FIZIOLOGIA ORGANITELOR CELULARE

reticulul endoplasmic &

semnalele citosolice de calciu

citoscheletul &
aparatul contractil actina-miozina

Reticulul endoplasmic (RE) este un ansamblu tubulovezicular cu rol in: - transport intracelular - stocarea si eliberarea Ca, - sinteza fosfolipidelor, acizilor grasi si steroizilor. - sinteza proteinelor eliberate direct in RE rugos RE se prezinta ca un sistem inchis de membrane plin cu lichid, raspandit in citosol, care se continua cu membrana nucleara.

RETICULUL ENDOPLASMIC
Exist dou aspecte ale RE: - reticulul endoplasmic neted (REN) sub forma unei reele de tuburi interconectate; - reticulul endoplasmic rugos (RER) care comunic cu reticulul endoplasmic neted ce se prezint sub forma unor stive de saci aplatizai a cror fa extern este presrat de particule de dimensiuni mici dense electronomicroscopic numite ribozomi.

SEMNALE DE CALCIU
Eliberarea din RE cresteri de Cac, integrabile in cresteri globale;

uniforme spatial
(fata de gradientele mari ce insotesc influxul). Fiziologic sunt activate ambele surse; - CICR recruteaza rezervele cand semnalul primar este influxul; - eliberarea nu este izolata, datorita SOC.
Ideea de semnal de Ca++ local a aparut in studii privind eliberarea neuromediatorilor si influenta Cas asupra canalelor.

SEMNALE DE CALCIU
Semnalul de Ca (SC) autoregenerativ; raspunsurile gradate indica natura cuantala.

Sensibilitatea variabila fata de Cac a canalelor reticulare permite gradarea prin recrutare.
Semnalul elementar (SE) = evidentiat in diverse celule (sparks, puffs, bumps, quantal emission domains). Exista si aspecte subquantale numite semnale unitare (quarks, blips). In general SE dureaza ~0,5 ms si ajung la concentratii de 0,1-200 M.

SEMNALE DE CALCIU
Frecventa globala si amplitudinea medie a SE contribuie la nivelul de repaus al Cac global, conditionand distanta pana la pragul de cuplare excitatie-raspuns. SE participa la controlul unor activitati zonale: - canale ionice membranare, - metabolismul mitocondrial, - eliberarea neuromediatorilor. Tranziente globale (spikes, waves); CICR asigura - amplificarea in avalansa - sincronizarea SC in citosolul profund, pentru raspuns sinergic. SE contribuie (direct / CICR) la cresterile globale ale Cac

SEMNALE DE CALCIU
SE submembranare; activarea simultana a unui mic grup de RyR duce la crestere locala (~20 nm) a Cac (10-100 M).

Un efect al SE: curentii cationici tranzitorii spontani (STOC) in neuroni, MN vascular si visceral.
Efluxul de K+ se realizeaza prin BKCa, cu sensibilitate mica pentru Ca++ si conductanta mare; hiperpolarizare de ~20 mV/SE.

SEMNALE DE CALCIU
SE produc curenti inhibitori (STIC) prin activarea unor canale de Cl Alte tinte ( CaM-dependente) raspund la cresteri mai mici (0,1-1 M), dar globale ale Cac.

Disocierea STOC de Cac global Cas,

cu cresteri locale mari separate de cele globale.
Imagistica 3D bazata pe MC distributia superficiala spiralata a formatiunilor reticulare (6% v/v) MF (fluo 4) situs profund de initiere a undelor de Ca++ propagate,

alte focare fiind superficiale, dispersate si putin active.

SEMNALE DE CALCIU
In MS deschiderea CaL poate sa nu fie insotita de SE (pot aparea si dupa inchidere), iar CICR depinde de influxul net, nu de curentul unitar si poate fi complet eliminat in prin tamponare citosolica (au fost studiate caveolele ca zona preferentiala de generare a SE). Spre deosebire de MS (CaL ca senzor de voltaj cuplat direct cu RyR din cisternele terminale) si de miocard (influxul prin CaL declanseaza CICR bazat pe RyR), in MN cuplarea influxeliberare este laxa. implicarea mitocondriei (preia din Ca++ eliberat n vecinatate, cu efect de tampon temporar).

FIZIOLOGIA ORGANITELOR CELULARE

reticulul endoplasmic & semnalele citosolice de calciu

citoscheletul &
aparatul contractil actina-miozina

Citoscheletul: - forma & mrimea celulei; - micarea unor constituieni n interiorul celulei. Se prezint sub aspect: microtubular, microfilamentar, intermediar, microtrabecular.

Structurile citoscheletului nu sunt fixe; ele sufer modificri reversibile, asigurnd redistribuirea i reorientarea organitelor. Semnale de la nivelul citoscheletului intervin n procesele de control a creterii i diviziunii normale a celulelor.

Citoschelet = ansamblu de filamente proteice, cu diferentieri regionale de compozitie si arhitectura ce servesc diverse roluri functionale. Se descriu trei clase de filamente: - microfilamente (implicate in mentinerea arhitecturii celulare), - microtubuli (implicati in motilitate), - filamente intermediare (ancorarea unor proteine membranare).

Microtubulii (tubulina) au rol n: - meninerea formei neregulate a unor celule, - transportul unor vezicule, - micrile cililor i flagelilor, - realizarea fusului mitotic. Microfilamentele = cele mai mari - alctuite din actin (i miozin n celulele musculare - reprezint sistemul contractil al celulei - contractilitatea muscular - micrile amiboide ale leucocitelor,

 Filamentele intermediare
- dimensiuni ntre ale microtubulilor i microfilamentelor; - mai ales n celulele care suport compresiuni

Reeaua microtrabecular
alctuit din filamente foarte subiri interconectate care traverseaz ntreaga citoplasm ancorndu-se de faa intern a plasmalemei
organitele, microtubulii i microfilamentele par a fi suspendate de reeaua microtrabecular realizeaz scheletul celulei, conferind n acest mod unitate funcional tuturor constituienilor citoplasmatici.

The cytoskeleton is a cytoplasmic network of filamentous, non-covalent protein polymers found in eukaryotic cells. The cytoskeleton allows cells to reproduce and move; it is critical for cell growth and for the cell to be able to respond to the environment. The cytoskeleton is rigid, yet flexible, and it is dynamic. The cytoskeleton functions to control cell shape and provide for a variety of different morphologies (e.g., neurons, epithelia, muscle). Cytoskeletal proteins also allow the cell to change its shape. The cytoskeleton contributes to the organization of cytoplasm, and allows for motility, both of whole cells (and animals) as well as of structures within the cell.

F-actina: contractie, modificari de forma, miscare amiboidala, citokineza Microtubuli: arhitectura, modificari de forma, mitoza, cili si flageli, miscari intracelulare Filamente intermediare: rigiditate Filament Diameter Subunit F-Actin INTERMEDIATE (MICROFILAMENTS) FILAMENTS (IFs) 8 nm monomer G-actin 42kD 10 nm MICROTUBULES (MTs) 24 nm

many types of subunits dimer a/b tubulin monomer: 55kD dimer: 110kD NO NO 2 GTP / dimer only one hydrolyzed YES colchicine colcemide nocodazole taxol

Nucleotide bound one ATP / monomer Polar? Drugs Favor depolym YES cytochalasins

Stabilize

phalloidin

ACTIN POLYMERIZATION You can assess actin polymerization by measuring solution viscosity or turbidity or by sedimenting F-actin polymer. G-actin can be induced to polymerize by addition of salt. Actin polymerization occurs in three steps: (1) the lag phase, during which actin assembly is nucleated. Nucleation involves the formation of a large enough cluster of actin monomers (currently thought to be three) that will then support further growth; (2) rapid assembly, and (3) steady state. During the rapid assembly phase, the filament is growing at both ends. At steady state, the filament is not at equilibrium. It is still growing and shrinking in a process called treadmilling, which is discussed in detail below. Actin assembly is strongly influenced by a property known as the critical concentration (Cc). This is a property that is also seen for other self-assembling molecules (e.g., tubulin). Filaments assemble only in solutions that are above the Cc. Solutions of actin polymer contain both F-actin and G-actin, and G-actin is maintained at the Cc. Solutions of actin polymer that are diluted to below the Cc will depolymerize.

 Celula musculara = aparat contractil specific, cu organizare sarcomerica Discul clar = miofilamente de actina; 2 semidiscuri, de o parte si de alta a membranei Z; lungime de 2 m. Aceasta reprezinta lungimea maxima, caracteristica muschiului intins in repaus (miofilamentele de actina nu patrund in interiorul discului intunecat).

Miofilamentele de actina: doua extremitati: - una patrunde printre miofilamentele de miozina, - una este fixata prin impletire pe membrana Z. Miofilamentele de miozina: discul intunecat (1,5 m); agregate moleculare cilindrice, cu proiectii laterale.
Exceptie face o zona neteda centrala, de 0,2 m, si o portiune mijlocie a acestei zone ingrosata, reprezentand stria M.

Sarcomerul

- portiunea cuprinsa intre 2 membrane Z succesive;

- contine un disc intunecat central si doua semidiscuri clare la extremitati - reprezinta unitatea morfo-functionala a miofibrilei
- lungimea depinde de starea functionala a muschiului:

- in repaus sarcomerul are lungimea de 2,2 m; filamentele de actina patrund partial printre cele de miozina, pana la limita zonei centrale, unde lipsesc proiectiile laterale (zona clara H, lungime de 0,2 m).
- intinderea prin tractionare a muschiului are ca efect iesirea filamentelor de actina inafara discului intunecat si alungirea discului clar; zona H se mareste.

In timpul contractiei musculare filamentele de actina patrund printre cele de miozina, in interiorul discului intunecat, se micsoreaza discul clar, stria H dispare, stria M devine evidenta (la nivelul ei filamentele de actina se suprapun).

Miofilamentele sunt alcatuite din: - proteine contractile fundamentale actina si miozina - proteine reglatoare troponina, tropomiozina, si actinina

 FILAMENTUL DE MIOZINA este un polimer;

200 de monomeri alcatuiti din 6 lanturi polipeptidice,

2 grele (200 kDa) si 4 usoare (20 kDa), configuratie de crosa de golf. Cele doua lanturi grele longitudinale rasucite in dublu helix formeaza manerul sau corpul. Extremitatile au forma de dublu cap polar cu structura globulara (legat de corpul moleculei printr-un scurt lant polipeptidic helicoidal) + atasate 2 lanturi usoare. Fiecare dintre cele doua capete polare are

activitate ATP-azica si afinitate pentru actina.

 Partea longitudinala a moleculei este meromiozina usoara (LMM), iar capetele polare si lantul peptidic de legatura formeaza meromiozina grea (HMM). Pe lantul peptidic care leaga capul polar de corpul moleculei exista 1-2 zone de flexibilitate moleculara, numite balama, capul polar putand avea inclinatii diferite fata de corpul moleculei. Structura supramoleculara ordonata a filamentului gros este conferita de subunitatile LMM alaturate longitudinal, alcatuind un cilindru gros, cu extremitatile libere ale moleculei orientate spre mijlocul filamentului si capetele polare proeminnd din aceasta structura pe un traiect spiralat = aspect de fascie romana

FILAMENTUL DE ACTINA
Actina fibrilara (F), = polimer (dublu helix) format din subunitati de actina globulara (G), cu GM de 47 kDa. Actina G (41,7 kDa, ~5,5 nm diametru) se dispune n numr de 2x14 molecule pentru fiecare tur a lanului spiralat de actin F. Actina prezint aa-numitele situsuri active pentru legarea miozinei. Filamentele subiri mai conin i proteinele accesorii, reglatoare; complexul troponin-tropomiozin.

TROPOMIOZINA dublu helix, rezulta din polimerizarea longitudinala a unor molecule de tropomiozina; legata de actina, situata in santurile dintre cele doua spirale ale filamentului subtire. ~5 kDa, ~38,5 nm = jumatate de tura a spiralei de actina in repaus tropomiozina acopera fizic zonele active ale actinei, impiedicand interactiunea cu miozina.
TROPONINA - situata la intervale de 40 nm din lungimea filamentului de actina - 3 subunitati globulare - troponina T cu afinitate pentru tropomiozina, - troponina I intermediara cu afinitate pentru actina - troponina C cu afinitate pentru ionii de calciu.

 Fixarea Ca++ pe troponina C

descoperirea zonelor active de pe actina

fixarea capului polar al miozinei prin activarea ATP-azei miozinice se modifica incarcarea capului polar care, atras de corpul filamentului de miozina, determina flexia puntii transversale spre interiorul discului intunecat.

Actina aluneca spre mijlocul sarcomerului,

care astfel se va scurta = mecanism glisant Desfacerea puntii transversale duce la revenirea in pozitie perpendiculara pe directia filamentului de miozina, refacand o noua legatura cu locusul urmator de pe actina. Procesul inceteaza si are loc relaxarea fibrei musculare cand scade concentratia calciului citosolic liber la nivelul de repaus.

 Ca++ citosolic indeparteaza efectul inhibitor exercitat de complexul troponina-tropomiozina asupra interactiunii actina-miozina. Forta dezvoltata de muschi este proportionala cu rata ciclarii puntilor transversale.
Lipsa ATP-ului este o situatie anormala, cnd ciclul se opreste si se formeaza un complex permanent actina miozina / acumularea ionului de calciu in sarcoplasma datorita ineficientei pompei de Ca++ - rigiditatea cadaverica - contractura fiziologica din oboseala musculara

 Relaxarea se datoreaza revenirii Ca++ citosolic la valorile de repaus, deoarece repolarizarea sarcolemei intrerupe influxul de calciu, permitand expulzarea din citosol a calciului suplimentar, prin activitatea pompei de calciu (sarcolemala / reticulara), la care se adauga antiportul sodiu / calciu sarcolemal
(3:1, transport activ secundar bazat pe gradientul de Na meninut de pompa de Na).

Inhibarea pompei de sodiu de ctre ageni cardiotonici din clasa digitalice duce la creterea nivelelelor de calciu activator, cu efect inotrop pozitiv.

 Scurtarea muchiului striat

este rezultatul scurtrii sarcomerelor (~1 m), cu meninerea constant a lungimii benzilor A, fapt datorat alunecrii reciproce a filamentelor de actin i miozin. Aceasta este rezultatul atarii i detarii ciclice a punilor transversale, prin legarea reversibil a capetelor miozinei pe situsuri active succesive de pe filamentul de actin.

Thick filaments are made up of 200 molecules of myosin, each with a molecular weight of ~500 kDa and comprising two heavy chains and four light chains (fig. 4.1). The heavy chains are organised in light meromyosin that forms the common tail and heavy meromyosin with regions S2 (common neck, flexible) and S1 (2 heads per myosin molecule, each with one binding site for actin and one for ATP). From the two light chains per myosin head one is essential and one is regulatory. The myosin filament is a bundle of parallel tails with the heads projecting from it every 14.4 nm, at 60o one from another (corresponding to the three surrounding actin filaments). They look like bundles of golf clubs, with no heads in the length midportion. By definition the sarcomere is a longitudinal fragment of a myofibril delimited by two successive Z membranes, placed in the middle of light bands I (isotropic), and to which actin filaments are anchored. The midportion of the sarcomere is the dark band A (anisotropic), made up of actin and myosin filaments, except the central H zone, with no actin (at normal lengths). In transverse section each myosin filament appears surrounded by six actin ones and each actin filament by three myosin ones. Phases of crossbridge cycling - ATP binding to the polar myosin head, - hydrolysis of ATP, with an increase in the tail to head angle, - formation of the actin-myosin crossbridge, - flexion of the myosin head, with traction of the actin filament (~10 nm), - detachment of the crossbridge (simultaneous / subsequent with the next step), - release of ADP and binding of another ATP molecule, hence a new cycle.