97

Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 97-112

INFLUENCE DU 2,4-D ET DE LEXPLANT EMBRYONNAIRE SUR LA CALLOGENSE DU BL DUR (*)

Kou toua AYOLI ( 1 ) , Hou da EL YACOUBI Atm ane ROCHDI ( 1 )

(1)

Des explants dembryons matures ou immatures entiers ou coups de moiti de varits marocaines de Bl dur (Triticum durum) ont t cultivs sur le milieu MS supplment de diffrentes concentrations de 2,4-D. Pour lensemble des varits tudies, les meilleurs taux de croissance de la matire frache ont t enregistrs 3,5 mg/l de 2,4-D avec des taux de germination trs faibles. La callogense dpend du gnotype et est favorise par lutilisation dembryons immatures et leur fragmentation. 3,5 mg/l de 2,4-D, le taux moyen de callogense atteint 64 et 79 % pour les embryons et demi-embryons matures, et 98 et 100 % pour les embryons et demi-embryons immatures.

INTRODUCTION
Le Bl est essentiellement amlior par des mthodes traditionnelles qui restent longues et onreuses. Lobtention de cals par culture in vitro permet une augmentation de la variabilit et peut tre suivie dune rgnration et dun taux lev de multiplication [13]. [4 ]

(*)

(1)

Manuscrit reu le 10 juillet 2006. Unit cophysiologie et Biotechnologie de culture in vitro, Universit Ibn Tofal, Facult des Sciences, BP 133, 14000 Knitra, Maroc. consty62@yahoo.fr

98 Chez le Bl tendre (Triticum aestivum), linitiation de cals a t gnralement ralise partir de fragments de feuilles [20], dinflorescences [15], dembryons immatures [1,10-11,14] et matures [5,8] avec plus ou moins de succs selon les varits. La callogense du Bl dur (Triticum durum) reste moins matrise et dpend des varits. La prsente tude vise dterminer les conditions optimales de callogense partir dembryons matures et immatures de sept varits de Bl dur en prsence de 2,4-D.

MATRIEL ET MTHODES

Matriel vgtal Sept varits marocaines de Bl dur (Triticum durum Desf.) ont t utilises : Amjad (recommande pour les zones semi-arides), Marzak (tolrante aux principales maladies cryptogamiques), OumRabia (recommande pour les zones semi-arides et arides), Sebou (rsistante la rouille et tolrante la septoriose et lhelminthosporiose), Ourgh (dadaptation trs large), Anouar et Tomouh (dadaptation large). Les semences ont t fournies par lINRA (Institut National de Recherche Agronomique) de Rabat (Maroc). Les embryons matures ont t prlevs partir des graines de six varits (Amjad, Marzak, OumRabia, Ourgh, Sebou, Anouar). Les embryons immatures (1 1,5 mm) de trois varits (Amjad, Marzak et Tomouh) ont t prlevs sur les pis de plantes cultives sous serre, 2 3 semaines aprs lanthse. Dsinfection et mise en culture Les caryopses matures et immatures dbarrasss de leurs glumes et glumelles sont dsinfects par trempage et agitation, dans de lthanol 70 50 et 30 secondes, puis dans de leau de Javel 25 % 25 et 15 minutes respectivement. Suivent trois rinages leau distille strile sous une hotte

99 flux laminaire horizontal. Une partie des embryons matures et immatures est sectionne en deux demi-embryons en divisant le scutellum dans le sens de la longueur. Les explants sont placs face scutellaire vers le haut sur le milieu de culture solide dans des botes de Petri de 9 cm de diamtre. Initiation de la callogense Le milieu utilis est celui de Murashige et Skoog (MS) [9 ] supplment de diffrentes concentrations (1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 et 4 voire 5 mg/l) de lauxine 2,4-D (acide 2,4-dichlorophnoxyactique). Le pH est ajust 5,7 avant autoclavage 20 minutes 120C. Lincubation a lieu lobscurit 25 2C. Pour chaque varit et chaque concentration en 2,4D, trois botes de Petri renfermant cinq embryons et cinq demi-embryons, matures ou immatures, sont utilises. Variables suivies Laptitude la callogense est value par les paramtres suivants : - Linduction des cals est estime par le taux de callogense, pourcentage dexplants ayant produit un cal aprs deux semaines de culture pour les embryons immatures et quatre semaines pour les embryons matures. - Certains explants germent et le taux de germination est alors dtermin aprs deux et quatre semaines respectivement chez les embryons immatures et matures. - Le taux daccroissement de la masse de matire frache du cal aprs deux semaines pour les embryons immatures et quatre semaines pour les embryons matures est calcul partir de la diffrence de masse entre lexplant initial et le cal obtenu, divise par la masse initiale. Analyse statistique Lanalyse de variance a t ralise par un logiciel de statistique et le test de Student-Newman-Keuls (SNK) a t utilis pour le classement des moyennes.

100

RSULTATS

Donnes gnrales Linduction des cals a dbut aprs trois jours de culture chez les embryons immatures et dix jours chez les embryons matures. Les cals provenant dembryons matures sont jaune clair sauf pour la concentration 5 mg/l 2,4-D ou la coloration est jaune fonc. Ceux provenant dembryons immatures sont jaune blanchtre. Les cals prsentent galement des diffrences dans la consistance, compacte ou friable et la texture, lisse ou rugueuse (Tableaux I et II).

Tableau I : Effet du 2,4-D sur linitiation des cals (toutes varits confondues) partir dembryons matures aprs quatre semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.
2,4-D Embryon (mg/l) 1,5 2 2,5 3 3,5 4 5 entier demi entier demi entier demi entier demi entier demi entier demi entier demi Induction des cals (%) 17,8 25,6 36,7 54,4 43,3 53,3 53,3 65,6 66,7 78,9 65,6 78,9 38,9 51,1 Germination Taux Consistance, (%) daccroissement Aspect 23,3 0,4 compact, lisse 27,8 43,3 0,8 compact, lisse 41,1 36,7 27,8 23,3 13,3 30,0 8,9 20,0 6,7 13,3 3,3 0,9 1,9 2,7 2,6 1,6 compact, lisse friable, lisse friable, rugueux friable, rugueux friable, rugueux

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Tableau II : Effet du 2,4-D sur linitiation de cals (toutes varits confondues) partir dembryons immatures aprs deux semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.
2,4-D Embryon (mg/l) 1,5 entier demi 2 entier demi 2,5 entier demi 3 entier demi 3,5 entier demi 4 entier demi Induction des cals (%) 100,0 91,1 91,1 93,3 88,9 91,1 93,3 97,8 100,0 97,8 97,8 97,8 Germination Taux Consistance, (%) daccroissement Aspect 93,3 86,7 64,5 35,6 53,3 20,0 48,9 15,6 46,7 4,4 41,1 11,1 0,5 1,9 2,3 2,5 2,7 2,6 peu friable, lisse peu friable, lisse peu friable, lisse compact, lisse compact, lisse compact, lisse

Le taux de germination est plus faible pour les demi-embryons que pour les embryons entiers et il baisse avec la teneur en auxine. En outre, 1,5 mg/l de 2,4-D, il se forme une longue racine qui tend disparatre partir de 3,5 mg/l. Les demi-embryons sont moins enclins la germination partir de 3,5 mg/l (Figures 1 et 2). Linduction des cals est importante ds 1,5 mg/l de 2,4-D pour les embryons et demi-embryons immatures alors quelle ne dpasse 50 % qu partir de 3 mg/l pour les embryons et demi-embryons matures. Cependant, 3,5 mg/l de 2,4-D, on a une bonne induction de cals de masse importante.

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Fig. 1 : Callogense d'embryons ( gauche des botes) et de demi-embryons ( droite des botes) immatures de Bl dur aprs deux semaines de culture sur le milieu MS en prsence de 1,5 (photo de gauche) et 3,5 mg/l (photo de droite) de 2,4-D.

Fig. 2 : Callogense d'embryons ( gauche) et de demi-embryons ( droite) matures de Bl dur aprs quatre semaines de culture sur le milieu MS en prsence de 3,5 mg/l de 2,4-D. Cas des embryons et demi-embryons matures Les varits tudies prsentent des taux de callogense diffrents aussi bien pour lembryon entier que pour le demi-embryon mature (Figure 3b). Cette diffrence met en vidence leffet gnotype. Concernant lembryon entier, les varits Anouar, Ourgh, Sebou et OumRabia prsentent des taux dinduction de cal suprieurs 50 % pour toutes les concentrations de 2,4-D utilises, lexception de 1,5 mg/l o les taux oscillent entre 13 et 26 %. Par contre, pour les varits Amjad et Marzak, les taux de callogense nexcdent 50 % qu 3,5 et 4 mg/l pour

103 Amjad et 4 mg/l pour Marzak. La concentration optimale pour linduction du cal est de 3,5 mg/l pour les varits Amjad, Sebou, Ourgh et Anouar et de 4 mg/l pour les autres varits. Concernant le demi-embryon, les taux de callogense dpassent toujours 50 % chez la varit Anouar et dans toutes les concentrations de 2,4-D utilises, except 1,5 mg/l chez les varits OumRabia, Sebou et Ourgh. Par contre, chez Amjad et Marzak, les taux de callogense natteignent 50 % qu 3,5 et 4 mg/l.
100

Callogense (%)

80 60 40 20 0

Amjad

Marzak

Oum Rabia

Sebou

Ourgh

Anouar

a - Embryons entiers

100

1,5 2 2,5 3 3,5 4 5

Callogense (%)

80 60 40 20 0

Amjad

Marzak

Oum Rabia

Sebou

Ourgh

Anouar

b - Demi-embryons

Fig. 3 : Variation du taux de callogense dembryons (a) et de demi-embryons (b) matures de six varits de Bl dur en fonction de la concentration de 2,4-D aprs quatre semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.

104

80 70 60 50 40 30 20 10 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar a - Embryons entiers 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar 1,5 2 2,5 3 3,5 4 5

Germination (%)

Germination (%)

b - Demi-embryons

Fig. 4 : Variation du taux de germination partir dembryons (a) et de demi-embryons (b) matures lors de la callogense de six cultivars de Bl dur en fonction de la concentration de 2,4-D aprs quatre semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.

Lanalyse de la variance (Tableau III) rvle des diffrences trs hautement significatives pour leffet de la concentration en 2,4-D, du gnotype et du type dexplant. Daprs le test SNK, 3,5 et 4 > 3 > 2, 2,5 et 5 > 1,5 mg/l de 2,4-D, OumRabia, Anouar et Sebou > Ourgh > Amjad et Marzak et les demi-embryons donnent de meilleurs rsultats que les embryons. Les pourcentages de germination des embryons et demi-embryons varient galement selon le gnotype (Figure 4a et b). Ils sont les plus levs chez la varit Sebou (80 et 75 %) et faibles chez Amjad et Marzak. Ils atteignent 50 60 % pour les varits Anouar, Ourgh et OumRabia.

105 Tableau III : Analyse de la variance lors de la callogense dembryons et de demi-embryons de divers cultivars de Bl dur en prsence de diffrentes concentrations de 2,4-D.
F observ Embryons matures Embryons immatures Nombre de Nombre Masse Nombre Nombre Masse cals dexplants frache des de cals dexplants frache des germs cals germs cals

Variables considres Source de variation Concentration en 2,4-D Gnotype Type dexplant

31,99 *** 30,76 *** 29,22 ***

14,88 *** 37,02 *** 18,70 ***

196,42 *** 38,88 *** -

2,48 * 10,77 *** 0,05 ns

25,76 *** 125,78 *** 3,77 * 70,74 *** 4,40 * -

ns: non significatif ; *** significatif 1 ; * significatif 5 %.

Par ailleurs, le taux de germination est gnralement plus faible pour les demi-embryons que pour les embryons entiers. Lanalyse statistique (Tableau III) met en vidence un effet trs hautement significatif de la concentration en 2,4-D et du gnotype sur la germination. Daprs le test SNK, 5 > 4 > 3,5 > 3 > 1,5 > 2,5 > 2 mg/l de 2,4-D, Amjad et Marzak > OumRabia, Anouar et Ourgh > Sebou et les demi-embryons donnent moins de germination que les embryons. La croissance des cals des embryons matures est importante 3,5 et 4 mg/l de 2,4-D (Figure 5). Lanalyse de la variance (Tableau III) montre un effet trs hautement significatif de la concentration en 2,4-D et du gnotype sur la croissance des cals. Daprs le test SNK, 3,5 et 4 > 3 > 5 > 2,5 et 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D, Ourgh et Sebou > OumRabia et Anouar > Amjad et Marzak pour la croissance des cals.

106

3,5 Taux de croissance de la matire frache des cals 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar Varits

1,5 2 2,5 3 3,5 4 5

Fig. 5 : Variation du taux de croissance des cals induits partir dembryons matures de six varits de Bl dur en fonction de la concentration de 2,4-D aprs quatre semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.

Cas des embryons et demi-embryons immatures Le taux de callogense des embryons et demi-embrons immatures (Figure 6a et b) est lev pour toutes les concentrations testes. Il est proche de 100 % pour Amjad et Tomouh et de 80 % pour Marzah.
110 100 90 80 70 60 50 Amjad Marzak Tomouh a - Embryons entiers
110 Callogense (%) 100 90 80 70 60 50 Amjad Marzak Tomouh b - Demi-embryons 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Callogense (%)

Fig. 6 : Variation du taux de callogense dembryons (a) et de demiembryons (b) immatures de trois cultivars de Bl dur en fonction de la concentration de 2,4-D aprs deux semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.

107

Lanalyse de la variance (Tableau II) rvle un effet significatif de la concentration de 2,4-D et du gnotype, mais pas pour le type dexplant. Daprs le test SNK, 3,5 > 4 > 1,5 et 3 > 2 > 2,5 mg/l de 2,4-D, Tomouh et Amjad > Marzak pour linduction de cals. Les taux de germination aprs deux semaines de culture (Figure 7) sont plus importants chez lembryon entier que le demi-embryon. Les taux les plus levs (> 80 %) sont observs aux faibles concentrations. Le taux est suprieur 50 % avec lembryon de la varit Tomouh. Les plus faibles taux ont t observs 3,5 mg/l avec le demi-embryon pour Amjad et Marzak.
100 Callogense (%)
Callogense (%)

100 80 60 40 20 0 Amjad Marzak Tomouh b - Demi-embryons

1,5 2 2,5 3 3,5 4

80 60 40 20 0 Amjad Marzak Tomouh a - Embryons entiers

Fig. 7 : Variation du taux de germination dembryons (a) et de demiembryons (b) immatures lors de la callogense de trois cultivars de Bl dur en fonction de la concentration de 2,4-D aprs deux semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.

Lanalyse de la variance montre un effet trs hautement significatif de la concentration en 2,4-D et du type dexplant sur la germination (Tableau III). Daprs le test SNK, 4, 3,5 et 3 et 2,5 > 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D et Amjad et Marzak > Tomouh. Le taux de croissance de la masse de matire frache des cals aprs deux semaines de culture augmente avec la concentration de 2,4-D (Figure 8) et atteint 380 % 3,5-4 mg/l. Ce taux de croissance reste relativement important pour les autres concentrations lexception d1,5 mg/l.

108 Lanalyse de la variance (Tableau III) a montr un effet trs hautement significatif de la concentration en 2,4-D sur la croissance du cal partir dembryons immatures entiers. Daprs le test SNK, 3,5 > 4 > 3 > 2,5 > 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D, Marzak > Amjad et Tomouh.
Taux de croissance de la matire frache des cals
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Amjad Marzak Varits Oum Rabia 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Fig. 8 : Variation du taux de croissance des cals de trois cultivars de Bl dur en fonction de la concentration de 2,4-D aprs deux semaines de culture sur le milieu MS 25C lobscurit.

DISCUSSION ET CONCLUSION
Chez le Bl tendre, la callogense a t induite en prsence du 2,4-D seul ou en combinaison avec une deuxime auxine, lANA [19]. Dans cette tude, le 2,4-D seul a t suffisant pour linduction et la croissance des cals chez plusieurs varits de Bl dur. Linfluence de la concentration en 2,4-D et des embryons ou demiembryons comme explants a t mise en vidence. Ainsi, les cals sont induits toutes les concentrations testes, avec un meilleur taux de callogense 3,5 et 4 mg/l. Dans dautres travaux, des cals ont t obtenus des concentrations plus faibles de 2,4-D (1 mg/l chez le Bl tendre [7] ; 1,5 [2] ou 2 mg/l chez le Bl dur [12 ]) ou beaucoup plus leves (6 et 8 mg/l [3]). La croissance des cals a presque quadrupl 3,5 et 4 mg/l de 2,4-D alors que le taux de germination est faible. Lutilisation dembryons immatures a permis lamlioration de la callogense in vitro chez le Bl [11]. Linduction callogne chez les explants immatures en seulement trois jours pourrait tre due la fragilit de leurs structures membranaires permettant ainsi une pntration rapide de lauxine. [17-18]

109 La pntration pourrait aussi tre favorise en coupant lembryon. Certains auteurs estiment que le niveau endogne de rgulateur de croissance relativement important chez les embryons immatures explique la formation rapide de cals surmonts souvent de jeunes pousses [10 ]. Le niveau de phytohormones endognes serait par contre trs faible chez lembryon mature [16], ce qui est mettre en rapport avec les dix jours dincubation ncessaires au dclenchement de la callogense. Du prsent travail, il ressort galement que le problme de la germination se pose beaucoup plus aux faibles concentrations de 2,4-D, notamment pour les explants non sectionns. Lexpression de la comptence morphogntique in vitro est complexe et influence par des facteurs physiologiques et dordre gntique. Ainsi, leffet du cultivar a t significatif sur la formation du cal en accord avec dautres travaux [6] effectus sur le Bl dur. En dfinitive, la callogense dpend du gnotype, du type dexplant et de la concentration en 2,4-D. Si lembryon immature nest disponible que pendant une priode trs courte du cycle vgtatif du Bl, son utilisation permet une nette amlioration de laptitude la callogense. La fragmentation des explants embryonnaires amliore la callogense et vite une germination.

RFRENCES

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ABSTRACT

Importance of 2.4-D and embryonic explants for the callogenesis of durum wheat Explants of mature and immature entire and/or half embryos of Moroccan durum wheat (Triticum durum) varieties were cultivated on MS medium supplemented with various concentrations of 2.4-D. For all of the varieties studied, the best average rate of growth was recorded at 3.5 mg/l 2.4-D with very low germination rates. The aptitude for callogenesis depended on the genotype and was improved by the use of immature embryos and their fragmentation. At 3.5 mg 2.4-D, the average callogenesis rate reached 64 and 79% for mature embryos and half embryos and 98 and 100% for immature embryos and half embryos, respectively. Key-words : 2.4-D, callogenesis, immature/mature embryos, Triticum durum, wheat.

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