ASOCIACIN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

SEMESTRE 2013-I IV CICLO

GUIA DE PRCTICA DE MICROBIOLOGIA MDICA

ASOCIACIN UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MDICA INDICE Pgina Recomendaciones generales Microscopia: estudio y manejo del microscopio Mtodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales Coloracin diferencial de Gram Coloracin diferencial de Ziehl-Neelsen Coloracin especial: coloracin de Leishman y Vago Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales Siembra bacteriana. Medios de aislamiento Metabolismo bacteriano Pruebas de sensibilidad a los antibiticos (antibiograma) Reaccin antgeno anticuerpo: Aglutinacin Fagocitosis Reaccin de Precipitacin Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA Preparacin de Antgenos bacterianos Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Gnero Streptococcus Aislamiento e Identificacin de cocos Gram negativos: Genero Neisseria Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: genero Listeria Estudio microbiolgico de la flora normal de la Secrecin Bucofarngea Aislamiento e Identificacin de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. Aislamiento e identificacin de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y Serologa Aislamiento e Identificacin de Enterobacterias: Coprocultivo Estudio e Identificacin de Vibrio cholerae Estudio e Identificacin del Genero Leptospira Estudio e Identificacin de Bartonella Estudio e Identificacin de Treponema Prueba de VDRL RPR Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes. Estudio e Identificacin de Hongos Ambientales Estudio e Identificacin de Hongos Dermatofitos Estudio de Hongos Levaduriformes: Observacin de cortes histopatolgicos Estudio de Hongos Dimrficos: Observacin de cortes histopatolgicos ANEXOS: SEMINARIOS: Gentica Microbiana e Ingeniera Gentica Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunacin Antibiticos y quimioterpicos Enfermedades de transmisin sexual. SIDA Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla 3 4 7 9 11 12 14 17 19 27 29 31 32 33 35 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 59 62 64 66 67 68 71 74 78 81 83 86 87 88 89 90

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RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGA MDICA

1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas llevando consigo la Gua de Prcticas, mandil, plumn indeleble para escribir sobre vidrio y lpices de colores. 2. No se podr ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prcticas, para evitar contaminaciones 3. Durante las prcticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles contaminaciones. 4. Sobre la mesa de trabajo slo debern colocar su gua de prctica y su libreta de apuntes. 5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodn, etc. al tacho de basura 6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de prctica para evitar que se tian la mesa de trabajo, ropa o manos. 7. Colocar las lminas preparadas sobre hojas de papel blanco. 8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan debidamente cerrados y en posicin vertical para evitar que se derramen. 9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en frascos de boca ancha con desinfectante. 10. Todos los cultivos que se preparen debern incubarse, teniendo en cuenta las siguientes anotaciones: Nombre o iniciales de los estudiantes Nombre del germen, nmero de mesa, turno y fecha de la siembra Las placas debern ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37C 11. Al finalizar el trabajo: Limpiar con algodn los objetivos del microscopio Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no queden lminas sobre la platina Limpiar la mesa de trabajo Comprobar que la llave de gas este cerrada Lavarse prolijamente las manos con jabn. 12. El Protocolo de cada prctica ser controlado por el profesor al final de la prctica.

El Profesor Responsable del Curso

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA SIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA PRCTICA N 1 MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

I.

OBJETIVO 1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio compuesto. 2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.

II. MATERIALES Microscopios Lminas portaobjetos Laminillas cubreobjetos Lminas coloreadas Suero fisiolgico Pipeta Pasteur Plumn indeleble Papel lente Tela de felpa(25 cm) Fibra de pelo y lana

III. PARTES DEL MICROSCOPIO Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio: PARTE MECANICA Tubo portalentes y cremallera Tornillos macro y micromtrico Revolver Platina PARTE OPTICA Ocular Objetivos Espejo Lentes de condensador Diafragma Condensador Brazo y Pie Charnela

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO 1. 2. 3. 4. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina. Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma. Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.

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METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES Y ESPECIALES.

INTRODUCCION La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos: A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromforo) es el anin llamados colorantes cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina. B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de metileno. C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina (cido). En los trabajos bacteriolgicos generalmente se usan colorantes bsicos como el azul de metileno, cristal de violeta, fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina. Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan: A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de lactofenol B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl Neelsen. C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares como la coloracin de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.

A. COLORACIONES SIMPLES Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los microorganismos.

MATERIAL Muestra con mezcla bacteriana Lminas portaobjetos Laminillas cubreobjeto Asa bacteriolgica de Kolle en aro Colorante Azul de metileno Colorante Tinta China 7

Colorante Azul de lactofenol Mechero de Bunsen Varillas para coloracin Aceite de cedro Xylol Papel lente Microscopio de luz con objetivo de inmersin COLORACIN AZUL DE METILENO: 1. 2. 3. 4. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 5 minutos Lavar con agua y dejar secar Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite de cedro

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA: 1. 2. 3. 4. Colocar una gota de tinta china sobre la lmina portaobjetos Agregar una gota de la mezcla bacteriana Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto Observar con lente de menor y mayor aumento.

RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus

COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL: 1 2 3 4 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante Cubrir con una laminilla cubreobjeto Observar con lente de menor y mayor aumento

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfologa de los microorganismos observados

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B. COLORACIONES DIFERENCIALES Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante es llamado colorante de contraste. Entre los ms usados tenemos la coloracin de Gram y la de Ziehl Neelsen o tambin llamado cido- alcohol resistente

COLORACION DE GRAM Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, segn la estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no estn entrelazadas; en las Gram positivas la mayora presenta muchas capas de peptidoglucano. Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff

MATERIAL Muestra con mezcla de bacterias Solucin fisiolgica al 0.85% Lminas portaobjetos Asa bacteriolgica de Kolle en aro Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff: Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario) Bicarbonato de sodio Lugol (mordiente) Alcohol- acetona (decolorante) Fucsina bsica (colorante de contraste) Mechero de Bunsen Varillas para coloracin Microscopio de luz con objetivo de inmersin Aceite de cedro Xylol Papel lente

PROCEDIMIENTO 1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del frotis. 2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el centro de la lmina portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparacin en capa fina. 3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen. 4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin. 5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solucin de bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos. 6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis) 7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua. 8. Decolorar el frotis con una solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que no arrastre colorante) mximo por 10 segundos. Luego lavar con agua. 9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. Luego lavar con agua. 10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen 11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin. RESULTADOS Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prcticas.

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 3 COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

INTRODUCCION Coloracin diferencial que permite la tincin de microorganismos que poseen elevado contenido de lpidos, como el gnero Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados tambin cido-alcoholresistente. Al teirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina bsica fenicada) que es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la clula y en esta forma resistir a la decoloracin. MATERIAL Lminas con frotices de bacilo tuberculoso Set de coloracin Ziehl-Neelsen: Fucsina fenicada al 5% (colorante primario) Alcohol cido (alcohol etlico con 3% de HCl) Azul de metileno (colorante de contraste) Mechero de alcohol PROCEDIMIENTO 1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lmina y calentar la preparacin con el mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por tres veces, evitando que hierva el colorante. 2. Lavar con agua corriente. 3. Decolorar con alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada. 4. Lavar con agua corriente 5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto. 6. Lavar con agua corriente 7. Secar y observar con lente de inmersin. RESULTADO Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistentes se tien de color azul. PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.

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COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

INTRODUCCION Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los colorantes de anilina como: las espiroquetas. As como tambin la coloracin de microorganismos presentes en la sangre.

COLORACION DE LEISHMAN Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.

MATERIALES Frotis de sangre con Bartonella Solucin de colorante Leishman Agua destilada tamponada Microscopio con lentes de 100X Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos Lavar con agua de cao y dejar secar Observar con objetivo de inmersin Anotar los resultados en el protocolo.

COLORACIN DE VAGO Es utilizado para la coloracin de grmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el mtodo de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy dbilmente con el Leishman.

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MATERIALES Lmina portaobjetos Palito mondadientes Solucin fisiolgica al 0.85% Set de coloracin de Vago: Mercuro cromo al 2% Violeta de genciana Asa de siembra en aro Microscopio con lentes de 100X Aceite de inmersin PROCEDIMIENTO 1. En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85% 2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera. 3. Fijar el frotis al calor suave 4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos 5. Lavar con agua corriente 6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos 7. Lavar con agua corriente 8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin. RESULTADOS Coloracin Leishman: Los microorganismos se tien de color rosado oscuro Coloracin de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 5 MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES,

INTRODUCCION Para el aislamiento de bacterias de un material patolgico, es necesario su cultivo en medios especiales con una determinada concentracin de iones de hidrgeno, sales, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Segn su utilizacin pueden ser: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales. MATERIALES Probetas de 100 ml. Balones de 250 ml. Tiras de Papel indicador de pH Frasco con solucin NaOH (N/10) Frasco con solucin HCl (N/10) Pinzas rectas Bagetas de vidrio Caldo nutritivo Extracto de carne Peptona Dextrosa Cloruro de sodio Agua destilada pH Goteros de vidrio Trpodes con malla de Asbesto Tubos de 16x150 mm Tubos de 13x100 mm Placas Petri Frascos estriles Agua destilada Tubo con sangre citratada

0.3 g 1.0 g 0.5 g 0.5 g 100 ml 7.0 - 7.4

Agar simple o Agar nutritivo Extracto de carne 0.3 g Peptona 1.0 g Dextrosa 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Agua destilada 100 ml Agar 1.5 g pH 7.0 - 7.4

Caldo peptonado Peptona 2.0 g Cloruro de sodio 1.0 g

5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado. 6.0 gr. de Agar SS deshidratado. 6.5 gr. de Agar TSI. 2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons 2.1 gr. de Agar Urea. 1.7 gr. de Caldo MR VP 3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.

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PREPARACION I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al calor hasta su completa dilucin. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es cido agregar gota a gota la solucin de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solucin de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121C por 15 Minutos. Controlar la esterilidad incubando a 37C por 24 horas. Luego dejar en refrigeracin hasta su utilizacin. 2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego agregar los dems ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH HCl. Luego envasar y esterilizar a 121C por 15 Minutos y controlar la esterilidad por incubacin a 37C por 24 horas. Dejar luego en refrigeracin hasta su utilizacin. II. MEDIOS ENRIQUECIDOS

1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar enfriar hasta una temperatura de 45C y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada. Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas Petri estriles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en refrigeracin hasta su utilizacin. El color normal del medio debe ser rojo cereza. 2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de 80C hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estriles y realizar control de esterilidad y dejarlo despus en refrigeracin.

III.

MEDIOS SELECTIVOS

3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su completa disolucin. Autoclavar a 121 C por 15 Minutos y repartir en placas estriles. 4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor hasta su completa disolucin. Repartir luego en placas estriles. No necesita autoclavar.

IV.

MEDIOS DIFERENCIALES

1. Para el Agar TSI (Hierro tres azcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir hasta su completa disolucin. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en autoclave a 121 C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final tendr un color rojo naranja. 2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendr un color verde. 3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucin y autoclavar. Despus adicionar 5 ml de Solucin de Urea al 40% esterilizada por filtracin; 15

mezclar homogneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendr un color amarillo. 4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de 13x100mm y autoclavar a 121 C por 15 Min. 5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa disolucin y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121 C por 15 min., y dejar enfriar los tubos en plano inclinado.

PROTOCOLO Realizar un cuadro indicando: A. B. C. Los medios de cultivo preparados en cada mesa. El color que presentan cada medio de cultivo preparado. Materiales que usaron para la preparacin.

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SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.

INTRODUCCION Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un incremento marcado del nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a las 24 horas y otras necesitan un perodo ms prolongado para alcanzar su mximo desarrollo. Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos y el resultado de la multiplicacin bacteriana colonia, as como el procedimiento por el cual se pone en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias tcnicas de siembra, siendo las ms usadas : La siembra por estra, por dispersin-agotamiento, por inoculacin y por puntura. Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son: FORMA ELEVACIN BORDE SUPERFICIE TAMAO CONSISTENCIA CROMOGENESIS MATERIALES Tubos con suero fisiolgico estril Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo Tubos de 16x150 con Agar nutritivo Placas con Agar nutritivo Placas con Agar Mac Conkey Placas con Agar hipertnico de Chapman Tubos con Agar Sabouraud Tubos de 16x150 con medio hipertnico de Chapman Torundas estriles Asas de siembra en aro y punta : Circular, elptica, puntiforme y filamentosa. : Plana, convexa, acuminada, umbilicada. : Entera, ondulada, dentada y filamentoso. : Lisa, rugosa, granulada. : Dimetro en milmetros. : Cremosa, membranosa y mucoide. : Pigmentacin verde, amarilla, roja, etc.

PROCEDIMIENTO A) TIPOS DE SIEMBRA Siembra por estra: Diseminar en forma de zigzag, una pequea cantidad de muestra bacteriana sobre la superficie del medio de cultivo slido con la ayuda de un Asa de siembra en aro. 17

Siembra por dispersin-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de la superficie del medio de cultivo slido que se encuentra en una placa Petri, girar sta unos 45 y continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro. Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-slido, con ayuda del Asa de siembra en punta, introducindola en forma vertical hasta la mitad de Agar. Siembra por inoculacin: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo hasta el fondo del tubo con medio lquido, procurando no tocar las paredes del tubo. B) LECTURA: Con la ayuda del profesor: 1. El alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos sembrados. 2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos. PROTOCOLO METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA SIEMBRA MEDIO DE CULTIVO USADO

ESTRIA

DISPERSION AGOTAMIENTO PUNTURA

INOCULACIN CARACTERISTICA DE LA COLONIA FORMA ELEVACIN BORDES SUPERFICIE TAMAO CONSISTENCIA CROMOGENESIS 18 OBSERVACION DE COLONIAS MEDIO DE CULTIVO USADO

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 7 METABOLISMO BACTERIANO INTRODUCCION La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las caractersticas de las colonias y morfologa con tincin de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel de gnero y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que son nicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificacin. En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos e indicadores qumicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos especficos. I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de oxido- reduccin que ocurre en un medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxgeno, un substrato orgnico sirve como el aceptor final de hidrgeno (electrones). Este trmino de fermentacin se refiere a la utilizacin de hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirn como fuente de energa y carbono. Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de cidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificacin del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de fermentacin (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio slido. A) REACCIONES DE OXIDACIN- FERMENTACIN DE AZUCARES: EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron) EL medio TSI fue diseado para la diferenciacin de Bacilos Gram negativos, basndose en la capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrgeno (H2S). El medio contiene tres azcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para detectar los productos cidos generados se emplea un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje est entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo). Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio pueden ser fundamentalmente tres: 1. Fermentacin de glucosa nicamente. 2. Fermentacin de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos. 3. No fermentacin de carbohidratos. 19

Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como pequeas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo. El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS). MATERIAL Tubo con medio TSI en plano inclinado. Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa

PROCEDIMIENTO 1. Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estre la superficie del pico de flauta. 2. Rotular e incubar a 37C por 18- 24 horas. INTERPRETACION Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada. 1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo. 2. Fermentacin de la glucosa nicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azcares), ha sido utilizada y la cantidad de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilizacin de la peptona; adems los cidos pueden ser utilizados. Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxgeno, slo hay fermentacin y el medio permanece cido. 3. Fermentacin doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentacin de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cidos, por lo que el tubo permanece amarillo. 4. No fermentacin de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin oxidativa de peptonas, por lo que slo la superficie del tubo se alcaliniza. 5. Produccin de gas: Formacin de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.

B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM ) 2. La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una caracterstica valiosa para identificar especies bacterianas que producen cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa. Estas bacterias que primariamente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos frecuentemente producen suficiente cido despus de una incubacin prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto cido lmite del indicador rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del pH del medio. 20

3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP ) El cido pirvico, un compuesto fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es metabolizado por algunos microorgansmos produciendo el acetil- metilcarbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la va 2,3- butilenglicol. La prueba se basa en la conversin del acetil- metil- carbinol en diacetil a travs de la accin del KOH y Oxgeno atmosfrico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la accin cataltica del Alfa naftol y Creatinina. MATERIALES Cepa bacteriana MR positivo y negativo Cepa bacteriana VP positivo y negativo Reactivo Rojo de metilo Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%) Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella

PROCEDIMIENTO 1. Por la tcnica de inoculacin, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37C. 2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.

INTERPRETACION 1. Para la prueba Rojo de Metilo, aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre, cuyo rango de viraje est entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja. 2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante aadir los reactivos en el orden especfico. Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretacin falsa positiva. En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.

II.

ACCION SOBRE LAS PROTEINAS PRODUCCION DEL INDOL Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminocido triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, cido pirvico y amoniaco(NH3). El indol puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparicin de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solucin que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.

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MATERIALES Cepa indol positivo y negativo. Medio lquido peptonado y/o Medio SIM Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido). Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.

PROCEDIMIENTO La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecer sin cambio alguno, siendo esta una prueba negativa.

III.

UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin de los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como nica fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee para determinar esta caracterstica no debe contener protenas ni carbohidratos. El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.

PRINCIPIO La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formacin de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en hidrxido de amonio(NH4OH), detectndolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).

MATERIALES Cepa control citrato positivo y negativo. Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado

PROCEDIMIENTO 1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnivca de estra en cada tubo la cepa citarto positiva y negativa. 2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18- 24 horas. 22

INTERPRETACION Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado. Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.

IV.

HIDRLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA) Prueba importante para la identificacin de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que hidroliza la urea, segn el siguiente esquema: O NH2- C- NH2 + 2HOH

------------------Ureasa

CO2 + H2O + 2 NH (NH4)2 CO3

El amoniaco reacciona en la solucin para dar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro. MATERIALES Cepa patrn ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus ) Medio Agar urea segn Christensen

PROCEDIMIENTO 1. Por medio de la siembra por estra, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el fondo. 2. Incubar durante 18- 24 horas a 37C INTERPRETACION Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio. Prueba negativa: El medio permanece del color original

V.

PRUEBA DE LA CATALASA La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y facultativas anaerobias. El perxido de hidrgeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y s se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin: 2 H2O2 --------> 2 H2O + O2 La prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).

23

MATERIALES Cepas Control: S. aureus, Streptococcus Enterococcus Solucin de Perxido de hidrgeno (H2O2) al 3% Medio de cultivo: cualquier medio slido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los eritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos. PRUEBA EN LMINA a) Con el asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una colonia bien aislada y transferir l inoculo a un portaobjetos limpio. b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3% c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo. d) Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante.

PRECAUCIONES 1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la prueba. 2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa. 3. El H2O2 es extremadamente acstico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que ocurra inundar el rea afectada con alcohol de 70% para neutralizar la accin. NO DEBE USARSE AGUA. INTERPRETACION Prueba cualitativa: La aparicin rpida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30, stas no son catalasa positivas. PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxgeno con formacin de agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios estrictos. En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solucin, discos o tiras llamados comnmente oxidasa). MATERIAL Cepa control: sembrada en Agar nutritivo Reactivo de oxidasa 24

VI.

PROCEDIMIENTO 1. 2. Directo: Se aaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa

INTERPRETACIN Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un intenso color azul oscuro.

AGAR LIA (Agar Lisina Hierro) Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminocido Lisina descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de la glucosa, la produccin o no de gases (CO2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H 2S).

Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin. Se lee la reaccin producida en la superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color purpura. Por contener una pequea cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina

Interpretacin: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas: a) Fermentacin de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminocido slo fermenta la glucosa: superficie purpura/fondo amarillo. b) Descarboxilacin de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo (superficie violeta/fondo amarillo). c) Desaminacin de la lisina: superficie roja/fondo amarillo. d) Produccin de gas: ruptura del medio. e) Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio.

VII.

PRUEBA DE LA HEMOLISINA Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias txicas que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos, segn el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma. MATERIALES Cepa bacteriana Placas con Agar sangre de carnero

PROCEDIMIENTO 1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre 2. Incubar por 18 24 horas a 37 C 25

INTERPRETACIN Hemlisis tipo Alfa: Es un tipo de hemlisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo de la biliverdina Hemlisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observndose una zona clara alrededor de la colonia VIII. PROTOCOLO

PRUEBAS BIOQUMICAS TSI (FermentacinH2S) VP VOGESPROSKAUER MR ROJO DE METILO

MEDIO DE CULTIVO

REACTIVO Y /O INDICADOR

LECTURA

INDOL

CITRATO

CATALASA

UREASA CITOCROMO OXIDASA

LIA (Agar Lisina Hierro)

HEMOLISINA 26

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 8 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA) INTRODUCCION Es una prueba de laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los antibiticos y quimioterapeticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes mtodos: Mtodo de dilucin Mtodo de Difusin en Agar OBJETIVOS 1. Realizar la tcnica de difusin en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los antibiticos. 2. Interpretar los resultados del mtodo utilizado. 3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la tcnica empleada. DILUCION EN TUBO Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibitico, midiendo la concentracin inhibitoria mnima (CIM), es decir, la concentracin ms baja que inhibe el crecimiento in vitro bacteriano. Consiste en la preparacin de una serie de diluciones del antibitico estudiado en caldo o en medio agar al cual se inocula luego una suspensin del germen. Luego de una incubacin por 24 horas, se puede observar la CIM como la dilucin ms alta en la que no existe crecimiento macroscpico bacteriano. Esta tcnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza. DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.) Es un mtodo simple de rutina en Microbiologa mdica, para seleccionar el antibitico o quimioterpicos ms adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel filtro que contienen los antibiticos y que despus de una incubacin de 24 horas, se observan las zonas de inhibicin alrededor de cada disco de antibitico. La cantidad de antibitico presente en el disco difiere para los distintos frmacos. MATERIALES 27 Placas de Agar Mller Hilton o Tripticase soya Tubos con caldo nutritivo Tubos con Agar semislido Tubos con cultivo bacteriano Asas de siembra

Torundas estriles Discos impregnados con diferentes antibiticos o quimioterpicos (sensi- disck). Pinzas Mecheros

PROCEDIMIENTO 1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar. 2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente. 3. Con la pinza en condiciones estriles, colocar los discos impregnados con los diferentes antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm. 4. Incubar a 37C durante 24 horas. LECTURA a) Medir en milmetros el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos, incluyendo el dimetro del disco. b) Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar si el microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes antimicrobianos utilizados. Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis altas del antibitico. La cantidad de antibitico presente en el disco depende de la concentracin y de su capacidad de difusin en el Agar. c) Anotar e interpretar los resultados.
Antimicrobiano Amikacina Amoxicilina + clavulanico Ampicilina Cefalotina Cefotaxima Ceftazidima Ceftriaxona Cefuroxina Ciprofloxacin Cloranfenicol Gentamicina Sulfazotrim Tetraciclina Tobramicina Cdigo Resistente Sensible 17 18 17 18 23 20 17 18 21 18 15 18 19 15 Antimicrobiano Ac.nalidixico Cefepima Ciprofloxacin Clindamicina Cloranfeicol Eritromicina Gentamicina Nitrofurantoina Norfloxacin Oxacilina Penicilina Rifampicina Sulfazotrim Tetraciclina Vancomicina Cdigo NA Resistente Sensible 16 18 21 17 18 18 15 17 17 13 20 20 18 19 12 Gram negativo AK-MK 14 AM AMP CFM CTX CAZ CRO RBA CIP C GM-GE SUT T NN 13 13 14 14 14 13 14 15 12 12 12 14 12 Gram positivo 21 14 15 14 12 13 12 14 12 10 19 16 12 14 9

FEP CIP CM-DA C E GM-GE FD NOR AO P RIF SUT T V

PROTOCOLO Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prctica desarrollada.

28

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 9 REACCION ANTIGENO ANTICUERPO: AGLUTINACIN

La aglutinacin es un fenmeno inmunolgico producto de una reaccin antgeno-anticuerpo en el que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamao grande. Estas partculas pueden ser bacterias, eritrocitos, partculas de ltex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables a simple vista o con lentes de poco aumento. AGLUTINACION BACTERIANA Existen muchos mtodos comnmente empleados para demostrar la aglutinacin bacteriana, uno de los ms simples es la aglutinacin en lmina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del antgeno con el suero del paciente en una lmina. Esta tcnica ofrece un mtodo de muestreo rpido para anlisis de rutina. MATERIALES Lmina para aglutinacin ( lminas excavadas) Antgeno bacteriano Suero de paciente Pipetas serolgicas de 0.2 ml Palitos mondadientes PROCEDIMIENTO 1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lmina de vidrio excavada. 2. Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada gota de suero de un mismo paciente. 3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota. 4. Hacer rotar suavemente la lmina por espacio de 2 a 3 minutos. RESULTADO La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable que tienden a agruparse en la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.

PROTOCOLO: Realizar una aglutinacin cualitativa y una cuantitativa 29

Aglutinacin cuantitativa

TUBOS REACTIVOS 1 2 3 4 5

ANTISUERO

0.08

0.04

0.02

0.01

0.005

ANTIGENO

AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO

TITULO

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

RESULTADO: Ttulo del suero: .

Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en prctica

30

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 10 FAGOCITOSIS La lnea celular de defensa est ntimamente asociada con la lnea humoral. La fagocitosis o el englobamiento de partculas extraas por ciertas clulas es un fenmeno no especfico, pero se incrementa cuando intervienen anticuerpos especficos o complementos. Entre las clulas fagocticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos (monocitos libres). A estas sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la fagocitosis se les llama OPSONINAS. FAGOCITOSIS IN VITRO Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difciles de realizar, en comparacin con otras pruebas serolgicas, pero en ciertos sistemas es la nica a ser utilizada. El antgeno y la sangre total (conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de estas mezclan se colorean. El ndice fagoctico es el nmero promedio de partculas ingeridas por cada 100 Neutrfilos de la sangre. MATERIAL Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o Klebsiella Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sdica al 1% Una jeringa de 5 ml con aguja N 20 Pipetas Pasteur con perilla de jebe Lminas portaobjetos

Colorante Wright Agua tamponada Bao Mara a 37C Centrfuga Gradilla Microscopio con objetivo de inmersin Aceite de cedro

PROCEDIMIENTO 1. Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa. 2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente. 3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente. 4. Llevar los tubos a Bao Mara por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos. 5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo. 6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glbulos blancos de cada tubo. 7. Realizar los frotices y colorear con Wright: Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos. Aadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla. Despus de 15 minutos, lavar con agua de cao. Secar y observar con objetivo de inmersin. RESULTADO Se observar la presencia de grmenes intracelulares que han sido fagocitados. 31

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 11 REACCION DE PRECIPITACION

INTRODUCCION Es una reaccin antgeno- anticuerpo, en el que el antgeno es de naturaleza soluble. Cuando se mezcla un antgeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de equivalencia y visibles por lo general macroscpicamente. Las reacciones de precipitacin pueden realizarse en un gel como el Agar. INMUNODIFUSION SIMPLE Llamada tcnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentracin de Inmunoglobulinas en el suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antgeno, procedindose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observndose la formacin de un halo circular de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la concentracin antignica. INMUNODIFUSION DOBLE Llamada tambin mtodo de Ouchterloni, es til para comparar antgenos, detectar anticuerpos precipitantes, anticuerpos antinucleares y antgenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar semi-slido en portaobjetos, en el cual se efectan perforaciones, los cuales se llenan con los elementos reaccionantes (antgeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubacin a temperatura ambiente, observamos la aparicin de bandas de precipitacin. MATERIALES Suero positivo Antgeno Lminas de vidrio con Agar noble al 1% Placas Petri Pipetas capilares Lminas preparadas y coloreadas

PROCEDIMIENTO 1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central. 2. Depositar en los orificios perifricos los antgenos a estudiar. 3. Colocar las lminas en una cmara hmeda. RESULTADO Observar las bandas de precipitacin que se forman: Identidad total : Las bandas de precipitacin se unen. Identidad parcial : Se observa un espoln. No identidad : Las bandas se cruzan. 32

INMUNOELECTROFORESIS Es til para la separacin de las protenas en un campo elctrico, permitiendo medir e identificar componentes sricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales. Resulta de la combinacin de la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera fase los antgenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su movilidad en un campo elctrico, luego de una corrida electrofortica, se coloca el antisuero en una especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las protenas que han migrado. Luego de incubar, se forman bandas de precipitacin frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.

PRACTICA N 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA INTRODUCCION En los ltimos aos se han desarrollado numerosos mtodos para la deteccin de antgenos virales como de anticuerpos especficos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales). Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacin o la prueba de Fijacin de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA). Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada utilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromognicos, las que producen una reaccin de color. Estas pruebas se conocen como Anlisis de Inmuno absorbencia Ligada a Enzimas (enzime- linked immunosorbent assay) ELISA. La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es necesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran nmero de muestras simultneamente en forma rpida y automatizada. PROCEDIMIENTO Determinacin de Anticuerpo en fase slida Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el anticuerpo especfico antiviral o anticuerpo de captura. Luego se aade la muestra clnica, si esta contiene antgeno viral se unir al anticuerpo de captura Esta unin se detectar mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas ms usadas son la peroxidasa, fosfatasa alcalina biotina- aviclina. Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antgeno. Aadir el sustrato de la enzima. Observar la presencia de color.

LECTURA El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colormetro o un espectrofotmetro. A mayor cantidad de antgeno presente en la muestra, ms intenso ser el color observado.

33

ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA

(Ensayo Inmunoenzimtico para la deteccin de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficiencia humana HIV-1 grupo O y HIV-2)

PLACAS CON GLICO-PROTEINA DEL VHI

SUEROS

CONJUGADO

SUSTRATO A 20 ul. Cromognico (Ag-Ac color celeste)

SOLUCION

OBTENIDOS DE PACIENTE

(Peroxidasa con Ig G Antihumana) 5ul C/ pozo

SUSTRATO B Buffer Perxido Hidrogeno 100 ul

DE PARADA

CONTROL +

INCUBAR 30 min a 37 Absorber

INCUBAR 30 min a 37

CONTROL +

CONTROL LAVAR twin salino 1/10 (5 veces) LAVAR twin salino 1/10

CONTROL -

CONTROL -

PACIENTE

PACIENTE SECAR la placa SECAR la placa

PACIENTE

(tomado de Wiener lab.)

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 13 PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS

INTRODUCCION Antgeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce la formacin de anticuerpos o la aparicin de fenmenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo especfico, dando lugar a fenmenos perceptibles. Los Antgenos ms comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos, hemates, suero, etc. Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antgeno en dosis adecuadas y generalmente progresivas con las siguientes finalidades. 1. Inducir en el hombre o en los animales, la formacin de anticuerpos que los protejan contra determinados procesos infecciosos. Este mtodo conocido como vacunacin confiere inmunidad adquirida activa. 2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales sern empleados en: a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, ttanos, etc., en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una inmunidad adquirida pasiva. B) La tipificacin de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de clasificacin, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.

I.

PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y FLAGELARES A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO. MATERIAL Cultivo bacteriano en medio slido y en desarrollo confluente Cultivo bacteriano en medio lquido (caldo nutritivo) Pipetas graduadas estriles de 5 cc. Suero fisiolgico estril, repartido en frascos de 100 cc. Embudos y gasa, estriles para filtrar Acido fnico concentrado en tubos de 13x100 ml. Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml. Pipetas de Pasteur, estriles Escala de MacFarland (tubo N 3) Pipetas graduadas de 1 ml. Tubos vacos estriles de 16x150 ml.

A.

35

Algodn y Alcohol yodado Agar nutritivo en placas y tubos

B.

PROCEDIMIENTO 1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiolgico estril a los cultivos bacterianos presentados en medio slido 2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar 3. Filtrar a travs de gasa estril 4. Separar la suspensin en cantidades iguales en dos tubos de 13x100 5. Para preparar el Antgeno somtico "O", medir la cantidad de suspensin bacteriana de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una concentracin de 0.5%. Se puede as mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antgeno a la ebullicin durante dos horas, o tratndolo con alcohol absoluto. 6. Para preparar el Antgeno flagelar "H", inactivar las fracciones somticas en el otro tubo de suspensin bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentracin del 0.5% 7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x10 8 grmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de suero fisiolgico, gotas de cada uno de los antgenos concentrados hasta alcanzar una turbidez similar al tubo N3 de la Escala de MacFarland. Este es un Mtodo turbidimtrico de clculo bacteriano, que consiste en diluir el antgeno y apreciar la turbidez obtenida comparndola con la de los tubos patrones de un nefelmetro o determinndola con exactitud mediante un Espectrofotmetro. El Nefelmetro ms conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera: Preparar una solucin de Cloruro de Bario al 1% Otra de cido sulfrico al 1%. Colocar una serie de 10 tubos vacos y estriles Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:

TUBO N

10

Cl2Ba 1%

0.1 cc.

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

H2SO4 1% Bacterias por cc.

9.9 cc. 3.0 x 108

9.8 6.0 x 108

9.7

9.6

9.5 1.5 x 109

9.4

9.3

9.2

9.1 2.7 x 109

9.0 3.0 x 109

9.0 x 1.2 x 108 109

1.8 x 2.1 x 2.4 x 109 109 109

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La unin de ambos reactivos qumicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al homogenizarse da una turbidez que es ms intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario empleado. A cada tubo corresponde una concentracin de grmenes determinada, de acuerdo a lo sealado en el cuadro.

C. CONTROL DE ESTERILIDAD Sembrar cada uno de los antgenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con la finalidad de controlar su esterilidad Realizar la observacin a las 18 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano. Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la prctica.

D. INOCULACION 1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc., 1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antgeno, con intervalo de 4 a 5 das. 2. Realizar la sangra despus de 4 das de la ltima inyeccin.

E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIN (DEMOSTRACION)

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 14

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: GENERO STAPHYLOCOCCUS

INTRODUCCION Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales, agrupados generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados, y Grampositivos en los cultivos jvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde fornculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, slo dos tienen importancia mdica. Slo la especie patgena S. aureus produce una enzima llamada coagulasa. MATERIALES Placas Petri con Agar hipertnico de Chapman (MH) o Manitol salado Placas Petri con Agar sangre (AS) Tubos con Caldo plasma Lminas portaobjetos Set de colorantes para Gram Asa de platino en aro Reactivo Catalasa

PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertnico de Chapman y Agar sangre, por el mtodo de dispersin-agotamiento y con 24- 48 horas de incubacin a 37C Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las caractersticas de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman (tamao, forma, pigmento, hemolisis, etc.) De la placa con Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman, tomar una asada de una colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37C (Prueba de la coagulasa) Realizar la prueba de la Catalasa. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y como indicador de pH el rojo de fenol Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina

4.

5. 6. 7. 38

RESULTADOS: 1. Caractersticas macroscpicas de la muestra: 2. Resultado de la coloracin realizada 3. Resultado de la reaccin de la Coagulasa, en caldo plasma observar que slo S. aureus coagula el plasma. 4. Resultado de la reaccin de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparicin de burbujas en las tres especies. 5. Resultado en Agar hipertnico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis. 6. Observar la presencia de hemlisis en las placas con Agar sangre 7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es sensible y S. saprofiticus resistente.

PROTOCOLO: Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamao de la colonia, forma que presenta, pigmento, hemlisis, y otras caractersticas que crea conveniente.

Complete el cuadro con lo realizado durante la prctica.

CEPAS BACTERIANAS TRABAJADAS

MH o Manitol salado

AS (Agar sangre)

COAGULASA

CATALASA

GRAM

Caracterstica morfolgica

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS: GENERO STREPTOCOCCUS INTRODUCCION El gnero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningn grupo). Con la coloracin de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos. Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite diferenciar algunas especies en base a la hemlisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente daados pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxgeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten la diferenciacin de las especies de Streptococcus. MATERIAL Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI Placas con Agar sangre de carnero Torunda estril y bajalengua Tubos con Thioglicolato Tubos con caldo Inulina Discos de Bacitracina Discos de Optochin Solucin de Desoxicolato al 2% Tubo con ClNa al 6.5% Lminas portaobjetos Set de colorantes de Gram- Kopeloff Asas de Kolle, pinzas Microscopio, aceite de inmersin.

PROCEDIMIENTO 1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce turbidez o sedimento. 2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el mtodo de dispersin y agotamiento e incubado a 37C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lmina portaobjetos y colorear por Gram. 40

3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el disco de Optochin, 4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato. 5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina. 6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5% 7. Realizar la prueba de la catalasa 8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas bacterias de lisarse en presencia de sales biliares LECTURA 1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolticos; S. viridans y S. pneumoniae son alfa- hemolticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram. 2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la Bacitracina y S pneumoniae es sensible a la Optochina 3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de Agar sangre e incubar a 35C durante 30 minutos. En una reaccin positiva se observa que las colonias son lisadas (desaparecen) 4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina. 5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% y cido tioglicolato que acta como agente reductor disminuyendo aun ms el potencial de oxidoreduccin del medio. 6. En la solucin de ClNa al 6.5% , observar que slo desarrolla Enterococo (Grupo D) 7. Todas las especies del gnero Estreptococo son catalasa negativa PROTOCOLO Realizar un protocolo de trabajo de la prctica realizada IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS
SENSIBILIDAD CAMP ORGANISMO Bacitra cina Opto chin Hidrlisis De Hipu Escu rato lina Metabo lismo de la Inulina Desarro llo en NaCl 6.5% Lisis por Bilis

Desoxi colato Sodio

- hemolticos GRUPO A S. pyogenes GRUPO B S. agalactiae GRUPO C, F, G - hemolticos GRUPO Viridans

R*

P*

R*

N*

N P*

R S N N N P N S. pneumoniae S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reaccin variable 41

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PRACTICA N 16

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO NEISSERIA

INTRODUCCION Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan caractersticamente en pares, con los lados adyacentes aplanados, simulando granos de caf. Comprende varias especies, entre stas N. gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En muestras clnicas del tracto urogenital u otras, se tien adicionalmente con el colorante azul de metileno, observndose las Neisseria intra y extracelularmente. Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin. La mayora de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una tensin de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37C y un pH de 7.2 a 7.6. Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros microorganismos morfolgicamente similares. La diferenciacin bioqumica se realiza por pruebas de utilizacin de hidratos de carbono: Glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa. El diagnstico de gonorrea requiere una estrecha cooperacin entre el mdico y el laboratorio. Se debe considerar los siguientes aspectos: a) Recoleccin correcta de la muestra. b) Seleccin del recipiente apropiado para el transporte y rpido envo al laboratorio. c) Seleccin del medio de cultivo apropiado d) Aislamiento e identificacin de la bacteria en el laboratorio. MATERIALES 42 Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria Lmina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram Reactivo de Citocromo- oxidasa Reactivo de catalasa Solucin fisiolgica al 0.85% Lminas portaobjetos Set de coloracin de Gram

Colorante de Azul de metileno Microscopio Asas de siembra en aro y punta Solucin de alcohol yodado Algodn y Xilol.

METODOLOGIA 1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeas, circulares de bordes continuos, blanco- grisceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeas de borde entero, circulares, translcidas o ligeramente opacas. 2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el cambio de color del rosado al marrn o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva. 3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la lmina control. 4. Realizar un frotis de la muestra clnica de secrecin endocervical y colorearla con el azul de metileno.

PROTOCOLO

MEDIO DE CULTIVO MUESTRA

COLONIAS

TAMAO

GRAM

AZUL DE METILENO

AGAR THAYER MARTIN

AGAR CHOCOLATE SECRECION ENDOCERVICAL OXIDASA PRUEBAS BIOQUIMICAS CATALASA

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 17 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO BACILLUS INTRODUCCION El gnero Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que pueden sobrevivir en el ambiente por muchos aos. Algunas especies causan enfermedades en el hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como "carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y se encuentran en el suelo, agua y aire. La especie patgena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patolgicos se presenta como un bacilo rectilneo, Gram positivo, grueso, inmvil y capsulado. En los cultivos, las colonias son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en largas cadenas, sin cpsula y conforme el cultivo envejece forman esporas. MATERIALES Placas Petri con Agar nutritivo Placas Petri con Agar sangre Tubos con Caldo nutritivo Tubos con Agar semislido Tubos con gelatina Lminas para frotices Set de coloracin de Gram Set de coloracin de Hiss para cpsula Set de coloracin de Wirtz Conklin para esporas Asa de Kolle

PROCEDIMIENTO 1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina. 2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin. COLORACION HISS (PARA CAPSULA) 1) 2) 3) 4) 5) Preparar un frotis Cubrir con Fucsina bsica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos Lavar con solucin acuosa de Sulfato de cobre al 20%. Lavar con agua corriente y secar Observar al microscopio con lente de inmersin

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COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS) 1) Preparar un frotis 2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos (adicionar colorante cada vez que falte) 3) Lavar con agua corriente 4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto 5) Lavar y secar 6) Observar al microscopio con lente de inmersin LECTURA: EN LOS CULTIVOS En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisceo, no hemoltica en las especies patgenas y - hemolticas en las especies saprofitas. En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo. En Agar semislido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido En Gelatina: slo las especies saprofitas producen hidrlisis. EN LAS LAMINAS COLOREADAS Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el centro del bacilo. Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color prpura y la cpsula de color claro o incoloro. Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde. RESULTADOS A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: GENERO
ESPECIE PATGENA

BACILLUS
ESPECIE SAPROFITA

Caldo nutritivo Agar nutritivo Agar sangre Agar semislido Hemolisis Hidrlisis de la gelatina Prueba de la Catalasa Fermentacin salicina Movilidad 45

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO LISTERIA

INTRODUCCION El gnero Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerfilos, no esporulados, mviles y presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposicin, en el suelo, en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patgena es Listeria monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los ganglios linfticos, produce sntomas neurolgicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre. El microorganismo se puede aislar de la sangre, lquido cefalorraqudeo y de las heces, desarrolla bien en medios de cultivo comunes. MATERIAL Tubos con Caldo nutritivo Tubos con medios semislidos (Motilidad) Placas Petri con Agar sangre Placas Petri con Agar nutritivo Tubos de 13x100 con: Agar urea de Christensen Citrato de Simmons Caldo rojo de fenol con glucosa Caldo rojo de fenol con sacarosa Caldo rojo de fenol con lactosa Caldo rojo de fenol con manita Caldo rojo de fenol con salicina Caldo esculina Caldo: MR VP

PROCEDIMIENTO 1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram. 2. Preparar una lmina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lmina y laminilla. 46

3. Sembrar en el Tubo con medio semislido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los diferentes medios diferenciales 4. Dejar en incubacin por 24 a 48 horas a 37C.

LECTURA FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos. LAMINAS EN FRESCO : Se observar la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos. EN CALDO NUTRITIVO: Se observar una turbidez tenue y homognea. EN AGAR SANGRE : Se observar colonias pequeas con hemlisis tipo Beta.

EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar

MOVILIDAD HEMOLISINA CATALASA OXIDASA UREA CITRATO

+ + + -

GLUCOSA SACAROSA LACTOSA MANITA SALICINA ESCULINA

+ + +

MR VP

+ +

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"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION BUCOFARINGEA

INTRODUCCION La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco despus del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen de la edad, nutricin y medio ambiente del individuo, por lo que es difcil determinar la flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto gastrointestinal, en los pacientes que estn recibiendo grandes dosis de antibiticos presentan un gran desarrollo de levaduras. La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos, Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos. La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran nmero de bacterias anaerobias. La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolticos y diplococos Gram negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patgenas como Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae.

MATERIALES

Caldo nutritivo en tubos (13 x 100) Agar nutritivo en placas Agar sangre en placas Agar chocolate en placas Medio hipertnico de Chapman en placas Agar Mac Conkey en placas Agar Sabouraud en tubos Torundas estriles (2 x tubo) Baja lengua Asa de Kolle en aro Laminas portaobjetos Set de colorante Gram Varillas para coloracin 48

PROCEDIMIENTO

A. PRIMER DIA 1. Con ayuda de torundas estriles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe. 2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo. 3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37C

B. SEGUNDO DIA LECTURA Con la ayuda del Profesor, el alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos.

IDENTIFICACION Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioqumico correspondiente y pruebas de patogenicidad si se requiere. Caldo plasma en tubo - Disco de Bacitracina - Disco de Optochin - Reactivo de Citocromo- oxidasa - Reactivo de catalasa

PROTOCOLO El alumno realizar un cuadro estadstico con los resultados obtenidos.

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOLRESISTENTES GENERO MYCOBACTERIUM. INTRODUCCION Este gnero esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfologa bacilar, poseen un alto contenido de lpidos complejos en su estructura qumica y se desarrollan lentamente en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos. Existen especies patgenas para el hombre y los animales, as como especies saprofitas en el aire, en el agua y en la tierra. Las especies patgenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis, que puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localizacin pulmonar, renal y digestiva los mas frecuentes y el esputo es el espcimen clnico ms comn para establecer el diagnstico especfico a travs de la baciloscopia. Mycobacterium leprae produce la lepra enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia, tambin, son patgenos.

MATERIALES Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo Lminas portaobjetos nuevas y desengrasadas Lminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis Lminas con extensin de otros tipos de Micobacterias Set de colorante de Gram Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.) Cepas patrones sembradas en medio Lownstein Jensen + verde de malaquita

PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 50 Observar los caracteres macroscpicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento. Tomar una partcula mucopurulenta del esputo y hacer una extensin homognea sobre la lmina portaobjetos nueva. Fijar la preparacin. Realizar una coloracin con Gram y otra con Ziehl- Neelsen

El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, etc. LECTURA Observar como los grmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloracin de Ziehl- Neelsen porque no son cidos alcohol resistente. El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en un fondo azul. EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO Enfocar con el objetivo de 100x la lmina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los resultados, segn el siguiente cuadro: Negativo : No se observan bacilos en 100 campos. Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos. Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos. Positivo (+++) : Ms de 10 bacilos por campo, en 25 campos. La lectura cuantitativa permite controlar la evolucin del paciente que esta en tratamiento y permite detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento. TIPIFICACIN DE MICOBACTERIAS Se investiga la velocidad de desarrollo y la produccin de pigmento, permitiendo clasificarlos en grupos. I. Cepas que desarrollan en 8 ms das. Llamadas de desarrollo lento . GRUPO I: Pigmentan por estmulo de la luz. Son fotocromgenas. Ejemplo: M. kansasi , M. simiae GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estmulo luminoso. Son escotocromgenas. Ejemplo: M. scrofulaceum GRUPO III: No pigmentan espontneamente, ni por estmulo luminoso. Son no cromgenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y M. tuberculosis var. Bovina II. Cepas que desarrollan en 7 das o menos. GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita PROTOCOLO DE TRABAJO: Realizar esquemas de lo realizado y observado en la prctica correspondiente.

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 21 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO CORYNEBACTERIUM INTRODUCCION El gnero Corynebacterium comprende un grupo heterogneo de bacterias en el cual se incluyen especies comensales y patgenos a animales, plantas y bacterias de suelo. Las caractersticas comunes del gnero son: 1) Bacilos pleomrficos Grampositivos, No forman esporas 2) Las clulas se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposicin en letras chinas, 3) Aerobios o anaerobios facultativos, 4) Catalasa positivos, 5) Citocromo oxidasa negativo. La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infeccin aguda, contagiosa y febril, caracterizada por inflamacin local y formacin de una seudomembrana en la orofaringe, adems del dao al corazn y nervios perifricos por accin de una exotoxina (toxina difterica). Es propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vas respiratorias superiores. El gnero se divide en tres grupos: Grupo I : Corinebacterias parsitas y patgenas para el hombre y animales; Grupo II : Corinebacterias fitopatgenas, y; Grupo III : Corinebacterias no patgenas. Algunas de las especies ms frecuentemente halladas en el laboratorio clnico son: C.diphtheriae, C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y C.hoffmannii (pseudodiphthericum). La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enrgicamente sobre cualquier lesin inflamatoria, adems del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito. MATERIAL 52 Cepa de Corynebacterium diphtheriae en caldo enriquecido Placa con Agar sangre Placa con Agar chocolate telurito de potasio Tubo de 13x100 con medio Pai en plano inclinado Set de colorante de Gram Set de colorante de Albert Tubos con Agar Urea Christensen en plano inclinado Caldo Rojo de fenol + Glucosa Caldo Rojo de fenol + Maltosa Asas de siembra Lminas portaobjetos Aceite de inmersin Microscopio

PROCEDIMIENTO 1. Tomar el inculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el mtodo de dispersin agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por estras. Incubar por 48 horas a 37C. 2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram. 3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el mtodo de Albert. 4. Bioqumica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa. COLORACION DE ALBERT Los grnulos metacromticos conocidos tambin como de volutina, son material de reserva de polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tien de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy dbilmente. PROCEDIMIENTO 1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave. 2. Cubrir con la Solucin A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, cido actico, alcohol etlico, agua destilada) por 3 a 5 minutos. 3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis. 4. Cubrir con la Solucin B de Albert (yodo metlico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1 minuto. 5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X LECTURA En la coloracin Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados ensanchados en sus extremos como mazos, pleomrficos (en forma de pera, huso) o dispuestos paralelamente, o en forma de letras chinas. En la coloracin Albert observar la bacteria color verde y los grnulos de color azul oscuro En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos) observar los tres tipos de bacilos diftricos: a) Tipo gravis: colonias grandes grisceas. b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras. c) Tipo intermedius: colonias pequeas, lisas o rugosas con centro negro. En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeas, convexas, con bordes enteros, color crema o blanco grisceas, slo las colonias Tipo mitis producen beta hemolisis.

BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae Hemolisis: Beta (slo el Tipo mitis) Catalasa : Positivo Movilidad: Negativa Urea* : Negativa Nitrato : Positivo Gelatina : Negativo Sacarosa : Negativo Glucosa : Negativo Maltosa : Positivo Lactosa : Negativo

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONAS

INTRODUCCION La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son mviles con flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cpsula, no forman esporas, no son exigentes para su desarrollo In Vitro. Pseudomona aeruginosa es la especie ms frecuentemente asociada con enfermedad humana, principalmente quemaduras severas, pero tambin se aslan de orina, sangre, lavados bronquiales, esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con riesgo de vida fatales. La deteccin del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnstica de P. aeruginosa, la mayora de los aislamientos producen tambin el pigmento fluoresceina y desarrollan bien a 42C. MATERIAL Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo. Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150 Agar nutritivo en Placa Petri Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150 Agar semi-slido en tubo de 13 x 100 Medio TSI Reactivo de Oxidasa Frasco con cloroformo Set de colorantes Gram Lminas portaobjetos

PROCEDIMIENTO 1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el mtodo de Gram. 2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las tcnicas conocidas. 3. Incubar a 37C por 24- 48 horas. 54

RESULTADOS COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeos, Gram negativos. CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de color verdoso y un olor caracterstico. AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa. MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este gnero no fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos slo por va oxidativa en el medio de oxidacin- fermentacin (OF)]. AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusin del pigmento en el Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa. CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la piocianina. PROTOCOLO

CARACTERSTICAS

MICROORGANISMOS Pseudomona aeruginosa

Crecimiento en Mac Conkey

Reacciones en TSI

Difusin de Pigmento en Agar nutritivo

Prueba de Citocromo- oxidasa

Solubilidad Cloroformo- piocianina

Crecimiento Agar nutritivo

Agar semislido

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PRACTICA N 23

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO BRUCELLA HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA

INTRODUCCION Son microorganismos pequeos, usualmente cocobacilares, inmviles no formadores de esporas. Son Gram negativos y necesitan una tincin prolongada con la fucsina bsica de por lo menos 2 minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tincin convencional de Gram. La enfermedad conocida como Brucelosis o Fiebre Malta es causada por las siguientes especies Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus. Su multiplicacin y desarrollo in vitro es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar Brucella o Caldo tripticasa soya. Para la identificacin de especies se utiliza una serie bioqumica para observar la produccin de H2S, hidrlisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 % y requerimiento de CO2.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, lquido cefalorraqudeo, mdula sea o biopsias de ganglios linfticos e hgado.

I: HEMOCULTIVO Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (slido + lquido) de Ruiz- Castaeda. La incubacin debe hacerse en una atmsfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37C. Las colonias aparecen entre el 4 al 5 da, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 das antes de ser descartado como negativo.

II: SEROLOGIA Para el diagnstico serolgico se utilizan las tcnicas de: 1. Aglutinacin rpida en placa 2. Aglutinacin lenta en tubo (Wright) 3. Prueba de aglutinacin del 2- mercaptoethanol (2- ME) 4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina) 5. ELISA 56

MATERIAL Tubo con cepa de Brucella Frascos con medio de Ruiz- Castaeda Muestra de sangre total de paciente Agar fucsina en placa Agar Thionina en placa Suero positivo y suero control negativo Antgeno estandarizado de Brucella Lminas excavadas Pipetas de 0.2 ml Palito mondadientes Lminas portaobjetos Set de coloracin de Gram

PROCEDIMIENTO

I: HEMOCULTIVO Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castaeda, e incubar por 4 a 5 das a 37C. Se debe esperar hasta 30 das para descartar el cultivo.

COLORACION Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el mtodo de Gram, siguiendo las recomendaciones sealadas anteriormente.

II: SEROLOGIA 1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer crculo de la 2da. Lnea de la lmina excavada. 2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lmina excavada, las siguientes cantidades de suero positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente. 3. A cada alcuota de suero aadir una gota de antgeno, equivalente a 0.03 ml. 4. Mezclar cuidadosamente por rotacin, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el suero negativo y la dilucin ms alta 1:400 5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lmina durante un minuto y dejar en reposo por 4 minutos ms. 6. A los 8 minutos no ms, observar la presencia de grumos (aglutinacin) que indica una reaccin positiva antgeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.

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INTERPRETACION

SUERO 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005 + + + + +

ANTIGENO 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03

DILUCION / TITULO 25 50 100 200 400 + ++ +++ ++++ +++++

DIFERENCIACION BIOQUIMICA

ESPECIES DE BRUCELLA Husped Preferido

PRUEBAS DE DIFERENCIACION Crecimiento en Necesidad Produccin Hidrlisis CO2 (5%) de H2S de Urea Fucsina Thionina 0.002 % 0.002 %

B.abortus B.melitensis B.suis B.canis

Bovino Cabra, oveja Cerdos Perros

+ -

++ + -

Dbil Dbil Fuerte Fuerte

+ + -

+ + +

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 24

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO

INTRODUCCION En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias ( Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de los cuales son patgenos para el Hombre y causantes de enfermedades. El diagnstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el aislamiento del agente patgeno bacteriano. La mayora de las Enterobacterias tienen una accin invasiva penetrando en la mucosa intestinal produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisin es generalmente por ingesta de alimentos contaminados con heces humanas. Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en determinadas condiciones patgena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite causar infecciones en el tracto gastrointestinal as como en el sistema urinario. La E. coli enterotoxignico (ECET) es la causa comn de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonizacin; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta. Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cpsula producen infecciones oportunistas en el husped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y urinario son los lugares de infeccin ms comunes, es difcil distinguir entre colonizacin e infeccin y son productoras de endotoxinas. Salmonella typhi, bacilo Gram negativo mvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la Salmonella paratyhi A, B C. El gnero Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmviles, causan la Disentera bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta. El gnero Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, mviles con flagelos peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones urinarias, heridas crnicas adquiridas generalmente en el hospital.

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MATERIALES Muestra de heces. Placas Petri con Agar Mac Conkey Placas Petri con Agar SS Placas con Agar Manitol Tubos con Agar Sabouraud Tubos con medio TSI, LIA Tubos con caldo peptonado Tubos con Citrato de Simmons Tubos con caldo MR-VP Frasco con Lugol Reactivo para Citocromo-oxidasa Reactivo de Kovacks (prueba de indol) Reactivo para Rojo de metilo Lminas portaobjeto y cubreobjeto Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidrxido de Potasio al 40%) Juego de colorantes para Gram Material bsico para laboratorio

PROCEDIMIENTO 1. Realizar un estudio macroscpico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de sangre, moco, etc.) 2. Realizar un estudio microscpico de la muestra con Lugol y suero fisiolgico y Gram. 3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos: a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de solucin salina. b) Tomar una asada de la suspensin de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37C por 24 horas. c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciacin bioqumica: TSI, LIA, Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37C por 24 horas.

LECTURA EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa. EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las colonias que son SH2. EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD , observar el desarrollo de colonias y anotar las caractersticas. EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro. EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilacin y desaminacin de la Lisina y produccin de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilacin de la lisina se eleva el pH del medio debido a la produccin de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color prpura) [indicador prpura de bromocresol] 60

EN CALDO PEPTONADO, observar la produccin de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de Kovac tornndose rojo grosella. EN CITRATO DE SIMMONS, se tornar de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente de energa y alcaliniza el medio. (Formacin de Hidrxido de amonio). Positivo (color azul), negativo (color verde). EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le aade el Rojo de metilo. Cuando hay produccin de cidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color amarillo). EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma despus de 15 minutos cuando se le aade alfa-naftol y KOH por la produccin de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo (color amarillo). PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso contrario no habr ningn cambio de color COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos. CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos

DIFERENCIACION BIOQUMICA

Especies Ac. Sup

TSI (glucosa, sacarosa lactosa,SH2 ) Ac. Fon Ga s SH2

LIA Lisina

Cp Indol

Ct MR-VP Citrat o Oxidasa

Escherichia coli Klebsiella

+ + -

+ + + + +

+ + -

+ V

V + -

+ V V -

+ + V

+ - + + - + -

Salmonella typhi Shigella Proteus

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PRACTICA N 25

ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE

INTRODUCCION Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los gneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El gnero Vibrio comprende muchas especies siendo las de importancia mdica Vibrio cholerae, causante del clera epidmico; V. parahaemolyticus, causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutneas, celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infeccin de heridas cutneas, tejidos blandos. Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy mviles, poseen un flagelo polar, no forman esporas, sin cpsula, aerobios y oxidasa positivo. La ltima pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa. Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos. MATERIAL Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus Tubos con TSI Tubos con LIA Tubo con Caldo peptonado Tubo con MR-VP Tubo con Citrato de Simmons Desoxicolato de sodio al 0.5 % Lminas portaobjetos Set de coloracin de Gram Microscopios Aceite de cedro

PROCEDIMIENTO Y LECTURA 1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V. cholerae, de 2-4 mm de dimetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares, de color amarillo (resultado de la utilizacin del citrato y formacin de cidos a partir de la utilizacin de la sacarosa) En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto 62

verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva) 2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la sacarosa, no produce H2 S. 3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol 4. En el medio LIA observar si hay decarboxilacin de la Lisina. 5. En el medio MR- VP detectar la produccin del acetil-metil-carbinol 6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formacin o no de hidrxido de amonio 7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram 8. Realizar la prueba de la cuerda positiva, colocando una gota de la solucin de Desoxicolato sobre una lamina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de V. cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensin viscosa al retirar el asa como una cuerda larga que se torna mas pegajosa despus de 60 segundos mas. 9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioqumicos sembrados.

PROTOCOLO

MEDIOS

Vibrio cholerae

Vibrio parahaemolyticus

TSI

Acidez en superficie y profundidad

Acidez superficie y profundidad Positiva

LIA

Positiva por descarboxilacin de la Lisina 10- 50% cepas es positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Positiva Positiva Positiva

VP MR Indol Citrato Urea Oxidasa Catalasa Prueba de la cuerda

Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positiva Negativo

RESULTADOS 1. Realizar esquemas de lo observado en la prctica 2. Realizar las pruebas bioqumicas correspondientes. 63

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PRACTICA N 26

ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA

INTRODUCCION Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas, muy mviles, con una longitud de 6 a 20 m y 0.1 m de dimetro, sus extremos semejan a ganchos semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos). El gnero Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales; comprende 6 especies patgenas Leptospira interrogans con 18 variantes serolgicas, L. noguchi, L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades antignicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de restriccin o la composicin de su DNA. La Leptospirosis es una zoonosis de distribucin mundial. Los reservorios naturales son los roedores y una gran variedad de animales silvestres y domsticos, los cuales eliminan con la orina el agente etiolgico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisin puede ser directo (orina, rganos de animales infectados) o indirecto (a travs del agua o material contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a travs de lesiones de la piel y mucosas incluyendo la conjuntiva ocular. Se colorean por mtodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y coloracin de Kiktenko, ya que toman dbilmente los colorantes de anilina. Son visibles al microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas. Desarrolla en medios especiales lquidos, semislidos y slidos enriquecidos con suero de conejo o carnero al 8-10%, a una temperatura ptima de 28 30C, en un periodo de incubacin de 5- 10 das, en condiciones de aerobiosis.

Para el diagnstico definitivo de Leptospirosis se requiere de : 1. 2. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clnicas (sangre, lquido cefalorraqudeo, orina) en medios de cultivo o inoculacin en hmster o cobayo. Evidencia sexolgica en sueros pareados con incremento cudruple del ttulo de diagnstico inicial de 1:100

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MATERIAL Cultivo de Leptospira en medio semislido de Fletcher- modificado Lamina control coloreada por el mtodo de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de Congo. Microscopio.

LECTURA En el medio semislido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en todo el tubo y la formacin de un anillo a unos milmetros de la superficie del medio En la coloracin de Kiktenko las Leptospiras se tien de un color rosado- violeta en fondo incoloro, presentndose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C S, generalmente con los extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas. En la observacin al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un collar de perlas son muy mviles, realizan movimientos de translacin, rotacin y al rededor de su eje.

RESULTADOS 1. Caractersticas del cultivo observado. 2. Realiza esquema de la observacin en las lminas coloreadas

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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 27 ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA INTRODUCCIN La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrin y se transmite a travs de la picadura de un insecto alado hematfago conocido como Lutzomya. Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su tamao vara entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de dimetro, presenta flagelos unipolares en nmero de 1 a 10. En los cultivos jvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y en cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta) Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright). Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura ptima de 29C en medios enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifsico con sangre y plasma, durante un periodo de incubacin de 5- 10 das. Su crecimiento es lento por lo general semanas, enturbia el medio con sedimento y a veces se observa pelculas o tmpanos en la superficie de la parte lquida del medio. Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemtica de la enfermedad, de las lesiones eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis. En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemtica) usando el agar de fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar pruebas serolgicas (aglutinaciones, fijacin de complemento, Elisa, etc.), por Infeccin de los hemates humanos por Bartonella (Danza de los hemates) e Inhibicin del movimiento de los hemates por accin de anticuerpos especficos antibartonella MATERIAL Frotices coloreados por Leishman, Wrigth Giemsa procedentes de cultivo. Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases Cortes histolgicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIN Observar al microscopio las lminas coloreadas y apreciar la morfologa y tincin de Bartonella. En las lminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada. En los cultivos observar la turbidez del medio, la formacin de sedimento y la formacin de pelculas o tmpanos Realizar esquemas de las observaciones realizadas. 66

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 28 ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE TREPONEMA PRUEBA DE VDRL RPR

INTRODUCCIN Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogneo de microorganismos espirilares mviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres gneros de microorganismos patgenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sfilis, T. pertenue, produce el pin, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis. La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y 5 a 15 m de largo, son mviles y giran constantemente, no se tien bien con los colorantes de anilina y es difcil su cultivo en medios artificiales. PRUEBAS DE DIAGNOSTICO 1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (lquidos tisulares) pueden observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas mviles caractersticas. 2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina 3. Pruebas serolgicas para sfilis, estas pueden usar antgenos treponmicos o antgenos no treponmicos (cardiolipina purificada del corazn de buey) 4. Prueba de Floculacin (VDRL), el antgeno VDRL es una solucin alcohlica que contiene 0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que las partculas del antgeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en enfermos se combina con la reagina de la sfilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra algunos antgenos). MATERIALES Suero problema Antgeno VDRL

Laminas excavadas Pipetasgraduadas

PROCEDIMIENTO Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (bao Mara a 56C x 30) sobre la lamina excavada Aadir una gota del antgeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formacin de floculos cuando la reaccin es positiva. RESULTADOS N (No reactivo) RD (Reactivo dbil) R (Reactivo) 67

........................ ........................ .......................

Ausencia de floculos Floculos pequeos Floculos medianos y grandes

ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 29 CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO

INTRODUCCION El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes patgenos causantes de una infeccin urinaria. Para la obtencin de muestras debe considerarse: La recoleccin debe ser con un mnimo de contaminacin Establecer el momento ptimo para la recoleccin, con el objeto de tener la mejor probabilidad de recuperar microorganismos causales. Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las tcnicas de cultivo necesarias. Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administracin de antibiticos. Normalmente la orina es estril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de contaminacin por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo: 1. Si existe menos de 10,000 grmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la muestra negativa. 2. Cuando la orina tiene ms de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infeccin urinaria. 3. Si el nmero de grmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y ser necesario repetir el cultivo. La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin para lograr recuentos de colonias exactos, luego se deber identificarlas y realizar el Antibiograma correspondiente.

MATERIAL Muestra de orina patolgica Sedimento de orina Agar Mac Conkey, Medio hipertnico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en placas Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50C Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50C Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea de Christensen. Tubos con 9.9 ml de Suero fisiolgico 0.85% Pipetas de 1 ml. estriles Placas Petri, vacas estriles 68

Bocal con desinfectante Microscopio Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen Serie de colorantes de Gram Lminas portaobjetos y laminillas PROCEDIMIENTO PRIMER DIA: A. Estudio de las caractersticas macroscpicas Describir el aspecto de la orina: Color (amarillo, oscuro, castao o incoloro) Sealar si la orina es clara o turbia.

B. Estudio de las caractersticas microscpicas 1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lmina y laminilla al microscopio con objetivos de 10X y 40X 2. Realizar un frotis y colorear por el mtodo de Gram y Ziehl- Neelsen

C. Siembra de la muestra de orina: 1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersin agotamiento en las placas con Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud 2. Mtodo de dilucin: Preparar una dilucin de la orina de la siguiente manera. a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con suero fisiolgico 0.85% estril. Mezclar bien. b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacas estriles. c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar nutritivo licuado, rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla homognea. d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37C por 18- 24 horas.

LECTURA 1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales anormales, leucocitos, levaduras, parsitos, espermatozoides, clulas epiteliales, cilindros. 2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram negativas, y por el mtodo de Ziehl- Neelsen las bacterias cido alcohol resistentes(en caso de infeccin por Mycobacterium). SEGUNDO DIA: 1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de 69

colonias resistente a altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia de levaduras. 2. En la siembra por dilucin, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el nmero de colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000. 3. Se deber seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioqumica respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de Christensen. Incubar a 37C por 18-24 horas.

Nota: El agente causal aislado e identificado deber ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara una suspensin en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentracin Mnima Inhibitoria (MIC) del antibitico cuya finalidad es orientar en la teraputica y la concentracin del antibitico alcanzado en el suero o en foco de infeccin. El mtodo de disco-difusin estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el laboratorio, para dicha determinacin (MIC).

REPORTE FINAL Disear el protocolo correspondiente, sealando: 1. La observacin macroscpica y microscpica de la muestra clnica. 2. Las caractersticas del desarrollo bacteriano, y los principios bioqumicos en cada uno de los medios selectivos empleados. 3. Los resultados del comportamiento bioqumico. 4. La determinacin del agente patgeno causante de la infeccin urinaria. 5. Determinacin cuantitativo nmero de UFC por ml. Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 30 AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES LACTANTES. OBSERVACION DE LMINAS COLOREADAS

INTRODUCCION Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los animales, de las plantas y tambin de las bacterias (bacterifagos). En este captulo analizaremos solamente los virus que producen patologa en el ser humano; debido a sus caractersticas especiales como son su pequeo tamao y su parasitismo intracelular obligado, los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las enfermedades producidas por ellos ya se conocan desde la antigedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y multiplicacin deben necesariamente utilizar los sistemas de las clula que parasitan y por ello se denominan parsitos intracelulares obligados. En los ltimos aos, se han desarrollado mtodos de diagnstico rpido para la mayora de las infecciones virales as como drogas antivirales especficas para muchos virus. Se emplean mtodos directos para el diagnstico de los virus, y dado que estos solo se replican en el interior de las clulas vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de mtodos especiales en el laboratorio de virologa, tales como: a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayora de los virus pueden multiplicarse en cultivo de clulas apropiadas. b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amnitica, cavidad alantoidea y saco vitelino). c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hmsters, monos) d) Serologa o demostracin de anticuerpos frente al virus. e) Demostracin directa del virus o de antgenos vricos a partir de frotis de las lesiones. OBJETIVO DE LA PRCTICA El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigacin mdica y epidemiologa y constituye un mtodo muy extendido para el diagnstico de la infeccin. Por lo tanto estas prcticas nos orientan a conocer los diversos mtodos de aislamiento directo o indirecto para demostrar los efectos citopticos de los diferentes virus y sus formas como se deben evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano. METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLGICO: 71

A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS. Muchos de los virus y rickettsias patgenas para el hombre y los animales pueden propagarse en las clulas vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrin de huevos embrionados de gallina. Estas tcnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y desde entonces estn siendo ampliamente usadas. Las vas de inoculacin y la edad del embrin a usar dependen del agente viral que va a ser inoculado. MATERIALES Huevos embrionados de 7-9 das. Huevos embrionados de 10-12 das. Jeringas de tuberculina con aguja N 25 x y 22 x 2. Colorante Fucsina al 1% con agua destilada Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada Frascos con Alcohol yodado Algodn Ovoscopio Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados Equipo de diseccin (Pinzas, tijeras curvas, guantes) INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 das. b) Hacer un pequeo orificio con el punzn en la zona marcada de huevos embrionados. c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente en ngulo de 45 e inocular 0.2 ml. de colorante. d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubacin a 33-35C por 2-4 das, luego cosechar y observar. INOCULACION POR VIA AMNIOTICA a) Marcar la cmara de aire y la posicin del embrin de 10-12 das. b) Limpiar con alcohol yodado un rea de la cmara de aire que est situada por encima del embrin y hacer una perforacin rectangular de 0.5 cm, con el punzn. c) Deja caer una gota de suero fisiolgico o aceite mineral estril, para visualizar una zona no vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente. d) Con una pinza curva introducir a travs de esta rea, coger hacia arriba la membrana amnitica, formando una pequea tienda en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solucin de Azul de metileno o del inoculo problema. e) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen. f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 33-35C por 2-4 das (sujeto a la muestra: Influenza) INOCULACION DEL SACO VITELINO a) Limpiar con alcohol yodado, la porcin de la cscara que cubre la cmara de aire del huevo embrionado de 6-7 das. b) Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire. c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la 72

aguja verticalmente a travs de la cmara de aire, hasta 35 mm de profundidad. d) Sellar la abertura COSECHA DE LOS LIQUIDOS (SEGN LAS CAVIDADES INOCULADAS) a) Comprobar que el embrin este vivo. Enfriar a 4C los huevos embrionados por algunas horas (2-3 horas antes) para prevenir sangrado de los embriones. b) Cortar la cscara que cubre la cmara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes. c) Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localizacin del Azul de metileno y/o Fucsina en las zonas de inoculacin (Membrana alantoidea, amnitica, corioalantoidea y saco vitelino). d) Cosechar las membranas en estudio y extraer el liquido alantoideo, amnitico y realizar las pruebas de diagnstico correspondientes segn la investigacin solicitada D. INOCULACIN EN RATONES LACTANTES: Se utilizaran ratones lactantes y las vas de inoculacin sern: Intraperitoneal, Intracraneal, Subcutnea y Nasal. E. OBSERVACIN DE LAMINAS COLOREADAS: Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusin (Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el ncleo o en el citoplasma y su localizacin es especfica de la enfermedad viral. Se considera estos cuerpos de inclusin (efecto citopatico) como conglomerados de virus asociados a productos de reaccin de la clula infectada. OBSERVACIN DE LMINAS: 1. Cultivo de clulas normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tie de rosado el citoplasma. 2. Rabia: corte histolgico de cerebro. Coloracin HE. Observar inclusiones eosinofilas intracitoplasmticas denominadas corpsculos de negri. 3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de clulas humanas (HEP-2), observar la degeneracin celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del ncleo hacia el borde de la clula. 4. Herpes simple en cultivos de clulas: Observar las clulas gigantes polinucleadas, las inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz. 5. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusin intranuclear basfila en ojos de lechuza rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basfilo). 6. Adenovirus en cultivo de clulas HEP-2: Observar la agrupacin de clulas en racimo y las inclusiones basfilas intranucleares. PROTOCOLO Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas. 73

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ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS AMBIENTALES

INTRODUCCION Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a expensas de la materia inerte existente, la mayora se encuentra como saprofito, otros pueden ser causantes de inducir hipersensibilidad as como tambin ser responsables de infecciones. Entre los hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula MATERIALES Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium, Rhodotorula y Helmintosporium. Lminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados. Microscopios

PROCEDIMIENTO 1. Estudie las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio areo, aspecto de la colonia, produccin de pigmento y consistencia de la colonia. 2. Observar al microscpico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos preparados en las lminas con azul de lactofenol. CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES Aspergillus Colonias al inicio de color blanco, luego vara de acuerdo a la especie en: amarillo, verde azufrado, marrn o negro. Microscpicamente presenta hifas tabicadas que forman conidiforos no tabicados que se ensanchan en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas y de donde salen las conidias en cadena. Penicillium Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante. Microscpicamente presenta hifas tabicadas con conidiforos ramificados en cuyo extremo se hallan los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena. Fusarium Colonias de micelio areo algodonoso de color rosado violeta en la superficie. 75

Microscpicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidiforos, macroconidias septadas y alargadas, fusiformes. Rhizopus Colonias de micelio areo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisceo. Microscpicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos esporangioforos que terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se encuentran las esporas. Cephalosporium Colonias de micelio areo de color blanco- rosado o blanco- amarillento. Microscpicamente presentan hifas septadas, conidiforos cortos que dan origen a conidias hialinas agrupadas. Helmintosporium Colonias de color gris al inicio, despus se torna de color negro en el centro, con la periferia elevada de color gris. Microscpicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales sobre conidiforos cortos y nudosos Rhodotorula Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos carotenoides. Microscpicamente se observa clulas ovoides o redondeadas con o sin yema.

PROTOCOLO Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica.

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PRACTICA N 32

ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS DERMATOFITOS INTRODUCCION Los dermatofitos son organismos queratinfilos que invaden las estructuras queratinizadas del cuerpo como la piel, pelo y uas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones ms comunes en los humanos. Los agentes causales mas importantes son los hongos del gnero Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton, as como tambin Malassezia furfur que es causante de la Tia versicolor o Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce ndulos en el tallo piloso de los cabellos, barba y bigote. Por su hbitat pueden clasificarse en: Zooflicos ( Microsporum canis), Geoflicos (Microsporum gypseum), y Antropoflicos (Epidermophyton). MATERIALES Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum y E. floccosum. Lmina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados. Lminas preparadas de M. furfur en hidrxido de potasio al 20%. Lminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai. Material bsico de laboratorio(xilol, algodn, alcohol) Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.

PROCEDIMIENTO 1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio, aspecto de la colonia , produccin de pigmento y consistencia de la colonia. 2. Observar al microscopio las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos preparados en lminas. CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA. Trichophyton rubrum Colonias de micelio areo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un pigmento de color prpura. Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias ssiles piriformes, a veces puede observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares. 78

Trichophyton mentagrophytes Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un pigmento amarillo- pardusco. Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esfricas agrupadas, pueden presentar hifas en espiral y macroconidias. Trichophyton tonsurans Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con pigmentacin amarillo- castao al reverso. Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en raquetas septadas, pueden observarse macroconidios. Microsporum gypseum Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela. Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en nmero de 4-6, rara vez se observan microconidias. Microsporum canis Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la colonia. Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con pequeas excrecencias en la superficie, pueden tambin observarse microconidias y clamidosporas. Epidermophyton floccosum Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la colonia. Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo. Malassezia furfur (Pityrosporum) Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnstico se da por el examen directo de la muestra Piedraia hortai Los ndulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro que envuelven completamente el tallo piloso.

PROTOCOLO Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 33 ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES. OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS. INTRODUCCION: Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutneos. Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crnicas en la piel o mucosas, aparato genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutneas; en el hombre la infeccin primaria es casi siempre pulmonar. MATERIALES Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans. Lminas de Candida albicans en Agar harina de maz. Lminas de Cryptococcus neoformans en tinta china. Cortes histolgicos con C. albicans y Cr. neoformans. Material bsico de laboratorio (xilol, algodn, alcohol) Microscopios con lentes de menor y mayor aumento. PROCEDIMIENTO 1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y consistencia de la colonia. 2. Observar al microscopio las caractersticas que presentan cada especie de los hongos en el Agar harina de maz, tinta china y en los cortes histolgicos. CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES Candida albicans Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado. En el Agar- almidn- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que tipifican a Candida albicans. En los cortes histopatolgicos observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las lesiones rodeadas de una zona de histiocitos. Cryptococcus neoformans Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo. En las lminas con tinta china se aprecia la cpsula como un halo brillante entre el borde de la levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china. En los cortes histopatolgicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las lesiones, las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltracin celular. 81

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA PRACTICA N 34 ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS. OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS. INTRODUCCION Los hongos dimrficos, son hongos causantes de infecciones mucocutneas y/o sistmicas en el hombre y algunos animales. Paracoccidioides brasiliensis En su fase inicial esporgena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su fase de levadura en tejidos infectados. Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infeccin crnica, granulomatosa de la piel, mucosa, ganglios y vsceras. Es ms frecuente entre los trabajadores rurales. Histoplasma capsulatum En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporgena, que se desarrolla principalmente sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza), excremento de murcilagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado. Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares. Sporothrix schenckii Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales contaminados con el hongo. La infeccin esta localizada preferentemente en los ganglios linfticos MATERIALES Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii. Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol Cortes histolgicos infectados por estos hongos. PROCEDIMIENTO 1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia. 2. Observar las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos. CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS Paracoccidioides brasiliensis En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histolgicos, se presentan como clulas esfricas u ovaladas de 10 a 80 micras de dimetro, con doble membrana y multigemantes. En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio areo de color blanco compacto, de crecimiento lento. Microscpicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con microconidias esfricas o piriformes. 83

En Agar Infusin cerebro corazn (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro. Microscpicamente se observan clulas esfricas.

Histoplasma capsulatum En frotices o cortes histolgicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas en los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeas, redondas u ovaladas de 1-3 micras de dimetro. En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscpicamente se observan hifas tabicadas con escasa produccin de microconidias y gran cantidad de macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa Clamidospora tuberculada. En el medio BHI desarrolla colonias pequeas de aspecto membranoso rugoso, color marrn claro. Microscpicamente, se observan como clulas ovaladas a veces gemantes. Sporothrix schenckii En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeas, blanquecinas presentando posteriormente un aspecto hmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema a negro. Microscpicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidiforos en cuyo extremo se encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita. En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan clulas en gemacin ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.

PROTOCOLO Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.

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SEMINARIO-I

GENETICA MICROBIANA E INGENIERIA GENTICA

(Organizacin de los genes. Transferencia del DNA. Mutacin. Expresin gnica e Ingeniera gentica)

TEMA 1 TEMA 2

: ORGANIZACIN DE LOS GENES (ADN PROCARIOTICO) : TRANSFERENCIA E INTERCAMBIO DE LA INFORMACIN GENETICA BACTERIANA. : MUTACIN Y SUS CONSECUENCIAS : EXPRESIN GNICA E INGENIERIA GENTICA Y SUS APLICACIONES EN LA MEDICINA.

TEMA 3 TEMA 4

OBSERVACIONES A TENER EN CUENTA: PRESENTACIN EN POWER- POINT Y TRPTICO EXPOSICIN: CADA TEMA 10-15 MINUTOS LUGAR: AULA DE CLASES TERICAS HORA: EN HORAS DE PRCTICAS PASO AL FINAL DE LA EXPOSICIN

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ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MDICA SEMINARIO II

VACUNAS ANTIMICROBIANAS. PROGRAMA DE VACUNACIN (Tipos de vacunas. Requisitos de una buena vacuna)

TEMA 1: TIPOS DE VACUNAS Y CONSECUENCIAS PATOLGICAS DE LA VACUNACIN.

TEMA 2: OBJETIVOS DE LA VACUNACIN Y REQUISITOS DE UNA BUENA VACUNA.

TEMA 3: PRACTICAS DE VACUNACIN ACTUAL Y MEDIDAS DE CONTROL

TEMA 4: CONSECUENCIAS PATOLGICAS DE LA VACUNACIN

TEMA 5: PROGRAMAS DE VACUNACIN

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SEMINARIO - III

ANTIBITICOS Y QUIMIOTERPICOS (Mecanismos bsicos de actividad y resistencia a los antibiticos)

TEMA 1: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS 1.1: Inhibidores de la Sntesis de la pared celular 1.2: Inhibidores de la Sntesis de protenas 1.3: Inhibidores de la Sntesis de cidos nucleicos 1.4. Inhibidores de la funcin de la membrana citoplasmtica

TEMA 2: RESISTENCIA A LOS AGENTES ANTIBACTERIANOS 2.1: Gentica de la resistencia 2.2: Mecanismos de resistencia

TEMA 3: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS Y ANTITUBERCULOSTTICOS 3.1. Mecanismos bsicos de actividad 3.2. Mecanismos de resistencia

TEMA 4: CLASES DE AGENTES ANTIVIRALES 4.1: Mecanismos bsicos de actividad 4.2: Mecanismos de resistencia

TEMA 5: CLASES DE AGENTES ANTIMICTICOS 5.1: Mecanismos bsicos de actividad 5.2: Mecanismos de resistencia

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SEMINARIO - IV

ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL: (ETS) Y SIDA

1. SFILIS CONGNITA. FASES DE LA ENFERMEDAD. DIAGNSTICO SEROLGICO.

2. PAPILOMAVIRUS

3. VIRUS DE LA HEPATITIS B

4. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH): A) B) C) ETIOPATOGENIA DEL SIDA Y ESTRUCTURA DEL VIH ASPECTOS GENERALES DEL CURSO DE LA INFECCIN POR VIH EPIDEMIOLOGA. TRATAMIENTO Y PREVENCIN

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SEMINARIO - V

ARBOVIRUS. DENGUE Y FIEBRE AMARILLA

TEMA 1: FIEBRE AMARILLA a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA b) MANIFESTACIONES CLNICAS Y EPIDEMIOLOGA

TEMA 2: FIEBRE AMARILLA a) DIAGNSTICO E INMUNOLOGA b) PREVENCIN Y CONTROL

TEMA 3: DENGUE a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA b) MANIFESTACIONES CLNICAS Y EPIDEMIOLOGA

TEMA 4: DENGUE a) DIAGNSTICO E INMUNOLOGA b) PREVENCIN Y CONTROL

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