Sunteți pe pagina 1din 77

1.

INTRODUCERE

n domeniul observaiei, hazardul nu favorizeaz dect minile pregtite - L. Pasteur Existena lumii microbiene a rmas necunoscut pn la inventarea microscopului la nceputul secolului al XVII-lea. Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723), savant olandez, a fost primul care a observat cu ajutorul unui microscop rudimentar fabricat de el nsui, particulele invizibile cu ochiul liber: sfere, bastonae, spirili. Microorganismele au fost descoperite n sec. al XIX-lea i clasificate n regnul vegetal. Haeckel (1866) propune crearea regnului Protista, alturi de cel animal i vegetal. Astfel, el regrupeaz organismele unicelulare sau pluricelulare care nu formeaz esuturi difereniate n: alge, ciuperci, protozoare i bacterii. n 1978, fiinele vii au fost clasificate n 5 regnuri, dup Whittaker i Margulis: (Prokaryotae, Protoctista, Fungi, Plantae i Animalia), urmnd ca , odat cu dezvoltarea biologiei moleculare, C. Woese s propun, n 1990, o nou clasificare n trei domenii: Archaea, Bacteria i Eucarya. Microbiologia este tiina care se ocup cu studiul microorganismelor, fiine unicelulare sau multicelulare microscopice. Aceast tiin biologic este scindat n mai multe specialiti: micologie, bacteriologie, virologie, algologie, protozoologie.

2. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE - GENERALITI

Laboratorul de microbiologie trebuie s cuprind dou compartimente: - o sal de pregtire a mediilor i obiectelor de lucru i de decontaminare, coninnd mese, un autoclav, o etuv, un congelator i un frigider (care va fi utilizat i pentru pstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticlria, mediile de cultur precum i reactivii. - o sal de lucrri propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la adpost de curenii de aer, dotat cu mese cu suprafa neted, rezistent, impermeabil, cu conducte de gaz i prize electrice, un sistem de vid i de aer comprimat i o hot sterilizabil, cu radiaii ultraviolete (eventual o hot cu flux laminar). n msura n care este posibil, n legtur cu aceast sal, ar trebui s existe anexe prevzute cu termostate la diferite temperaturi ( 250C, 300C, 370C, 440C, 550C). Manipulrile de culturi microbiene sau de produse susceptibile s conin microorganisme se efectueaz innd cont de unele tehnici particulare prin care s se evite cele dou tipuri de contaminare: 1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit personalului sau mediului inconjurtor; 2. contaminarea personalului sau a mediului nconjurtor de ctre microorganismele studiate. In laboratorul de microbiologie, operaia de baz este transferul de microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrare ce se execut n zona steril de protecie din jurul flcrii becului de gaz. Sticlria cel mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n eprubete de diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, plci Petri, pipete Pasteur i pipete gradate. n ultima perioad sunt din ce n ce mai mult utilizate recipientele i pipetele din plastic, de unic folosin. Pentru prelevarea i inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau firul metalic, fabricate din nicrom. Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform a inoculului pe suprafaa mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub sau a unei baghete din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi ntrebuinate o serie de alte instrumente, n funcie de operaia efectuat. Laboratorul de microbiologie trebuie s aib n dotare urmtoarele aparate i echipamente:

robinet cu ap cald i rece, de preferin acionat cu piciorul; hot cu flux laminar sau ni sterilizabil, indispensabil lucrrilor de microbiologie bec de gaz tip Bunsen pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con albastru i pentru sterilizarea ansei etuv pentru sterilizarea sticlriei autoclav pentru sterilizarea mediilor de cultur i pentru decontaminarea obiectelor baie de ap termostatat frigidere pentru conservarea mediilor i a culturilor balane

termostat bacteriologic pentru incubarea culturilor


pH-metru microscoape

3. TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru pregtirea materialului de lucru i a mediilor de cultur. Un produs este considerat steril cnd nu mai conine forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuie tratate. n laboratorul de microbiologie de analize de rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai ntrebuinat.

STERILIZAREA PRIN CLDUR Cldura umed Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeul de autoclavare. Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 1210C. Aceasta este metoda cea mai eficient de sterilizare. Autoclavul permite: - pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor; - decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C). Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc, trebuie neaprat distruse. Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin,n mod separat. Timpul de sterilizare Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru analizele de rutin.

Materialul

Temperatura (0C)
4

Presiunea (barr)

Timp (minute)

sterilizat Sticlrie curat Ap , ser fiziologic Parafin Sruri minerale Medii curente (bulion nutritiv, geloz nutritiv) Lapte degresat Medii coninnd substane termolabile (ex. glucide) Glucoz n soluie

121 121 121 121 121

1 1 1 1 1

20 20 20 20 15 - 20

115 110

0,7 0,5

15 20

110

0,5

20

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au fost ndeplinite condiiile de sterilizare. Pasteurizarea Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul 560C - 850C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu umed, n funcie de produs. n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate. Tyndalizarea Tyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii: nclzire la 560C (pn la 800C) timp de 1 or, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore. Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substane termolabile. Cldura uscat
5

Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer cald (etuve). Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400C sau 1 or la 1800C. Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor. ALTE PROCEDEE DE STERILIZARE Sterilizarea prin filtrare Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni. Sterilizarea prin gaze toxice Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic folosin din industrie. Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor Radiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate : - pentru sterilizarea apei - pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiant

Radiaiile gamma Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii.
6

Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri.

3.1. PREGTIREA I STERILIZAREA STICLRIEI N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz. Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt: - splarea - uscarea - executarea dopurilor i ambalarea - recipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile pan la 2000C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz prin nurubare. Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de laborator trebuie ambalat i sterilizat corespunztor. Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n conteinere metalice nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri, baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorul trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului fierbinte n obiectele de sterilizat. n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere urm toarele etape:

perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or; perioada de meninere a temperaturii de sterilizare; perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aprox. 2 ore. n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180o C i a
7

unei durate de o or. Din exces de pruden se practic sterilizri la temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. n unele cazuri aceast practic este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar - la durate i temperaturi mari de sterilizare uscat - elibereaz gudroane ce pot inhiba creterea microbian. Materiale utilizate: - pipete; - plci Petri; - eprubete; - flacoane Erlenmayer; - vat hidrofob; - tifon; - hrtie ambalaj; - etuv. Mod de lucru: Se execut dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc in coul de srm i se acoper cu hrtie. Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care s rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf. Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat nfurat n tifon. Toat sticlria se sterilizeaz 1 or la 180 oC la etuv, timp socotit din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se oprete i se ateapt rcirea materialului. 4. EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fr utilizarea microscopului; examenul microscopic joac un rol important n studiul i identificarea germenilor, precum i n determinarea numrului acestora.
8

100 m domeniul microscopiei optice 10 m celule epiteliale globule roii din snge bacterii tipice 1 m micoplasme 100 nm virusuri 10 nm (100 ) proteine 1 nm (10 ) aminoacizi atomi 0,1 nm (1 ) domeniul microscopiei electronice

MICROSCOPUL OPTIC Microscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optic, o platin port-obiect i un sistem de iluminare. Sistemul de transmisie optic

Ocularele au puterea de mrire de 5x, 7x, 10x, 15x, 20x i chiar 30x. n lucrrile curente cele mai des folosite sunt cele 7x i 10x. Ocularele au rolul de a mri imaginea preparatului, dar i de a aplatiza i lumina cmpul optic. Obiectivele reprezint un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe lentile destinate a forma o imagine real a obiectului. Puterea lor de mrire este invers proporional cu distana focal, adic cu distana dintre obiect i lentila pe care se formeaz imaginea. Calitatea esential a obiectivelor este puterea lor de rezoluie. Aceasta la rndul ei depinde de mrimea deschiderii unghiului pe care l face conul de raze care intr n lentil precum i de indicele de refracie al mediului dintre obiect i lentil. Obiectivele sunt fixate prin nurubare pe un revolver port-obiectiv care permite selecionarea rapid a unuia din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare n microbiologie se compune din trei obiective cu puterea de mrire de 10x, 20x, 40x i un obiectiv cu imersie cu grosismentul 90x. Acest obiectiv se folosete n cazul n care obiectul ce trebuie examinat este mai mic sau dac este necesar a se observa amnunte foarte fine. La obiectivul cu imersie este necesar a se interpune ntre obiect i lentila frontal a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru, ulei de parafin, balsam de Canada etc). Sistemul de iluminare se compune din surs luminoas i dintr-un condensator. Condensatorul este o pies care se gsete imediat sub platina microscopului i care are rolul nu att de a strnge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin, ct de a mri seciunea conului de lumin pentru o mai bun claritate a imaginii. Sistemul de reglare Deplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se efectueaz cu ajutorul unei cremaliere, prin intermediul a dou butoane: unul mare care d o micare ampl i rapid (viza macrometric) i altul mic, pentru reglajul fin ( viza micrometric). Modul de utilizare a microscopului Preparatul este plasat pe platina microscopului, avnd grij s fie bine fixat n dispozitivul de prindere. Este selectat obiectivul; n general, un examen debuteaz cu utilizarea obiectivului cel mai mic. n practic, se utilizeaz obiectivul 10x, apoi 20x pentru un preparat necunoscut sau pentru drojdii i mucegaiuri i obiectivul 40x pentru bacterii. Se regleaz distana lentilei obiectivului fa de preparat prin micarea vizei macrometrice i a
10

celei micrometrice. (Obiectivele au o distan de reglare care descrete cu puterea lor). Cutarea imaginii este apoi efectuat prin manevrarea butonului care acioneaz cremaliera, iar dup fixarea imaginii se face o nou reglare a acesteia. Curarea sistemului optic se efectueaz regulat cu xylol i nu cu alcool etilic. Reglarea intensitii luminii condensatorului se face innd seama de puterea de mrire a obiectivelor; cu ct aceasta este mai mare, cu att poziia condensatorului este mai ridicat.

EXAMENUL PREPARATELOR N STARE PROASPT Acest tip de operatie const n examinarea unui microorganism ntr-un mediu lichid ntre lam i lamel.

4.1. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE DROJDII Drojdiile reprezint un grup taxonomic complex i heterogen de microorganisme unicelulare eucariote, care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori. Una din proprietile cele mai importante ale drojdiilor este aceea de a fermenta o serie de zaharuri, n condiii de anaerobioz, cu formare de alcool etilic, dioxid de carbon i compui secundari, care dau aroma caracteristic produselor fermentate, proprietate foarte mult utilizat n industria alimentar. Drojdiile au o compoziie chimic valoroas i, dup cultivare n condiii de aerare sunt utilizate ca surs de proteine cu denumirea de SCP (single cell protein) n alimentaia omului i a animalelor. Celula de drojdie are n mod obinuit form sferic, oval, cilindric, apiculat, sau form de sticl, cu dimensiuni medii de 4 - 14 m. Forma i dimensiunea celulei sunt caractere de specie i pot fi influenate de starea fiziologic i de condiiile de cultivare. Principiul metodei: Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale ale drojdiilor se folosesc preparate microscopice n stare proaspt, studiate la microscop cu obiectivele 10x, 20x, 40x. Materiale utilizate: - ca materiale biologice se vor utiliza o tulpin de Saccharomyces cerevisiae i o
11

tulpin de Candida utilis, cultivate pe mediu cu extract de mal-agar. - lame de microscop; - lamele de microscop - microscop; - pipete sterile; - ans; - eprubete sterile; - albastru de metilen; - alcool etilic 95 %; - ap distilat 100 ml; - sticlu picurtoare.

Mod de lucru
a)

Prepararea colorantului -soluie albastru de metilen

Se cntresc 0,3 g albastru de metilen, peste care se adaug 30 ml alcool etilic 95 %. Dup dizolvarea colorantului n alcool se adaug 100 ml ap distilat. b) Evidenierea caracterelor morfologice De pe suprafaa mediului de cultur se recolteaz cu ansa o poriune din cultura de drojdie care se amestec ntr-o eprubet cu civa ml ap. Din suspensia de celule se depune pe lama microscopic o pictur cu diametrul de ~ 0,7 cm, n zona central, cu ajutorul unei pipete. Se acoper preparatul cu o lamel curat, evitndu-se formarea de bule de aer. Se examineaz la microscop cu obiectivele de 10x, 20x i 40x, reinndu-se forma celulei, prezena nucleilor, prezena celulelor nmugurite. c) Evidenierea celulelor autolizate O suspensie de celule de drojdie se amestec n volume egale cu o soluie de albastru de metilen diluat i dup 3-5 minute se execut un preparat umed: celulele autolizate vor apare intens colorate in albastru, comparativ cu celulele vii, necolorate. ntr-un cmp microscopic se vor determina numrul total de celule i separat, celulele autolizate, fcnduse raportul acestora.

12

4.2. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE MUCEGAI

Mucegaiurile (sau fungii filamentoi) includ microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, cu nutriie de tip absorbtiv, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori sexuai sau asexuai. Corpul mucegaiurilor const din celule filamentoase, ramificate, numite hife, care formeaz miceliul. Mucegaiurile pot fi monocelulare, cnd se dezvolt sub forma unei celule uriae cu ramificaii (miceliu coenocitic) sau pluricelulare, caz n care miceliul este septat prin perei despritori (miceliu necoenocitic). Aparatul reproductor este reprezentat de hifele reproductoare purttoare de spori sexuai sau asexuai. Principiul metodei: Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale -hife vegetative i aparat reproductor - se efectueaz un preparat proaspt ntre lam i lamel sau un preparat n lactofenol, prin tehnica benzii adezive. Materiale utilizate: - culturi de Aspergillus niger i Penicillium sp.n plci Petri ; - lame microscopice; - lamele microscopice; - microscop; - pipete sterile; - ans; - lactofenol; - band adeziv transparent.

Mod de lucru: Se efectueaz un preparat umed ntre lam i lamel, n felul urmtor: din cultura n plci Petri se recolteaz cu ajutorul firului metalic, din partea marginal a coloniei i fr a deranja structura iniial a miceliului, o mic poriune, care se desprinde uor ntr-o pictur de ap steril sau lactofenol de pe lama microscopic. Se aeaz lamela evitnd formarea n preparat a bulelor de gaz i se face studiul cu obiectivele 10x, 20x i 40x. Pentru meninerea ct mai exact a structurii aparatului reproductor, se poate aeza uor banda cu partea adeziv peste cultura de mucegai din placa Petri, apoi se pune peste pictura de lactofenol de pe lama microscopic. Se examineaz cu aceleai obiective. Pentru cele dou
13

tulpini fungice se observ forma hifelor, prezena septurilor hifale, prezena conidiforilor cu organele de fructificaie specifice genurilor Aspergillus i Penicillum.

4.3. EVIDENIEREA MICROSCOPIC A BACTERIILOR

Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot, cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii ntre 0,5 - 8 m, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar, izomorf. Bacteriile au un rol major n natur n transformarea compuilor organici n compui anorganici simpli, prin procesul de mineralizare a materiei organice nevii, contribuind la realizarea circuitelor unor elemente chimice de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor .a. n procesele industriale, bacteriile sunt utilizate drept culturi starter n unele procese fermentative din industria alimentar (fabricarea produselor lactate, n panificaie, la conservarea materiilor prime vegetale), la obinerea de enzime, proteine, aminoacizi, acizi organici, solveni, antibiotice, ngrminte biologice, insecticide , vitamine, hormoni etc. Principiul metodei: metoda se bazeaz pe efectuarea preparatului proaspt ntre lam i lamel din culturi bacteriene obinute din Bacillus subtilis i Lactobacillus sp. Materiale utilizate: - cultur n slanturi de Bacillus subtilis; - cultur de Lactobacillus in mediu lichid (mediul MRS); - lame microscop; - lamele; - ans; - ap distilat.

Mod de lucru: Pe lama microscopic se pune o pictur de ap steril cu diametrul de 0,7 -1 cm. Cu vrful firului metalic se recolteaz steril, la flacra de gaz, o poriune dintr-o cultur de Bacillus subtilis pe agar nutritiv, n eprubete. Cultura se omogenizeaz ntr-o pictur de ap, apoi se ia o lamel curat , se sprijin pe lam la un unghi de 45o , se deplaseaz pn cnd lamela devine tangent la pictur i se las s cad peste aceasta: lichidul n exces
14

se absoarbe cu o hrtie de filtru. Un preparat bun nu trebuie s prezinte bule de aer; acestea pot determina aglomerri de celule i mpiedic o bun observare a proprietilor. Pentru executarea preparatului din culturile lichide de Lactobacillus, se recolteaz din proba omogenizat cu o pipet din care se las s cad pe lam o pictur, care se acoper apoi cu lamela. Se observ cu obiectivele 20x i 40x. Se vor urmri: n ambele cazuri- forma celulelor, eventual formarea de lanuri de bacili; prezena sporilor bacterieni n cazul preparatului cu Bacillus subtilis.

EXAMENUL PREPARATELOR BACTERIENE N STARE USCAT

Efectuarea unui preparat n stare uscat sau frotiu const n etalarea probei de studiat urmat de o uscare, de o fixare i, eventual, de o colorare. Frotiurile sunt realizate frecvent pentru bacterii sau pentru produse care conin bacterii, rareori pentru alte microorganisme.

4.4. TEHNICA DE EXECUTARE A PREPARATELOR USCATE. GRAM

COLORATIA

n anul 1884 Christian Gram a constatat c bacteriile reacioneaz diferit n urma aceleiai tehnici de colorare i pune bazele metodei difereniale de colorare ce i poart numele, prin care bacteriile sunt mprite in dou mari grupe : Gram - pozitive i Gram negative. Aceast afinitate tinctorial diferit fa de colorani este datorat structurii deosebite a peretelui celular la cele dou categorii de bacterii : bacteriile Gram - pozitive se coloreaz n violet prin aceast tehnic, n timp ce bacteriile Gram - negative primesc culoarea roz sau roie a colorantului secundar utilizat. Peretele celular al bacteriilor Gram pozitive const ntr-un strat unitar i omogen de peptidoglican, cu grosimea de 20 - 80 nm. n contrast, peretele celular al bacteriilor Gram - negative este mai complex, format dintr-un strat de peptidoglican de 1 -3 nm nconjurat de o membran extern de 7 - 8 nm.

15

Principiul metodei: Colorarea difereniat a celulelor n funcie de structura peretelui celular, prin metoda Gram, are la baz o tehnic n mai multe etape. n prima etap, celulele sunt colorate cu colorantul bazic cristal-violet, utilizat drept colorant primar. Cea de a doua etap cuprinde tratamentul cu o solutie de I2 / KI, cu rol de mordant, care mrete interacia dintre colorant i componentele celulei. A treia etap este reprezentat de splarea cu alcool-aceton, unde se difereniaz cele dou tipuri de bacterii ; cele Gram pozitive rein cristalul violet, n timp ce bacteriile Gram - negative pierd colorantul primar i devin incolore. n final, acestea din urm sunt colorate cu un alt colorant, secundar, cum este safranina sau fuxina. n acest mod, cele dou categorii de bacterii rmn colorate diferit, putnd fi difereniate n funcie de structura peretelui lor celular. Materiale utilizate: - cultur bacterian; - violet de geniana; - fenol cristalizat; - iod; - iodur de potasiu; - alcool; - aceton; - fuxin sau safranin - ulei de imersie; - lame de sticl; - balan; - pipete; - baloane cotate; - sticlue picurtoare. Mod de lucru: A. Prepararea soluiilor 1. Violet de geniana: - violet de geniana 1 g - fenol cristalizat5 g - alcool etilic 96 %10 ml - ap distilat..100 ml
16

Se tritureaz cristalele n mojar, se adaug cteva picturi de glicerin i treptat, alcoolul, pn devine ca o past, i apoi cantitatea de ap. Se pstreaz 48 ore, dup care se filtreaz i se folosete la colorarea dup Gram. 2. Soluie de Lugol: - iod metalic1 g - iodur de potasiu. 2 g - ap distilat..300 ml Se dizolv iodura de potasiu n 5 ml ap, se adaug cristalele de iod i se dizolv, apoi se adaug restul de ap pn la 300 ml. 3. Fuxina Ziehl: - fuxin bazic1 g - fenol cristalizat5 g - alcool etilic 96%10 ml - ap distilat.100 ml Se tritureaz cristalele n mojar, se amestec cu cteva picturi de glicerin, se adaug alcoolul treptat, pn se formeaz ca o past i se adaug ap distilat. Se filtreaz dup un repaos de 48 ore. Pentru soluia diluat se face un amestec cu ap distilat n proporie de 1/10. B. Etapele de obinere a frotiurilor colorate sunt urmtoarele:

Pregtirea lamei: Lama perfect curat se sterilizeaz prin treceri consecutive ale ambelor fee prin flacra becului de gaz i se las s se rceasc pe stativ, n poziie nclinat.

Etalarea suspensiei de celule: Preparatul se realizeaz n pictur de ap steril n care se suspend celulele recoltate cu firul de inoculare. Suspensia de celule se ntinde prin deplasarea firului ansei tangent cu lama, ntr-un strat uniform. Preparatul de pe lama pe care s-a fcut etalarea i uniformizarea materialului biologic poart numele de frotiu.

Uscarea frotiului: Dup uniformizare, frotiul se aeaz pe stativul de uscare sau se menine n curentul de aer cald, la distan de flacra becului de gaz, pentru a se produce evaporarea lichidului i ataarea celulelor bacteriene de suprafaa lamei.

Fixarea frotiului const n omorrea i aderarea la lam a celulelor microbiene.


17

Fixarea prin cldur se face trecnd frotiul uscat de trei ori, cu o micare lent, prin flacra becului de gaz, cu faa opus celei pe care se afl preparatul.

C. Tehnica de colorare const n urmtoarele:

Frotiul uscat i fixat se acoper cu violet de geniana, care se menine 1-2 minute, dup care se scurge i se cltete cu ap. Frotiul se acoper cu solutie Lugol, cu rol de mordant, timp de 1 minut; se scurge i se cltete cu ap; Splarea frotiului n 2-3 rnduri, cu picturi din amestecul de alcool-aceton (3/1); Frotiul se spal cu ap n jet subire i se coloreaz cu o soluie de fuxin diluat (1/10), care se menine pe preparat 1-2 minute, se scurge excesul de colorant, se spal cu ap;

Uscarea frotiului i examinarea preparatului cu obiectiv de imersie.

Celulele Gram pozitive [G(+)] vor apare colorate n violet, celulele Gram negative, [ G(-)], n rou. 4.5. DETERMINAREA DIMENSIUNII CELULELOR CU AJUTORUL SCALEI MICROMETRICE

Principiul metodei: Msurarea diametrului celulelor, sporilor sau hifelor poate fi efectuat utiliznd un sistem ocular-obiectiv prevzut cu un micrometru ocular i un micrometru obiectiv. Micrometrul ocular este o plcu rotund din sticl foarte clar, pe care este gravat o scar micrometric. Acesta se introduce n tubul ocularului microscopic, cu faa n jos, dup deurubarea lentilei superioare. Scara micrometric este divizat n 50 de diviziuni egale notate de la 0 - 50, din 10 n 10. Valoarea unei diviziuni a scrii micrometrice variaz de la microscop la microscop, dar i n funcie de obiectivul folosit la examinare. De aceea este necesar ca aceste valori s fie determinate pentru fiecare microscop n parte i, la acelai microscop, pentru fiecare combinaie ocular - obiectiv. Etalonarea se face cu ajutorul unei lame speciale numit micrometru obiectiv sau lam micrometric, pe care este de asemenea gravat sau fotografiat o scar lung de 1
18

mm i divizat n 100 pri. Spre deosebire de scara micrometric a ocularului, valoarea unei diviziuni de pe lama micrometric este cunoscut, fiind egal cu 1 / 100 dintr-un milimetru, adic cu 10 micrometri. Deci intervalul dintre dou diviziuni de pe lama micrometric este egal cu 10 micrometri.

Materiale utilizate: - micrometru obiectiv (0,01 mm); - micrometru ocular; - microscop; - culturi de drojdii i mucegaiuri; - lame microscopice; - lamele microscopice; - ac de inoculare.

Mod de lucru: Etalonarea scrii micrometrice Se aeaz lama cu micrometrul obiectiv pe platina microscopului i se introduce ocularul micrometric n ocularul stng al microscopului, cu faa in jos. Se prinde n cmpul microscopului scara micrometric a obiectivului (cu linii groase) i se pune la punct pn ce apare foarte clar vizibil. Se caut s se suprapun cele dou scri micrometrice aflate acum n cmpul microscopului (aceea cu linii groase i mai mari fiind scara obiectivului i aceea cu linii mai mici i subiri, scara ocularului). Se rotete ocularul cu scara micrometric astfel nct s se suprapun exact peste scara obiectivului. Se caut cte diviziuni ale micrometrului obiectiv sunt acoperite exact de diviziunile micrometrului ocular. Practic se procedeaz astfel: se caut prima diviziune a scrii obiectivului, care se suprapune exact peste una din liniile subiri ale scrii oculare. Se numr a cta diviziune a micrometrului ocular se suprapune din nou exact peste o diviziune a micrometrului obiectiv. Pentru stabilirea valorii unui interval dintre dou diviziuni ale ocularului micrometric (care se mai numete i indice sau coeficient micrometric), se calculeaz astfel: dac o diviziune a obiectivului micrometric este egal cu 0,01 mm, atunci fiecare diviziune a micrometrului ocular va fi egal cu 0,01/ nr de diviziuni dup care se suprapun. Etalonarea micrometrului ocular se va face pentru obiectivele 20x i 40x, astfel: dac n gradaii de pe ocular corespund la una sau p gradaii de pe obiectiv, o singur gradaie de
19

pe ocular va avea valoarea 0,01/q sau (p/q) 10-2 mm. Prin acelai procedeu se determin indicele micrometric al fiecrui microscop, pentru toate combinatiile ocular-obiectiv, care se scriu apoi pe o list ce se aeaz n interior, pe ua cutiei microscopului. Pentru msurarea dimensiunilor celulei se va aeza preparatul microscopic proaspt ntre lam i lamel, pe platina microscopului i suport, se va poziiona astfel nct s poat fi determinat numrul de gradaii de pe ocular, corespunztor diametrului mare i diametrului mic, rotindu-se ocularul i dispozitivul de poziionare al platinei-port obiect. Cunoscndu-se valoarea unei diviziuni {(p/q) 10-2} i numrul de diviziuni citite pe scal, se va determina valoarea dimensiunii celulei: (n p/q) 10-2 mm.

5. PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR DE CULTUR

Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze substanele i energia necesare n procesele de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale. Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s corespund din punct de vedere nutritiv,

s aib o concentraie a substantelor dizolvate care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei s nu conin substane toxice, s aib un anumit pH s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai celulele introduse prin inocul. Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica industrial i

sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit. n tehnica de laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru ntreinerea culturilor selecionate. n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de biomas sau a unor compui de natur microbian.

20

Dup scopul utilizrii lor, mediile de cultur se mpart n:


* *

medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de specii medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns de

microorganisme
*

medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n funcie de anumite

caractere biochimice
*

medii de mbogire destinate separrii i cultivrii unor microorganisme

pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus *
*

medii de conservare medii de cultur industriale Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n 3

categorii:
*

medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o compoziie chimic

nedefinit n mod exact;


*

medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap distilat, cu o

compoziie perfect determinat;


*

medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite, dar i din

produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).

Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt: 1. Extracte de carne i macerate Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea utilizat pentru preparare. 2. Extracte de drojdie Aceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile (vitamine din complexul B). 3. Peptone i hidrolizate Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n urma aciunii enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: pepton pepsic din carne, pepton
21

tripsic din cazein (cu coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic de carne, pepton papainic de soia, peptone compuse. Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte. 4. Agar-agarul sau geloza Agar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii (Rhodophyceae) din genul Gelidium i Gracilaria, recoltate n mrile Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la o temperatur n jur de 900C i se solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur. Nu este degradat de microorganismele obinuite. Este comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarte impur), sub form de paiete (mai puin impur), sau sub form de pulbere. Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea mediilor de cultur de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid). Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compozitia acestor medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahrului i care conine 45 55% zaharoz, diferite tipuri de finuri, cereale boabe, zer bogat n lactoz, tre etc. Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug fosfai, sulfai, cloruri etc. Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de cretere, se adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de drojdie, extract din radicele de mal i germeni de gru i porumb.

5.1. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NTRETINEREA BACTERIILOR, DROJDIILOR I MUCEGAIURILOR

Materiale utilizate: - balan cu precizie de 0,1 g; - pahare Berzelius; - sit azbest;


22

- agar nutritiv pulbere; - mediu de cultur extract de mal - agar pulbere; - mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere; - eprubete cu dop, sterile; - pipete de 10 ml; - flacoane Erlenmayer; - bec de gaz; - autoclav cu gaze.

Mod de lucru: Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 ml mediu pentru baloanele Erlenmayer. n cazul n care nu exist medii deshidratate, procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin cntrirea componentelor pentru volumul final dorit. Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 l, pn la completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz cte 10 ml n eprubete sterile, prevzute cu dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se acoper cu hrtie. n mediu se determin pHul i, dac este necesar, se ajusteaz la valoarea dorit. Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific la rcire. Cnd sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup sterilizare. Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la gur cu hrtie i sfoar. Courile i baloanele Erlenmayer se introduc n autoclavul cu gaze, iar sterilizarea se face conform instructiunilor afiate lang aparat. Se nchide capacul autoclavului, se verific nivelul apei n vasul de nivel, se aprinde gazul i se ateapt apariia jetului de abur viu care este eliminat prin purj. Dup 10-15 minute de purjare se nchide robinetul purjei, iar presiunea indicat de manometru va urca pn la valoarea 1, unde va fi meninut timp de 20 min. prin micorarea flcrii. ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se prezint n tabelul urmtor:
23

Temperatura n grade Celsius 100 105 110 112 115 120 121 122 128 130 135 140

Presiunea n kg/m3 0,00 0,20 0,43 0,55 0,69 0,99 1,00 1,33 1,55 1,72 2,16 2,65

Presiunea n atmosfere 0,00 0,20 0,42 0,50 0,67 0,96 1,00 1,29 1,50 1,65 2,09 2,56

Dup acest interval se oprete gazul, se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide purja i dup 5 minute se poate deschide capacul autoclavei. n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare suficient pentru microorganisme. De aceea , dup sterilizare tuburile cu mediu se nclin pentru ca s rmn cu o suprafa mare de cretere. nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ude dopul de vat, ci s se opreasc la 2 - 3 cm de acesta. Prin r cire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai reci ai eprubetelor i cad sub form de picturi pe mediu, adunndu-se pe fundul eprubetei. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se aeaz n poziie orizontal, ci vertical, in couri de srm. Acestea se acoper apoi cu o hrtie i se leag cu sfoar. Pentru a nu prepara n fiecare zi medii, sau, dac este nevoie de mai multe feluri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare. Sticlele cu medii se eticheteaz, notndu-se tipul mediului i data preparrii. Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive n frigider.

24

6. NSMNAREA CULTURILOR DE BACTERII, DROJDII I MUCEGAIURI

Principiul metodei: Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia de trecere a unei culturi dintrun vas de cultur n altul se numete repicare sau trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete inoculum. n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer. Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast zon de protecie.

6.1. NSMNAREA N TUBURI Materiale utilizate: - culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv; - culturi de Saccahromyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar; - culturi de Monascus purpureus , Aspergillus niger i Penicillium pe mediul extract de cartof - dextroz - agar; - fir de inoculare; - bec de gaz; - eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar, extract de cartof-dextroz-agar); - termostat la 30 oC; - lamp bactericid.

25

Mod de lucru: nsmnarea cu ansa Se terge suprafaa din interiorul niei de lucru cu un tampon mbibat cu alcool 95%. Se aprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz i se regleaz flacra, care trebuie s aib conul de culoare albastr. Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n poziie vertical pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 2 -3 ori i restul acului pn la mner, n flacr. Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la mna dreapt ndoit, se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndu-l de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas sub nici un motiv, ci se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 - 2 mm) din cultur pe vrful acului (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii respective). Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul de vat din mna dreapt. Se las jos eprubeta i se ia, tot cu mna stng, o alt eprubet cu mediu steril. Acul de repicat cu fragmentul de cultur , se ine mai departe n mna dreapt ferindu-l acum de flacr. Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima, adic: se ine n poziie orizontal sau putin oblic n mna stng, se scoate dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu-se tot timpul operaiei de repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul eprubetei), pn ce bucica de cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai strns cu el. Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i captul dopului care a fost inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid. Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este absolut necesar i trebuie fcut cu rbdare, pentru a se evita infectarea mediilor urmtoare. Dup arderea
26

acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicat i se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril. Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere par minore, dar de care depinde foarte mult reuita unei repicri. Astfel, trebuie avute n vedere: -inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea sporilor de ciuperci i bacterii din atmosfer pe mediu; -inerea acului de repicat n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca arderea s se fac pe o poriune ct mai mare; -scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul n mn, pentru a-l feri de contaminri secundare; -arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece pe marginile exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infecie secundar. Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul , culoarea, tipul coloniilor, precum i eventuala prezen a contaminrii cu alte microorganisme. nsmnarea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat Pentru pregtirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticl obinuit, cu diametrul exterior de 6 mm i cel interior de 4 mm, care se taie la o lungime de 25 cm, se rotunjesc marginile la flacr, se astup cu dopuri de vat, se ambaleaz i se sterilizeaz. n momentul utilizrii, partea median a tubului se menine n vrful conului albastru al flcrii, se rotete uor i, cnd sticla s-a nmuiat, se ndeprteaz din flacr i se efileaz dup lungimea dorit. Dup solidificare, se separ n cele dou jumti cu care se poate lucra. nsmnarea cu pipeta se practic atunci cnd se dorete recoltarea unui inocul lichid. Pipeta se trece rapid prin flacr, iar pipeta Pasteur se sparge n dreptul mijlocului efilat. Din tubul ce conine cultura se preleveaz cteva picturi sau un volum determinat de inocul, care se pipeteaz n mediul proaspt, steril. Culturile se termostateaz timpul necesar dezvoltrii fiecrui tip de microorganism.

27

6.2. NSMNAREA N PLCI PETRI

Materiale utilizate: - plci Petri sterile - medii de cultur pentru bacterii, drojdii, mucegaiuri, aceleai ca n cazul nsmnrii n tuburi - culturi de bacterii, drojdii, mucegaiuri - pipete sterile - ap steril - fir de inoculare - bec de gaz - termostat

Mod de lucru Mediul de cultur steril se topete pe baie de ap, dup care se rcete la 470C i se repartizeaz n mod aseptic n plcile Petri, pentru evitarea unui condens prea mare pe capacul plcii. Se las mediul s se solidifice la temperatura camerei. Pentru economie de spaiu i pentru evitarea formrii unui condens prea abundent, plcile se pot aeza una peste alta, dac este posibil. Se agit tubul coninnd suspensia de celule n ap steril i se recolteaz cu pipeta aproximativ 2 ml din cultur, care se introduc n placa Petri, pe suprafaa mediului nutritiv. Se repartizeaz omogen, pe toat suprafaa, se scurge excesul de lichid i se termostateaz la temperatura convenabil. nsmnarea mediului de cultur din plcile Petri se poate face de asemenea, prin ncorporarea suspensiei de celule, astfel: se pipeteaz n placa steril, goal, 1 ml din suspensia de celule, dup care se toarn mediul topit i rcit la 45 - 470C i se omogenizeaz pentru repartizarea uniform a celulelor din cultur. Se las s se solidifice i se incubeaz.
28

7. STUDIUL CARACTERELOR COLONIILOR DE BACTERII, DROJDII I MUCEGAIURI

1. Caractere morfocoloniale ale bacteriilor a. Culturi pe medii gelozate n plci Petri Se vor examina coloniile bacteriene care s-au dezvoltat pe suprafa a mediului solidificat n perioada care a trecut de la lucrarea anterioar , avndu-se n vedere urmtoarele caractere: Mrimea coloniilor: - colonii mici < 1 mm - colonii medii 1,5 pn la 3 mm - colonii mari 3 mm 2. Forma coloniei: - punctiform (a), circular (b), filamentoas (c , neregulat (d), rhizoid (e), fusiform (f).

3. Profilul coloniei: - plat (a), crescut (b), convex (c , pulvinat (d), umbonat(e).

29

4. Marginea: - uniform (a), ondulat (b), lobat (c , erodat (d), filamentoas (e), buclat (f).

5. Transparena: - colonii transparente - colonii translucide - colonii opace. 6. Suprafaa: - colonii lise (uneori strlucitoare) - colonii rugoase - colonii mucoide

30

7. Consistena - nu poate fi apreciat cel mai adesea dect n urma prelevrii de probe: - colonii grase, cremoase, care dau uor suspensii omogene - colonii uscate - colonii mucoide (filante), care dau greu suspensii omogene. 8. Pigmentaia: - coloniile sunt cel mai adesea de culoare crem. O culoare diferit este datorat unor pigmeni, care sunt uneori solubili n mediul de cultur i care nu apar dect la o temperatur determinat. n final, coloniile bacteriene pot aparine unuia din urmtoarele tipuri: Tipul 1. Colonii S (engl. Smooth = neted, lucios) - margini regulate, uneori semi-bombate - suprafa neted - consisten cremoas suspensie omogen Tipul 2. Colonii R (engl. Rough = rugos, aspru, zbrcit) - margini adesea neregulate - suprafa rugoas - consisten uscat suspensie heterogen Tipul 3. Colonii M (cu consisten mucoid) - margine uniform, regulat - colonii bombate - suprafa neted, strlucitoare - consisten filant suspensie heterogen corespund adesea bacteriilor capsulate Gram negative (Klebsiella, Enterobacter etc)

31

b. Culturi n medii lichide n tuburi Dac s-a realizat o cultur ntr-un bulion nutritiv n tuburi, dup o incubare de 48 ore se pot evidenia urmatoarele caractere: 1. Turbiditatea: - tulburare mai mult sau mai puin intens a mediului 2. Formarea unei pelicule: - n cazul bacteriilor aerobe apare la suprafaa mediului o mas de celule care formeaz un voal 3. Formare de depozit: n cazul bacteriilor anaerobe se formeaz un sediment pe fundul tubului, mai mult sau mai puin abundent, colorat sau nu. 2. Caractere morfocoloniale ale drojdiilor - se va observa forma i profilul coloniei, diametrul acesteia, aspectul (de obicei cremos), suprafaa (lucioas sau mat), culoarea (n general alb-crem). 3. Caractere morfocoloniale ale mucegaiurilor Vor fi determinate urmtoarele caractere coloniale: - diametrul coloniei dup un timp cunoscut - culoarea coloniei i modificarea acesteia n timp - culoarea reversului coloniei - textura suprafeei coloniei: pufoas, psloas - eventual prezena picturilor de transpiraiepe miceliul aerian - mirosul

8. DETERMINAREA VITEZEI DE CRETERE A COLONIILOR DE MUCEGAI Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid n condiii favorabile, astfel c n interval de 2 - 3 zile pe mediu nutritiv se formeaz colonii vizibile, care cresc n diametru. n cazul mucegaiurilor inferioare caracterizate prin miceliu coenocitic, neseptat, coloniile se dezvolt rapid, sunt extinse, cu tendina de a ocupa tot spaiul disponibil, avnd aspect pslos i culori alb, bej, cenuiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate prin miceliu septat formeaz colonii cu cretere radiar limitat i culori ce difer de la alb la galben, brun, verde, portocaliu, albastru. Principiul metodei:
32

Viteza de cretere a mucegaiurilor se poate determina prin cultivarea acestora n plci Petri, prin nepare central i msurarea zilnic a diametrului coloniei, pn la invadarea complet a suprafeei plcii. Pentru microorganismele cercetate , apariia sporilor coincide cu colorarea zonei respective, ncepnd cu centrul coloniei. Materiale utilizate: - plci Petri sterile; - ans microbiologic; - mediu de cultur: extract de mal - agar n flacoane Erlenmayer; - soluie acid lactic 5 %, steril; - hrtie indicatoare de pH; - material biologic -cultura n slanturi de Pencillum, Aspergillus sau alt mucegai - baie de ap termostat; - bec de gaz. Mod de lucru: Mediul de cultur se topete pe baia de ap, apoi se termostateaz la 45 oC. Se adaug soluia steril de acid lactic pn cnd pH-ul devine 3,5, valoare la care este inhibat dezvoltarea bacteriilor, dar nu i a mucegaiurilor. Se toarn 15-20 ml mediu de cultur n fiecare plac Petri i se las la temperatura camerei pentru solidificare. Cu vrful acului de inoculare, se recolteaz o mic poriune din cultur sporulat din eprubeta cu cultura de mucegai i se nsmneaz prin nepare n partea centrala a plcii, cu mare atenie pentru a nu se rspndi sporii pe suprafaa mediului de cultur. Cutia se va nchide cu band adeziv i se termostateaz la temperatura camerei, msurndu-se zilnic diametrul coloniei. Se determin viteza de cretere, Vcretere, dup formula: Vcretere = diametrul maxim al coloniei / nr.zile (ore)

9. ESTIMAREA DENSITII POPULATIILOR MICROBIENE

33

Numrarea

microorganismelor se execut n mod frecvent n laboratorul de

microbiologie, n vederea aprecierii stadiului de multiplicare a celulelor din diferite culturi folosite n industrie sau pentru determinarea gradului de contaminare a unor produse, n special alimentare. Pentru a asigura o numrare rapid i n acelai timp precis, innd cont c ncrctura microbian a diferitelor produse i culturi poate s fie foarte ridicat, se recomand n prima etap s se efectueze diluri ale produsului supus analizei microbiologice.

TEHNICA OBINERII DILUIILOR DECIMALE Dup recoltare, la omogenizarea probelor destinate analizei microbiologice, se recomand ca raportul ntre produs i diluant s fie de 1:10, obinndu-se astfel prima diluie (diluie 10-1). Pentru efectuarea urmtoarelor diluii decimale, cu o pipet steril, se barboteaz lichidul pentru omogenizare , se recolteaz 1 ml din diluia I i se scurge lichidul n alt eprubet cu 9 ml ser fiziologic steril, obinndu-se diluia a II-a (diluie 10-2) i se continu procedeul pn la obinerea diluiei necesare. Gradul de diluare este condiionat de numrul presupus de microorganisme din proba de analizat; cu ct numrul este mai mare, cu att se fac mai multe diluii. Pentru majoritatea produselor sunt suficiente 4 - 8 diluii succesive. Cnd se face numrarea celulelor dintr-o anumit diluie considerat corespunztoare, numrul obinut se multiplic cu coeficientul de diluie k, pentru a obine numrul de celule existent n produsul iniial (pentru d I, k = 10, pentru d II, k = 100 etc). Pentru evitarea erorilor se recomand omogenizarea coninutului eprubetelor n care s-a fcut diluarea fie prin rotirea eprubetei ntre palme, fie, cu ajutorul pipetei sterile, prin barbotare, nainte de recoltarea volumului de 1 ml destinat urmtoarei diluii. Se iau toate msurile de precauie pentru a evita contaminarea cu microorganisme din mediul ambiant, lucrnd n zona de protecie din jurul flcrii becului de gaz i respectnd regulile de manipulare.

1 ml

1 ml
34

1 ml

1 ml

Suspensie iniial

1: 10

1 : 100

1 : 1000

1 : 10000

Dup efectuarea diluiilor decimale, numrarea microorganismelor se poate realiza prin metode directe, cu ajutorul camerelor de numrare sau prin metode indirecte.

9.1. ESTIMAREA DENSITII POPULAIILOR MICROBIENE CU AJUTORUL CAMEREI THOMA

Estimarea densitii populaiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma este o metod direct de numrare a celulelor, rapid i uor de efectuat, cu utilizri n stabilirea dinamicii de acumulare a celulelor microbiene ntr-un mediu de cultur, n scopul urmririi formrii de biomas, de obinere a unui inocul sau n diferitele procese fermentative. Metoda prezint dezavantajul c nu deosebete celulele vii de cele moarte, este greu de aplicat pentru bacterii de dimensiuni mici, necesit suspensii celulare destul de dese i nu este foarte exact. Principiul metodei: Camerele de numrat reprezint lame de sticl prevzute cu trei platforme, din care platforma central este denivelat fa de celelalte dou cu 0,10 mm. Camera Thoma prezint o reea cu suprafaa de 1 mm2, divizat n 400 microcelule elementare, numrtoarea fcndu-se n grupuri de 16 microcelule.

lamela
35

1/10 mm lama Thoma

1/20 mm

1/20 mm

Materiale utilizate: - suspensii de celule de drojdie i spori de muceagi n ap; - lamele; - camera Thoma; - pipete sterile. - microscop.

Mod de lucru: Se execut un preparat umed, plasnd suspensia de celule pe suprafaa reelei. Se
36

aeaz lamela, care, sprijinindu-se pe cele dou platforme laterale, va delimita nlimea stratului de lichid, egal cu adncimea camerei (0,1 mm). Preparatul astfel obinut se fixeaz cu cleme de platina microscopului i se caut imaginea reelei. In cmpul microscopic , prin deplasarea platinei se pot aduce grupe de cte 16 microcelule elementare i se face numrarea celulelor de drojdii. Se exclud de la numrare celulele care se afl cu mai mult de jumtate din suprafaa celulei n exteriorul careului de 4 x 4. Se fac numrri din mai multe cmpuri microscopice (minimum 5) i se calculeaz numrul mediu de celule dintr-o microcelul.
V =

Cunoscnd suprafaa unei microcelule i volumul su (

1 1 mm 3 ), n funcie de diluia folosit la numrare, se poate calcula numrul de 400 10

celule prezente ntr-un cm3 lichid de analizat, cu formula: N = n x 4000 x 1000 x k n care: n = numrul mediu de celule pe microcelul; 4000 = volumul microcelulei, n cm3; 1000 = factor de transformare n cm3; k = coeficientul de diluie.

9.2. ESTIMAREA NUMRULUI DE CELULE MICROBIENE PRIN METODA CULTURAL Principiul metodei: Metoda cultural Koch const n nsmnarea unui volum cunoscut din suspensia de celule n / sau pe medii de cultur solidificate n plci Petri i, dup o perioad de incubare, se face numratoarea coloniilor considernd c fiecare colonie este rezultat prin multiplicarea unei singure celule. Metoda cultivrii n plci este foarte adesea folosit pentru determinarea numrului de microorganisme vii dintr-un produs i permite, n acelai timp, o analiz calitativ prin studiul caracterelor morfologice ale coloniilor dezvoltate. De obicei se utilizeaz diluiile decimale ale produsului de analizat. Rezultatul se exprima in UFC (uniti formatoare de colonii), deoarece pot exista mai multe celule aglomerate care formeaz o colonie, iar n cazul mucegaiurilor exist fragmente
37

multicelulare de hife; n plus, exist destule celule izolate care nu formeaz colonii. Se vor alege plcile care conin ntre 30 i 300 colonii.

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 Materiale utilizate:

10-1

10-2

10-3

- mediu de cultur: agar nutritiv sterilizat n flacoane Erlenmayer de 500 ml; - plci Petri sterile; - pipete sterile; - eprubete cu cte 9 ml ap steril; - probe de ap din diferite surse; - baie de ap la 45 oC; - termostat la 37 oC; - dispozitiv de numrat colonii. Mod de lucru: Mediul de cultur coninut n balonul Erlenmayer se pune la topit pe baie de ap. Dup fluidificarea complet, se termostateaza, tot pe baie de ap la 45 oC. Folosind pipeta steril, se pregtesc cte 3 diluii din probele de ap i apoi se recolteaz cte 1 cm3 din aceste diluii I, prin desfacerea plcii Petri sterile, se las s
38

treac numai pipeta i se scurge coninutul. Peste volumul de suspensie se toarn mediul de cultur steril la 42-45 oC i, imediat, prin rotirea n plan orizontal a plcii, se face omogenizarea cu mediul i se las n repaos pentru solidificarea mediului i fixarea celulelor. Se recomand ca din aceeai diluie s se fac nsmnari n cte dou plci paralele. Plcile cu mediile nsmnate se introduc n termostat, reglat la temperatura de 37
o

C, pentru dezvoltarea microorganismelor. Numrarea coloniilor se va face dup 72 ore.

Pentru numrare se aleg plcile n care numrul de colonii este cuprins ntre 30 - 300, acolo unde este posibil. n cazul n care coloniile sunt dese, pentru a nlesni numrtoarea, placa Petri se inverseaz i se aeaz pe numrtorul de colonii TITRIPLAQUE. La metoda culturii, toate operaiunile se execut cu mult atenie evitndu-se orice surs de infectare cu microorganisme strine, care, ajungnd n plac ar influena rezultatul analizei. Numrul de uniti formatoare de colonii este dat de formula: UFC/ml = Nr. colonii x coeficientul de diluie

9.3. DETERMINAREA NUMRULUI DE MICROORGANISME N MEDII LICHIDE

Aceast metod se bazeaz pe efectuarea de diluii cu care este nsmnat mediul de cultur lichid. Diluiile se efectueaz din 10 n 10, pornind de la suspensia iniial pentru care se determin numrul de germeni. Mediul de cultur ales convenabil este repartizat steril cte 9 ml n fiecare tub. Serii de 3 sau 5 tuburi vor fi nsmnate cu cte 1 mililitru din suspensia iniial, apoi din diluiile decimale n ordine descresctoare a densitii celulelor (fiecare nou serie antreneaz un nou factor 10 de diluie). Dup incubare se procedeaz la citirea rezultatelor, considerndu-se pozitive tuburile n care este vizibil creterea (sau este vizibil o activitate biologic: virajul unui indicator de pH, degajare de gaz sau altele) i negative celelalte. Pentru fiecare serie de culturi provenite din aceeai diluie, se numr tuburile pozitive, care pot fi:
39

1. - 0, 1 sau 2 pentru 2 tuburi; 2. - 0, 1, 2 sau 3 pentru 3 tuburi; 3. - 0, 1, 2, 3, 4 sau 5 pentru 5 tuburi.

Se compune astfel un numr caracteristic, format din cifrele corespunztoare pentru trei diluii succesive (pentru cazul 2), prima diluie utilizat fiind cea mai concentrat. Numrul este alctuit din trei cifre i anume: prima cifr reprezint numrul de eprubete din ultima diluie n care s-a observat creterea n toate eprubetele nsmntate, urmtoarele dou cifre reprezint numrul de eprubete pozitive din urmtoarele dou diluii succesive. Interpretarea acestui test se bazeaz pe date statistice. Tabelele elaborate dau pentru fiecare numr caracteristic, numrul de celule cel mai probabil dintr-un mililitru din tubul corespunztor primei cifre din numrul caracteristic. Numrul de microorganisme dintr-un gram sau mililitru din produsul ini ial se calculeaz nmulind numrul din tabel (corespunztor cifrei caracteristice) cu coeficientul de diluie corespunztor primei cifre din caracteristic. Concentraia iniial se calculeaz innd cont de diluiile efectuate. De exemplu, pentru numrul caracteristic 210 (care nseamn 2 tuburi pozitive pentru cea mai mare densitate de celule, un tub pozitiv pentru cea medie i toate tuburile negative pentru densitatea cea mai mic), n tabel corespunde numrul cel mai probabil de celule 1,5 / ml, care se va nmuli cu coeficientul de diluie. Dac, de exemplu, diluia a fost 10-2, au fost iniial 150 celule / ml. n tabelul urmtor (numit tabelul lui Mac Grady) se prezint relaia ntre numrul caracteristic corespunztor pentru trei tuburi nsmnate i numrul cel mai probabil de celule:

40

Numr caracter istic 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200

Numr de celule

Numr caracter istic

Numr de celule

Numr caracter istic

Numr de celule

0,0 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0,9

201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301

1,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0

302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333

6,5 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 140,0

DETERMINAREA BACTERIILOR COLIFORME DINTR-UN PRODUS ALIMENTAR Pentru a reflecta calitatea microbiologic a produselor alimentare n timpul fabricaiei, n timpul conservrii, ct i pentru a asigura protecia fa de microorganismele
41

patogene transmisibile prin alimente, se efectueaz analize microbiologice n scopul de a garanta sigurana igienei pentru consum. Bacteriile coliforme fac parte din categoria microorganismelor indicatori igienicosanitari, fiind bacterii Gram negative nesporulate, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot s se nmuleasc n prezena srurilor biliare, capabile de a fermenta lactoza cu producere de gaze. Principiul metodei: Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include teste

prezumptive i de confirmare, bazate pe capacitatea bacteriilor coliforme de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2 i H2, n timp de 48 ore la 370C. Testul prezumptiv const n inocularea probei n mediul nutritiv de mbogire cu lactoz, favorabil att coliformilor ct i altor bacterii capabile s foloseasc lactoza drept surs de carbon. Aprecierea probelor pozitive se face fie n funcie de acumularea de gaze n tubul Durham (plutitor), fie ca urmare a modificrii pH-ului datorit acumulrii de acizi. Testul de confirmare const din inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale testului prezumptiv, pe medii selective care inhib dezvoltarea bacteriilor nsoitoare i evideniaz bacteriile coliforme. Materiale utilizate: - proba de analizat (ap, carne tocat, produse lactate etc) - eprubete n care a fost introdus tubul Durham - bec de gaz - termostat - stativ pentru eprubete - mediul pentru testul prezumptiv: bulion lactozat - pepton ..10g - NaCl..5g - extract de carne.3g - lactoz ..5g - ap dist. .1000ml sau mediu Mac Conkey (conform cataloagelor de medii de cultur)
42

- mediu pentru testul de confirmare - bulion bil lactoz verde briliant (BLBV) sau - bulion E.C. (conform cataloagelor)

Mod de lucru: Mediile lichide de cultur se introduc n eprubetele ce conin tuburile Durham rsturnate, astfel nct s nu rmn aer n acestea, n volum de aproximativ 10 ml, n funcie de grosimea eprubetei. Se sterilizeaz prin autoclavare, dup indicaiile de pe flaconul cu mediu deshidratat. Din proba de analizat i din diluii decimale succesive se inoculeaz cte 1 ml n cte 3 eprubete cu mediu pentru testul prezumptiv (ce conin tuburile Durham inversate) i se incubeaz 24 - 48 ore la 370C, dup care se citesc rezultatele, conform tabelului de mai sus. Se consider pozitive eprubetele n care se nregistreaz tulburarea mediului de cultur, acumulare de gaz n plutitor (mai mult de 1/3 din volum) i, unde este cazul, virarea indicatorului de pH. Pentru testul de confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans (fir cu bucl) i se face inocularea n mediul pentru confirmare. Se termostateaz 48 ore la 370C, se citesc rezultatele. Dup nmulirea numrului citit n tabel cu factorul de diluie, se obine numrul cel mai probabil de coliformi /g sau ml prob de analizat (MPN = most probable number).

10. METODE DE IZOLARE I OBTINERE A CULTURILOR PURE

Cultura pur reprezint o mas de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril. Cultura pur este considerat i colonia care se formeaz ca rezultat al izolrii unei celule sau a unei uniti formatoare de colonie, atunci
43

cnd aceasta este localizat pe un mediu nutritiv solid. n practica de laborator se cunosc numeroase metode prin care se poate realiza separarea unei singure celule din microbiota heterogen a mediilor naturale. Aceste tehnici permit izolarea unui germen dat plecnd de la medii complexe, separarea unor germeni diferii dintr-un amestec, purificarea unei sue contaminate, precum i efectuarea studiului calitativ i cantitativ al florei unui produs, (de exemplu un produs alimentar). Scopul final este obinerea de tulpini pure care pot fi astfel identificate, studiate i eventual numrate. A.Metode prin rspndire - se folosesc pe scar larg, fiind uor de executat, avnd ca principiu rspandirea celulelor din mediile naturale unde acestea se afl n numr mare. Metode scarificate sau n strii n placa Petri se repartizeaz un mediu de cultur solidificat i, cu firul metalic se recolteaz celule din mediul natural i se execut trasri pe suprafata mediului, astfel nct diversele celule s rmn distanate ntre ele. Prin termostatare 48 - 72 ore, din colonia care corespunde microorganismului ce trebuie izolat, se execut o repicare n eprubete cu mediu solid nclinat (eprubete cu slant - agar) i astfel se obine o cultur pur. O tehnic similar folosete drept suprafa de rspndire mediul nclinat din 2 -3 eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, n mod succesiv. Aceste dou metode se folosesc i n cazul n care o cultur pur este contaminat cu microorganisme strine n perioada de pstrare i trebuie salvat. B. Metode prin diluare n cazul acestor metode, n prima etap, din mediul natural se execut diluii decimale n ser fiziologic steril, astfel nct numrul de celule s fie relativ redus, permind obinerea de colonii izolate pe suprafaa mediului de cultur. O metod simplificat pentru separarea sporilor fungici const n inundarea suprafeei plcii Petri din diluia convenabil. Sporii care au rmas ataai de mediu vor da colonii izolate. n general, mucegaiurile nu ridic probleme la izolare, deoarece cresc sub form de colonii mari pe diferite substraturi, iar pentru obinerea n cultur pur se face repicarea de spori situai n centrul coloniei. Metoda de izolare cu ajutorul micromanipulatorului - este o metod precis i se
44

realizeaz cu ajutorul unui aparat prevzut cu tuburi capilare cu care se poate face selecia celulelor dorite din preparate studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se poate face recoltarea de ascospori din celule ascogene i este folosit n cercetarea genetic, n dirijarea proceselor de fuziune a protoplatilor, pentru conjugare .a. Metode biologice de obinere a culturilor pure - sunt foarte diverse i se bazeaz pe proprietile fiziologice ale microorganismelor de izolat care permit diferen ierea clar a acestora de restul microorganismelor nsoitoare din acelai biotop. Prin metode biologice pot fi selectate bacteriile sporogene din medii naturale, pe baza termorezistenei deosebite a endosporilor. Numeroase metode de izolare se bazeaz pe introducerea n mediile de cultur a unor substane chimice cu rol de inhibitor asupra microorganismelor de care trebuie separat cultura dorit. 10.1. IZOLAREA MICROORGANISMELOR DIN SOL DE GRDIN Principiul metodei: cnd o celula microbian ajunge pe un mediu favorabil de cultur , aceasta se multiplic formnd o colonie: din coloniile suficient de separate i distanate se pot izola culturi pure. Materiale utilizate: - plci Petri - pipete sterile - probe de sol de grdin - tuburi cu ser fiziologic steril sau ap steril - penicilin - fir de inoculare - termostat - bec de gaz - baie de ap - mediu de cultur - agar nutritiv Mod de lucru: Repartizarea mediului de cultur n plcile Petri: - se lichefiaz coninutul unui flacon cu mediu gelozat ntr-o baie de ap la fierbere, se
45

rcete la 470C 20C, apoi se toarn coninutul n plcile Petri .sterile innd seama de urmtoarele precauii:

se terge cu grij flaconul la scoaterea din baia de ap se ndeparteaz dopul n zona steril a flcrii i se flambeaz gtul vasului pentru n timpul ct se toarn mediul, se deschid plcile Petri n imediata apropiere a dup introducerea mediului, placa Petri se nchide rapid se repartizeaz geloza prin agitare uoar, dac este cazul se las plcile pe o suprafa plan pentru solidificarea mediului dac se lucreaz cu mai multe plci, este avantajos s se aeze acestea unele peste

distrugerea microorganismelor

flcrii; nu se atinge placa cu flaconul


altele, evitndu-se rcirea brusc i deci formarea n cantitate prea mare a condensului. A. Tehnica striurilor Izolrile se efectueaz n plci Petri, prin trasarea de striuri n una din urmtoarele forme:

a)

b)

c)

46

d)

Pentru nsmnarea plcilor se va utiliza o diluie din sol de grdin. B. Tehnica diluiilor Din proba de cercetat se efectueaz diluii n ap steril sau ser fiziologic, n tuburi ce conin cte 9 ml. Prima diluie se efectueaz prin pipetarea unui mililitru de prob (sau prin cntrirea unui gram) n primul tub - aceasta reprezint diluia 1 / 10 ; diluia a doua reprezentnd 1 / 100 se efectueaz prin pipetarea i amestecarea a 1 ml din diluia 1 /10 n alt tub cu 9 ml ser fiziologic i aa mai departe. Din fiecare diluie efectuat se pipeteaz cte 2 ml pe suprafaa mediului repartizat n plcile Petri, ncepnd cu cea mai mare diluie. Se incubeaz plcile la 370C timp de 48 de ore, dup care se examineaz i se izoleaz colonia care intereseaz, cu vrful firului metalic.

10.2. IZOLAREA GERMENILOR DIN AER Se deschid total plcile coninnd mediul de cultur solidificat, timp de cteva minute, agitndu-se lent i expunndu-le n curent de aer. Timpul de expunere a pl cilor poate varia pentru cteva plci. Se termostateaz timp de 48 ore sau mai mult i se examineaz coloniile aprute. 10.3. IZOLAREA GERMENILOR REZISTENI LA ANTIBIOTICE Mediul de cultur se va suplimenta cu cte o pictur pentru fiecare plac, dintr-o soluie obinut dintr-un antibiotic cumprat din comer (de ex. penicilin), dup care se nsmneaz fie prin inundare, fie prin ncorporarea probei n geloz. 10.4. IZOLAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE Diluia din proba de sol va fi nclzit timp de 2 minute pe baie de ap la fierbere
47

(fierberea distruge formele nesporulate), dup care se inoculeaz mediul de cultur. Pentru toate cazurile se vor recunoate coloniile de bacterii, drojdii sau mucegaiuri. Se va nota aspectul coloniilor (rotunde sau neregulate, bombate sau plate, netede sau nu, strlucitoare sau mate, colorate sau nu, transparente sau nu). Cele mai reprezentative colonii se vor examina la microscop, determinndu-se tipul microorganismului, forma, aparatul reproductor n cazul mucegaiurilor.

11. METODE DE CONSERVARE A MICROORGANISMELOR

Microorganismele aflate n studiu ct i cele care prezint unele proprieti remarcabile trebuie pstrate n colecii de culturi, denumite micoteci. Dintre tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure, tehnici bazate pe prelungirea fazei sta ionare i evitarea etapei de declin,cele mai importante sunt urmtoarele: Repicarea periodic prin transfer de celule din eprubeta coninnd cultura pur, n care mediul este epuizat, n eprubeta cu mediu nutritiv steril, proaspt, cu compoziie similar. Intervalul de repicare este dependent de natura culturii, compozi ia mediului i temperatura de pstrare. Acest procedeu necesit un mare volum de munc, prezint risc de
48

contaminare i este greu de realizat atunci cnd numrul de culturi de ntreinut este mare. Prelungirea intervalului ntre dou repicri prin scderea vitezei de metabolism a celulelor i deci evitarea strii de declin ce poate duce la autosterilizare, se poate realiza prin mai multe procedee: Meninerea culturilor la temperaturi sczute, n condiii de refrigerare sau congelare. n acest caz, de exemplu, culturile de fungi pstrate la 50C se transfer anual, n timp ce dac pstrarea se face la 160C, repicarea va avea loc la un interval de 6 luni. Desicarea poate fi realizat n laborator la o pomp de vid, culturile fiind plasate n fiole speciale, care sunt apoi nchise la flacr. Metoda desicrii are la baz reducerea umiditii mediului, care conduce la trecerea celulelor n starea de anabioz, ce poate fi meninut timp ndelungat fr a se produce modificri intracelulare, ireversibile. Liofilizarea const ntr-o congelare urmat de o sublimare. Prin acest procedeu se prelungete considerabil intervalul de conservare a culturilor, f r s se produc modificri ale proprietilor lor fiziologice. Liofilizarea se realizeaz n aparate speciale numite liofilizatoare, culturile fiind suspensionate n lichide protectoare (de obicei un coloid hidrofil cum este laptele, glicerol 10%, gelatin, ser etc) i introduse n fiole speciale.

11.1. REVITALIZAREA PREPARATELOR DESICATE SAU LIOFILIZATE Materiale utilizate: - culturi desicate sau liofilizate - ansa cu bucl - pipete sterile - bec de gaz - dopuri sterile pentru fiolele cu culturile desicate sau liofilizate - lichid de revifiere: - extract de drojdie.5g - glucoz ..5g - ap distilat .1000ml - mediu de cultur n eprubete

49

Mod de lucru: Se nclzete gtul fiolei ce conine cultura desicat sau liofilizat, la vrful flcrii de gaz. Cu o pipet steril se las s cad cteva picturi de ap steril rece pe gtul ncins al fiolei, care se va crpa; vrful se desprinde uor cu o bucat de vat steril, se mai arde o dat marginea fiolei n flacr, dup care se introduce dopul inut n mna dreapt. Cu o alt pipet steril se ia un mic volum din lichidul de revifiere sau ap steril i se pipeteaz uor peste coninutul fiolei. Se agit cu grij i se las n repaos jumtate de or la temperatura camerei sau n termostat. Dup acest interval, n zona steril a flcrii se deschide dopul fiolei, se arde gtul acesteia n flacr i se recolteaz din cultura liofilizat un mic volum, cu ajutorul ansei. Se nsmneaz mediul de cultur din eprubet i se incubeaz la temperatura optim de cretere. Dup dezvoltarea microorganismului, se observ aspectul culturii i eventualele modificri morfologice.

12. INFLUENA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA CRETERII MICROORGANISMELOR

Avnd o mas redus, celula microbian este puternic influenat de condiiile mediului ambiant i reacioneaz foarte rapid la diferii factori, cum sunt: temperatura, umiditatea relativ, concentraia de oxigen, compoziia chimic, concentraia substratului i pH-ul mediului de cultur, radia iile etc, fie prin adaptare, fie prin dispariie. Influena temperaturii asupra creterii microorganismelor Temperatura are o mare influen asupra proceselor fiziologice ale celulei deoarece stimuleaz sau inhib activitatea echipamentului lor enzimatic. Diferitele specii microbiene se caracterizeaz prin anumite temperaturi numite cardinale: - temperatura minim (temperatura la care mai poate avea loc creterea, iar sub aceasta valoare creterea este
50

oprit); temperatura optim (temperatura la care viteza specific de cretere este maxim) i temperatura maxim (la care creterea este nc posibil, dar prin depirea acesteia efectul devine letal).

12.1. INFLUENA TEMPERATURII DE CULTIVARE ASUPRA VITEZEI DE CRETERE A MUCEGAIURILOR Principiul metodei: n funcie de temperatura de cultivare, pe acelai mediu de cultur, mucegaiurile prezint viteze diferite de cretere, deci diametrele coloniilor vor avea mrimi diferite. Materiale utilizate: - cultura de mucegai (Monascus purpureus) - plci Petri - ac de inoculare - bec de gaz - termostate la diferite temperaturi - autoclav - mediul de cultur - extract de cartof - dextroz - agar Mod de lucru: Mediul de cultur repartizat n flacoane Erlenmeyer se sterilizeaz prin autoclavare la 121oC, timp de 20 minute, apoi se toarn cte 15 - 20 ml n plci Petri sterile i se las la temperatura camerei s se solidifice. Seturi de cte trei plci se nsmneaz prin nepare central din cultura de Monascus, avnd grij s nu se mprtie sporii de pe firul acului de inoculare pe suprafaa mediului. Din cele nou plci astfel nsmnate, trei vor fi incubate la temperatura de 40oC, trei la 30oC i trei la frigider, la 4-5oC. Dup o sptmn de dezvoltare a tulpinii fungice, se vor msura diametrele coloniilor pentru cele trei temperaturi, fcndu-se media aritmetic a celor trei valori i se va determina viteza orar de cretere.

12.2. DETERMINAREA BACTERIILOR PSIHROFILE Principiul metodei: Metoda se bazeaz pe cultivarea bacteriilor pe mediu nutritiv i incubarea plcilor la temperatura de 100C, timp de 7 zile, condiii care favorizeaz
51

dezvoltarea bacteriilor psihrofile. Materiale utilizate: - proba de analizat - plci Petri - pipete gradate sterile - bec de gaz - termostat - mediu de cultur: agar nutritiv Mod de lucru: Se face omogenizarea probei de analizat i se efectueaz diluiile decimale. Din diluii se recolteaz aseptic cte 1 ml care se introduce n dou plci Petri (probe duble) i deasupra se repartizeaz mediul nutritiv sterilizat i rcit la 450C, fcndu-se o uniformizare rapid. Dup solidificarea mediului de cultur n plcile Petri, acestea se menin inversate n frigider i dup 7 zile se face analiza calitativ i cantitativ a culturilor. Se calculeaz numrul de celule din plcile ce conin ntre 30 i 300 colonii i, n funcie de diluia folosit, se calculeaz numrul de bacterii psihrofile dintr-un gram sau dintr-un mililitru de prob. 13. ESTIMAREA CRETERII MICROBIENE N CULTUR DISCONTINU

n condiii favorabile de via, n prezena mediului nutritiv, microorganismele reacioneaz rapid I are loc creterea, proces prin care are loc mrirea coordonat a tuturor componentelor celulei, rezultat prin adugarea de substan nou format prin biosintez. Dac microorgamismul este coenocitic, creterea nseamn dezvoltarea celulei unice, dar nu I sporirea numrului de celule. n cazul microorganismelor care se reproduc prin nmugurire sau prin sciziune binar, dezvoltarea conduce la mrirea numrului de celule. Creterea microbian este studiat prin analizarea curbei de cretere a culturii (n medii lichide), n sistem discontinuu, n arje - batch (n timpul incubrii nu se introduce mediu proaspt i nu se extrag produi i din aceast cauz concentraia substratului scade, iar cea a produilor de metabolism crete). Creterea microorganismelor care se reproduc prin sciziune binar poate fi reprezentat grafic prin logaritmul numrului de
52

celule n funcie de timp.

Timpul de generaie () = durata unui ciclu de cretere sau timpul necesar pentru ca populaia s se dubleze. Viteza specific de cretere () = numrul de generaii n unitatea de timp.

=t/n

=n/t

unde n = numrul de generaii

Curba de cretere va avea ase faze:


1. 2. 3. 4. 5.

faza de lag sau faza de laten n care = 0 faza de accelerare a creterii n care viteza specific de cretere este cresctoare faza exponenial de cretere ( este constant i maxim) faza de ncetinire a creterii ( este descresctor) faza staionar ( = 0)

6. faza de declin

lg N

6 timp

53

Materiale utilizate: - cultura de Saccharomyces cerevisiae - camera Thoma - lamele - bec de gaz - termostat - mediu de cultur - must de mal sau melas - eprubete cu ap - ap distilat - pipete gradate sterile - eprubete Mod de lucru: Mediul de cultur (200 ml / flacon Erlenmeyer) i eprubetele coninnd aproximativ 10 ml ap se sterilizeaz n autoclav, timp de 20 minute la 1210C. Cultura de drojdie din eprubet, pe mediu solidificat (extract de mal - agar) este suspensionat n ap steril , din care se inoculeaz 1 ml n mediul din flaconul Erlenmeyer, cu ajutorul pipetei gradate, n zona de protecie a becului de gaz. Cultura se incubeaz la 300C, recoltndu-se probe, n mod aseptic, cu ajutorul pipetelor sterile (cate 2 ml), la intervale de cte 3 ore (sau la intervalul posibil). Recoltarea probelor se va face numai dup omogenizarea culturii prin agitare n scopul obinerii unei suspensii ct mai uniforme de celule. Probele se examineaz la microscop, determinndu-se numrul de celule direct din prob sau din diluia decimal, dac este cazul. Analiza probelor va fi efectuat, pe ct posibil, imediat dup recoltare, evitndu-se pstrarea probelor pentru numrarea ulterioar. Concomitent cu determinarea numrului de celule, se va nota i valoarea pH. Se va trasa curba de cretere corespunzatoare numrului de celule de drojdie dintr-un mililitru de cultur (inndu-se seama de diluia efectuat), n funcie de timp, completndu-se urmtorul tabel:

Durata de dezvoltare (ore) Diluia


54

probei Numr de celule/ ml pH

Pe parcursul experimentului se vor nota eventualele observaii (debutul fermentatiei, aspectul culturii, apariia unei eventuale infecii etc).

14. METABOLISMUL MICROBIAN

14.1. EVIDENIEREA METABOLISMULUI GLUCIDIC AL MICROOGANISMELOR Glucidele (monozaharide, dizaharide, polizaharide) pot fi degradate de bacterii urmnd una din cele dou ci principale: oxidarea (n aerobioz) sau fermentaia (n anaerobioz). Principiul metodei: Metoda se bazeaz pe virarea culorii unui indicator de pH datorit metabolizrii zahrului de ctre tulpina bacterian. Materiale utilizate: - cultura bacterian - eprubete cu dop de vat - ac de inoculare - bec de gaz - baie de ap la fierbere
55

- parafin steril - mediul de cultur: (se va utiliza mediul Hugh - Leifson) - pepton..2g - extract de drojdie1g - NaCl5g - K2HPO4..0,2g - albastru de bromtimol.0,08g - agar-agar.2,5g - zahrul adugat..10 - ap distilat.1000ml - termostat - autoclav Mod de lucru: Mediul de cultur repartizat cte 10 ml n eprubete, se sterilizeaz separat de zahrul ce trebuie testat, la 121oC timp de 20 minute. Dac mediul a fost preparat mai nainte, se regenereaz prin topire ntr-o baie de ap la fierbere, se adaug zahrul ce trebuie testat, dup care se solidific. Se inoculeaz tuburile prin nepare n profunzime, pn la baza mediului din cultura de studiat. Pentru fiecare zahr se vor realiza cte dou tuburi, din care unul se va acoperi cu un strat de ulei de parafin steril (5 mm nlime). Tuburile se vor incuba la 30 sau 37oC timp de 48 ore sau mai mult, dup care se va observa modificarea culorii mediului de cultur (care a avut iniial culoarea verde), existnd urmtoarele posibiliti; A. Culoare galben n ambele tuburi (cu sau fr ulei):

fermentarea zahrului

B. Culoare galben (n suprafa) n tubul fr ulei:

oxidarea zahrului

Fermentarea unui zahr poate fi nsoit de o degajare de gaz. C. Culoare verde n ambele tuburi (cu sau fr ulei):

zahrul nu a fost metabolizat

D. Culoare albastr n tubul fr ulei i verde n tubul cu ulei:

alcalinizare datorat utilizrii peptonei


56

MICROORGANISME PRODUCTOARE DE ENZIME HIDROLITICE

14.2. EVIDENIEREA MICROORGANISMELOR PRODUCTOARE DE ENZIME AMILOLITICE Principalele enzime microbiene care hidrolizeaz amidonul sunt -amilaza, -amilaza i glucoamilaza, enzime extracelulare produse de bacterii, mucegaiuri i de drojdii. Bacteriile din genul Bacillus ( B. subtillis, B. licheniformis, B. macerans, B. stearothermophillus) sunt productoare de amilaze active la 50-60oC, termostabile i folosite pentru obinerea amilazelor industriale. Alte specii de Bacillus cum sunt: B. cereus, B. megaterium, B. polymixa sunt productoare de -amilaz, enzim zaharogen, care prin hidroliza legturilor glucozidice elibereaz molecule de maltoz. Mucegaiurile produc mai ales -amilaza i glucoamilaza (Aspergillus, Mucor i Rhizopus), deosebindu-se prin raportul ntre aceste dou enzime sintetizate. Dintre drojdii, cei mai importani din acest punct de vedere sunt reprezentanii genurilor Saccharomycopsis, Tricosporon, Candida. Principiul metodei: evidenierea enzimelor amilolitice produse de ctre coloniile microbiene poate fi efectuat utiliznd un mediu de cultur solidificat, coninnd amidon. Sub aciunea amilazelor ce difuzeaz n gelul de agar, amidonul este scindat hidrolitic i, n urma adaosului de solutie Lugol (I2 / KI), zona din jurul coloniilor productoare nu se mai coloreaz n brun. Valoarea raportului ntre diametrul zonei de hidroliz i diametrul coloniei sau indicele amilolitic, este o msur a cantitii de enzim produs de microorganismul testat. Materiale utilizate: - cultura microbian - plci Petri - mediul de cultur: - extract de drojdie .. 4g - amidon solubil 10 g - K2HPO4 .. 1g,
57

- Mg SO4.7H2O .. 0,5 g - agar-agar . 20 g - ap distilat ..1000 ml - I2 - KI - ac de inoculare - termostat - lamp bactericid - bec de gaz - autoclav Mod de lucru: Mediul se sterilizeaz n autoclav timp de 30 minute, la 120oC, dup care se toarn n cutii Petri i se las s se solidifice. Plcile sunt apoi nsmnate prin nepare central sau din diluii decimale ale microorganismului de testat.Termostatarea se face timp de 72 ore pentru bacterii i 5 zile pentru mucegaiuri. Pentru determinarea diametrului zonei de liz a amidonului, peste mediul din plci se toarn solutie Lugol i se msoar diametrul coloniei i cel al zonei rmase necolorate. Se calculeaz indicele amilolitic astfel:

zona de hidroliz a amidonului

colonie

diametrul zonei de liz a amidonului IA= diametrul coloniei

14.3. EVIDENIEREA MICROORGANISMELOR PRODUCTOARE DE ENZIME CELULOZOLITICE Celuloza este polizaharidul de structur cu cea mai mare rspndire n lumea vegetal, putnd fi hidrolizat de enzimele celulozolitice produse de bacterii i mucegaiuri.
58

Hidroliza general a celulozei are loc dup schema:

celuloz

endoglucanaze (C1-celulaz)

lanuri 1-4 glucanice (insolubile)

endo 1-4 glucanaze

celodextrine; cel-oligoglucide

exo 1-4 glucanaze

celobioz celobiaza glucoz Dintre bacteriile care produc enzime celulozolitice fac parte bacterii cu forme spiralate aparinnd genurilor: Cytofaga, Cellvibrio, Cellulomonas. Mucegaiurile cu activitate celulozolitic superioar sunt : Fusarium, Mucor, Trichoderma, Aspergillus, Rhizopus. Principiul metodei: n cazul n care microorganismul testat produce enzime celulozolitice extracelulare, acestea difuzeaz n mediul de cultur i produc o clarificare a agarului n jurul coloniilor active.

59

Materiale utilizate: - cultura microbian (Trichoderma viridae) - plci Petri - ac de inoculare - mediul de cultur: - celuloz pudr 2,5g - pepton0,5g - K2HPO40,2g - MgSO4 .7H2O.0,2g - K2CO30,4g - CaCl2..0,02g - FeSO4.7H2O0,02g - NaCl.0,02g - agar-agar..15g - ap distilat.1000ml Autoclavare 20 minute, 121oC - termostat - lamp bactericid - bec de gaz - autoclav Mod de lucru: Mediul de cultur se sterilizeaz n flacoane Erlenmeyer de 500 ml, la 121oC timp de 20 minute, apoi se repartizeaz cte 15 - 20ml n cutii Petri i se las s se solidifice. nsmnarea se face fie prin neparea central a suprafeei mediului , fie din diluii decimale ale culturii de analizat. Termostatarea va avea loc la 30 oC, timp de 2 - 3 zile pentru tulpina de Trichoderma viridae sau o durat corespunzatoare n cazul utilizrii altor tulpini. Dac microorganismul testat produce enzime cu aciune celulozolitic, acestea determin clarificarea mediului de cultur n jurul coloniei datorit procesului de hidroliz a celulozei incorporate. Se va calcula indicele celulozolitic al tulpinii studiate, ca fiind raportul dintre diametrul zonei de liz i diametrul coloniei: diametrul zonei de hidroliz a celulozei IC= diametrul coloniei

60

14.4. EVIDENIEREA MICROORGANISMELOR PRODUCTOARE DE ENZIME PROTEOLITICE Proteinele constituie unul din substratele nutritive pentru microorganisme. Ele nu sunt direct asimilabile, datorit mrimii moleculei lor i, de aceea, trebuie degradate n peptide cu mas mai mic i apoi n aminoacizi, cu ajutorul enzimelor extracelulare. Proteinele coninute n materia organic nevie, care se acumuleaz n sol i ape, prin moartea plantelor, animalelor, microorganismelor, pot fi hidrolizate sub aciunea proteazelor extracelulare produse de ctre bacterii i mucegaiuri -ageni ai putrefaciilor (degradarea proteinelor de origine animal) i ai putrezirii (degradarea proteinelor de origine vegetal). Spre deosebire de bacterii i mucegaiuri, drojdiile nu pot folosi proteinele din mediu n procesul de nutriie deoarece ele conin proteaze intracelulare, care nu se pot elibera n mediul extern dect prin dezintegrarea nveliurilor celulare sau moarte prin autoliz. Proteazele sunt produse de un numr de bacterii ale genului Bacillus, Streptomyces, Proteus, Clostridium, Pseudomonas i de mucegaiuri din genul Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, Mucor. A. Hidroliza cazeinei Principiul metodei: Coloniile productoare de enzime proteolitice determin n jurul lor o zon clar de liz a cazeinei din mediul de cultur. Materiale utilizate: - cutii Petri - cultura microbian (Bacillus subtilis) - ac de inoculare - bec de gaz - termostat - autoclav - mediu de cultur - cazein 2,5g - Ca(OH)2 0,15g - CaCL2.0,05g - agar-agar15g
61

- ap distilat 1000ml Mod de lucru: Mediul de cultur se repartizeaz cte 200 ml n flacoane Erlenmeyer de 500 ml I se sterilizeaz prin autoclavare la 121oC timp de 20 minute, apoi se toarn cte 15 - 20 ml n plcile Petri i se las s se solidifice. nsmnarea plcilor se efectueaz din cultura de lucru prin nepare central sau din diluii decimale i se incubeaz la 30oC, timp de 48 -72 ore. Se msoar diametrul zonei n care se observ dispariia turbiditii mediului de cultur ca urmare a hidrolizei cazeinei, precum i diametrul coloniei i se face raportul acestora pentru a se determina indicele proteolitic: diametrul zonei de hidroliz a cazeinei IP = diametrul coloniei

B.

Hidroliza gelatinei

Principiul metodei: Microorganismele productoare de proteaze extracelulare pot hidroliza gelatina din mediul de cultur, care i pierde astfel proprietatea de a se solidifica la temperaturi sczute. Materiale utilizate: - cultura microbian (Bacillus subtilis) - eprubete cu mediul de cultur coninnd gelatin - ac de inoculare - bec de gaz - termostat - frigider - autoclav - mediul de cultur: - pepton de carne.5g - extract de carne3g - gelatin120g - ap distilat 1000ml Mod de lucru: Mediul de cultur se repartizeaz cte 10 mililitri n tuburi prevzute cu dop
62

de vat i se sterilizeaz n autoclav, timp de 20 minute la 121oC. Dup solidificarea mediului nutritiv (pstrat peste noapte n ap rece), tuburile se inoculeaz prin nepare central cu tulpina bacterian cercetat, apoi se incubeaz la 37oC timp de 48 ore. Dup acest interval, culturile se plaseaz aproximativ o or la +4oC, pentru solidificarea gelatinei n cazul n care nu a fost hidrolizat. Dac tulpina a prezentat activitate proteolitic, mediul de cultur rmne lichid dup pstrarea n frigider.

14.5. EVIDENIEREA MICROORGANISMELOR PRODUCTOARE DE ENZIME LIPOLITICE Lipidele prezente n materia nevie, de origine vegetal i animal, care ajung n habitaturi naturale, precum i cele coninute n materii prime sau produse alimentare pot suferi transformri sub aciunea microorganismelor productoare de lipaze extracelulare. Lipidele nu pot fi asimilate dect dup hidroliza lor n prezena enzimelor specifice, numite n general lipaze, dar, grupate totui n funcie de tipul substratului pe care l degradeaz n trei categorii: esteraze, lipaze i lecitinaze. Lipazele sunt sintetizate de numeroase microorganisme: mucegaiuri (genul Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Geotrichum .a.) i drojdii ale genului Candida. Cu microorganisme selecionate se pot obine preparate enzimatice cu activitate lipazic ce pot fi utilizate la fabricarea brnzeturilor pentru dezvoltarea aromei, n terapeutic mpreun cu lipaza pancreatic pentru mbuntirea digestiei, precum i n industria detergenilor. Principiul metodei: Lipazele din grupa esterazelor hidrolizeaz compuii denumii TWEEN, care sunt esteri ai sorbitolului cu acizii grai cu lan lung. n tehnicile calitative cele mai utilizate, aceti esteri solubili n ap sunt ncorporati ntr-o geloz nutritiv coninnd CaCl2. Acizii grai eliberai sub aciunea lipazelor reacioneaz cu CaCl2 i formeaz sruri insolubile de calciu care provoac opacifierea mediului n jurul coloniilor productoare de esteraze. Materiale utilizate: - cultura microbian cu activitate lipolitic - cutii Petri
63

- ac de inoculare - bec de gaz - termostat - mediul de cultur: - agar nutritiv Mod de lucru: se sterilizeaz mediul de cultur n flacoane Erlenmeyer de 500 ml i, separat, o soluie 1% de Tween 20, 40, 60 sau 80 i o soluie 1% CaCl2, n regim de 121oC / 20 minute. n plcile Petri sterile se introduc cte 2 ml din soluia de Tween i 0,5 ml din soluia de CaCl2. Peste acestea se toarn rapid 15 - 20 ml din agarul nutritiv, se omogenizeaz prin rotirea n ambele sensuri a plcilor i se las s se solidifice. Mediul se nsmneaz prin nepare central din cultura de cercetat i se termostateaz la temperatura optim de dezvoltare a microorganismului, timpul necesar. Microorganismele cu activitate tween-esterazic determin apariia n jurul coloniilor a zonelor opace. Se calculeaz indicele lipolitic dup formula: diametrul zonei de hidroliz a esterului IP = diametrul coloniei

64

14.6. STUDIUL EFECTULUI ANTIBIOTICELOR ASUPRA MICROORGANISMELOR

EFECTUAREA ANTIBIOGRAMEI PRIN METODA DISCURILOR

Antibioticele sunt substane a cror aciune antibacterian se exprim astfel:

prin inhibarea multiplicrii bacteriilor - efect bacteriostatic

prin distrugerea bacteriilor - efect bactericid

Evidenierea aciunii bacteriostatice a unor antibiotice prin metoda discurilor Principiul metodei: Cnd un antibiotic este plasat pe suprafaa unui mediu de cultur gelozat, n cutii Petri, acesta difuzeaz dup un gradient de concentraie. Bacteria nsmnat nu se va dezvolta la concentraii ale antibioticului superioare unei mrimi numit C.M.I. (concentraie minim de inhibiie). n jurul discurilor de hrtie impregnate cu antibioticul respectiv se vor observa zone concentrice de inhibiie, al cror diametru este dependent de sensibilitatea mai mare sau mai mic a tulpinii testate fa de acest antibiotic. Materiale utilizate: - cultura bacterian - cutii Petri - discuri de hrtie impregnate cu diferite antibiotice (discurile au un diametru de aproximativ 0,6 cm i sunt inscripionate cu denumirea prescurtat a antibioticului respectiv; concentraia de antibiotic este menionat de obicei de firma productoare pe ambalaj). - eprubete cu ap steril - pipete sterile de 5 ml - bec de gaz - termostat - mediul de cultur: agar nutritiv

65

Mod de lucru: Se sterilizeaz mediul de cultur I eprubetele cu ap prin autoclavare 20 minute la 121oC, apoi se toarn n plcile Petri i se las s se solidifice. Se pregtete inoculul prin obinerea unei suspensii de celule bacteriene n ap steril, astfel nct concentraia acestuia s fie de 2 -3 x 106 UFC/ml. Aceast concentraie bacterian trebuie s permit obinerea de colonii confluente pe suprafaa mediului de cultur. De asemenea, este indicat ca inoculul s provin dintr-o cultur bacterian veche de 24 ore, aflat n faza staionar. nsmnarea mediului de cultur din plcile Petri se realizeaz prin inundarea ntregii suprafee cu 2 -4 ml din diluia obinut din cultura bacterian, iar excesul de lichid se scurge prin aspirare cu o pipet Pasteur. Se aplic apoi discurile de testat fie cu ajutorul distribuitorului automatic, fie cu o pens (sterilizat prin flambare), n mod aseptic, apsnd uor pe discuri pentru a asigura aderena la mediu. Acest din urm procedeu este tot mai rar ntrebuinat. Incubarea are loc 16 - 18 ore la 37oC. Se msoar diametrul zonei de inhibiie i se compar influena diferitelor antibiotice asupra tulpinii bacteriene testate, menionndu-se cel mai eficient antibiotic precum i cel cu aciunea cea mai slab.

Antibiotic 2 Antibiotic 3

Antibiotic 4

Antibiotic 5 Antibiotic 1

66

15. BIOSINTEZA PE CALE MICROBIAN A UNOR COMPUI DE INTERES INDUSTRIAL

Microbiologia industrial a devenit o parte important a microbiologiei, avnd ca domeniu de studiu utilizarea microorganismelor n scopul producerii de metabolii de interes industrial, farmaceutic, agricol, pentru conservarea mediului etc. Produii de origine microbian sunt clasificai n metabolii primari i secundari. Metaboliii primari sunt reprezentai de compuii aflai n legtur cu sinteza componentelor celulei microbiene, produi cel mai adesea n faza de cretere exponenial sau trofofaza. Acetia includ aminoacizi, nucleotide, enzime, produi finali de fermentaie cum sunt etanolul sau acizii organici. Metaboliii secundari se acumuleaz n mediul de cultur n idiofaz, adic n perioada urmtoare fazei de cretere exponentiale; acetia sunt compui care nu au legtur direct cu creterea i sinteza de material celular. Din aceast categorie fac parte cele mai multe antibiotice, micotoxine i colorani microbieni.

Curba de cretere

metabolii primari

metabolii secundari

timp

Principalii metabolii microbieni de interes industrial i biotehnologic sunt prezentai n tabelul urmtor : SUBSTANE MICROORGANISME

67

Produse industriale Etanol (din glucoz) Etanol (din lactoz) Aceton i butanol 2,3 - butandiol Enzime Produse agricole Gibereline Insecticide microbiene Aditivi alimentari Aminoacizi Acizi organici Nucleotide Vitamine Polizaharide Produse medicale Antibiotice Alcaloizi Insulin, hormon uman de cretere, somatostatin, interferon Combustibili Hidrogen Metan Etanol Microorganisme fotosintetice Methanobacterium Zymomonas, Thermoanaerobacter Penicillium, Streptomyces, Bacillus Claviceps purpurea Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae i altele prin inginerie genetic Corynebacterium glutamicum Aspergillus niger Corynebacterium glutamicum Ashbya, Eremothecium, Blakeslea Xanthomonas Gibberella fujikuroi Bacillus thuringiensis Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces fragilis Clostridium acetobutylicum Enterobacter, Serratia Aspergillus, Bacillus, Mucor, Trichoderma

Microorganismele utilizate n aplicaiile industriale sunt cultivate fie n tuburi, n flacoane agitate, n fermentatoare, cu agitare sau static, n medii lichide n submers sau pe medii solide (fermentaie pe suport solid). Mediile de cultur utilizate trebuie s aib un pre de cost ct mai mic, de aceea sunt reprezentate de materii prime, produse, subproduse i deseuri ale industriei agroalimentare, constituind sursa de carbon, de azot , factorii de cretere, care pot fi suplimentate cu sruri minerale.

15.1. OBINEREA DE BIOMAS DIN FUNGI

68

Materiale utilizate: - cultur de Pleurotus ostreatus sau alt microorganism ce poate fi utilizat n acest scop - flacoane Erlenmeyer de 1500 ml - ac de inoculare - tuburi cu ap steril - bec de gaz - termostat - mediu de cultur: boabe de gru Mod de lucru: n flacoanele Erlenmeyer se cntresc cte 100 g de boabe de gru curate i se adaug 100 ml ap de robinet. Mediul se sterilizeaz 30 minute la 1210C, iar dup rcire se nsmneaz cu cultura de Pleurotus ostreatus obinut prin suspensionarea celulelor dintr-un tub n ser fiziologic sau ap steril. Se omogenizeaz cultura i se termostateaz la temperatura camerei, timp de 2 - 3 sptmni, notndu-se data la care cultura a invadat suprafata mediului i efectundu-se cntriri ale flaconului din 3 in 3 zile, pentru determinarea pierderii masice datorate evaporrii, respiraiei i metabolizarii substratului. Ciuperca cultivat este comestibil, (ea face parte din categoria ciupercilor superioare, cu plrie) iar produsul brut obinut ar putea fi prelucrat i utilizat ca aditiv n industria alimentar pentru valoarea sa nutritiv ridicat, gust i aroma caracteristic.

15.2. OBINEREA DE ENZIME PECTOLITICE DIN ASPERGILLUS NIGER Substanele pectice sunt constitueni fiziologici universali ai vegetalelor, alctuind lamela mijlocie care formeaz legtura dintre celule. Tesuturile parenchimatoase sunt deosebit de bogate n substane pectice: acizi pectinici, acizi pectici i protopectine. Acizii pectinici sunt heteropolizaharide constituite n principal din acizi D-galacturonici, n majoritate sub form de ester metilic, unii prin legturi -1,4. Acizii pectici sunt acizi poligalacturonici neesterificai insolubili in ap. Protopectinele, insolubile n ap, stau la originea substanelor pectice, pe care le elibereaz prin hidroliz. Enzimele care acioneaz asupra substanelor pectice se pot ncadra n dou grupe: enzime depolimerizante i enzime saponifiante. Enzimele pectolitice saponifiante sunt esteraze nalt specifice cataliznd demetoxilarea pectinelor prin scindarea legturilor esterice
69

dintre grupele -COOH i alcoolul metilic din lanturile poligalacturonice. Ele se numesc pectin-metil-esteraze sau pectin-esteraze fiind notate PME sau PE. Enzimele pectolitice depolimerizante catalizeaz depolimerizarea pectinei. Preparatele enzimatice comerciale se obin prin cultivarea tulpinilor selecionate de microorganisme (de obicei Aspergillus niger) pe medii de cultur formate din tre de gru, tiei de sfecl de zahr, morcovi, melas, tescovin de mere etc. Dup dezvoltarea microorganismului i biosinteza enzimelor, mediile de cultur sunt prelucrate dup tehnicile cunoscute obinndu-se preparate enzimatice pectolitice purificate sub form de lichid concentrat sau sub form solid. Preparatele enzimatice pectolitice de origine microbian sunt utilizate n industria sucurilor de fructe, conservelor de legume, vinurilor, produselor zaharoase. Materiale utilizate: - tulpina de Aspergillus niger productoare de enzime pectolitice - flacoane Erlenmeyer de 1500 ml - ac de inoculare - ap steril - mediu de cultur: trae de grau cu umiditate de 40 - 50% - bec de gaz - termostat Mod de lucru: Se prepar mediul de cultur coninand tre de gru i ap de robinet (50% umiditate) i se repartizeaz cte 100 g n fiecare flacon, dup care se sterilizeaz la 1210C, timp de 60 minute. Se inoculeaz cu 10 ml suspensie de spori de Aspergillus niger obinut prin raclarea culturii dintr-un tub de cultur n 10 ml ap steril. Mediul nutritiv se omogenizeaz foarte bine i se incubeaz la 300C, timp de 5 zile, cu agitare din 24 n 24 de ore. Dup dezvoltarea complet i sporularea culturii, se efectueaz o extracie 1: 3 n ap de robinet, n care se adaug i cteva picturi de Tween pentru umectarea sporilor i optimizarea extraciei i se las la temperatura camerei 2 ore. Se filtreaz mai nti grosier, apoi pe filtru EK i se poate supune operaiei de concentrare. Preparatul enzimatic brut se prezint ca un lichid transparent, de culoare brun, avnd, o ncrctura relativ ridicat de conidiospori de Aspergillus niger, care poate fi nlturat prin trecerea pe filtru EK, din azbest.

70

15.3. OBINEREA PIGMENTILOR MICROBIENI BIOSINTEZA OREZULUI ROU FERMENTAT CU MONASCUS PURPUREUS Mucegaiul Monascus purpureus, utilizat de secole n rile din Orient pentru prepararea unor mncruri tradiionale, reprezint n prezent o nou surs de obinere a unui aditiv de culoare pentru industria alimentar , farmaceutic i cosmetic, i n rile Europei i Americii. Acest microorganism produce prin cultivare n medii lichide sau prin fermentare pe suport solid cel putin 6 pigmeni, dintre care 2 galbeni (ankaflavina i monascina), 2 oranj (rubropunctatina i monascorubrina) i 2 roii (rubropunctamina i monascorubramina), n funcie de natura sursei de carbon i azot i de condiiile de cultivare. Totodat, acest microorganism sintetizeaz o serie de enzime hidrolitice (n special amilaze), care degradeaz componenii mediului de cultur i poate fermenta o serie de glucide, fapt pentru care este folosit n Orient la obinerea vinului de orez. Materiale utilizate: - tulpina de Monascus purpureus - flacoane Erlenmeyer de 1500 ml - ac de inoculare - eprubete cu ap steril - bec de gaz - termostat - mediu de cultur: orez boabe sau mcinat Mod de lucru: Mediul de cultur se repartizeaz cte 100 g n fiecare flacon Erlenmeyer i se sterilizeaz prin autoclavare la 1210C, timp de 30 minute. Dup rcire, mediul este nsmnat cu o suspensie de conidiospori de Monascus purpureus obinui prin raclarea culturii din tub n ap steril. Se agit energic coninutul flacoanelor, aceast operaie repetndu-se zilnic pn la ncheierea biosintezei. Termostatarea va avea loc la ntuneric, la 300C, timp de 3 sptmani. Se va nota intervalul dup care are loc apariia hifelor, colorarea mediului de cultur n oranj sau rou i se vor cntri flacoanele la fiecare 3 zile pentru evidenierea scderii n greutate ca urmare a evaporrii, consumului de substrat i a respiraiei celulare. Dup ncheierea procesului de sintez a pigmenilor, acetia vor fi extrai din mediul de cultur n etanol, putndu-se trasa spectrul n vizibil.
71

16. INFLUENA RADIAIILOR UV ASUPRA MICROORGANISMELOR 16.1. POSIBILITATEA INDUCERII MUTAGENEZEI N CELULA MICROBIAN Radiaiile ultraviolete cu lungimea de und de 254 nm pot avea efecte letale asupra celulei microbiene, n funcie de doz i de starea microorganismelor. Ele sunt puternic absorbite de bazele azotate, determinnd asupra acestora efecte chimice constnd n formarea de pirimidine legate covalent (dimeri de pirimidin ), n principal de timin adiacent n lanul polinucleotidic. Aceti dimeri cauzeaz o distorsiune n helixul de ADN, dar cele mai multe modificri pot fi reparate prin procese de fotoreactivare, prin excizie, recombinare sau reparare SOS. Dac doza de radiaii este subletal, informaia genetic se transmite eronat i se pot obine tulpini mutante, cu caractere diferite de cele ale tulpinei parentale. La nivel molecular, mutaiile reprezint alterri ale secvenei de baze din structura ADN. n practica biotehnologic, acest aspect este utilizat pentru obinerea de mutante cu potential productiv ridicat, cultivate pentru biosinteza unor compui de interes industrial. Principiul metodei: Radiaiile ultraviolete fac parte din categoria agenilor mutageni fizici, care determin, pe lng moartea unor celule, mrirea ratei de apariie a mutaiilor, care,
72

oricum s-ar fi produs i spontan, dar n intervale de timp mult mai mari. Aciunea radiaiilor UV poate fi evideniat prin determinarea numrului de celule viabile dup expunerea la acest tip de factori fizici, fa de un martor neiradiat. Materiale utilizate: - lamp germicid (cu = 254 nm) - cultura microbian - stativ - cronometru - pipete sterile - plci Petri - termostat - mediu de cultur - se va utiliza mediul adecvat tulpinii cu care se lucreaz. Pentru determinarea numrului de bacterii viabile se va utiliza agar nutritiv, pentru drojdii sau mucegaiuri - extract de mal - agar. Pentru evidenierea tulpinilor mutante se va alege un mediu special, n funcie de caracterul care se dorete a fi selecionat, de exemplu: indice amilolitic, proteolitic etc, crescut (vezi lucrrile anterioare), producie de pigmeni, proprietatea de rezisten la un anumit antibiotic .a.

Mod de lucru: Mediul de cultur sterilizat n prealabil se fluidific pe baie de ap, dup care se repartizeaz n plci i se las s se solidifice. nsmnarea plcilor se face dintr-o diluie corespunztoare, n ser fiziologic sau ap steril, astfel nct s poat fi determinat numrul de colonii aprute dup termostatare, n cazul probei neiradiate. n cazul probelor ce vor fi expuse aciunii radiaiilor UV, trebuie s se in seama c diluia va fi din ce n ce mai mic, mergnd, unde se poate, pn la pipetarea direct din inocul. Pentru iradierea probelor, se fixeaz stativul sub lampa germicid, la o distan de aproximativ 20 cm, i se sterilizeaz nia timp de 15 minute prin aprinderea lmpii. Pentru efectuarea iradierilor, plcile Petri nsmnate i deschise vor fi plasate pe stativ, pornindu-se cronometrul concomitent cu aprinderea lmpii. Atenie! nainte de pornirea lmpii bactericide, se va nchide nia cu ajutorul ecranului protector mobil. Nu se introduce mna n ni n timp ce lampa de ultraviolete este n funciune!
73

Timpii de expunere a culturilor din pl ci la aciunea radiaiilor UV sunt cuprini ntre 30 secunde i cteva minute, n funcie de tulpina cu care se lucreaz. Imediat dup iradiere, plcile se nchid cu capacul, se noteaz timpul de expunere, se ambaleaz n hrtie neagr (pentru evitarea reparaiilor prin fotoreactivare) i se introduc n termostat, lsnduse durata necesar dezvoltrii coloniilor. Dup acest interval se numr coloniile aprute n fiecare plac, inndu-se seama de coeficientul de diluie. Pentru fiecare timp de iradiere trebuie efectuate cte trei plci, n scopul exprimrii rezultatelor ca medie a trei determinri. Viabilitatea celulelor expuse iradierii se va calcula dup formula: nr. colonii din plac x coeficientul de diluie Viabilitatea = x 100 nr. colonii din placa martor (neiradiat) x coeficientul de diluie

Se va completa urmtorul tabel: Nr. prob Timp de iradiere (sec) Nr. celule/ml Viabilitate (%) 0 10 30 60 90 120 150 180 210 240 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n cazul n care se dorete izolarea de tulpini mutante cu caractere fenotipice modificate fa de tulpina parental, se va utiliza un mediu de cultur convenabil, care s permit selecionarea uoar i rapid a coloniilor mutante. Acestea vor fi nsmnate n tuburi, pe mediu nclinat, urmnd ca tulpinile selecionate s fie testate prin cultivare n submers sau suprafa din punct de vedere al biosintezei metaboliilor utili. De exemplu, pot fi izolate tulpini bacteriene sau fungice productoare de amilaze, proteaze, celulaze, lipaze, colorani microbieni, rezistente la aciunea unor factori de mediu etc.

74

DESFURAREA ACTIVITII I PROTECIA MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Microbiologia este o disciplin care necesit ordine, metod, rigoare i o curenie impecabil n timpul lucrului. n laboratorul de microbiologie trebuie respectate o serie de reguli de igien, fr de care nu pot fi aplicate metodele de lucru specifice acestei discipline, exist nd totodat pericolul contaminrii propriei persoane, a celor din jur, precum i a materialelor care se manipuleaz. Numrul microorganismelor din ncperi variaz de la cteva sute / m3, n ncperi foarte curate, fr micri de aer, pn la zeci de mii n ncperi nentreinute igienic. Este cunoscut faptul c majoritatea microorganismelor din aer provin de pe sol, din depozitele de materie organic i ajung n aer odat cu particulele de praf. O alt categorie sunt microorganismele expulzate de pe mucoasele aparatului respirator prin tuse, strnut, vorbire i chiar n timpul respiraiei. Pentu desfurarea unei activitti normale de lucru n laboratoarele de microbiologie se vor respecta urmtoarele reguli:
*

ntreinerea n perfect stare de curenie a ncperilor (pardoseal, perei, plafon i

geamuri), combaterea insectelor i a mucegaiului;


*

ndeprtarea de pe mesele de lucru i din ncpere a tuturor obiectelor inutile;


75

ntreinerea n perfect stare de curenie a aparaturii, mobilierului i meselor de

lucru;
* * *

tergerea meselor de lucru cu un dezinfectant nainte de nceperea lucrului; evitarea formrii curenilor de aer n ncperile de lucru; iradierea cu raze ultraviolete a atmosferei i suprafeelor de lucru nainte de

nceperea activitii
*

ntreinerea n perfect stare de curenie a minilor, mbrcmintei i

nclmintei persoanelor care lucreaz n laborator.

De aceea, n laboratorul de microbiologie :

purtai un halat de laborator dintr-un material neinflamabil, n stare bun, curat i dintr-o singur culoare; lsai-v hainele n vestiar sau n spaiul special amenajat; dup terminarea lucrrilor, halatul va fi pstrat n locuri speciale;

protejai-v uviele lungi de pr, purtai unghiile curate i tiate scurt; splai-v mainile cu ap cald i spun (de preferin lichid sau pudr, cu aciune bactericid) i tergei-le pe un prosop de hrtie de folosin unic nainte i dup manipularea microbiologic;

dup utilizarea sticlriei cu care ai manipulat microorganismele, aceasta trebuie depozitat separat n vederea autoclavrii;

ESTE INTERZIS ARUNCAREA OBIECTELOR CARE AU FOST N CONTACT CU MICROBII LA COUL DE GUNOI !

nu mncai, nu bei i nu fumai n incinta laboratorului; nu depozitai alimentele personale n frigiderul laboratorului; nu vorbii, nu strnutai i nu tuii n timpul nsmnrilor ;

n practica de laborator, principalele accidente pot apare la: - mini - tieturi sau inepturi cu pipete Pasteur sau cu cioburi de sticl; arsuri ale degetelor n timpul lucrului n zona steril din jurul flcrii de la becul de gaz; arsuri cu amestec sulfocromic; - ochi - prin proiectarea cioburilor de sticl sau a unor stropi de ap fierbinte sau substane chimice n timpul lucrului; - gur - ingerarea de produi toxici (reactivi) sau de culturi microbiene; acest tip
76

de accidente este foarte rar, deoarece pipetele sunt prevzute cu un dop de vat la capt; - nas - inhalarea unei dispersii de germeni (aerosoli infec ioi), din cauza practicilor greite de nsmnare sau cnd un tub de cultur microbian se sparge: acest tip de accidente poate fi evitat prin purtarea unei mti sterile din hrtie.

77