratiilor bacteriostatice si bactericide ale substantelor testate. .

ajuta la aprecierea corespondentei intre eficacitatea in vivo si in vitro a substantei utilizate. • Astfel se poate stabili daca concentratia substantei se mentine in umorile organismului la un nivel activ. .Discutii • Dozarea chimioterapicelor si antibioticelor din umorile organismului este necesara pentru evaluarea in vivo a eficientei unui tratament cu chimioterapice sau antibiotice. permite controlul modului si ritmului de administrare . etc.

• Lipsa dezvoltarii bacteriene in aceste tuburi indica efectul bactericid al antibioticului testat. .Discutii • Aprecierea efectului bactericid prin metoda dilutiilor se realizeaza astfel: din ultimele 2 eprubete in care dezvoltarea a fost inhibata. tuburi cu mediu similar. se insaminteaza cu un inocul mic. dar fara antibiotic.

Concluzii • Antibiograma este una dintre cele mai utile determinari de laborator care aduce informatii pretioase privind atitudinea medicului in terapia cu antibiotice. .

Concluzii • Antibiogramele se vor repeta ori de cite ori o dicteaza evolutia clinica dupa tratamentul cu antibiotice si eventual se vor utiliza asociatii de antibiotice pentru a obtine un efect terapeutic mai promt si prevenirea instalarii rezistentei bacteriei la antibiotice si chimioterapice. .

.

the VITEK 2 Compact uses the same technology as the VITEK 2 to deliver results the same day. is expected to bring these advantages to small and mid-size laboratories. VITEK® 2 Compact. but with a smaller footprint. • Currently awaiting approval by the Food and Drug Administration (FDA). .VITEK 2 Compact Brings Rapid ID/AST Testing to Labs • The newest product by bioMérieux Inc.

The system was designed to introduce workflow efficiencies and sophistication for larger laboratories. but its clinical applications were realized and developed by what became the VITEK subsidiary of the company.• The original VITEK was developed by the McDonnell Douglas Corp of St. for the aerospace program. Louis. a French company. Mo. In 2001. The product was sold to bioMérieux. in 1992. the company began development of the VITEK 2 Compact to offer the technology within a smaller unit. • bioMérieux immediately set out to bring the product to the next level and introduced the VITEK 2 in 1998. . before McDonnell Douglas’ merger with Boeing.

. • The new photometric technology in the instrument takes advantage of advances in optics to detect changes in growth for each well. The optical system reads the wells every 15 minutes. The system also can identify an organism’s phenotype based on the antibiotic susceptibility through pattern recognition using the Advanced Expert System (AES). with representative antibiotics in each well.How It Works • The VITEK 2 and VITEK 2 Compact use a standard inoculum to prepare an organism suspension and sophisticated algorithms to analyze parameters and test conditions. A variety of susceptibility cards used in the instruments are available to allow an institution to match the susceptibility testing to its pharmacy antibiotic formulary. • Each susceptibility card contains 64 small-volume wells.

but validation requires a laboratory technologist.• According to Donahoe. “Roughly 80% of identification and susceptibility results are delivered in 6 hours. In addition. 90% within 8 hours. portions of the setup and process can be completed by a low-level technologist or technician.” he says. but it does eliminate a number of manual steps. The AES helps with verification.” . the expanded menu eliminates the need to run extra tests • Donahoe reports that the mean time for result delivery is 6–8 hours. allowing consistent handling of the test process as well as time and cost savings. “This means that nine of ten patients could have their results in 8 hours or less.” Donahoe says. “This software package puts a PhD-level review in the hands of the small lab. • The VITEK 2 Compact does not feature as much automation as the VITEK 2. which typically lacks the scientist traditionally needed to run this test. though not necessarily one specializing in microbiology.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful