CICLUL ACIDULUI CITRIC

Ciclul acidului citric cunoscut si ca ciclul acizilor tricarboxilici (Ciclul TCA) sau ciclul Krebs, sau cunoscut mult mai rar ca ciclul Szent-Gyrgyi-Krebs este reprezentat de o serie de reactii chimice catalizate enzimatic, de o importanta majoritara, in toate celulele vii care utilizeaza oxigen ca parte din respiratia celulara. In celulele eucariote, acest ciclu are loc in mitocondrii. Reactiile acestui ciclu au fost stabilite de catre Albert Szent Gyorgyi si separat de Hans Krebs, motiv pentru care mai poarta si numele acestora. La organismele aerobe, ciclul acidului citric este o parte a cailor metabolice implicate in conversia carbohidratilor, grasimilor si proteinelor in dioxid de carbon si apa pentru a genera energie utila. Reactiile importante care au loc inaintea ciclului Krebs sunt glicoliza urmata de oxidarea piruvatului si de fosforilarea oxidativa dupa TCA. In plus, acest ciclu furnizeaza precursorii pentru numerosi compusi inclusiv unii aminoacizi si este de aceea functional si in celulele care realizeaza procese de fermentare, fiind deosebit de important si pentru cunoasterea proceselor biotehnologice din orice domeniu. ATP utilizat de cele mai multe celule pentru mentinerea homeostazei, este produs in mare parte prin oxidarea piruvatului in Ciclul acizilor tricarboxilici. In timpul acestui proces de oxidare se genereaza nicotinamid dinucleotida redusa (NADH) si flavin adenin dinucleotida redusa (FADH2). Acestea sunt utilizate, majoritar, pentru realizarea proceselor de fosforilare oxidativa, fiind responsabile de transformarea potentialului lor reducator in legatura macroergica a fosfatului din ATP. Soarta piruvatului depinde de incarcatura energetica a celulei. In celule sau tesuturi cu incarcatura energetica superioara, piruvatul este directionat spre procesul de gluconogenza, dar cand incarcarea energetica este scazuta, piruvatul este, in mod preferential, oxidat la CO2 si H2O prin intermediul ciclului acizilor tricarboxilici, cu generarea a unui total de 15 echivalenti de ATP per molecula de piruvat. Reactiile enzimatice ale TCA precum si ale fosforilarii oxidative sunt localizate in mitocondrii. Aici exista doua enzime principale care actioneaza asupra piruvatului: piruvat carboxilaza (o enzima glucogenica) si piruvat dehidrogenaza (PDH), prima enzima din complexul de transformare a piruvatului pana la acetil-CoA. Aceasta

transformare are loc printr-o succesiune de reactii care implica 3 categorii de enzime: piruvat dehidrogenaza, dihidrolipoil transacetilaza si dihidrolipoil dehidrogenaza. De asemenea complexul de transformare necesita si 5 coenzime diferite: CoA, NAD+, FAD+, acid lipoic si tiamin pirofosfat (TPP). Trei dintre aceste coenzime sunt necesare enzimelor ce catalizeaza reactiile complexului de transformare (TPP, acidul lipoic, FAD+) in timp ce doua sunt folosite ca transportori ai produsilor complexului de reactii (CoA, NAD+). Reactia globala a procesului de transformare a piruvatului in acetil-CoA este: Piruvat + CoA + NAD+ > CO2 + acetil-CoA + NADH + H+ Acetil CoA este o substanta macroergica si mai este denumita si acid acetic activ, acetatul activ sau fragmentul C2 activ. Printr-un proces exergonic Acetil CoA cedeaza cu usurinta radicalul acetil, contribuind la sinteza acizilor grasi, a sterolilor, a pigmentilor etc. Sub aceasta forma piruvatul intra in Ciclul Krebs. Schema simplificata a Ciclului Krebs sau Ciclul Acidului Citric este:

Reactiile separate ale Ciclului Krebs: 1. In prima reactie a ciclului acidului citric, acetil-CoA reactioneaza cu oxaoacetatul pentru a forma citrat printr-o reactie de condensare aldolica. Hidroliza tioesterului de la Acetil-CoA favorizeaza deplasarea echilibrului spre formarea produsului.

Dupa cum se vede in aceasta reactie, catalizata de citrat sintetaza, gruparea metil a acetil-CoA cedeaza un ion de hidrogen care se leaga de carbonilul oxalacetatului si intre cei doi atomi de carbon implicati se formeaza o legatura simpla. S-a format astfel citrat, acidul citric sub forma ionica, de fapt prima substanta din ciclul propriu-zis al acizilor tricarboxilici. 2. In urmatoarea etape citratul este izomerizat la isocitrat. Aceasta reactie

catalizata de aconitaza este stereospecifica prin deplasarea gruparii hidroxil de la atomul central de carbon al citratului (cel care a fost atomul carbonil in oxaloacetat) la gruparea metilen provenita de la acetat.

De fapt aceasta reactie are loc in doua trepte si anume intai se formeaza acid cisaconitic care apoi trece in acid izocitric. Intre acesti compusi reactiile sunt reversibile 3

stabilindu-se un echilibru la concentratii de: 89% acid citric, 3% acid cisaconitic si 8% acid izocitric. 3. In aceasta etapa isocitratul este decarboxilat la -cetoglutarat, in prezenta

isocitrat dehidrogenazei si NAD+. Daca citratul nu ar fi izomerizat la isocitrat, aceasta decarboxilare ar conduce la un compus ramificat care este mult mai greu de metabolizat.

Si aceasta etapa decurge printr-o succesiune de reactii: acidul izocitric este dehidrogent apoi este decarboxilat formand -cetoglutarat. -cetoglutaratul este un ceto-acid, care contine o grupare carbonil adiacenta gruparii carboxil. Aceasta structura il face foarte reactiv reactionand similar cu piruvatul. 4. In aceasta etapa -cetoglutaratul produce prin decarboxilare destula energie

incat sa formeze o legatura tioesterica cu coenzima A. Reactia catalizata de cetoglutarat dehidrogenaza in prezenta NAD + si este similara cu cea a piruvat dehidrogenazei ca derulare, cofactori utilizati si mecanism.

5.

Ca orice legatura tioesterica, cea prezenta in succinil-CoA este macroergica

astfel incat hidroliza in prezenta Succinil-CoA sintetazei sau SuccinatTiokinaza, va conduce la producerea ATP sau mai precis la un compus macroergic echivalent GTP.

6.

In ultimele 3 reactii ale Ciclului Krebs se regenereaza oxaloacetatul din succinat.

Intai succinatul este oxidat la fumarat in prezenta complexului succinat dehidrogenazei. Potentialul redox necesar oxidarii legaturii simple C-C la o legatura dubla C=C este prea inalt incat electronii implicati sa fie acceptati de NAD+ (E0= 320 mV). De aceea celula va utiliza FAD (E0= 0 mV) ca acceptor de electroni. Deci reactia etapei 6 este:

In celulele mamiferelor acceptorul final de electroni este coenzima Q10 (CoQ10), care este un transportor mobil de electroni, restrictionat insa de natura sa lipofilica la faza lipidica a membranei mitocondriale. 7. Prin hidratarea stereospecifica a fumaratului, in prezenta fumarazei, rezulta LMalat.

Fumaraza este extrem de specifica ea necatalizand decat aceasta reactie. 8. L-Malatul prin oxidare, in prezenta malat dehidrogenazei si NAD+ conduce la

oxaloacetat (OAA), inchizand ciclul.

Reactia stoichiometrica globala a Ciclului Acidului Citric este deci: Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + 2 H+ + GTP + HSCoA Ciclul Acizilor Tricarboxilici, asa cum se vede din reactia globala de mai sus este puternic exergonic, reprezentand o cale principala de formare a energiei in organism prin formarea moleculelor macroergice (ATP, GTP, etc.). Bilantul energetic al acestui ciclu poate fi exprimat in diferite moduri. Cel mai simplu si poate cel mai vizibil este prin exprimarea acesteia prin moli de ATP. Astfel generarea a unui mol de NADH este echivalenta cu acumularea a 3 moli de ATP, generarea unui mol FADH2 este echivalenta cu 2 moli ATP, iar a unui mol GTP cu 1 mol ATP. Deci tinand cant de acestea si calculand conform ciclului Krebs avem: In etapele 3, 4 si 8 cate un mol NADH deci In etapa 5 se formeaza 1 GTP deci In etapa 6 se formeaza un mol FADH2 deci TOTAL 3 x 3 = 9 ATP; 1 x 1 = 1 ATP 1 x 2 = 2 ATP 12 ATP

De asemenea pentru a trece de la piruvat la Acetil-CoA se genereaza un mol de NADH deci inca 3 moli ATP, astfel plecand de la piruvatul rezultat din glicoliza, procesul complet al ciclului Krebs genereaza 15 moli ATP.

Reactiile Ciclului Krebs pot fi prezentate simplificat in forma unui tabel:

1 Substraturi Oxaloacetat + Acetil-CoA + H2O Citrat Cis-Aconitat + H2O Isocitrat + NAD+ Oxalosuccinat -Cetoglutarat + NAD+ + CoA-SH Succinil-CoA + GDP + Pi Succinat + ubiquinona (Q) Produsi Citrat + CoA-SH Enzima Citrat sintaza Tip de reactie Condensare aldolica Dehidratare Aconitaza Hidratare Oxidare Isocitrat dehidrogenaza Decarboxilare -Cetoglutarat dehidrogenaza Succinil-CoA sintetaza Succinat dehidrogenaza Decarboxilare oxidativa fosforilare Oxidare Izomerizare reversibila Genereaza NADH care este echivalenta cu 2,5 ATP Etapa ireversibila, genereaza o molecula din 5 C Genereaza NADH care este echivalenta cu 2,5 ATP, regenereaza un lant de 4 C Se genereaza un echivalent al ATP Foloseste FAD ca si grupare prostetica (FAD FADH2 in prima etapa a reactiei), genereaza echivalentul a 1,5 ATP Genereaza NADH (echivalent a 2,5 ATP) Comentarii Etapa limitatoare de viteza deoarece are loc extinderea unei molecule de la 4C la 6C Izomerizare reversibila

2 3 4 5 6

Cis-Aconitat + H2O Isocitrat Oxalosuccinat + NADH + H+ -Cetoglutarat + CO2 Succinil-CoA + NADH + H+ + CO2 Succinat + CoASH + GTP Fumarat + ubiquinol (QH2)

7 8

9 10

Fumarat + H2O L-Malat + NAD+

L-Malat Oxaloacetat + NADH + H+

Fumaraza Malat dehidrogenaza

Aditie de H2O (hidratare) Oxidare