P. 1
Riscuri Asociate Produselor Alimentare

Riscuri Asociate Produselor Alimentare

|Views: 134|Likes:
Published by Iulian Ciuica

More info:

Published by: Iulian Ciuica on Apr 07, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

10/03/2013

pdf

text

original

1 RISCURI ASOCIATE PRODUSELOR AGROALIMENTARE (note de curs

)

Bucureşti 2

CUPRINS

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE..............................................................3 PROCESE METABOLICE ALE MICROORGANISMELOR ŞL APLICAŢII ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ............................................................52 MICROBIOLOGIA PREVIZIONALĂ..........................91 TRASABILITATEA PRODUSELOR ALIMENTARE........................................................................103 ANALIZA RISCULUI IN SIGURANŢA ALIMENTELOR......................................................................118 BIBLIOGRAFIE.....................................................................129 3

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

Microbiologia produselor alimentare, ştiinţă microbiologică cu caracter aplicativ, are drept obiect de studiu cunoaşterea naturii şi activităţii metabolice a microorganismelor, care pot contamina materiile prime, semifabricatele, produsele finite, în scopul prevenirii alterării alimentelor sau a îmbolnăvirii populaţiei prin consum de alimente contaminate cu microorganisme patogene sau toxicogene. în cadrul disciplinei sunt studiate microorganisme utile folosite drept culturi starter în fermentaţii ce stau la baza biotehnologiilor alimentare. Un alt obiectiv este controlul microbiologic şi igienico-sanitar în diferite etape tehnologice de prelucrare şi păstrare a produselor alimentare, pentru prevenirea contaminării microbiene şi pentru respectarea standardelor, criteriilor şi normelor microbiologice. Clasificarea generală a microorganismelor în sistematica generală a microorganismelor sunt admise, în stadiul actual, unităţi taxonomice ca supraregnuri, regnuri, ramuri, grupe, bazate pe criterii ce diferenţiază celula - unitatea fizică elementară ce stă la baza vieţii. în tabelul următor se prezintă sistematica generală a microorganismelor cu importanţă practică. Sistematica generală a microorganismelor

Supraregn/ Caractere generale Regn 1 I. Eucariotae: nucleu definit, separate prin membrană de citozol ADN + histone în cromozomi ADN în mitocondrii şi plasmide Micetalia (Mycota) Eumycota (Fungi) Micromicete (ciuperci microscopice): -monocelulare: drojdii, mucegaiuri inferioare -pluricelulare: mucegaiuri superioare (cu miceliu septat) Macromicete - ciuperci comestibile Plantae Alge Alge verzi-albastre: - surse neconvenţionale de proteine Animalia Protozoa Trichomonas, Plasmodium ş.a. Monocelulare, din care patogene: Giardia, Ramură 2 Grupe importante 3 4

II. Procariotae: -ADN în citozol -lipsă organite libere Bacteria Scotobacteria PHotobacteria Bacterii, actinomicete, Mycoplasme (bacterii fără perete celular, patogene) Bacterii fotosintetizante III. Vira: - particule infecţioase acelulare Protovira Euvira

Ribovira Deoxyvira Virusuri ce conţin ARN Virusuri ce conţin ADN Prioni -patogeni transmisibili, agenţi ai îmbolnăvirilor degenerative ale sistemului nervos central 4

Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme cu importanţă în industria alimentară Drojdii (levuri) Drojdiile reprezintă un grup taxonomic complex şi heterogen de microorganisme monocelulare de tip eucariot, care se înmulţesc prin înmugurire (mitoză), ca formă generală de reproducere şi, în mod particular, prin ascospori formaţi pe cale asexuată şi sexuat (în urma proceselor de conjugare între celule). Importanţă şi rol. Având drept caracteristică principală capacitatea de a produce fermentarea glucidelor simple în anaerobioză, cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon, drojdiile fermentative sunt utilizate industrial în biotehnologii alimentare la fabricarea spirtului de fermentaţie, a vinului, berii şi pâinii. Drojdiile au o compoziţie chimică valoroasă şi după cultivare în condiţii de aerare şi prelucrare sunt utilizate ca sursă de proteine în alimentaţia umană (cu denumirea de SCP = single cell protein - proteine din monocelulare) sau în alimentaţia animalelor, deoarece, pe lângă 45 - 55 proteină brută % s.u., aduc în raţie aminoacizi şi vitamine ale grupului B. în microbiologia industrială, din biomasâ de drojdie se obţin: plasmolizate, autolizate, folosite ca aditivi alimentari sau pentru îmbogăţirea în substanţe azotate a mediilor de cultură destinate fermentaţiilor. Cu ajutorul drojdiilor se pot obţine avantajos, în condiţii industriale, vitamine hidrosolubile (Bu B2, PP, ergosterol), enzime (Pfructofuranozidaza şi (3-galactozidaza), iar prin metode de inginerie genetică, din mutanţi ai speciei Saccharomyces cerevisiae, s-a obţinut interferonul - substanţă cu efect antiviral şi citostatic. Răspândire în natură. Drojdiile au o largă răspândire în mediul ambiant, fiind întâlnite în toate habitatele naturale: sol, ape, aer, plante, animale. în sol, celulele de drojdie se întâlnesc în straturile superficiale, până la adâncimi de aproximativ 30 cm, în concentraţii de 102- 2 • 105 g"1. Cantitatea creşte în solurile viilor şi grădinilor, ca urmare a îmbogăţirii solului în substanţe nutritive furnizate de fructele care cad la sol şi suferă lent putrezirea. Din sol, prin acţiunea unor factori fizici, mecanici şi biologici, microorganismele ajung temporar în aer şi se răspândesc la distanţe mari; din sol şi aer drojdiile pot ajunge în ape, unele specii fiind întâlnite chiar la adâncimi de 4000 m.

în mod permanent, drojdiile se află în microbiota epifită a plantelor (flori, fructe, frunze, rădăcini); răspândirea drojdiilor este favorizată de insecte, care, o dată cu nectarul/sucul, preiau şi celule de drojdii care pot hiberna îri tractul digestiv al 5

insectelor. în organismul animal, drojdiile sunt prezente în biocenoza intestinală şi se elimină pe căi naturale prin produsele de dejecţie; în cantităţi mai reduse se întâlnesc în cavitatea bucală şi pe piele. Un grup restrâns de drojdii sunt patogene (Candida albicans, Cryptococcus neoformans) şi dau îmbolnăviri la om şi animale. Caractere morfologice. Celula de drojdie are în mod obişnuit formă sferică, ovală sau cilindrică, cu dimensiuni medii de 4-14 pm. Unele tulpini sunt monomorfe, deci prezintă în cultura pură celule de un singur tip morfologic, iar altele sunt dimorfe sau polimorfe. Forma şi dimensiunea celulelor este un caracter de gen şi specie, dar acestea pot fi influenţate de starea fiziologică şi de condiţiile de cultivare. Dintre formele caracteristice unor genuri, cu importanţă în industria alimentară, se menţionează: - forma ovală (elipsoidală) specifică drojdiilor fermentative ce aparţin genului Saccharomyces; - forma sferică - predomină la drojdii din genul Torulopsis; -forma apiculatâ (de lămâie), întâlnită la genurile Kloeckera şi Hanse-niaspora; - forma cilindrică (alungită), specifică drojdiilor din genul Candida şi genul Pichia; - forma de sticlă, specifică drojdiilor din genul Saccharomycodes. Structura celulei de drojdie. Celula eucariotă de drojdie se deosebeşte puţin de celula animală; de celula vegetală se diferenţiază prin absenţa cloro-plastelor şi a învelişului celulozic. Unele structuri subcelulare se pot vizualiza cu ajutorul microscopului fotonic (nucleu, mitocondrii, vacuole, perete celular, citozol), în timp ce ultrastructurile (membrana citoplasmatică, reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi ş.a.) au putut fi observate doar cu microscopul electronic (x 20 000). Cunoaşterea organizării arhitecturale complexe a celulei de drojdie este utilă pentru înţelegerea potenţialului funcţional al diferitelor componente. Peretele celular are o grosime de aproximativ 250 nm şi poate să reprezinte o pondere de 5 - 15 % din biomasa uscată de drojdie. Din punct de vedere structural, peretele celular are aspect laminar şi este alcătuit din 2-3 straturi. Stratul extern are o suprafaţă rugoasă şi în anumite zone prezintă aşa-numitele cicatrice mugurale, locul de desprindere a celulelor rezultate prin înmugurire. în componenţa stratului extern predomină mananul cuplat prin legături covalente şi radicali fosfat de molecule de proteine, formând complexe macromoleculare. Stratul intern are o suprafaţă ornamentată cu riduri proeminente, formate din 6

permeaze) implicate în biosinteză compuşilor peretelui celular şi în procese de transfer al substanţelor. Peretele celular are rol esenţial în asigurarea formei celulei şi de protecţie faţă de factorii mediului ambiant. în cooperare cu piasmalema participă la creşterea şi reproducerea celulară, în biosinteză şi catabolism. Prin îndepărtarea peretelui celular, prin metode enzimatice, se obţin protoplaştii folosiţi în ingineria genetică pentru obţinerea prin fuziune a hibrizilor cu importanţă practică. Prin amplasarea protoplaştilor pe mediu nutritiv, în timp de 8-12 ore, are loc regenerarea peretelui celular. Piasmalema (membrana citoplasmatică) reprezintă un^strat lamelar cu o grosime de circa 8-9 nm, care delimitează protoplastul la exterior. Piasmalema este o structură de natură lipoproteică în care lipidele (fosfolipide, steroli, acizi graşi nesaturaţi) reprezintă 23-30%, iar proteinele (glicoproteine) 30-33 % din masa nativă a membranei. Piasmalema este sediul complexelor multienzimatice cu rol în biosinteză poliglucidelor din peretele celular (glucansintetaze şi chitinsintetaze), în glicoliză, fosforilare oxidativă (oxidoreductaze, citocromi, reductaze), în principalele căi metabolice ale celulei vii. Piasmalema este o structură dinamică în care se realizează importante funcţii ale celulei vii. în primul rând este o barieră osmotică, cu permeabilitate selectivă ce reglează transferul de substanţe nutritive necesare în celulă pentru a fi metabolizate, precum şi eliminarea de cataboliţi, iar prin sistemele enzimatice, active la acest nivel, intervine în reglarea procesului de creştere şi înmulţire. Citoplasmă (citosolul) reprezintă o materie fundamentală a celulei vii în care sunt înglobate organitele subcelulare specifice. Citosolul este un sistem coloidal cu un conţinut de 75-85 % apă, în care substanţele componente se află sub formă de sol sau gel, formând micele coloidale. Dintre substanţele organice predomină proteinele cu rol structural sau catalitic, lipidele cu rol plastic şi glucidele cu rol energetic. în compoziţia chimică a citosolului intră şi acizii nucleici, respectiv ARN (mesager, de transfer şi ribozomal) cu rol în biosinteză proteinelor celulare, ARNk (denumit killer) implicat în sinteza de proteine cu acţiune toxică pentru alte celule sensibile şi ADN-extra-cromozomial, component al plasmidelor citoplasmatice. în citosol, în anumite faze ale creşterii celulare, se pot acumula substanţe în exces sub forma unor incluziuni de rezervă şi anume: - granule de glicogen, care se prezintă sub forma unor corpusculi sferici şi care se pot evidenţia prin suspendarea celulelor de drojdie în soluţie de Lugol, când glicogenul în prezenţa iodului se colorează în brun-roşcat. Glicogenul reprezintă principala substanţă de rezervă a celulei şi este metabolizat atunci când celula este în stare de înfometare; - sferozomii (oleiozomii), care sunt incluziuni lipidice. Dintre organitele celulare cu care citosolul interacţionează în mod permanent, formând o unitate morfofuncţională, fac parte următoarele: nucleul, mit-ocondriile, aparatul Golgi, sistemul vacuolar.

Nucleul reprezintă „spaţiul" genetic în care are loc stocarea, replicarea şi transmiterea informaţiei celulare. în timpul diviziunii celulare, ADN-ul nuclear se divide în 2 sau mai mulţi cromozomi, în funcţie de specie. în timp ce Saccha-romyces cerevisiae are 17 cromozomi, la specii ale genului Hansenula au fost identificaţi 4. Unele drojdii sunt obligatoriu haploide, de exemplu drojdiile din genul Candida, genul Torulopsis, genul Rhodotorula, în timp ce alte genuri (Saccha-romyces ş.a.) pot prezenta faza haploidă (1 n) - în faza de ascospori şi faza diploidă (2n) - în faza vegetativă de reproducere. 7

Mitocondriile sunt organite mari, care pot ocupa până la 25% din volumul citosolului, în care sunt localizate enzime de catabolism, implicate în ciclul Krebs şi în p-oxidarea acizilor graşi, în fosforilarea oxidativă, în sinteza de ATP pentru necesităţile energetice ale celulei. O celulă poate conţine 10-50 mitocondrii. Sistemul vacuolar poate fi vizibil la microscop în faza staţionară de creştere a celulei sub forma unui vacuom central prevăzut cu o membrană, tonoplasma, sau să fie alcătuit din mai multe vacuoie mici, în faza de creştere exponenţială. Vacuolele conţin o cantitate mare de apă şi îndeplinesc funcţii importante în reglarea presiunii şi în menţinerea stabilităţii chimice a citosolului. Reticulul endoplasmatic face legătura între nucleu şi vacuom şi reprezintă o reţea de vezicule - cisterne interconectate, caracterizate printr-o mare plasticitate morfologică. Reticulul endoplasmatic este sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, NADH, enzime ale lanţului transportor de electroni) şi are rol în biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi; participă la expansiunea învelişului nuclear şi a plasmalemei în diferite etape de dezvoltare ale celulei, Aparatul Golgi este un sistem de endomembrane, alcătuit din unităţi funcţionale dictiozomi, care face legătura între reticulul endoplasmatic şi plasmalemă. Veziculele Golgi sunt privite adesea ca aparatul de sortare şi dirijare a proteinelor şi componentelor membranare spre locul lor de destinaţie; au rol în expansiunea peretelui celular. Ribozomii sunt particule nucleoproteice implicate în sinteza proteinelor celulare, răspândiţi în citosol - citoribozomi, liberi sau în asociaţii de 5-6 ribozomi (polizomi). Au în structură ARN-ribozomal şi proteine; ARNr este implicat în procese de transcripţie a informaţiei genetice pentru biosinteza proteinelor/ enzimelor necesare celulei. Lizozomii sunt structuri veziculare bogate în enzime: fosfataze, proteaze, lipaze ş.a., active la pH = 5, cu rol în digestia unor compuşi ai celulei vii care nu mai funcţionează eficient. în exteriorul lizozomului, în citosol, enzimele nu sunt active deoarece pH-ul este de 7,3. Când sub acţiunea unor factori, de.exemplu în starea de înfometare, în absenţa apei care asigură transportul în exteriorul celulei a cataboliţilor formaţi, pH-ul în citosol scade, devin active enzimele din lizozom şi celula moare datorită procesului de autoliză.

Peroxizomii sunt structuri sferice cu membrană simplă şi o matrice pe care sunt localizate oxidaze, cu rol în adaptarea celulei de drojdie la condiţii aerobe. Intervin în ciclul glioxilatului, în degradarea acizilor graşi, a aminoacizilor -(de exemplu a metioninei) şi a apei oxigenate. Caractere fiziologice generale. O proprietate importantă a unor drojdii cu importanţă în industria alimentară este aceea de a fermenta în condiţii de anaerobiozâ, glucide (hexoze, diglucide, triglucide) cu formare de alcool etilic, dioxid de carbon şi produse secundare care dau aroma caracteristică produselor fermentate. în condiţii de aerobioză, drojdiile asimilează glucidele transformându-le prin respiraţie în C02 şiAH20, iar energia eliberată favorizează creşterea şi înmulţirea celulelor. în raport cu temperatura, majoritatea drojdiilor industriale sunt mezofile (temperatura optimă 28...32°C); există şi drojdii adaptate care sunt active la temperaturi de refrigerare (drojdii de vin), sau drojdii termofile active la 35...38°C (din genul Candida). 8

Drojdiile se dezvoltă bine într-un domeniu larg de pH, cu valori limită între 2,5 şi 8,5 şi un pH optim la 5,5. Celulele de drojdie, ca şi alte celule, reacţionează activ la presiunea osmotică dată de concentraţia substanţelor dizolvate în mediul în care se află suspendate. Dacă mediul este hipotonic, cu o concentraţie a substanţelor dizolvate mai mică decât concentraţia intracelulară, apa va pătrunde în celula care îşi măreşte volumul şi, dacă se prelungeşte această stare de turgescentă, celula suferă deteriorări fizice ireversibile. în mediul hipertonic, când concentraţia mediului este superioară concentraţiei intracelulare, apa din celulă difuzează în exterior pentru a asigura izotonia, iar celula trece în starea de plasmoliză. în condiţii naturale, se pot întâlni, ocazional (temporar), celulele de drojdii în diferite stări: fiziologică activă, în care celulele cresc şi se înmulţesc; de anabioză, determinată de reducerea cantităţii de apă liberă din interiorul celulei, în care celula se menţine în viaţă, în schimb activitatea enzimatică este redusă la minimum; de autoliză când, în condiţii nefavorabile, are loc o solubilizare a compuşilor sub acţiunea enzimelor proprii (în special proteaze), care conduce la moartea fiziologică a celulei. Reproducerea drojdiilor. Forma generală de reproducere a drojdiilor este înmugurirea vegetativă (calea asexuată), care are la bază un proces simplificat de mitoză, când din celula-mamă se formează noua celulă, identică din punct de vedere genetic. Unele drojdii au capacitatea de a se înmulţi nu numai prin înmugurire, ci şi prin spori; sporularea este condiţionată genetic, are loc în anumite condiţii de mediu şi are la bază procesul de meioză. Reproducerea prin sporulare la drojdii poate avea loc pe cale asexuată din/în celula vegetativă sau pe cale sexuată prin procese de copulare (conjugare) între celule diferenţiate.

Reproducerea prin înmugurire. Pe cale vegetativă (asexuat), drojdiile se pot înmulţi prin înmugurire propriu-zisă, caracteristică majorităţii lor, şi prin sciziune, în urma formării unui perete despărţitor, caracteristică genurilor Schizosaccha-romyces şi Endomyces înmugurirea are loc în condiţii optime când drojdiile se află în mediu cu o concentraţie de glucide simple de 2-5%, substanţe cu azot asimilabile, săruri minerale şi factori de creştere; pH-ul optim pentru înmulţire este în domeniul acid 4,5-5,5, iar temperatura optimă la valori între 25 şi 32 °C. O condiţie necesară pentru înmugurire este aerarea corespunzătoare a mediului, deoarece în prezenţa oxigenului din aer are loc asimilarea eficientă a nutrienţilor cu recuperarea energiei potenţiale a acestora, energie folosită de celula în creştere pentru procese de biosinteză, consumatoare de energie. în aceste condiţii, în prima etapă, celula de drojdie creşte în dimensiuni în urma măririi coordonate a compuşilor intracelulari; creşterea în volum fiind mai rapidă decât a suprafeţei învelişurilor celulare, la un anumit stadiu se declanşează înmugurirea. Astfel, într-o zonă (placă) a peretelui celular are loc o înmuiere enzimatică a peretelui şi apare o protuberantă - mugurele, care, treptat, creşte în dimensiuni; între celula parentală şi mugure se perfectează un canal - diverticulum - prin care se transferă, în celula nou formată, material nuclear şi citoplasmatic, prin cariokineză şi citokineză. Când celula-fiică va conţine toate componentele necesare unei vieţi independente, la nivelul canalului se formează un perete inelar cu o concentraţie ridicată în chitină, ce se dezvoltă centripet, până când are loc obturarea şi separarea. în condiţii optime de viaţă, o celulă de drojdie poate forma 9-42 noi celule, apoi celula moare din punct de vedere fiziologic. Pentru drojdiile la care separarea mugurelui are loc prin sciziune, prin înmugurire se pot forma structuri liniare ce alcătuiesc miceliu adevărat. în procesul, de înmulţire a drojdiei prin mitoză, numărul original de cromozomi se păstrează constant; aceasta înseamnă că dacă celula parentală este diploidă şi celulele rezultate prin înmugurire vor rămâne tot diploide (2/n), respectiv, dintr-o celulă haploidă se vor forma două celule tot haploide (1 n). înmulţirea drojdiilor prin înmugurire este un proces cu multiple aplicaţii industriale, în scopul obţinerii, cu un randament ridicat, a biomasei de celule 1a 9

fabricarea drojdiei comprimate, a drojdiilor furajere, a culturilor de drojdii selecţionate folosite la fabricarea spirtului, berii, vinului, sau pentru extragerea din biomasă a unor corcjJŞfcişi endogeni valoroşi (vitamine, enzime ş.a.). Reproducerea prin sporulare. Este un proces particular întâlnit la drojdiile sporogene care au dobândit capacitatea genetică de a forma în anumite condiţii, în medie, 2-14 ascospori. Sporularea are la bază procesul de meioză, prin care numărul de cromozomi ai celulei parentale diploide se reduce la jumătate, iar celulele formate, primind un singur set de cromozomi, sunt haploide.

în cazul drojdiilor ascogene, de exemplu al celor aparţinând genului Saccharomyces, sporularea poate fi indusă prin transferul celulelor din must în fermentaţie pe un bloc de ghips sau pe un mediu inductiv: mediul McGlary sau mediul Gorodkova. în aceste condiţii, în celulă prin sporulare asexuată se formează ascosporii, ale căror număr şi caractere morfologice sunt dependente de specie. Sporularea este iniţiată după circa 10 ore de expunere pe mediu de sporulare şi este mai intensă după 24-48 de ore. în timp, celula generatoare de spori, denumită şi ască, se poate rupe sau poate să se solubilizeze prin autoliză şi ascosporii liberi, în condiţii favorabile, germinează şi formează prin reproducere vegetativă colonii (clone) haploide. Ascosporii haploizi pot fi de tip „a" sau „a", în funcţie de natura feromonilor specifici; în condiţii favorizante, celulele ajunse la maturitate fiziologică, denumite şi gârneţi, pot să fuzioneze printr-un proces de conjugare pentru a forma din nou celule diploide. Dacă are loc conjugarea între celule de acelaşi tip a/a, celulele diploide sunt viabile, dar ascosporii formaţi îşi pierd această calitate.. Sub formă de ascospori, drojdiile rezistă timp îndelungat în sol, în condiţii de uscăciune, în schimb termorezistenţa lor este apropiată cu cea a celulelor vegetative şi inactivarea are loc la 75...85 °C. Capacitatea de sporogeneză a drojdiilor este un criteriu taxonomic important în identificarea speciilor, iar lucrările de obţinere a hibrizilor rezultaţi prin conjugare dirijată (drojdii mutante) ocupă un loc important în bioinginerie. Descrierea principalelor caractere de gen şi incidenţa drojdiilor în industria alimentară Bretanomyces cuprinde drojdii anascogene de formă oval-cilindrică (sau de ogivă) cu înmugurire terminală, care pot, în aerobioză, să producă acid acetic prin fermentarea glucozei. Dau alterări ale berii, vinului (cu formare de esteri şi substanţe cu gust amar), ale băuturilor nealcoolice şi ale murăturilor. Candida este un gen bogat în specii (81), heterogen din punct de vedere morfologic şi fiziologic şi care a suferit în timp multe modificări taxonomice. Candida mycoderma (valida), denumită şi floarea vinului, se dezvoltă în prezenţa aerului la suprafaţa lichidelor slab alcoolice, formând un voal caracteristic; prin oxidarea alcoolului la dioxid de carbon şi apă are loc deprecierea vinului, berii. Alte specii, cum ar fi C. utilis, C. robusta, C. tropicalis, C. lypolitica ş.a. se pot cultiva pe medii obţinute prin prelucrarea unor deşeuri ale industriei alimentare, a lemnului şi celulozei, obţinânduse o biomasă cu un conţinut de 45-55 % proteină, folosită în furajarea animalelor. Candida krusei intervine la fermentarea boabelor de cacao şi de cafea. Drojdiile C. kefyri sunt utile la fabricarea chefirului, iar C. pseudoîropicalis este frecvent întâlnită în microbiota cărnii tocate de vită. Candida albicans, drojdie facultativ patogenă, nu se înmulţeşte în alimente. în organismul viu, poate fi agent al dermatitelor, candidozelor viscerale, pulmonare. 10

Clasificarea generală a drojdiilor. în tabelul următor se prezintă o clasificare selectivă a drojdiilor, pe baza datelor prezentate de Krieger van Rijj, 1984.

Diviziune/ clasă/ordin Clasificarea selectivă a drojdiilor Familie/subfamilie Genuri 1 2 3 Saccharomycetaceae a) Schizosaccharomy-cetoid ae Schizosaccharo- myces Schiz. pombe Schiz. acidovorax Schiz. octosporus Specii 4

lAscomycota/ Hemiasco- mycetes Debaryomvces D. hansenii Hansenula H. anomala H. satumus Issatchenkia 1. orientalis Kluyveromyces K. lactis K. fragilis b) Saccharomycetoidae fahnosa Pichia P. membranefaciens P. fermentans P.

Saccharomyces Sacch. cerevisiae Sacch. uvarum Sacch. ellipsoideus Sacch. bayanus Saccharomycopsis Saccharomycopsis fibuligera Torulaspora T. delbrueki Yarrowia Zygosaccharomyces Y. lipolitica Z. rouxii Hanseniaspora H. apicuiata Saccharomycodes Lypomices Brettanomyces B. intermedius Sacch. ludwipii

Candida KIoeckera Rhodotorula Trichosporon Sporobolomyces 11

C. mycoderma C. utilis C. robusta C. tropicalis K. apicuiata K. magna Rh. glutinis Rh. rubra T. cutaneum

Debaryomyces cuprinde drojdii de formă oval-cilindrică, cu înmulţire multipolară; pot produce pseudomiceliu. D. hansenii este halotolerantă şi creşte în medii cu 24% sare, la valori de aw = 0,65. Poate produce mucus la suprafaţa batoanelor de salam, se dezvoltă la suprafaţa brânzeturilor şi dă alterări ale sucurilor concentrate de portocale. Hanseniaspora include drojdii cu proprietăţi fermentative reduse (5° alcool), cu formă apiculată şi înmulţire bipolară. Sunt răspândite în microbiota fructelor citrice, a smochinelor; intervin în fermentarea naturală a boabelor de cacao. Hanseniaspora apicuiata se poate dezvolta în must şi în vin, fiind responsabilă pentru formarea de acizi volatili şi esteri care dau un gust străin vinului. Prin contaminarea vinului folosit la obţinerea şampaniei la sticle, H. apicuiata poate forma un sediment aderent la sticlă, care se îndepărtează greu la degorjare. Issatchenkia cuprinde drojdii cu înmulţire multipolară, producătoare de pseudomiceliu. Lohentalis este o drojdie oxidativă şi poate forma voal la suprafaţa lichidelor fermentate. Este teleomorf al speciei Candida krusei. KIoeckera cuprinde drojdii de formă apiculată (de lămâie sau amforă) întâlnite în microbiota fructelor dulci. Se dezvoltă în mustul de struguri în prima etapă a fermentaţiei şi activitatea lor este inhibată la creşterea concentraţiei în alcool peste 4-6° alcool. Speciile KIoeckera apicuiata şi KIoeckera magna pot să prezinte forme sexuate înscrise în genul Hanseniaspora. Kluyveromyces, drojdii cu înmulţire multilaterală, pot produce pseudohife şi se înmulţesc prin ascospori (1-16/ască) sferici sau reniformi. K marxianus (care include speciile denumite anterior K fragilis, K. lactis) produce 0-galactozidază, fermentează lactoza şi poate produce alterări ale brânzeturilor. Pichia cuprinde 35 de specii; se înmulţesc prin înmugurire multilaterală, pot forma miceliu adevărat (cu arthrospori) sau pseudohife. Au o slabă activitate fermentativă; Pichia membranefaciens, stare teleomorfă a drojdiei Candida valida, produce 3° alcool, iar Pichia fermentans până la 7,4° alcool. Sunt drojdii peliculare care prin dezvoltare şi formare de voal produc deprecierea vinului, berii. Se pot izola de pe suprafaţa peştelui şi a creveţilor, din saramura măslinelor conservate şi pot produce alterări ale produselor vegetale murate.

Rhodotorula include celule cu formă oval - cilindrică, care prezintă şi incluziuni intracelulare refringente, de natură lipidică. Sunt drojdii oxidative şi pot sintetiza pigmenţi carotenoizi care imprimă coloniei culoarea roşu-cărămiziu. Rh. glutinis şi Rh. mucilaginosa sunt predominante pe alimente: pui, peşte, creveţi, pe suprafaţa untului şi sunt specii psihrotrofe. Saccharomyces cuprinde 45 de specii cu activitate predominant fermen-tativă. Se înmulţesc prin înmugurire şi sporulare, producând 1-4 ascospori în asce persistente formate direct din celula diploidă. Dintre speciile reprezentative ale genului menţionăm: .. - Sacch. cerevisiae (Hansen), folosită la fabricarea spirtului de fermentaţie şi la obţinerea drojdiei de panificaţie. Celulele au o formă ovală cu dimensiuni medii de (3-7) x (4-14) pm. Fermentează în anaerobioză glucoza, fructoza, galactoza, zaharoza, maltoza şi doar 1/3 rafinoza. Prin fermentare (optimă la 30...32 °C), în lichide formează o spumă persistentă. Din biomasa de celule obţinută în mediul nutritiv şi în condiţii de aerare, prin procedee biotehnologice se pot obţine enzime (invertază), vitamine din grupul B, interferon şi altele; - Sacch. carlsbergensis (uvarum), de formă ovală; în condiţii favorabile, raportul între diametre variază de la 2/1 la 1/1. Se diferenţiază de Sacch. cerevisiae prin faptul că fermentează complet rafinoza şi prin fermentare formează o spumă puţin stabilă. Temperatura optimă de înmulţire este de 30°C; poate produce fermentaţia alcoolică la temperaturi scăzute, de 3... 12°C. Se utilizează industrial la fabricarea berii, iar din drojdia reziduală rezultată după fermentare se pot obţine plasmolizate, autorizate, substanţe de aromă; 12 - Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus (Sacch. vini), de formă elip-soidală cu dimensiuni (3-6) x (6-12) pm, care fermentează: glucoza, fructoza, galactoza, zaharoza, maltoza şi 1/3 din rafinoza. Formează prin fermentare 8,2-16,8% (v/v) alcool etilic. Este sulfitorezistentă şi poate produce fermentaţia alcoolică în medii cu până la 300 mgd"3, S0 total. în mustul de struguri în fermentaţie poate reprezenta 80% din microbiota levuriană. Se poate utiliza în culturi starter pentru vinificaţie; - Sacch. bayanus (var. oviformis şi var.bayanus), care are formă ovoidală cu dimensiuni de (4-7) x (5-10) pm. Fermentează glucoza, fructoza, zaharoza, maltoza şi 1/3-2/3 din rafinoza; produce prin fermentaţie 8,5-18,4% (v/v) alcool etilic. Este sulfitorezistentă. Se utilizează sub formă de culturi pure la fabricarea şampaniei, a vinurilor spumante şi a vinurilor speciale (tip Xeres şi Jura). Saccharomycodes, cu specia Saccharomycodes ludwigii, prezintă forme apiculate sau oval alungite cu dimensiuni până la 20 pm. Fermentează fructoza, glucoza, zaharoza, celobioza şi 1/3 din rafinoza cu formare de 8-9 % (v/v) alcool etilic. Este osmotolerantă şi acidotolerantă. Poate fi agent de alterare a musturilor şi sucurilor de fructe. Saccharomycopsis [Endomycopsis), cu specia importantă Saccharomy-copsis fibuligera, prezintă celule ovale cu dimensiuni de (4-8) x (6-18) pm şi forme filamentoase, ramificate. Fermentează glucoza, zaharoza, maltoza, asimilează amidon, alcool etilic,

acid lactic ş.a.; unele tulpini produc glucoamilază şi se pot folosi pentru obţinerea de drojdii furajere. Schizosaccharomyces cuprinde drojdii de formă cilindrică, ovală, la care, desprinderea celulei nou-formate prin reproducere se face prin sciziune. Schizosaccharomyces pombâ, cu dimensiuni (5-7) x (3-5) pm, este xerofită, rezistentă la conservanti, se dezvoltă rapid la 37°C şi poate produce alterarea siropurilor de zahăr. Torulopsis prezintă celule sferice, ovale sau cilindrice. Specii ale genului întâlnite în mustul de struguri (T. bacillaris, T. stei lata) au putere alcooligenă redusă. Sunt osmotolerante, psihrofile, sulfitorezistente. Pot produce alterări ale laptelui concentrat, ale siropurilor, ale sucurilor. Zygosaccharomyces cuprinde drojdii haploide cu celule ovale, cu proprietăţi fermentative, osmotolerante. 2. rouxii poate creşte în medii cu aw~ 0,62. Pot produce fermentarea mierii, a siropurilor concentrate de zahăr cu formare de alcool etilic, acid acetic, C02. Mucegaiuri (micromicete, fungi filamentoşi) Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricetulare, diferenţiate din punct de vedere morfologic şi care se reproduc prin spori formaţi pe cale asexuată sau pe cale mixtă (asexuată şi sexuată). Răspândire. Mucegaiurile sunt întâlnite în toate habitaturile naturale, datorită capacităţii lor deosebite de adaptare la cele mai diferite condiţii ale mediului ambiant. Sunt înzestrate cu un echipament enzimatic complex, ceea ce le permite utilizarea în nutriţie a compuşilor organici macromoleculari. Sunt puţin pretenţioase: se pot dezvolta în absenţa din mediu a factorilor de creştere şi nu necesită cantităţi mari de apă. Un prim habitat îl constituie stratul superficial al solului, care le asigură condiţii de creştere sau supravieţuire. Prin activitatea lor de degradare a materiei organice nevii, mucegaiurile participă la transformarea unor compuşi organici macromoleculari în compuşi mai simpli şi sunt consideraţi agenţi ai putrezirii reziduurilor vegetale. Din sol, prin intermediul factorilor naturali, sporii de mucegai sunt antrenaţi pe calea aerului la distanţe foarte mari, ceea ce asigură diseminarea nelimitată de graniţe geografice. în aer, mucegaiurile sub formă de spori sau hife vegetative pot supravieţui un timp îndelungat, iar în absenţa curenţilor de aer se depun cu o viteză ce poate atinge valori de 3 cm/s. în funcţie de condiţii, pot să rezistesub formă de spori timp de zeci de ani. 13

în apă, prezenţa mucegaiurilor este ocazională, apa fiind un mediu prin carese poate face răspândirea sporilor. Creşterea mucegaiurilor în ape este dependentă de conţinutul acestora în compuşi organici şi poate avea loc numai în condiţii de aerare.

Mucegaiurile sunt frecvent întâlnite în microbiota plantelor, pe suprafaţa fructelor şi legumelor. în afara mucegaiurilor saprofite-agenţi ai putrezirii, se întâlnesc mucegaiurile patogene care pot parazita plante, animale peşti şi insecte. Mucegaiurile fitopatogene produc boli ale plantelor industriale, ca mălura, rugina, tăciunele ş.a. La om şi la animale, mucegaiurile patogene produc îmbolnăviri denumite micoze, când infectarea se face pe cale respiratorie. Rolul mucegaiurilor în industrie. în afară de rolul important al mucegaiurilor în natură, în industria alimentară culturi selecţionate se pot folosi la fabricarea brânzeturilor tip Roquefort, Camembert sau la maturarea salamurilor crude. Cu ajutorul mucegaiurilor, pe cale biotehnologică, se pot obţine compuşi deosebit de valoroşi: antibiotice (peniciline), acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumărie), vitamine (B2, ergosterol-provitamina D), enzime (amilaze, proteaze, lipaze, invertazâ ş.a.). Mucegaiurile se mai pot folosi pentru îmbogăţirea în proteine a făinurilor vegetale şi ca agenţi de depoluare ai apelor reziduale. Ca aspect negativ, mucegaiurile pot produce degradarea produselor alimentare prin mucegăire, cu modificarea calităţilor senzoriale şi pierderea valorii alimentare. Unele mucegaiuri pot să elaboreze micotoxine. Caractere morfologice. Mucegaiurile se răspândesc în natură prin spori rezistenţi la uscăciune, formă în care se menţin în stare viabilă ani de zile. Dacă un astfel de spor ajunge pe suprafaţa unui mediu favorabil pentru creştere, cu o cantitate suficientă de apă liberă, în primul stadiu are loc absorbţia apei şi activizarea sistemelor enzimatice (34h), apoi germinarea celulei sporale şi formarea tuburilor vegetative numite hife sau taluri. Hifele se extind pe suprafaţa mediului, se diversifică şi îndeplinesc anumite funcţii specializate. Hifele de extindere se pot dezvolta de-a lungul mediului, în spaţiul aerian sau în profunzimea mediului realizând absorbţia nutrienţilor şi au rol de susţinere. La un anumit grad de dezvoltare a hifelor vegetative se formează hifele reproducătoare, generatoare de spori, diferenţiate în funcţie de gen şi specie. Totalitatea hifelor vegetative şi reproducătoare alcătuieşte miceliul. Structură. Mucegaiurile au la bază celula de tip eucariot ce include toate organitele descrise la celula de drojdie. Spre deosebire de drojdii, peretele celular este mai gros şi conţine a- şi 0-glucani. între peretele celular şi membrana citoplas-matică există un spaţiu periplasmic. 14

Celula poate conţine 1-2 nudei cu câte 2-4 cromozomi fiecare. în funcţie de caracterele genetice, mucegaiurile pot fi monocelulare, când se dezvoltă sub forma unei celule uriaşe cu ramificaţii. Acest caz este întâlnit la mucegaiurile inferioare ce au miceliu neseptat sau coenocitic. Alte mucegaiuri denumite superioare sunt pluriceiulare, au peretele celular comun pentru mai multe celule care sunt separate

între ele printr-un perete despărţitor, denumit sept, prevăzut cu un por central prin care se poate face transferul citoplasmatic. Caractere fiziologice. Mucegaiurile sunt microorganisme uşor adaptabile, deoarece au capacitatea de a forma enzime induse în funcţie de natura substratului pe care se află, astfel încât produc degradarea atât a produselor alimentare cât şi a fibrelor textile, a cauciucului, betonului ş.a. în raport cu umiditatea, mucegaiurile sub formă de hife sau spori sunt foarte rezistente şi, în absenţa apei, se menţin în stare latentă de viaţă un timp îndelungat. în raport cu oxigenul, mucegaiurile sunt microorganisme aerobe şi necesită pentru creştere prezenţa oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat în mediu. Un număr limitat de specii sunt microaerofile şi pot produce mucegăirea internă a untului şi a ouâlor. Mucegaiurile se pot dezvolta în limite largi de pH (1,5-9), cu o valoare optimă în domeniul acid, cu pH = 5,5-6. Mucegaiurile sunt microorganisme mezofile cu temperaturi optime de creştere la 25°C. Un număr restrâns sunt termofile, cele patogene având temperatura optimă la 37°C. Altele sunt adaptate la temperaturi scăzute (0...3°C). Rezistenţa termică a mucegaiurilor sub formă de hife sau spori este mică, majoritatea fiind inactivate la temperatura de 80°C. Cei mai rezistenţi spori, aparţinând genului Byssochiamys, sunt distruşi la 88°C, în 10 minute. Reproducerea mucegaiurilor. Mucegaiurile se înmulţesc pe două căi principale: pe cale vegetativă şi prin sporulare. Reproducerea vegetativă se realizează prin intermediul fragmentelor de hife rezultate sub acţiunea unor factori mecanici, atunci când acestea conţin cel puţin o celulă. Fragmentele hifale, chiar dacă conţin mai multe celule, vor forma o singură colonie. Din acest motiv, la determinarea numărului de mucegaiuri din diferite produse, exprimarea se face în unităţi formatoare de colonii - UFC. Creşterea are loc prin extensie la apexul celulei. 15

Timpul de dublare a miceliului ca şi intervalul între cicluri succesive de formare a septului depind de specie şi de condiţii de cultură şi poate dura aproximativ 2 ore (Aspergillus nidulans). Se apreciază că pentru mitoza completă a nucleilor la mucegaiuri sunt suficiente 10 minute (Alternaha, Aspergillus), iar intervalul între mitoza şi apariţia septurilor este de 20-40 minute. Reproducerea prin sporulare este forma cea mai răspândită la mucegaiuri şi poate avea loc numai pe cale asexuată sau pe cale mixtă, respectiv asexuat când mucegaiul prezintă stare anamorfă şi sexuat când se află în starea teleomorfă. Reproducerea pe cale asexuată conduce la formarea sporilor imperfecţi. Dintre tipurile de spori formaţi pe această cale prezintă interes sporangiosporii şi conidiosporii.

Sporangiosporii sunt spori endogeni, haploizi (monocelulari), caracteristici mucegaiurilor inferioare. La maturitate, pe talul coenocitic se formează hifa reproducătoare denumită şi sporangiofor, care se continuă cu o formaţiune cu diametrul mai mare decât al hifei purtătoare, denumită columelă. Prin acumularea de nudei şi în urma procesului de mitoza, sporii rezultaţi se acumulează în exteriorul columelei şi se maturizează în spaţiul dintre columelă şi membrana sporangelui. Sporangele cu columelă este denumit stilosporange. în urma presiunii exercitate prin creşterea în dimensiuni a sporilor sau sub acţiunea unor factori mecanici, membrana sporangelui se rupe şi sporangiosporii se răspândesc în mediul ambiant. Se înmulţesc prin sporangiospori mucegaiurile din genurile Mucor, Rhizopus, Absidia, Thamnidium ş.a. Reproducerea pe cale sexuată; formarea sporilor perfecţi. Calea sexuată de sporulare este întâlnită la mucegaiurile inferioare şi superioare şi reprezintă un criteriu important în clasificarea acestora. Sporii perfecţi rezultaţi în urma unor procese de conjugare, ce au loc mai ales în condiţii naturale, pot fi de mai multe tipuri: oospori, zigospori, ascospori şi bazidiospori. Clasificarea generală a mucegaiurilor. Mucegaiurile reprezintă un grup taxonomic complex, motiv pentru care clasificarea acestora este în continuă transformare. Numărul posibil de specii este apreciat ia aproximativ 250 000. Mucegaiurile de interes alimentar sunt grupate în 20 de genuri şi aproximativ 1000 de specii. Clasificarea are la bază anumite criterii morfologice - structură, caractere coloniale, pigmentogeneză - integrate cu date fiziologice şi genetice. Mucegaiurile fac parte din diviziunea EUMYCOTA sunt micromicete cu plasmodium absent, frecvent şi tipic filamentoase (denumite fungi filamentoşi pentru a fi diferenţiaţi de drojdii care sunt incluse în aceeaşi diviziune) şi sunt clasificate în subdiviziuni, clase, ordine şi genuri conform tabelului următor. 16

Clasificarea selectivă a mucegaiurilor după Hawksworth ş.a., I986 Subdiviziunea 1 Mastigomycotina Phvtlum. Zygomycotina Clasa 2 Oomycetes Zygomycetes 3 Ordinul Genul 4 Achiya, Phytophtora,

Mucorales Absidia, Blakeslea, Mucor, Phycomyces, Rhizomucor, Rhizopus, Thamnidium Entomophthora

Ascomycotina (Ascomycetes)

Basidiomycotina (Basidiomycetes) Plectomycetes (Plectascales) Pyrenomycetes Hemiascomycetes Discomycetes

Hemibasidiomycetes (Teliomycetes) Eurotiales Sphaeriales Clavicipitales Hypocreaies Endomycetales Pezizales Uredinales Ustilaginales Byssochiamys, Emerlcella, Eupenicilium, Eurotium, Monascus, Neosarîorya, Petromyces, Talaromyces, Neurospora Claviceps, Gibberella Eremothecium, Ashbya Morchella, Tuber Puccinia Ustilago Deuteromycotina (Deuteromycetes fungi imperfecţi) Coelomycetes Hyphomycetes Moniliales Colletotrichum, Geotrichum, Aureobasidium, Aspergillus, Aliemaria, Curvularia, Cladosporium, Fusarium, Gliocladium, Moniilia, Paecilomyces, Peniciilium, Stachybotris, Trichoderma, Trichothecium, Verticillium Descrierea mucegaiurilor cu importanţă în industria alimentară. Din microbiota produselor alimentare, se vor descrie principalele caractere de gen şi specie care să permită recunoaşterea mucegaiurilor descrise în clasificare. Absidia. Prezintă sporangi mici cu columelă de formă conică. Sporangioforul are la capăt o apofiză largă sub care se observă un sept. Unele specii sunt termofile şi produc îmbolnăviri la animale şi la om. Poate produce mucegăirea porumbului şi elaborează toxine. 17

Alternaria. Formează colonii pufoase cu miceliu septat şi conidii mari cu septuri longitudinale şi transversale - porospori. Produc putrezirea brună a fructelor, cum ar fi mere, smochine, şi putrezirea neagră a fructelor citrice. Este considerat mucegai de câmp şi este prezent pe suprafaţa seminţelor proaspăt recoltate, fiind folosit ca indice de prospeţime al cerealelor. Aspergillus (132 specii). Cuprinde numeroase specii cu importanţă biotehnologică. Se caracterizează prin formarea de conidiofori drepţi, neramificaţi care poartă capul conidial alcătuit dintr-un suport anatomic denumit veziculă, pe care se dezvoltă celulele conidiogene, respectiv fialide, generatoare de lanţuri lungi de fialospori. Fialidele se pot dezvolta pe toată suprafaţa veziculei sau numai în partea superioară, fie într-un singur strat - fialide primare, fie în două straturi suprapuse - fialide primare sub forma unor celule lungi şi groase şi fialide secundare, mai scurte şi subţiri. Conidiosporii au forma rotundă, elipsoidală sau ovală şi formează lanţuri lungi care se pot interconecta prin intermediul unor punţi plasmatice. Capul conidial are forma sferică, atunci când fialidele cresc pe toată suprafaţa fertilă a veziculei, sau forma columnară, atunci când vezicula este fertilă numai în partea sa superioară, şi poate fi observat macroscopic la unele specii. Din punct de vedere taxonomic, speciile genului Aspergillus sunt divizate în 18 grupe ce includ specii cu caractere înrudite şi care poartă denumirea speciei tip. Grupele mari pot fi divizate în serii. Speciile mai importante ale genului sunt: - A. niger, care formează colonii radiale de culoare brun-negru. Prezintă conidiofor cu cap conidial sferic şi două rânduri de fialide dispuse pe toată suprafaţa veziculei. Numeroase tulpini selecţionate sunt folosite pentru obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, glucozoxidaze, invertaze, enzime pectolitice sau pentru obţinerea acizilor organici: acid citric, acid lactic; -A. oryzae, care formează colonii de culoare bej-oranj cu conidiofori drepţi şi cap conidial sferic, cu un singur rând de fialide. Este numit, pe drept cuvânt, „arsenalul enzimelor", deoarece se cunosc peste 200 de enzime elaborate de mucegai şi obţinute în stare purificată. Este folosit pentru obţinerea de enzime amilolitice - tip koji, pentru zaharificarea plămezilor amidonoase din orez şi pentru obţinerea unor băuturi fermentate - sake. Pentru obţinerea de amilaze (alfa-amilaze şi glucoamilaze) mai pot fi folosite speciile: A. awamori, A. phoenicis,A usamii, A. cinnamommeus ş.a.; - A.flavus, care formează colonii de culoare alb-gălbui, la maturitate galben- verzui spre brun cu revers colorat în galben-brun. Capul conidial este tipic radial, uneori columnar. Fialidele sunt uniseriate sau biseriate, cu diferenţe mari în formă şi dimensiuni. Fialosporii sunt piriformi sau globoşi, galben-verzui, rugoşi. Este răspândit în sol, pe produse vegetale şi are capacitatea de a produce aflatoxine (micotoxine) cu efect cancerigen. Botrytis (Botryotinia). Formează colonii extinse, pâsloase, de culoare cenuşie. Conidioforii poartă terminal un mănunchi de ramuri scurte purtătoare de botrioblastospori de formă elipsoidală. B.cinerea este denumit mucegaiul cenuşiu şi poate produce, în funcţie de condiţii, putrezirea vulgară sau nobilă a strugurilor. Specii fitopatogene ale genului dau boli la floarea-soarelui şi alterări în depozit ale fructelor şi legumelor.

Byssochlamys. Se caracterizează prin formarea de asce cu 8 ascospori termorezistenti şi produce alterarea alimentelor conservate cu acizi. B. fulva şi B. nivea produc alterarea conservelor de fructe. Este forma teleomorfă a unor specii de mucegaiuri, incluse în genul Paecilomyces, întâlnite rar pe alimente. 18

Cladosporium. Formează colonii cu aspect catifelat, de culoare brun-oliv cu revers colorat în bleumarin-negru. Se reproduc prin blastospori cu o formă de lămâie. CI. herbarum poate forma pete inestetice pe carcase de carne şi produce mucegăirea untului şi margarinei. Este prezent în microbiota cerealelor proaspăt recoltate. Este agent al putrezirii negre a strugurilor şi pepenilor galbeni. Eurotium. Include starea perfectă-teleomorfă a mucegaiurilor din grupul Aspergillus glaucus. Produc cleistotecii galbene cu ascospori. E. herbariorum este xerofit şi poate produce alterarea gemurilor şi a jeleurilor. Fusarium. Include specii saprofite răspândite în sol şi specii patogene parazite ale plantelor superioare. Se reproduc prin conidiospori monocelulari (microconidii) şi pluricelulari (macroconidii) cu caractere distinctive, în funcţie de specie. Specii ale genului: F.graminearum, F.moniliforme, F. tricinctum, F. nivali ş.a. produc putrezirea brună a fructelor citrice, putrezirea umedă a smochinelor, mucegăirea cerealelor (orz, grâu) cu producerea de micotoxine (trichothecene). Geotrichum. Formează colonii extinse, catifelate, de culoare albă. Produce miceliu septat din care se separă arthrospori, ce au tendinţa de aranjare în zigzag. G. candidum este întâlnit în industria laptelui şi la fabricarea pastei de tomate, drept contaminant al utilajelor (mold-machine). G. albidum produce putrezirea fructelor citrice, a caiselor, alterarea smântânii. Monascus, cu specia M. ruber, este folosit pentru obţinerea de coloranţi roşii de uz alimentar. Mucor (88 specii). Se caracterizează prin formarea de sporangiospori în stilosporange. La maturitate, prin ruperea membranei şi eliberarea sporilor, rămâne, la baza columelei, un collar. Sporangioforii pot fi repartizaţi de-a lungul hifelor vegetative, monopodial, simpodial sau dichotomic. în funcţie de specie, columela poate avea dimensiuni şi forme diferite. Dintre speciile mai importante ale genului menţionăm pe: M. mucedodenumit şi mucegaiul alb al pâinii; M. racemosus - agent de putrezire a fructelor şi legumelor; M. pussillus şi M. miehei - specii selecţionate pentru obţinerea de proteaze cu acţiune similară cu cea a cheagului animal, folosite la fabricarea brânzeturilor. Penicillium (4â3 specii). Se caracterizează prin formarea unui aparat reproducător ramificat alcătuit din ram, metule, fialide şi fialospori, cu diferenţieri morfologice în funcţie de specie. în cadrul genului, specii selecţionate sunt folosite la: obţinerea brânzeturilor cu pastă albastră - P. roqueforti; obţinerea brânzeturilor cu pastă moale - P. camemberti; maturarea salamurilor crude uscate - P. nalgiovense. Pentru obţinerea de antibiotice din grupa penicilinelor se folosesc tulpini de P. notatum şi P.

chrysogenum. Numeroase specii: P. expansum, P. islandicum, P. citrinum ş.a.sunt agenţi de putrezire şi pot produce micotoxine. Rhizopus (11 specii). Se caracterizează prin stilosporange de dimensiuni mari, cu columela semisferică, fără collar după ruperea membranei sporangelui. Sporangioforii se dezvoltă în mănunchi dintr-un punct în care se dezvoltă rhizoizi-hife de susţinere cu rol absorbant. Extinderea coloniei are loc rapid, ca urmare a formării unor lăstari micelieni denumiţi stoloni. Specia cea mai răspândită pe toate produsele alimentare este Rh. stolonifer (sin. Rh. nigricans) - agent de mucegăire a fructelor şi legumelor; unele tulpini selecţionate pot fi folosite pentru obţinerea pe cale fermentativă a acidului fumărie. împreună cu Rh. oryzae şi Rh. delemar, producătoare de amilaze, se pot folosi la obţinerea unor produse fermentate de tip tempeh şi arrak pe bază de cereale. Thamnidium. Se caracterizează prin formarea de sporangiofori terminaţi cu un stilosporange mare sub care se dezvoltă sporangiofori scurţi purtători de sporangioli (fără columela şi cu un număr mic de sporangiospori). Th. elegans produce mucegăirea produselor conservate prin refrigerare. Trichoderma. Formează colonii extinse, pufoase sau pulverulente, de culoare gălbui spre verde. Conidiosporii se formează pe fialide în formă de sticlă şi cresc pe ramuri laterale, în mănunchi. Formează, frecvent, chlamidospori elipsoidali, hialini. T. reesei (viridae) produce activ celulaze şi un antibiotic - gliotoxina - cu efect fungistatic faţă de mucegaiurile care produc putrezirea lemnului. 19

Trichothecium. Formează colonii cu aspect pufos, de culoare roz-portocaliu. Se reproduce prin conidiospori bicelulari (aleuriospori). Dintre cele 4 specii ale genului, T. roseum este cel mai frecvent întâlnit pe suprafaţa boabelor de cereale: grâu, orz, porumb, reziduuri vegetale, ca agent al putrezirii fructelor (pepene galben). Bacterii Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii între 0,5 şi 8 ym, care se înmulţesc asexuat prin sciziune binară, izomorfă. Răspândire. Bacteriile sunt microorganisme cu o largă răspândire în natură, ca rezultat al adaptării lor în cursul procesului de evoluţie. Rezervorul natural al bacteriilor este solul în care concentraţia de celule poate ajunge la valori de 107-109 g"1 atât în straturile superficiale (bacterii aerobe) cât şi în straturile de profunzime (bacterii anaerobe). Din sol, bacteriile s-au adaptat să trăiască în ape, unde concentraţia de celule poate fi de la 10 cm"*3 în apa de izvor, până la valori de 1012 cm"3, de exemplu, în ape fecalo-menajere. Bacteriile se pot întâlni la adâncimi mari în apa mărilor şi oceanelor, în

ape termale. Existenţa în aer a bacteriilor este temporară şi prin intermediul curenţilor de aer sunt răspândite la distanţe foarte mari. Din aer sunt antrenate din nou în sol, prin intermediul precipitaţiilor atmosferice. Bacteriile fac parte din microbiota naturală a plantelor şi animalelor. Din sol, prin creşterea plantelor, bacteriile ajung la suprafaţa acestora şi se menţin în stare activă, până când condiţii favorabile le permit creşterea şi reproducerea. în organismul animal există o microbiota bacteriană intestinală cu rol important în transformarea bolului alimentar şi în imunitatea organismului; la animalele erbivore, bacteriile anaerobe din rumen contribuie la degradarea fibrelor celulozice în procesul de nutriţie. Din organismul animal, bacteriile se elimină în mediul ambiant prin intermediul materiilor de dejecţie. Rolul bacteriilor în natură şi în industrie. în condiţii naturale, bacteriile au un rol imens în transformarea compuşilor macromoleculari în compuşi simpli, prin mineralizarea materiei organice nevii, contribuind astfel la realizarea naturală a circuitului unor elemente de importanţă vitală: carbon, azot, sulf, fosfor, fier ş.a. Datorită activităţii microorganismelor din sol se formează rezerva de substanţe nutritive - humusul, necesar pentru dezvoltarea plantelor. Pe drept cuvânt se consideră că, fără activitatea bacteriilor, „pământul s-ar transforma treptat într-un uriaş cimitir^. în industria alimentară, bacterii lactice selecţionate sunt folosite în calitate de culturi starter la fabricarea produselor lactate acide şi a brânzeturilor, în industria panificaţiei, la conservarea legumelor, măslinelor, furajelor verzi ş.a. Bacteriile propionice se folosesc la fabricarea brânzeturilor tip şvaiţer, deoarece prin fermentare produc acid propionic şi C02> responsabil pentru desenul caracteristic al acestor produse. Bacteriile acetice sunt folosite la obţinerea industrială a oţetului. Pe căi biotehnologice, folosind culturi bacteriene selecţionate sau mutanţi ai acestora, se obţin produse cu o mare valoare economică, de exemplu: enzime, proteine, aminoacizi, acid lactic, acid acetic, solvenţi (acetonă.alcool izopropilic, alcool 20

butilic), hormoni (insulina produsă de un mutant de Escherichia coli), îngrăşăminte biologice (genul Azotobacter), insecticide biologice (Bacillus thuringiensis), antibiotice (Streptomyces sp.), vitamine (Propionibacterium shermanii- vitamina B12) ş.a. în acelaşi timp, trebuie subliniate şi unele aspecte negative ale activităţii bacteriilor. Astfel, în industria alimentară, bacteriile pot produce alterarea produselor alimentare (acrirea berii, vinului, putrefacţia cărnii ş.a.) - Un grup de bacterii care poate creşte pe alimente produce toxine de natură proteică, încât prin ingerarea alimentelor contaminate se produc stări de toxiinfecţii alimentare. Alte bacterii patogene sunt adaptate să infecteze organismele vii şi dau îmbolnăviri grave (tuberculoză, febră tifoidă, dizenterie, sifilis, bruceloză, antrax ş.a., bacterioze la plante).

Caracterele morfologice ale bacteriilor. Bacteriile prezintă forme celulare foarte diversificate şi anume forme de bază, monocelulare, precum şi forme derivate ale acestora, ce rezultă în urma asocierii stabile a celulelor rezultate prin reproducere. Dintre formele de bază se disting următoarele: - sferică - denumită coccus, în care sfera este perfectă (micrococi) sau ovalară (enterococi), lanceolată (pneumococi) sau reniformă (gonococi); - bacilară-cilindrică, denumită şi bacterium; - ralate-elicoidale, specifice bacteriilor patogene care pot fi: forma vibrio (la genul Vibrio comma - gentul holerei), forma spirillum, sub forma unor filamente rigide cu spire largi, forma spirocheta, sub forma unor filamente flexibile cu mai multe spire (la agentul sifilisului); - lamentoase, caracteristice bacteriilor miceliene cu habitatul în sol şi în ape (actinomicete; chlamydobacterii ş.a.). Structura celulei bacteriene. Bacteriile au celula de tip procariot, mai simplificată decât celula eucariotă. Principalele diferenţe constau în faptul că celula are un singur cromozom amplasat într-un nucleoid lipsit de membrană nucleară şi nu conţine organite detaşate de membrană. Părţile componente ale celulei bacteriene sunt: peretele celular şi structurile extraparietale, membrana plasmatică, citosolul şi structuri din citosol: ucleoid, ribozomi, vacuole de gaz, mezozomi. Membrana plasmatică. Situată în interiorul peretelui celular, membrana piasmatică are o structură lipoproteică, o grosime de 5-10 nm şi este alcătuită din straturi de fosfolipide în care sunt situate proteine integrate şi proteine globulare. Membrana plasmică are un rol vital, deoarece reţine citosolul la bacterii lipsite de perete celular. Este o barieră osmotică ce dă o permeabilitate selectivă celulei; la nivelul său sunt localizate enzime care asigură transportul activ al nutrienţilor în celulă şi receptori chimici. Matricea citoplasmatică reprezintă substanţa cuprinsă între membrana plasmatică şi nucleoid. Conţine, în stare solubilă sau gel, substanţe organice şi anorganice. Incluziunile organice pot fi reprezentate de glicogen (substanţă de rezervă în celulă ce poate fi folosită ca sursă de energie) şi p-hidroxibutirat. Incluziunile anorganice cuprind polifosfaţi (incluziuni de volutină), incluziuni de sulf sau de mâgnetit. 21

Dintre structurile interne ale citosolului fac parte: - zozomii sau corpii membranoşi, care rezultă prin invaginări ale membranei plasmatice şi au un rol funcţional important în creşterea suprafeţei şi în diviziunea celulară. Contribuie la sinteza peretelui celular, în procese secretorii ale metaboliţilor şi în procesul de respiraţie; - cuolele de gaz, care au un perete rigid, alcătuit din proteine cu molecule mici, permeabil la gaz şi impermeabil la apă;

- bozomii, care sunt alcătuiţi din molecule de ARN şi proteine, au dimensiuni mai mici decât la eucariote şi pot fi localizaţi fie în zona membranară fie în matrice, alcătuind reticulul ribozomal; - cleoidul sau materialul nuclear, care reprezintă o zonă din matricea citoplasmatică în care este localizat cromozomul bacterian format din ADN dublu spiralat, nucleoproteide şi cantităţi mici de ARN. Molecula de ADN are un număr mare de nucleotide, care pot alcătui aproximativ 1000 de gene ce pot transmite tot atâtea caractere genetice. în bacterii de dimensiuni mari se poate întâlni ADN extracromozomial, în plasmide cu rol în tehnici de inginerie genetică. Peretele celular. Are o mare diversitate structurală ce influenţează comportarea celulelor la diferite condiţii de mediu şi condiţionează afinitatea tinctorială a bacteriilor. încă din 1884, Christian Gram a constatat că bacteriile reacţionează diferit atunci când se aplică aceeaşi tehnică de colorare şi pune baza metodei diferenţiale de colorare ce îi poartă numele, prin care bacteriile sunt împărţite în două mari grupe: bacterii Grampozitive şi bacterii Gram-negative. Peretele celular asigură forma (rigiditatea) celulei şi protecţia faţă de liza osmotică sau de prezenţa unor substanţe toxice, antibiotice ş.a. Structuri extraparietale. La unele bacterii în exteriorul peretelui celular se află o structură complexă de natură piloglucidică denumită glicocalix, care extinde suprafaţa celulei şi favorizează aderenţa bacteriilor în condiţii naturale, la suprafaţa diverselor materiale. Diferitele tipuri de glicocalix pot aparţine următoarelor categorii: stratul S - format din şiruri regulate de subunităţi glicoproteice, şi capsula - ormată dintr-o matrice fibroasă. Capsula poate fi rigidă, flexibilă sau integrată prin asociere cu suprafaţa periferică. în timp ce capsula este uniform repartizată pe suprafaţa celulei, stratul mucos se prezintă sub forma unei mase neorganizate de materie. La bacteriile acetice, de exemplu, stratul mucos leagă prin fibrile extracelulare mai multe celule şi poartă denumirea de masă zoogleică. Capsula şi stratul mucos sunt componente inerte rezultate din metabolismul celulei care îi asigură protecţie la desicaţie, iar în cazul bacteriilor patogene le măreşte rezistenţa la acţiunea fagocitelor. La unele bacterii se mai pot întâlni următoarele formaţiuni: - flageli (cili), care sunt organite de locomoţie prezente sub forma unor filamente, cu lungimea de 12-25 pm, la bacteriile mobile. Deplasarea celulei se produce prin rotirea flagelului în jurul axului ca o elice, propulsând celula; - fimbri (pili), care sunt structuri pericelulare sub forma unor tuburi subţiri din proteine aranjate helicoidal. Au rol în ataşarea bacteriilor şi în formarea de pelicule; - spini - structuri rigide (1 -15 /celulă), întâlnite la bacteriile Gram-negative. Caractere morfologice coloniale. Mediul de bază pentru cultivarea bacteriilor întâlnite pe produse alimentare şi folosit în practică este bulionul de carne lichid (BCL) sau solidificat cu agar-agar (BCA). Prin reproducere, dintr-o celulă de bacterie, aflată 22

pe mediu nutritiv solidificat, ia naştere o clonâ sau o colonie alcătuită din biomasă de celule rezultate prin sciziune din celula unică. în cazul bacteriilor sunt întâlnite colonii aparţinând următoarelor tipuri: - colonii de tip S („smooth" - neted lucios); - colonii de tip R („rough" - rugos, aspru, zbârcit); - colonii de tip M, cu consistenţă mucoidă, gelatinoasă, formate de către bacterii producătoare de capsule. Pe BCA, coloniile devin vizibile după 24-48 ore şi pot avea culori diverse (alb, alb-crem, galben-auriu, oranj-roşu, albastru, fluorescentă), caractere macro-scopice importante în identificare. Prin cultivare în medii nutritive lichide, bacteriile pot da tulburare şi sediment, în cazul bacteriilor anaerobe şi facultativ anaerobe, sau pot să formeze la suprafaţa lichidelor voal caracteristic, fragil, cutat sau gelatinos, în cazul bacteriilor aerobe (acetice). Caractere fiziologice generale ale bacteriilor. Bacteriile se caracterizează prin complexitate metabolică, având o mare capacitate de adaptare. Sunt răspândite pe cele mai diverse medii, ca urmare a producerii de enzime inductive, care le permit utilizarea în nutriţie a compuşilor organici macromoleculari (celuloză şi alte poliglucide, protide, lipide). în raport cu temperatura, bacteriile se dezvoltă într-un domeniu larg, -10°C şi +90°C; majoritatea bacteriilor-agenţi de alterare a alimentelor sunt bacterii mezofile şi dau alterări la temperatura camerei (bacterii de putrefacţie). Bacteriile, în forma vegetativă sunt inactivate pe cale termică la temperaturi de pasteurizare, iar sub formă de endospori, la temperaturi de sterilizare. In raport cu oxigenul, majoritatea bacteriilor sunt aerobe (bacterii acetice), altele care cresc în semiaerobioză (bacterii lactice), iar un grup restrâns de bacterii sunt adaptate să crească în strictă anaerobioză (bacterii butirice). Bacteriile se pot dezvolta în domeniu de pH = 1 - 11, cu zone optime la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice, lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefacţie. Creşterea şi reproducerea bacteriilor. în condiţii favorabile de viaţă, în prezenţa mediului nutritiv, bacteriile reacţionează rapid şi are loc creşterea, proces prin care se produce mărirea coordonată a tuturor componentelor celulei, rezultată prin adăugarea de substanţă nou-formată prin biosintezâ. în cazul în care prin creştere se produce o modificare în raportul optim stabilit genetic între suprafaţa care asimilează şi volumul care acumulează, se declanşează reproducerea prin sciziune, care va restabiji raportul vital. în prima etapă, o dată cu biosintezâ componentelor celulare, are loc replicarea cromozomului bacterian, dublarea numărului de mezozomi care vor lega moleculele de ADN şi printr-un proces de cariochineză acestea vor fi deplasate spre polii celulei. în zona mediană începe biosintezâ unui perete despărţitor, încât celula parentală se regăseşte în cele două celule rezultate prin sciziune, celule identice ca formă, dimensiune şi structură genetică. în urma reproducerii, celulele nou-formate se pot separa sau pot rămâne asociate pe direcţia axei de sciziune, cu obţinerea următoarelor forme derivate, care dau uneori denumirea genului:

- a forma coccus prin sciziune într-un singur plan se formează diplococi şi prin sciziune repetată se formează lanţuri de coci cu denumirea de streptococi; - dacă sciziunea are loc succesiv în două plane perpendiculare, între ele rezultă prin asociere formaţiuni cu câte patru coci denumite tetrade (genul Pediococcus). 23

în endospor au loc importante modificări de compoziţie şi activitate metabolică comparativ cu celula vegetativă, înainte de sporulare. Din punct de vedere fizic, endosporui ocupă 1/7-1/17 din volumul celulei vegetative, iar masic aproximativ 1/3 din cea a celulei producătoare. în endospor, cantitatea de apă se reduce de la 80 la-15%. Forma în care se găseşte apa în endospor este cea de. apă legată de diferite componente structurale, apă care nu favorizează reacţiile biochimice. Datorită lipsei de apă liberă, enzimele sporale sunt inactive, iar din punct de vedere metabolic endosporui se află în stare de anabioză. în endospor este prezentă în concentraţie ridicată o substanţă specifică - acidul dipicolinic (10 %/s.u.), care prin cele două grupări carboxilice formează cu uşurinţă chelaţi cu ionii de calciu şi magneziu. Se consideră că aceste modificări arhitecturale în structura sporoplasmei contribuie la proprietăţile deosebite ale bacteriilor sporogene. O proprietate remarcabilă a endosporilor este termorezistenţa. în timp ce celula vegetativă este inactivată termic la temperaturi de 80°C/1-5 min, ca urmare a denaturării proteinelor/enzimelor din citosol, sub formă de endospori inactivarea poate avea loc la temperaturi de 120°C/10-20 min, în mediu umed, sau la 180°C/45-60 min, în mediu uscat. Termorezistenţa este explicabilă prin conţinutul redus în apă, prezenţa proteinelor cu sulf şi a acitlului dipicolinic, compuşi care protejează enzimele sporale, în anumite limite, de o inactivarea ireversibilă. O altă proprietate importantă este rezistenţa la uscăciune, deoarece în stare de anabioză, deşi în stare inactivă, enzimele îşi menţin calitatea de biocatalizatori un timp îndelungat, prelungind starea latentă de viaţă a celulelor sporale (zeci/sute de ani). în condiţii favorabile sau prin reactivare prin încălzire la 60°C/10 min, are loc germinarea sporilor. Se produce o absorbţie a apei, are loc activarea enzimelor, creşte activitatea de respiraţie şi fermentaţie şi sunt eliminate substanţe specifice cum ar fi acidul dipicolinic şi unele peptide. Se formează tuburi germinative în poziţie polară şi celula vegetativă rezultată are caracterele genotipice originare. Sporularea reprezintă un caracter de specie, este o formă de diferenţiere celulară şi trebuie privită ca o strategie de adaptare a procariotelor, deoarece sporii sunt forme de rezistenţă ce păstrează caracterele genetice ale celulei sporogene. Clasificarea generală a bacteriilor. Clasificarea de bază, folosită în prezent, aparţine lui Bergey, iar bacteriile sunt grupate în 10 ordine şi 47 familii (1952); această clasificare a fost modificată în 1984 după criterii morfologice, prin care bacteriile sunt reîmpărţite în 33 de secţiuni. în continuare, în mod selectiv, se vor trece în revistă principalele ordine, familii şi genuri cu importanţă practică.

în clasificarea generală a microorganismelor, bacteriile sunt incluse în regnul PROCARIOTAEcu două diviziuni: - diviziunea SCOTOBACTERIA, în care sunt cuprinse bacterii chimiosin-tetizante, ce folosesc pentru creştere şi multiplicare energia rezultată din reacţii chimice; - diviziunea PHOTOBACTERIA, care cuprinde bacterii ce conţin pigmenţi similari clorofilei şi care pot folosi energia luminoasă în procese de biosinteză celulară. în diviziunea Scotobacteria bacteriile sunt clasificate în trei clase: A. clasa BACTERIA - ce include bacterii chimiosintetizante propriu-zise; B. clasa ACTINOMYCES - care cuprinde bacterii filamentoase; C. clasa MOLICUTES (Mycoplasma) - cu bacterii lipsite de perete celular, patogene. 24

în tabelul următor. se prezintă cele mai importante genuri de bacterii din clasele Bacteria şi Actinomyces. Clasificarea bacteriilor din clasa Bacteria şi clasa Actinomyces A. Clasa BACTERIA Ordine Pseudomonadaies Spirillaceae Familii Genuri importante

Pseudomonadaceae Nitrobacteriaceae Thiobacteriaceae

Eubacteriales Achromobactehaceae Azotobacteriaceae Bacillaceae Enterobactehaceae Lactobacillaceae Micrococcaceae Propionibactehaceae PseudomonastAcetobacterf Xantomonas, Zymomonas Nitrobacter, Nitrosomonas Thiobacillus Cellvibrio, Cellulomonas Achromobacter.Alcaligenes, Flavobacterium Azotobacter Bacillus, Clostridium Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc Micrococcus, Sarcina, Staphylococcus Propionibactehum

B. Clasa ACTINOMYCES

Actinomycetaies Mycobaeteriaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae Mycobacterium Actinomyces Streptomyces Ricketsiales Ricketsia, Coxiella

A. Clasa BACTERIA cuprinde mai multe ordine, familii, respectiv genuri. Ordinul Pseudomonadaies cuprinde bacterii Gram-negative, cu habitat în sol şi ape, aerobe, nesporulate, în care sunt incluse familiile prezentate în continuare: Familia Pseudomonadaceae cuprinde bacterii Gram-negative, nesporulate. Familia Nitrobacteriaceae include bacterii care produc oxidarea compuşilor cu azot rezultaţi din putrefacţie, cu transformarea azotului amoniacal în azotiţi şi azotaţi, formă asimilabilă de către plante. Familia Thiobacteriaceae cuprinde bacterii-agenţi ai coroziunii biologice care produc oxidarea compuşilor cu sulf. Familia Spirillaceae cuprinde bacterii care produc degradarea celulozei în condiţii aerobe. Ordinul EUBACTERIALES cuprinde bacteriile propriu-zise, foarte răspândite, de formă coccus, bacterium şi forme derivate rezultate prin sciziune. Din acest ordin fac parte familiile prezentate în cele ce urmează: Familia Achromobacteriaceae cuprinde bacterii nesporulate Gram-negative, care produc putrefacţie. 25

Familia Azotobacteriaceae cuprinde bacterii care folosesc azotul atmosferic în nutriţie; au rol în circuitul natural al azotului şi sunt folosite pentru obţinerea de îngrăşăminte biologice - {Azotobacter chroococcum). Familia Bacillaceae cuprinde bacterii sub formă de bastonaşe, Gram-pozitive, producătoare de endospori. Familia Enterobacteriaceae cuprinde bacterii Gram-negative, nesporulate, aerobe/facultativ anaerobe, patogene/facultativ, cu habitatul în tractul digestiv. Familia Lactobacillaceae cuprinde bacterii (lactice) Gram-pozitive, nesporu-late, facultativ anaerobe, sub forma de bacili sau forme derivate de la coccus. Caracterul fiziologic comun este capacitatea de a fermenta lactoza cu formare de acid lactic. Familia Micrococcaceae cuprinde bacterii Gram-pozitive, cu forma coccus sau forme derivate prin sciziune. Familia Propionibacteriaceae cuprinde bacterii nesporulate Gram-pozitive, care produc fermentaţia propionică. B. Clasa ACTINOMYCES cuprinde două ordine mai importante.

Ordinul Actinomycetales cuprinde bacterii filamentoase, Gram-pozitive, saprofite sau facultativ patogene, folosite industrial pentru obţinerea de substanţe biologic active. Familia Mycobacteriaceae cuprinde bacterii patogene (M. tuberculosis). Familia Actinomicetaceae cuprinde bacterii patogene pentru animale/plante. Au rol în formarea humusului şi în închiderea la culoare a solului. Familia Streptomicetaceae cuprinde bacterii filamentoase producătoare de antibiotice, enzime. Principalele genuri cu importanţă pentru industria alimentară sunt următoarele: - Acetobacter - bacterii acetice care produc oxidarea alcoolului etilic şi se folosesc la fabricarea acidului acetic de fermentaţie; - Acinetobacter - bacterii sub formă de bastonaşe, Gram-negative, strict aerobe, răspândite în sol, ape, alimente proaspăt refrigerate (denumiri sinonime: Moraxella, Psyhrobacter); - Achromobacter - care produc amine biogene toxice prin degradarea protidelor. Sunt bacterii aerobe şi produc alterarea produselor refrigerate; - Aeromonas - bastonaşe Gram-negative cu habitatul în microbiota intestinală a peştilor. Produc gaze prin fermentarea glucidelor; - Alcaligenes - care produc reacţie alcalină în lapte litmus, sunt nepigmentate. Pot fi întâlnite în lapte, pe carne de pui, de peşte, şi pe materii fecale; - Alteromonas - bastonaşe mobile, Gram-negative, strict aerobe, cu habitat în ape marine, care necesită sare pentru creştere; - Bacillus (28 specii) - bacterii de putrefacţie aerobe sporogene. Unele specii selecţionate se folosesc pentru obţinerea de enzime: amilaze şi proteaze; - Brochothrix - bacterii Gram-pozitive sub formă de bastonaşe scurte, cocoide. B. thermosphacta şi B. campestris se întâlnesc pe carne proaspătă, păstrată în condiţii de refrigerare; - Campylobacter - bastonaşe curbate sau spiralate, microerofile/anaerobe; în clasificările anterioare erau incluse în genul Vibrio. - Carnobacterium - bacterii sub formă de bastonaşe, Gram-pozitive, catalazo-negative, anterior asociate cu lactobacilii. Sunt heterotrofe, cresc bine la 0°C şi nu cresc la 45°C. Specii: C. divergens, C. piscicola, C. gallinarium; - Cellulomonas - bacterii folosite la prelucrarea deşeurilor de hârtie pentru obţinerea de proteină bacteriană folosită în scop furajer; 26

- morfogeneza, etapa de asamblare prin care moleculele de acid nucleic viral sunt înconjurate de unităţile protomere; - eliberarea particulef virale, care se poate face prin: exocitoză, transport prin locusuri ale celulei, sau liza peretelui celulei parazitate. Particulele virale mature (denumite virioni) pot să continue infecţia celulelor adiacente din ţesutul viu şi are loc fie distrugere acestuia, fie o creştere anarhică, anormală, ce conduce la formarea tumorilor.

Procesul de infecţie se opreşte când ţesutul este distrus sau când intervine un factor de inhibare a ciclului litic viral. Un succes al biotehnologiei este obţinerea prin inginerie genetică a interferonului, substanţă care inhibă adsorbţia şi transmiterea unor virusuri. Unele virusuri pot avea concomitent un ciclu lizogenic, având capacitatea să se integreze în cromozomul celulei atacate, care se va reproduce normal, până când un factor favorizant va elibera acidul nucleic viral ce va induce etapele ciclului litic . Fagii Fagii sunt virusuri care parazitează celule microbiene şi, în funcţie de natura celulelor parazitate, se cunosc bacteriofagi şi micofagi. Bacteriofagii. Sunt virusuri adaptate să paraziteze celula procariotă şi au fost puşi în evidenţă de către F. Twort (1915) şi d'Herelle (1917). Răspândire şi rol. Bacteriofagii pot face parte din microbiota intestinală şi se elimină prin materii de dejecţie. în condiţii naturale, bacteriofagii au un rol ecologic important, ca agenţi de depoluare a apelor fecalo-menajere. în industria alimentară, bacteriofagii pot contamina şi distruge culturi de bacterii lactice. Din acest motiv sunt folosite culturi starter lizorezistente. în ingineria genetică, bacteriofagii sunt folosiţi pentru transfer de gene şi obţinerea de tulpini bacteriene modificate genetic. Structura. Bacteriofagii sunt formaţi dintr-o capsidă cu contur hexagonal, care închide genomul. în interiorul capului hexagonal se află o moleculă de ADN dublu catenar, împachetată în molecule de proteine şi poliamine. în continuarea capului se află un disc şi un cilindru axial (coada bacteriofagului), gol în interior, alcătuit din 24 de inele-capsomere. Acestea alcătuiesc teaca contractilă a cozii, care, prin contracţie, îşi reduce lungimea la 1/2. Cilindrul axial se termină cu o placă bazală prevăzută cu un orificiu central şi cu 6 croşete - unităţi de fixare a bacteriofagului pe celula bacteriană receptivă Infecţia cu bacteriofag are loc în următoarele etape: - adsorbţia, care se produce prin ciocniri întâmplătoare ale bacteriofagilor cu celulele bacteriene, până când aceştia ajung pe un situs receptor al peretelui bacterian (de exemplu, acizii teichoici la bacteriile Gram-pozitive, lipopoliglucidele la bacteriile Gram-negative); - fixarea, care se realizează cu ajutorul croşetelor din placa bazală. Au loc modificări catalizate enzimatic ce conduc la solubilizarea peretelui celular în zona de contact; - injectarea, când se produce o contractare a capsomerelor aflate pe tija cilindrului axial. Prin contracţie, tija pătrunde în celulă pe o distanţă de aproximativ 12 nm şi molecula de ADN, în stare relaxată, este propulsată în interiorul celulei. Carcasa liberă de acid nucleic rămâne în exteriorul bacteriei; 27

- replicarea acidului nucleic, care are loc similar cu a celorlalte virusuri, cu deosebirea că formarea capului şi a cozii au loc separat şi apoi are loc, intracelular, morfogeneza; - liza celulei bacteriene şi eliberarea fagilor, care poate avea loc într-un interval de 25-60 min şi se produce sub acţiunea unei enzime induse de prezenţa fagului, denumită muramidază, iar sub acţiunea presiunii interne şi a lizei are loc ruperea/solubilizarea peretelui celular. Sunt sensibile la fagi, bacterii ale genurilor: Enterobacter, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Lactobacillus, ş.a. în celulele lizogene se pot întâlni forme de profagi care, în condiţii favorabile, devin virulenţi. Micofagii (micovirusurile). Micovirusurile sunt mai puţin studiate comparativ cu bacteriofagii. Au în structură ARN şi pot parazita mucegaiuri ale genurilor: Penicillium, AspergiHus, Mucor, Fusarium, sau drojdiii: Saccharomyces cerevisiae ş.a. Compoziţia chimică a microorganismelor Prin studiul compoziţiei chimice elementare a microorganismelor se constată că aproximativ 95% din substanţa uscată a celulelor microbiene este alcătuită din două mari grupe de elemente: - macroelemente, denumite şi elemente universale: C, H, O, N, S, P, care intră în diferite proporţii în compoziţia substanţelor organice şi se găsesc în compoziţia tuturor organismelor vii; de asemenea, în această grupă mai intră Na, K, şi Fe, necesare în cantităţi mari la unele microorganisme specifice; - elementele minore în cantităţi de ordinul microgramelor, din care fac parte: Cu, Mg, Zn, Co şi altele. Aceste elemente pot juca rolul de cofactori enzimatici: Mg are un rol important în creşterea termorezistenţei endosporilor bacterieni, Co intră în componenţa vitaminei B12. Elemente din celula microbiană Elemente Carbon Oxigen Hidrogen | Fosfor Sulf % fată de s.u. 50 20 14 8 3 Elemente Sodiu Potasiu Calciu Magneziu Fier; altele % fată de s.u. 1 1 0,5 0,5 0,2/0,3

Prin analize de compoziţie s-a stabilit că bacteriile conţin apă în proporţie de 61-85%, iar drojdia de panificaţie 67-70%. Cantitatea mare de apă în celulele microbiene se justifică prin rolul acesteia în viaţa celulei. Apa reprezintă mediul în care se solubilizează diferitele substanţe necesare nutriţiei, în care au loc reacţiile enzimatice, încât viaţa celulei nu este posibilă în absenţa apei libere. Apa în celula microbiană poate fi întâlnită sub două forme: apă liberă, apâ folosită de către celula vie pentru desfăşurarea normală a metabolismului, şi apă legată de compuşi organici: protide, acizi nucleici, fosfolipide sub

forma unor straturi de molecule de apă cu rol în funcţionalitatea macromoleculelor organice. în condiţii extreme, prin care se îndepărtează apa intracelulară (evaporare, osmoză, congelare) prin pierderea apei libere, celula trece într-o stare de anabioză. 28

Biomasa uscată a celulei microbiene conţine 12-14% cenuşă. în compoziţia cenuşii în concentraţii mari se găsesc oxizii de fosfor, aproximativ 50%, deoarece fosforul intră în structura acizilor nucleici, a acizilor adenilici, a fosfolipidelor şi a fosfoprotidelor. în concentraţii mai mici se întâlnesc oxizii de sodiu, potasiu şi oxizi ai elementelor minore. Raportat la % substanţă uscată, compuşii organici reprezintă 86-88% şi îndeplinesc în celula microbiană trei roluri de bază : - structural, intrând în compoziţia învelişurilor celulare; sunt de natură poliglucidică (de exemplu: glucani, manani); - funcţional, participând activ la desfăşurarea proceselor metabolice ca, de exemplu: protide cu funcţii enzimatice, vitamine cu rol de coenzime, unele fosfolipide ş.a.; - energetic, prin acumularea intracelulară a compuşilor de rezervă de natură glucidică: trehaloza, glicogenul şi incluziuni lipidice. în tabelul următor se prezintă conţinutul în protide, lipide şi acizi nucleici din diferite grupe de microorganisme. Compuşi organici (%) ai principalelor grupe de microorganisme Grupe de microorganisme Drojdii Mucegaiuri Bacterii Virusuri Protide 45-55 10-25 40-50 50-90 Lipide 1-6 1-7 10-15 1 Acizi nucleici 4-10 1-3 13-25 5-50

Dintre compuşii organici, substanţele de natură glucidică reprezintă 16-40% şi sunt întâlnite în structura pereţilor celulari sau în structurile extraparietale ale bacteriilor (dextran la Leuconostoc mesenteroides, xantan la genul Xanthomonas, acetat de celuloză la genul Acetobacter, fosfomanani la drojdii). Glucidele simple nu se întâlnesc în stare liberă, dar intră ca unităţi de bază în structura poliglucidelor sau a acizilor nucleici (riboza, deoxi-riboza). în celule de drojdii şi mucegaiuri se acumulează, în faza activă de creştere, trehaloza, glicogenul, iar la bacterii -granuloza, substanţe ce pot fi consumate de celule în condiţii de înfometare. Unele mucegaiuri pot produce, după ce a avut loc faza activă de creştere, substanţe toxice - micotoxine de natură hidrocarbonată. Un alt grup important de compuşi organici îl formează protidele, cu procente de 50-55 % din biomasa uscată. Structura lor este similară cu cea întâlnită în produse de origine vegetală sau animală sau pot să prezinte caractere specifice (mucorine la mucegaiurile

inferioare). în general, protidele microbiene au o compoziţie echilibrată în aminoacizii esenţiali; spre deosebire de protidele de origine animală, acestea conţin o concentraţie mai redusă în aminoacizii cu sulf (metionină şi cisteină), iar spre deosebire de protidele vegetale conţin mai multă lizină şi triptofan. Datorită conţinutului ridicat de protide, biomasa microbiană după uscare şi inactivarea celulelor se poate folosi în nutriţia animalelor sau la obţinerea, după purificare, a proteinelor din monocelulare folosite ca aditivi alimentari. în celula microbiană, numeroase protide îndeplinesc funcţii de biocatalizatori. Astfel, enzimele pot fi constitutive - mereu prezente în celula vie - şi adaptive (induse), endogene sau exogene sintetizate ca urmare a adaptării metabolismului la noi condiţii de mediu. Unele bacterii pot produce protide cu efect toxic ca, de exemplu, toxina 29

botulinică produsă de Clostridium botulinum, enterotoxine produse de bacterii ale genul Staphylococcus, endotoxine produse de genul Salmonella ş.a. Alţi compuşi celulari, lipidele, intră în structura membranelor, a incluziunilor libere sau sunt asociate cu compuşi macromoleculari - poliglucide sau protide. Unele drojdii ale genul Rhodotorula ca şi mucegaiuri ale genul Aspergillus, Fusarium, Geotrichurn, în funcţie de condiţii de cultivare pot acumula intracelular 20-35% lipide cu o compoziţie valoroasă. în celula microbiană sunt întâlnite numeroase vitamine dintre care predomină vitaminele din grupul B (B1t B2, B-12), ergosterolul - provitamina D2, p-carotenul -provitamina A ş.a. ce pot fi obţinute cu microorganisme selecţionate pe cale industrială. Un mare grup de compuşi îl formează pigmenţii care dau colorarea caracteristică a coloniilor, cu rol de protecţie faţă de acţiunea unor radiaţii sau cu rol funcţional în cazul în care participă la obţinerea de energie prin procesul de fotosintezâ. în tabelul următor se prezintă corelaţiile între numărul de celule şi cantitatea de biomasă. Corelaţii între număr de celule şi biomasa celulară Grupe de microorganisme Drojdii 2,9 Mucegaiuri superioare 1-5 Bacterii 0,02 Virusuri 0,0005 Număr de celule 2-1013 108-4108 2-1010 1010 Masa (g)

Cunoaşterea compoziţiei specifice a diverselor microorganisme este importantă în cultivarea microorganismelor cu utilizări industriale, deoarece diversele elemente care intră în compoziţie trebuie asigurate în mediu pentru ca celula să aibă la dispoziţie elementele necesare pentru activitatea fiziologică. Un alt aspect îl reprezintă valoarea deosebită a unor compuşi microbieni intracelulari care se pot obţine avantajos pe diverse căi biotehnologice. Nutriţia microorganismelor Procesul de nutriţie este un proces fiziologic complex prin care microorganismele îşi procură elementele necesare şi energia pentru biosinteza compuşilor celulari pentru creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor vitale. Nutriţia se desfăşoară în cadrul metabolismului celular prin reacţii de degradare a compuşilor macromoleculari în compuşi cu masă moleculară redusă, ce pot fi transportaţi în interiorul celulei, reacţii exergonice ce au loc în cadrul catabolismului celulei. Concomitent cu reacţiile de catabolism, folosind compuşii simpli şi energie, celula vie sintetizează compuşii celulari esenţiali pentru creştere, în cadrul anabolismului. Viaţa celulei microbiene este posibilă atât timp cât cele două procese se desfăşoară concomitent. Celula microbiană poate sintetiza între 3 000 şi 6 000 de tipuri de molecule diferite, din care aproximativ 50% sunt reprezentate de molecule de apă şi ioni. Pentru a sintetiza această diversitate de compuşi, microorganismele au posibilitatea să-şi procure elementele majore şi minore din compoziţie prin procesul de nutriţie, iar energia necesară pentru biosinteza, pe cale chimică, aşa cum este cazul microorganismelor chimiosintetizante, sau prin fotosinteză, de către bacteriile fotosintetizante. Microorganismele întâlnite în industria alimentară sunt microorganisme chimiosintetizante ce îşi obţin energia prin degradarea compuşilor organici, cu eliberarea energiei potenţiale a substratului nutritiv (alimentului) pe care acestea se dezvoltă, dând de cele mai multe ori alterarea specifică a acestuia. Prin substrat nutritiv se înţelege acel mediu care conţine apă, surse de energie (de natură glucidică), surse asimilabile de azot, săruri minerale şi, facultativ, factori de creştere. Modalităţi de transport ai nutrienţilor. Nutrienţii solubili, cu molecule mici, intră în celula microbiană pe diferite căi. Una din căile cele mai frecvente este pătrunderea prin difuzie şi anume prin: - difuzie pasivă, care se realizează ca urmare a unui gradient de concentraţie, posibil când în exteriorul celulei concentraţia este superioară celei din interiorul acesteia 30

- . Prin anumiţi pori ai membranei plasmatice, nutrientul pătrunde în interior şi este metabolizat. Pe această cale pot pătrunde glicerolul, acizii cu molecule mici;

- difuzia facilitată, care se realizează ca urmare a prezenţei în biomembrane a unor proteine receptoare denumite permeaze, localizate la nivelul plasmaiemei sau în spaţiul periplasmic. Această difuzie este stereospecifică şi se realizează faţă de un gradient de concentraţie, iar celula nu consumă energie pentru acest transfer; - transportul activ, care are următoarele particularităţi: transportul în celulă este asigurat chiar în absenţa gradientului de concentraţie şi se realizează cu consum de energie. Acest transport a fost demonstrat în cazul drojdiilor care pot acumula intracelular o cantitate de glucide şi de aminoacizi mai mare decât cea existentă în.mediul de cultură. Se admite că o moleculă-transportor, care consumă o cantitate de energie pentru a se activa şi a produce o legătură instabilă cu molecula nutrientului printr-o reacţie catalizată enzimatic, transferă nutrientul şi îl eliberează în interior. Transportorul se activează ca urmare a energiei eliberate prin transformarea ATP; - translocaţia de grup, un transport activ întâlnit la drojdii şi mucegaiuri, în care intervine un sistem enzimatic complex de transferaze şi transfosfataze, ce permit pătrunderea glucidelor prin membrane sub forma esterilor fosforici. Astfel, fosfoenolpiruvatul se poate combina cu molecula de glucid din exteriorul celulei şi se transformă în piruvat şi esterul fosforic al glucidului transportabil în interior. în cazul microorganismelor acvatice (protozoare), există sistemul de endocitoză sau pinocitoză prin care nutrientul din exterior este înglobat în interior, apărând stadiul de picătură suspendată şi eliberarea în interiorul celulei. Numeroase microorganisme, mai ales bacteriile, pot folosi pentru transportul intracelular aşa-numitul „gradient protonic" rezultat în urma transportului de protoni şi ioni, care acţionează permanent în celula vie ca o pompă electrochimică. Tipuri nutriţionale şi surse nutritive. Ca rezultat al adaptării microorganismelor la diferite condiţii ale mediului ambiant, acestea pot fi de 4 tipuri nutriţionale, în funcţie de sursa de carbon şi de energie: - chimioorganotrofe heterotrofe (bacterii, fungi), care îşi obţin energia pe cale chimică prin procese de oxidare a compuşilor organici şi îşi procură oxigenul şi hidrogenul din compuşi organici şi anorganici; - photolitotrofe autotrofe (alge, bacterii din ape), care folosesc energia luminoasă în procese de biosinteza şi folosesc drept surse de carbon, hidrogen şi oxigen, compuşii anorganici; - photolitotrofe heterotrofe, care folosesc energia luminoasă, iar ca sursă majoră de carbon, dioxidul de carbon din aer; - chimiolitotrofe autotrofe (sulfobacterii, ferobacterii), care îşi obţin energia pe cale chimică, iar ca sursă de carbon, hidrogen - compuşii anorganici. Conform exigenţelor nutritive ale microorganismelor, încadrate în primul tip de nutriţie, se poate stabili o anumită succesiune; cele mai pretenţioase din punct de vedere nutritiv sunt bacteriile Gram-pozitive, urmate de bacterii Gram-negative, drojdii şi mucegaiuri. în funcţie de natura alimentelor folosite preferenţial în procesul de nutriţie, se disting trei surse de nutriţie, care sunt prezentate în continuare: Nutriţia hidrocarbonată. Este procesul nutritiv prin care microorganismele îşi procură surse de carbon şi hidrogen, elemente majore din compoziţia compuşilor celulari. în timp ce microorganismele autotrofe cu habitat în sol şi ape au un rol limitat în

microbiologia produselor alimentare, microorganismele organotrofe, adaptate să se dezvolte prin asimilarea carbonului din materie organică au un rol major, fiind cunoscute ca agenţi selecţionaţi pentru dirijarea proceselor fermentative, ca agenţi de alterare sau patogeni. în grupa microorganismelor organotrofe se disting următoarele subgrupe: - microorganismele saproorganotrofe (saprofite), care se dezvoltă folosind ca sursă de carbon şi energie, materia organică nevie. în această categorie intră majoritatea microorganismelor cu aplicaţii industriale, dar şi bacteriile de putrefacţie, mucegaiuri care se dezvoltă pe alimente ş.a.; - microorganismele comensale, care se dezvoltă la suprafaţa sau în interiorul organismelor vii (plante sau animale), beneficiind de această asociere şi hrănindu-se 31

cu substanţe ce rezultă în mod natura! din activitatea metabolică a acestora. Se pot exemplifica microorganismele din microbiota epifită a plantelor, a pielii, din microbiota intestinală; - microorganismele patogene sau parazite, care pot fi strictpatogene, fiind specializate să se hrănească şi să trăiască parazitând celula vie. Acestea pot fi vehiculate prin alimente contaminate, încât, prin ingerare, microorganismele pătrund în circuitul sangvin, se localizează pe organe specifice şi, atunci când agentul patogen va învinge forţele de apărarea ale organismului, se declanşează starea specifică de boală; -- microorganismele potenţial patogene, care pot să crească pe produse •> alimentare bogate în nutrienţi şi pot, în anumite condiţii, să elaboreze toxine, încât prin ingerarea alimentului contaminat se produc stări de toxiinfecţii alimentare sau toxicoze. Dintre sursele de carbon, preferate de microorganismele organotrofe, fac parte: - unele poliglucide: amidon, celuloză, substanţe pectice, care pot fi folosite în special de către bacterii şi mucegaiuri producătoare de enzime specifice, extra-celulare. Drojdiile fermentative ale genul Saccharomyces nu produc amilaze, motiv pentru care, înainte de fermentare, plămezile amidonoase sunt zaharificate chimic/enzimatic; - anumite monoglucide (hexdze, pentoze) şi diglucide, care reprezintă atât surse de carbon cât şi de energie pentru toate microorganismele şi sursa de bază în nutriţia drojdiilor; - acizii organici (acid lactic, malic, acetic), care pot fi o sursă de carbon pentru mucegaiuri şi unele drojdii; - alcoolii, utilizaţi de către drojdii oxidative (genul Candida, genul Pichia) şi de bacterii (genul Acetobacter). Nutriţia azotată. Este asigurată de compuşii organici cu azot (macro-moleculari), produşii de hidroliză ai acestora, precum şi de alte săruri cu azot: săruri amoniacale, azotaţi ş.a. Protidele pot fi folosite în nutriţie numai de către microorganisme ce produc proteaze extracelulare, respectiv de bacterii - agenţi ai putrefacţiei şi mucegaiuri -agenţi ai putrezirii. Drojdiile care produc numai proteaze intracelulare folosesc în nutriţia azotată

produşi de hidroliză ai protidelor şi anume peptone, peptide şi aminoacizi. Se mai pot folosi, în mediile de cultură a drojdiilor, sulfatul de amoniu şi ureea. Alţi compuşi, cum ar fi nitraţii, sunt asimilaţi de către mucegaiuri şi bacterii; nitriţii sunt asimilaţi numai de către bacterii (genul Niirosomonas) şi au efect toxic pentru fungi. înmulţirea drojdiilor este oprită la concentraţii de 200 mg nitriţi /dm3. Nutriţia minerală. Pentru procurarea elementelor minore, sunt preferate, de către microorganisme, săruri ale acestora, în următoarea succesiune: fosfaţi > sulfaţi > > azotaţi > carbonaţi. Studii privind necesarul în substanţe minerale, efectuate de Raulin, au arătat importanţa pe care o au diferitele elemente în procesul de creştere microbiană. El stabileşte o lege a minimului, demonstrând că creşterea microorganismelor este dependentă de elementul necesar care se află în concentraţia cea mai mică. Efectul pe care îl are adăugarea diferitelor substanţe minerale asupra creşterii poate fi definit prin indicele de utilitate specifică, ce reprezintă raportul dintre biomasa formată pe un mediu de cultură complet şi cea rezultată în mediul carenţatîn substanţa/elementul respectiv. Factorii de creştere. Sunt denumiţi factori de creştere oricare dintre compuşii organici pe care un microorganism îi necesită, fie în calitate de precursor fie de constituent al materialului celular, dar pe care nu îi poate sintetiza din surse simple de carbon. 32

Factorii de creştere, ca structură şi funcţie metabolică, intră în următoarele trei categorii: - aminoacizi necesari pentru biosinteza protidelor; - purine şi pirimidine ce intră în compoziţia acizilor nucleici; - vitamine care pot forma o parte a grupării prostetice sau sunt centrii activi ai unor enzime. Unele microorganisme sunt dependente de prezenţa acestor factori, de exemplu drojdiile, bacteriile lactice şi acetice, care necesită în mediu: biotină, acid pantotenic, acid folie ş.a. La unele microorganisme există o interdependenţă strictă între cantitatea de biomasa şi concentraţia în vitamine din mediu, fapt ce a condus la stabilirea unor metode analitice de dozare a vitaminelor sau a aminoacizilor. Alte microorganisme sunt independente de prezenţa în mediu a acestor factori, deoarece au capacitatea de a-şi autosintetiza factorii de creştere necesari. Din acest grup fac parte mucegaiurile şi multe bacterii adaptate la cele mai vitrege condiţii de viaţă. Medii de cultură. Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, cu rol de aliment, care trebuie să asigure, microorganismului ce urmează a fi cultivat, cantitatea necesară de apă, surse de carbon, azot, săruri minerale, factori de creştere, substanţe care să îi furnizeze atât cantitatea de energie cât şi toate elementele folosite de celulă în procese de metabolism. Mediul de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: să corespundă din punct de vedere nutritiv, să aibă o concentraţie a substanţelor dizolvate în mediu care să nu

influenţeze negativ schimburile osmotice ale celulei, să nu conţină substanţe toxice sau să genereze compuşi toxici în urma creşterii culturii microbiene, să aibă un anumit pH sau rH şi să fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel încât să se dezvolte numai celulele introduse prin inocul. Mediile de cultură se folosesc în practica de laborator sau în practica industrială şi sunt foarte diferenţiate în funcţie de scopul urmărit. în tehnica de laborator, mediile se folosesc pentru izolarea din natură a diferitelor microorganisme, pentru obţinerea de culturi pure, pentru cultivarea acestora în scopul obţinerii de biomasă sau pentru întreţinerea culturilor pure selecţionate. în scopuri industriale se folosesc pentru obţinerea de celule sau a compuşilor rezultaţi prin activitatea microorganismelor selecţionate. în funcţie de destinaţia lor, mediile de cultură sunt de mai multe tipuri. Mediile de cultură generale asigură dezvoltarea unui număr mare de specii şi genuri, deoarece includ în compoziţia lor substanţe-aliment diversificate. Dintre mediile de cultură generale, folosite în practica laboratorului de microbiologie, menţionăm bulionul de carne lichid sau gelozat (BCA); mediul triptonă-extract de drojdie-glucoza-agar (TEGA), pentru cultivarea bacteriilor, şi mustul de malţ-agar (MMA), pentru cultivarea drojdiilor şi mucegaiurilor. Mediile de cultură pot fi definite atunci când în compoziţia lor intră substanţe chimice pure ce pot fi exact dozate conform reţetei sau medii complexe în care intră compuşi naturali cu o compoziţie variabilă. Mediile de cultură selective sunt medii cu compoziţie chimică definită, care permit dezvoltarea unui grup restrâns de microorganisme sau chiar a unei specii. Aceste medii conţin, pe lângă substanţe nutritive, şi substanţe cu efect inhibitor asupra altor microorganisme însoţitoare întâlnite în microbiota din care se face izolarea culturii ce dorim să o selecţionăm. Un mediu selectiv folosit la determinarea bacteriilor coliforme este BLBV (bulion-bilă-lactoză verde brilliant), în care sărurile biliare inhibă alte bacterii, în timp ce coliformii sunt adaptaţi. Numărul mediilor selective este foarte mare, ele permiţând izolarea unor specii de interes industrial sau putându-se folosi 33

pentru identificarea, determinarea sau evidenţierea microorganismelor contaminante în produse alimentare. Mediile de cultură de diferenţiere permit diferenţierea speciilor în funcţie de anumite caractere biochimice, atunci când acestea au fost selectate dintr-o microbiota heterogenă. De exemplu, dacă pe un mediu selectiv s-au izolat bacterii ale grupului coliform, prin folosirea mediilor de diferenţiere pot fi definite speciile componente ale grupului. Mediile de îmbogăţire (fortifiate) sunt destinate separării şi cultivării unor microorganisme pretenţiose din punct de vedere nutritiv şi care se află în număr redus în produsul analizat din punct de vedere microbiologic. Pentru a le pune în evidenţă, se fac treceri din produsul alimentar în mediul de îmbogăţire, steril, şi se asigură înmulţirea celulelor. Din mediul în care s-a produs înmulţirea se facetransfer de celule pe medii de diferenţiere, iar rezultatul se exprimă prin prezenţa/ absenţa lor. De exemplu, la

determinarea bacteriilor din genul Salmonella - agenţi ai toxiinfecţiilor alimentare normele microbiologice stabilesc absenţa lor în 25 g produs. Clasificarea mediilor de cultură se poate face şi, în funcţie de compoziţie şi provenienţă, în medii naturale şi medii sintetice. Mediile naturale sunt cele mai utilizate, deoarece reproduc condiţiile în care se dezvoltă microorganismele. Mediile naturale de origine vegetală sunt sucurile de fructe, de legume, mustul de malţ, legumele fierte/terciuite (morcovi, cartofi), anumite fructe, infuzii de plante ş.a. Ca medii de origine animală se folosesc, după sterilizare, laptele, sângele (pentru bacterii facultativ patogene), zerul, bulionul de carne, carnea, ficatul, ouăle. în condiţii de laborator se folosesc medii lichide, în special pentru cultivarea microorganismelor facultativ anaerobe, pentru studiul proceselor fermentative şi medii solide (pâine, cartofi felii ş.a.) şi, frecvent, medii solidificate obţinute prin adăugarea în mediile lichide a unor agenţi de solidificare. Pentru solidificarea mediilor de cultură se foloseşte: agar-agarul (geloza), un poliglucid obţinut din alge ale genului Gelidium, având în structură molecule de galactoză şi acid D-galacturonic legate prin legături 1,2; 1,3 glicozidice. în stare purificată se prezintă sub formă de pulbere sau fibre şi se adaugă în cantitate de 0,5-2% mediu lichid. Are o mare capacitate de îmbibare şi, în prezenţa apei, îşi măreşte volumul de circa 16 ori. Se solubilizează la temperatura de fierbere şi gelifică la temperatura de 42...45°C. Agarul are calitatea de a fi un bun agent de solidificare, deoarece nu este hidrolizat pe cale enzimatică. în mediu acid, la temperaturi de sterilizare, îşi pierde capacitatea de a forma gel. Un alt agent de solidificare este gelatina, de natură proteică, extrasă din ţesuturi colagenice. Se foloseşte în cantitate de 12-15 g%. Se fluidifică la temperaturi mai mari de 35°C şi gelifică lent sub temperatura de 30...25°C. Are dezavantajul că poate fi folosită ca nutrient de către microorganisme cu activitate proteolitică care nu produc proteaze extracelulare. Este utilizată pentru izolarea drojdiilor. în afara mediilor descrise şi care se pot prepara în condiţii de laborator, numeroase firme (Difco, Sartorius, I. Cantacuzino ş.a.) sunt specializate în fabricarea de medii de cultură ce pot fi livrate sub diverse forme. Astfel, există medii gata preparate sau sub formă de pulberi ce pot fi reconstituite conform reţetei şi au un termen îndelungat de valabilitate. Mediile fermentative sunt medii de cultură industriale destinate producerii unor cantităţi mari de celule sau pentru obţinerea de produşi de metabolism cu valoare economică. în compoziţia acestor medii intră, ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahărului şi care conţine circa 45-55% zaharoză şi săruri minerale; diferite tipuri de făină, cereale măcinate; zerul bogat în lactoză; tărâţe 34

cu -20% amidon ş.a. Dintre sursele de azot amintim: făinurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, îngrăşământul complex. Pentru îmbogăţirea în săruri minerale se adaugă:

fosfaţi/sulfaţi, cloruri. La cultivarea microorganismelor, dependente de prezenţa factorilor de creştere, se adaugă: extract de porumb, obţinut prin concentrarea apelor rezultate la înmuierea porumbului, bogat în aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente; extract de drojdie; extract din radicele de malţ şi germeni de grâu/porumb. Diversitatea mediilor de cultură este datorată atât capacităţii de adaptare a numeroaselor microorganisme întâlnite în habitaturile naturale cât şi faptului că prin modificarea compoziţiei mediilor de cultură se pot obţine randamente superioare în produşi de metabolism microbian cu valoare economică. Mediile de cultură sunt utilizate, frecvent, în tehnici microbiologice de laborator, pentru izolarea, cultivarea şi întreţinerea culturilor pure şi pentru controlul microbiologic al produselor alimentare. Metode de izolare şi obţinere a culturilor pure Cultura pură reprezintă o biomasă de celule rezultate prin reproducere dintr-o singură celulă aflată într-un mediu nutritiv steril, cu volum limitat Cultură pură este considerată şi colonia care se formează ca rezultat al izolării unei celule, sau al unei unităţi formatoare de colonie (UFC), atunci când aceasta este localizată pe un mediu nutritiv solid. Puritatea unei culturi se poate obţine şi prin repicare, deci prin transfer de celule din eprubeta ce conţine cultura pură, în alt vas cu mediu de cultură steril. în practica de laborator se cunosc numeroase metode prin care se poate realiza separarea unei singure celule din microbiota heterogenă a mediilor naturale. Metodele cunoscute şi practicate în laborator, în scopul izolării culturilor pure, pot fi clasificate în metode fizice-mecanice şi metode biologice. Metode fizice de izolare şi obţinere a culturilor pure Metodele de izolare prin răspândire. Se folosesc pe scară largă, fiind uşor de executat, având ca principiu răspândirea celulelor din medii naturale, unde acestea se află în număr mare, prin diluare în medii lichide sau prin diseminare mecanică pe suprafaţa mediilor sterile, solidificate. Aceste metode pot fi clasificate în trei categorii. Metode scarificate. în placa Petri se repartizează un mediu de cultură adecvat, de exemplu MMA/BCA şi, după solidificarea mediului, cu firul metalic se recoltează celule din mediul natural şi se execută trasări pe suprafaţa mediului, astfel încât diversele celule rămân distanţate între ele. Prin termostatare 48-72 ore, din colonia care corespunde microorganismului ce trebuie să fie izolat se face repicare în eprubete cu mediu solid înclinat (slant-agar) şi, astfel, se obţine o cultură pură. Metoda în striuri. Este similară cu cea anterioară, în schimb, drept suprafaţă de răspândire, se foloseşte mediul înclinat din 2-3 eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea de striuri, în mod succesiv. Metoda se foloseşte şi în cazul în care o cultură pură este contaminată cu microorganisme străine în perioada de păstrare a culturii şi aceasta trebuie să fie salvată.

Metoda de cultură Koch. Este folosită în special pentru izolarea de drojdii. Ca mediu de răspândire se foloseşte mustul de malţ cu gelatină repartizat în 3 eprubete, fluidificat şi menţinut la 40°C. Din mediul natural, de exemplu must în fermentaţie, se recoltează cu o ansă care se introduce succesiv în cele 3 eprubete, cu agitare, pentru desprinderea celulelor. După inoculare şi uniformizare, conţinutul fiecărei eprubete se repartizează în câte o placă Petri; prin solidificare, celulele rămân fixate în gei şi prin 35

multiplicare vor forma colonii izolate. în funcţie de densitatea celulelor recoltate iniţial, în placa a doua sau a treia, coloniile sunt suficient de distanţate; se preferă distanţe de circa 2 cm, pentru a putea face izolarea din colonia adecvată a culturii pure, prin repicare în eprubeta cu slant agar. Metode de izolare prin diluare. în prima etapă» din mediul natural se fac diluţii decimale în ser fiziologic steril, astfel încât numărul de celule într-o micropicătură din ultima diluţie să fie redus. Dintre metodele prin diluare fac parte metoda Lindner şi metoda Naumov. Metoda Lindner se foloseşte pentru izolarea de drojdii fermentative. Din diluţia convenabilă, cu ajutorul unei peniţe topografice se punctează 9 picături pe suprafaţa unei lamele sterile. Lamela se amplasează cu picăturile în jos pe o lamă cu escavatie şi se studiază la microscop fiecare picătură. Se notează cu un marker conturul picăturii în care se află o singură celulă. Se desprinde lama şi cu ajutorul unei benzi sterile de hârtie se absoarbe picătura notată. împreună cu lichidul se adsoarbe şi celula de izolat, apoi banda se introduce într-o eprubeta cu must lichid. Din celula unică prin reproducere rezultă o cultură pură. Deşi este meticuloasă, metoda propusă de Lindner este o metodă precisă, deoarece se face sub control microscopic. Metoda Naumov este folosită pentru izolarea culturilor pure de mucegaiuri. Dintr-o diluţie convenabilă se aplică, distanţat, micropicături pe capacul interior al unei plăci, peste acestea se adaugă în picături mediu MMA fluidificat (termostatat la 42°C) şi, după 2-3 zile, se selectează din picătura, cu o singură colonie, cultura pură dorită. O metodă simplificată pentru separarea sporilor fungici constă în inundarea unei plăci cu MMA cu 1 -2 cm3 din diluţia convenabilă. Sporii care au rămas ataşaţi de mediu vor da colonii izolate şi acestea dacă sunt utile vor fi transferate în eprubete cu slant-agar. în general, mucegaiurile nu ridică probleme, deoarece cresc sub formă de colonii mari pe diverse alimente şi pentru obţinerea în cultură pură se face repicarea de spori situaţi în centrul coloniei . Metoda de izolare cu ajutorul micromanipulatorului. Este o metodă precisă şi se realizează cu ajutorul unui aparat prevăzut cu tuburi capilare cu care se poate face selecţia

celulelor dorite din preparate studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se poate face recoltarea de ascospori din celule ascogene şi este folosit, în ingineria genetică, în dirijarea proceselor de fuziune a protoplaştilor, pentru conjugare ş.a.

Metode biologice de obţinere a culturilor pure Metodele biologice sunt foarte diverse şi se bazează pe proprietăţile fiziologice ale microorganismelor de izolat, care să se diferenţieze clar de cele ale microorganismelor însoţitoare din acelaşi biotop. Uneori, prin aceste metode, se face izolarea unui grup cu caractere taxonomice apropiate şi apoi se face izolarea de culturi pure prin tehnici de răspândire sau prin folosirea mediilor selective. O metodă biologică clasică este metoda Buni, prin care se face separarea microorganismelor în funcţie de necesarul de oxigen pentru creştere. Dacă dintr-un mediu natural se face inocularea în BCA fluidificat (42°C) şi după uniformizare acesta se introduce într-un tub lung de sticlă, prevăzut la un capăt cu dop de cauciuc, prin răcire celulele sunt imobilizate în gel şi prin termostatare, în funcţie de accesul oxigenului din aer, în zona tubului prevăzut cu dop de cauciuc se vor dezvolta bacterii anaerobe, intermediar bacterii microaerofile, iar în stratul de mediu, la care aerul a pătruns prin dopul de vată al tubului, bacterii aerobe. 36 Prin metode biologice pot fi selectate bacteriile sporogene din medii naturale, pe baza termorezistenţei deosebite a endosporilor. Astfel, Bacillus subtilis se poate izola din infuzii de fân pe care formează un voal cutat, deoarece endosporii rezistă la fierbere, în timp ce alte bacterii sunt distruse. Numeroase metode de izolare se bazează pe introducerea în medii de cultură a unor substanţe chimice cu efect inhibitor asupra microorganismelor de care trebuie separată cultura dorită. De exemplu, prin introducerea de 0,02% actidionă are loc inhibarea dezvoltării drojdiilor aflate în amestec cu bacterii. Metoda este folosită pentru izolarea unor bacterii ce pot produce contaminarea drojdiilor folosite sfub formă de culturi pure în industrii fermentative. Cinetica de creştere a microorganismelor (culturi pure) Prin inocularea de celule, aparţinând unei culturi pure, într-un mediu nutritiv steril se poate stabili dinamica de creştere prin studiul vitezei de acumulare a biomasei sau prin creşterea numărului de celule raportat !a unitatea de volum a mediului. în timp ce la mucegaiurile inferioare, la care prin creştere are loc diviziunea nucleilor şi nu a celulei coenocitice, creşterea se apreciază prin determinarea masică a biomasei formate, la alte microorganisme, la care concomitent cu diviziunea nucleară are loc şi diviziunea

celulară (înmugurire la drojdii, sciziune la bacterii, formarea de pereţi despărţitori la mucegaiuri superioare), creşterea se apreciază fie prin acumularea de biomasă fie prin determinarea numărului de celule. Dacă într-un mediu nutritiv steril se face inocularea cu A/0 celule şi se determină creşterea lor într-o anumită perioadă de timp, se obţine o curbă caracteristică ce reflectă dinamica de creştere a culturii şi în care se pot distinge următoarele faze: - AS - o fază lag, în care nu se constată o creştere a numărului de celule. în această fază are loc o adaptare a celulelor la condiţiile de mediu, biosinteza de ADN/ARN şi o activizare a sistemelor enzimatice şi elaborarea de enzime induse, în cazul drojdiilor, această fază poate dura 1-2 ore, durată ce depinde de compoziţia mediului şi de capacitatea de reglare a metabolismului propriu; - BC - faza de început a creşterii, când are loc o creştere în dimensiuni a celulelor prin mărirea mai rapidă a volumului în raport cu suprafaţa celulară, ceea ce favorizează declanşarea procesului de reproducere; - CD -faza logaritmică (exponenţială), care reprezintă faza în care creşterea masei de celule poate fi determinată cantitativ prin dublarea numărului de celule în unitatea de timp (pentru drojdii şi bacterii), sau ca dublare a biomasei/f pentru microorganisme filamentoase: streptomicete şi fungi. Prin exprimarea acestora valori pe o scară semilogaritmică rezultă o dreaptă. Dacă unghiul pantei acestei drepte este mic, rezultă că condiţiile de creştere nu sunt dintre cele mai favorabile. Deşi celulele produc o modificare a mediului de cultură prin asimilare de compuşi nutritivi şi eliberează compuşi de catabolism, în faza logaritmică, rata de creştere rămâne constantă. Rata de creştere este independentă de concentraţia în nutrienţi atâta timp cât aceştia se află în exces. Rata de creştere în biomasă X (g-dm"*3) este corelată cu rata specifică de creştere p, în timp ce rata de creştere a numărului de celule este corelată cu M şi densitatea celulelor N. Rata specifică de creştere JU este dependentă de trei parametri şi anume: concentraţia substratului limitativ (S), rata maximă de creştere \sm şi o constantă specifică dependentă de substrat, KSt conform ecuaţiei stabilită de Jaques Monod: Constanta Ks este concentraţia substratului la care se obţine 1/2 din rata specifică maximă de creştere (p = 0,5 \xm) şi este echivalentă cu constanta Michaelis în cinetica enzimatică. Dacă există un exces al tuturor nutrienţilor, atunci p = pm şi 37

cultura se află, deci, în faza logaritmică la rata maximă de creştere. Dacă unul din nutrienţii preferaţi, de exemplu glucoza, s-a epuizat, în prezenţa altor surse de carbon se observă aşa-numitul fenomen de diauxie când se poate, după o nouă fază lag, să aibă loc metabolizarea noului substrat şi creşterea exponenţială a celulelor. La sfârşitul fazei logaritmice se acumulează o cantitate maximă de biomasă, substratul este rapid epuizat şi cultura trece în faza staţionară de creştere. Rata specifică de creştere maximă, |jm, are o importanţă considerabilă în procesele industriale în care se urmăreşte

obţinerea de celule şi este dependentă de natura microorganismului şi de condiţiile de cultivare. De exemplu, pentru mucegaiuri, aceasta poate să varieze între 0,090 şi 0,61 h~1. La cultivarea lui Aspergillus niger pe mediu cu glucoza la 30°C s-au obţinut un [im = 0,2 şi un timp de dublare al biomasei de 3,46 h; - DE - o fază de încetinire a creşterii ca urmare a epuizării treptate a nutrienţilor, reducerea concentraţiei în oxigen şi acumularea de compuşi de catabolism ce pot avea efect inhibitor asupra celulelor; - EF- faza staţionară de creştere, când se stabileşte un echilibru între numărul de celule care se formează prin reproducere şi cel al celulelor care se autolizează. Cantitatea de biomasă poate rămâne constantă, deşi se schimbă compoziţia celulelor. Datorită lizei unor celule se eliberează noi substraturi care vor servi drept nutrienţi pentru celulele viabile. Această fază poate fi prelungită atunci când urmărim păstrarea culturii pure, prin modificarea unor factori care scad viteza de metabolism celular; - FG - faza de declin sau curba de distrugere şi inactivare metabolică a celulelor, ca urmare a: lipsei de surse de nutriţie şi energie; denaturării componentelor celulare în prezenţa substanţelor acumulate (alcooli, acizi ş.â.); procentului de celule autolizate. Consecinţa acestor acţiuni conduce, în final, la sterilizarea mediului şi, deci, la moartea tuturor celulelor, respectiv la pierderea culturii. Importanţa practică a culturilor pure Izolarea şi obţinerea culturilor pure, cunoaşterea cineticii de creştere prezintă o importanţă practică deosebită, în domeniile prezentate în continuare: Identificarea, selecţionarea şi îmbunătăţirea proprietăţilor de biosinteză. Culturile pure sunt folosite pentru studiul proprietăţilor morfologice şi fiziologice, în scopul identificării, caracterizării şi stabilirii domeniului de utilizare a culturii. Microorganisme aparţinând aceleaşi specii, în funcţie de sursa de izolare şi de compoziţia mediului de cultură, pot prezenta proprietăţi fermentative diferite, încât tulpinile izolate pot fi folosite pentru selecţionarea şi îmbunătăţirea proprietăţilor lor de metabolism. Sub formă de culturi pure, microorganismele pot fi supuse unor tratamente fizico-chimice prin care se pot induce modificări genetice la nivelul acizilor nucleici cu obţinerea de culturi mutante, din rândul cărora se face din nou selecţia tulpinilor performante. Obţinerea culturilor starter în procese fermentative industriale. Pornind de la cultura pură, în biotehnologii alimentare, prin cultivarea în medii adecvate se obţine cantitatea necesară de inocul (maia) folosită drept cultură starter a procesului fermentativ. Inoculul reprezintă un mediu nutritiv în care s-au înmulţit celule aparţinând unei culturi pure, aflată în etapa finală a creşterii exponenţiale. Cantitatea de inocul trebuie astfel calculată încât, prin introducerea sa în mediul fermentativ steril, concentraţia în celule să asigure declanşarea rapidă a procesului fermentativ. Pornind 38

de la eprubeta cu cultura pură, se face, la început, activizarea celulelor prin transfer succesiv în mediu de cultură steril, cu o compoziţie similară cu a mediului care trebuie să fie fermentat, pentru a elimina etapa de adaptare, astfel încât, după 3-4 pasaje, să se obţină cantitatea de inocul necesar sau maia de producţie. Obţinerea cantităţii de inocul şi a densităţii de celule pentru declanşarea rapidă a fermentaţiei în condiţii industriale se realizează prin transfer de volum de 1-2% pentru bacterii, 4-5 % pentru drojdii şi 5-10% pentru mucegaiuri, pasaje intercalate cu perioade de termostatare în condiţii optime pentru reproducerea exponenţială a celulelor. în funcţie de specificul biotehnologic, este obligatorie asigurarea continuităţii în transfer pentru aprovizionarea cu inocul activ, la perioada solicitată de producţie. Utilizarea culturilor pure în biotehnologii alimentare (la fabricarea berii, spirtului, vinului, produse lactate acide, panificaţie ş.a.) permite obţinerea unor produse cu calitate constantă. Procedee de conservare a culturilor pure. Sub formă de culturi pure sunt păstrate atât microorganismele aflate în studiu cât şi cele care prezintă proprietăţi de biosinteză remarcabile, culturi întreţinute şi înregistrate în colecţii autorizate de microorganisme, denumite micoteci. în continuare sunt desrise tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure, tehnici bazate pe prelungirea fazei staţionare de creştere şi evitarea etapei de declin. Repicarea periodică are loc prin transfer de celule din eprubeta cu cultura pură în care mediul nutritiv este epuizat şi transferul în eprubeta cu mediu nutritiv steril cu compoziţie similară. Intervalul de repicare este dependent de natura culturii, de compoziţia mediului şi de temperatura de păstrare. în timp ce bacteriile lactice necesită repicări la intervale de 1-3 săptămâni, drojdiile se pot păstra pe slant agar 3-6 luni, iar bacteriile sporulate 6-12 luni. Mucegaiurile sunt rezistente la păstrare şi, chiar după uscarea mediului, sporii se menţin viabili ani de zile. Procedeul de repicare periodică necesită un mare volum de muncă, prezintă risc de contaminare şi este greu de realizat atunci când numărul de culturi de întreţinut este mare. Prelungirea intervalului între două repicări prin scăderea vitezei de metabolism a celulelor şi, deci, evitarea stării de declin ce poate duce la auto-sterilizare se pot realiza prin: - menţinerea culturilor la temperaturi scăzute, în condiţii de refrigerare sau congelare. Culturile de fungi păstrate la 5°C se transferă anual, iar dacă păstrarea se face la 16°C la interval de 6 luni; - privarea de oxigen. în absenţa oxigenului din aer, microorganismele aerobe trec în stare latentă de viată. Pentru drojdii şi mucegaiuri, cultura dezvoltată în mediu solidificat (drept) se acoperă cu un strat de ulei de parafină steril; concomitent se previne şi uscarea mediului. Când celulele vii se acoperă cu ulei de parafină (sterilizat în prealabil la 170°C/2h), procesele metabolice ale fungilor decurg de 10 ori mai lent; - reducerea umidităţii mediului, care conduce la trecerea celulelor în stare de anabioză, ce poate fi menţinută timp îndelungat fără a se produce modificări intracelulare, ireversibile. Bacteriile sporogene ale genului Bacillus se pot menţine sub formă de endospori prin antrenarea culturii în eprubete cu nisip steril şi, după evaporarea apei, sporii se menţin adsorbiţi pe particulele de nisip, zeci de ani. Păstrarea sporilor fungici în apă distilată. După 4 ani de păstrare la temperatura camerei, 93% din spori şi-au menţinut viabilitatea.

Păstrarea culturilor în stare liofilizată este tehnica cea mai uzitată şi avantajoasă, deoarece prelungeşte cel mai mult intervalul de conservare a culturilor fără să producă modificări ale proprietăţilor lor fiziologice. în cazul mucegaiurilor, o suspensie de spori în lapte degresat se congelează rapid la -25°C, apoi are loc uscarea în vacuum, timp de 3 ore, în recipiente din sticlă (ampule), care se închid 39

ermetic şi culturile se pot menţine 10 ani. Spori aparţinând genului Aspergillus liofilizaţi şi păstraţi astfel la 7°C şi-au menţinut viabilitatea timp de 23 ani. Bacteriile lactice sunt mai sensibile la păstrare comparativ cu fungii. Astfel, pentru Lactobacillus bifidus liofilizat într-un mediu cu 8% zaharoză, 5% lapte şi 1,5% gel, păstrat la 4°C, timp de 6 luni, procentul de viabilitate a fost de 60%. In lume se cunosc colecţii de culturi care, în marea lor majoritate, cuprind culturi protejate prin brevete; dintre acestea colecţia NRRL - S.U.A., cunoscută din 1975 cu acronym ARS, cuprinde peste 1000 de tulpini în majoritatea lor actinomicete şi mucegaiuri, CBS Fungus Collection (Olanda) conţine 19 300 fungi ş.a. Factori de control al creşterii microorganismelor Celula microbiană, având o masă redusă, este puternic influenţată de condiţiile mediului ambiant şi reacţionează foarte rapid la diferiţii factori, fie prin adaptare fie, în caz contrar, prin dispariţie. Astfel, creşterea microbiană este dependentă de numeroşi factori fizicochimici şi biologici, ceea ce a condus, în cursul evoluţiei, la adaptări specifice prin stabilirea de interrelaţii între microorganisme şi mediu. Pentru a înţelege modul în care celula microbiană reacţionează la condiţiile mediului ambiant, diferiţii factori au fost împărţiţi, în mod arbitrar, în trei mari grupe, cu precizarea că, în condiţii naturale, bioefectul acestora poate fi cumulativ sau sinergie. Factorii extrinseci sunt factori exogeni, ai mediului natural/industrial: temperatura, umezeala relativă a aerului, concentraţia de oxigen, radiaţiile, factori mecanici, factori chimici. Factorii intrinseci sunt factori dependenţi de natura alimentului - biotop, care influenţează creşterea şi activitatea culturilor starter, dar şi natura alterării specifice a produselor alimentare (compoziţia chimică şi concentraţia în nutrienţi, aWf pH, AH, structura anatomică ş.a.). Factorii impliciţi sunt factori biologici determinaţi de relaţiile ce se pot stabili între diferitele grupe de microorganisme, care alcătuiesc microbiota alimentului respectiv. Influenţa factorilor extrinseci asupra microorganismelor Temperatura. Microorganismele sunt piokilotermice, deci temperatura aces-tora variază cu cea a mediului. Temperatura are o mare influenţă asupra proceselor fiziologice ale

celulei, deoarece stimulează sau inhibă activitatea echipamentului lor enzimatic. în funcţie de temperaturile posibile ale mediului natural şi ca rezultat al adaptării, diferitele specii prezintă anumite temperaturi cardinale: temperatura minimă -temperatura la care mai poate avea loc creşterea, iar dacă temperatura scade sub valoarea minimă, creşterea este oprită; temperatura optimă -temperatura la care rata specifică de creştere este maximă; temperatura maximă, la care creşterea este încă posibilă dar prin depăşirea acesteia efectul devine letal. Domeniul general al temperaturilor cardinale pentru majoritatea micro- organismelor cu implicaţii în industria alimentară este situat între 0 şi 75°C şi este mai extins în limite de -34°C...+250°C (în cazul archebacteriilor). Unele microorganisme, care prezintă un domeniu restrâns al temperaturilor cardinale (eugenezice), sunt denumite stenotermice, în timp ce microorganismele cu domeniu extins sunt denumite euritermice. Astfel, procariotele (bacterii) au un domeniu mai extins decât al eucariotelor (drojdii, fungi filamentoşi). 40

în cadrul domeniului general al temperaturilor cardinale, în funcţie de domeniul specific de creştere, microorganismele sunt separate în patru categorii. Microorganismele psihrofiie. în această categorie intră specii care cresc bine la 0°C, au o temperatură optimă de creştere la 10...15°C şi maximă la aproximativ 20°C. Se consideră că aproximativ 90% din microbiota apelor prezintă temperaturi optime de creştere la aproximativ 5°C. Tolerează temperaturi negative şi se consideră că temperatura limită pentru creşterea microorganismelor este -10°C. Din grupa bacteriilor psihrofiie de putrefacţie fac parte genurile: Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Alcaligenes. Microorganismele psichrofile prezintă sisteme enzimatice active la temperaturi scăzute, deoarece conţin în membrana plasmică o concentraţie mai mare de acizi graşi nesaturaţi (acid linoleic), ceea ce explică menţinerea sa în stare semifluidă la rece şi degradarea la temperaturi mai mari de 30°C. Microorganismele psihrotrofe sau facultativ psihrofiie. Aceste micro- organisme au temperatura minimă de creştere la 0°C, cresc bine la 7°C şi produc, prin păstrare la această temperatură, colonii vizibile sau turbiditate după 7-10 zile de păstrare. Au temperatura optimă de creştere între 20 şi 30°C şi maximă la 35...40°C. în acest grup sunt incluse bacterii din genurile: Enterobacter, Hafnia, Yersinia, Pseudomonas, Campylobacter, Vibrio, Listeria; drojdii din genul Candida, genul Rhodotorula şi mucegaiuri, microorganisme ce pot da alterări ale alimentelor păstrate prin refrigerare. Microorganismele mezofile. Reprezintă grupul majoritar, cu temperaturi minime la 15...20°C, temperaturi optime în intervalul 30...40°C şi maximum la temperaturi peste 45°C. Cuprinde bacterii, drojdii, mucegaiuri, inclusiv microorganisme patogene pentru om/animale. Microorganismele termofile. Sunt microorganisme adaptate să crească la temperaturi mai mari de 45°C şi majoritatea au temperaturi optime la 55...65°C şi temperaturi maxime peste 90°C. în cadrul grupului, se diferenţiază microorganisme preferenţial

termofile (Tm = 25...28°C; T0 = 45...55°C; TM = 60...65°C), din care fac parte bacterii lactice ale genului Lactobacillus, unii fungi, precum şi microorganisme obligat termofile (Tm = 37°C; T0 = 50...60°C ; TM = 60...75°C), din care fac parte specii ale genului Bacillus şi Clostridium, actinomicete. Aceste bacterii se înmulţesc mai repede la 60...65°C şi întregul ciclu de dezvoltare are loc în 10-12 ore. Bacteriile termofile prezintă o fază de lag mai redusă, iar timpul de generaţie la temperatura optimă de creştere poate să fie de aproximativ 10 min. Microorganismele termofile sintetizează enzime stabile şi active la temperaturi ridicate, ca urmare a unui conţinut mai ridicat în aminoacizi hidrofobi (glutamină). în ARN-ribosomal al bacteriilor termofile se află un procent mai ridicat al bazelor guanină-citozină care dau stabilitate termică. în compoziţia membranei plasmatice intră lipide cu acizi graşi saturaţi, cu punct de topire mai ridicat. Microoganismele termofile sunt mai pretenţioase din punct de vedere nutritiv, necesitând prezenţa factorilor de creştere în mediu. Sunt afectate de concentraţia de oxigen din mediu, deoarece cu creşterea temperaturii scade solubilitatea oxigenului. între termofile sunt incluse şi specii de drojdii ale genul Candida şi peste 30 de genuri de mucegaiuri (Mucor, Absidia, Aspergillus fumigatus, Penicillium duponti ş.a.). Sunt considerate microorganisme termotolerante acele microorganisme care continuă să crească şi la temperatura de 50°C, şi termodurice - microorganisme care supravieţuiesc prin expunere la temperaturi relativ ridicate, dar nu necesită aceste temperaturi pentru creştere. Microorganismele termofile sunt folosite industrial pentru obţinerea unor produse lactate acide, pentru obţinerea enzimelor termostabile, pentru purificarea 41

apelor reziduale, şi ca bioindicatori pentru anumite tratamente termice. Pot produce alterarea conservelor şi încingerea cerealelor. Valori minime de temperaturi pentru creştere bacteriană Microorganisme Vibrio Yersinia enterocolica , Enterococcus Listeria monocytogenes Clostridium botulinum Salmonella Staphylococcus Temperatura minimă de creştere,°C -5 -2 0 1 3,3 4 6,7

Efectul temperaturilor disgenezice se referă la efectul temperaturilor subminimale şi supramaximale. Temperaturile subminimale. Păstrarea celulelor la temperaturi situate sub valoarea temperaturii lor minime afectează activitatea în sensul reducerii vitezei de desfăşurare a metabolizării substanţelor nutritive şi, în consecinţă, determină scăderea

producerii de proteine/enzime prin biosinteză, La scăderea temperaturii cu 10°C sub temperatura minimă, viteza de metabolism se reduce până la 20%, iar explicaţia constă în faptul că, la temperaturi scăzute, are loc o pliere a moleculelor de proteine, cu formarea de noi legături între lanţurile peptidice, care conduc la mascarea centrului activ al enzimei. Astfel, accesul substratului la catalizator este blocat şi nu se mai desfăşoară reacţiile de anabolism/catabolism. Celulele pot trece într-o stare latentă de viaţă, respectiv starea de psihroanabioză. Dacă temperaturile scad sub temperatura de îngheţare a apei, celula trece în starea de crioanabioză şi, în acest caz, pot avea loc modificări ireversibile de natură fizico-chimică, care conduc la moartea/distrugerea celulelor. Degradarea ireversibilă este datorată fie cristalelor de gheaţă, care se formează extracelular/intracelular, fie plasmolizei avansate, ca rezultat al difuziei apei din interiorul celulei în exterior, unde formează cristale mari de gheaţă. în condiţii de crioanabioză (congelare sub -10°C), procentul de supravieţuitori se reduceîn funcţie de specie. Cunoaşterea comportării celulelor şi a proceselor care au loc la temperaturi subminimale a condus la numeroase aplicaţii practice: - păstrarea prin refrigerare (-2°C...+ 8°C) prelungeşte durata de păstrare a valorii alimentare a produselor la zile-săptămâni. Durata este limitată în funcţie de natura şi concentraţia microorganismelor aflate pe produs şi de gradientul de temperatură. Astfel, prin introducerea alimentelor calde în spaţiul de refrigerare, microorganismele continuă să se înmulţească la o rată impusă de viteza de răcire; - păstrarea prin congelare (-10°...-60°C) nu conduce la o sterilizare a produselor, deoarece microorganismele pot să rămână viabile în produsul congelat în proporţie de 10-40% din numărul iniţial. Când congelarea are loc lent (3-72 ore), procentul de supravieţuitori este mai ridicat, deoarece apa migrează din celulă în exterior, formând cristale mari de gheaţă, nu se produce un şoc termic, astfel încât celula se adaptează şi îşi menţine viabilitatea în stare de plasmoliză. O parte din celule sunt distruse de către cristalele care cresc în dimensiuni şi cauzează rupturi ale învelişurilor celulare sau datorită prelungirii stării de plasmoliză. 42

Când congelarea se face rapid, mai ales până la atingerea temperaturii de -20°C, se formează cristale mici, atât intracelular cât şi extracelular, ce pot produce distrugerea membranei şi a componentelor celulare, blocarea metabolitilor, şoc termic la terrmofile şi mezofile, încât procentul de supravieţuitori este mai mic comparativ cu congelarea lentă. Deoarece prin congelare apa legată nu îngheaţă, în timpul păstrării se produce deshidratarea, au loc pierderi de gaze 02/C02, modificări de pH de până la 0,2-2 unităţi şi unele proteine sunt ireversibil denaturate. în produse congelate la -20°C, indicele aw este de 0,8 şi scade la 0,62 la temperaturi de -50°C. Din acest motiv, produsele congelate au o durată de păstrare definită, deoarece unele enzime de natură microbiană sau din ţesut pot să fie active; în special lipazele se menţin active până la -12°C şi dau modificări senzoriale nedorite, de exemplu în carne, îngheţată ş.a.

în funcţie de forma celulei, bacteriile cu forma sferică sunt mai rezistente la congelare decât bacteriile sub forma de bacili. Este important de subliniat că endosporii bacterieni şi toxinele ca şi bacteriile-agenţi ai toxiinfecţiilor alimentare nu sunt afectate de temperaturile din domeniul de congelare. Congelarea este utilizată şi pentru păstrarea culturilor microbiene. Pentru aceasta, celulele recoltate din mediul de cultivare se suspendă într-o soluţie de glicerol, lactoză 10% sau xiloză, cu rol stabilizator, apoi se face o congelare lentă cu 1°C/min şi se păstrează în această stare de crioanabioză până în momentul folosirii. După decongelare, microorganismele au un timp de generaţie mai mare decât cel specific şi necesită activarea. Temperaturi supramaximale. Temperaturile care depăşesc cu 10°C temperatura maximă de creştere determină în celula microbiană denaturări ireversibile, ce conduc la moartea fiziologică a celulelor, ca rezultat al coagulării proteinelor, al unor procese de oxidoreducere şi al inactivării enzimelor. Enzimele (la creşterea temperaturii peste valoarea maximă) suferă modificări în arhitectura moleculară, au loc dezaminări ale unor aminoacizi (de exemplu, ale argininei care este mai sensibilă), au loc rupturi în stratul moleculelor de apă legată de moleculele proteice, se produc desfaceri ale legăturilor disulfitice şi, în final, are loc inactivarea ireversibilă asociată cu distrugeri parţiale ale învelişurilor celulare. O bacterie este considerată moartă, dacă nu mai creşte când se inoculează într-un mediu de cultură care, în mod normal, îi asigură creşterea. Viteza de inactivare termică a celulelor microbiene este dependentă de raportul temperatură/timp, respectiv cu cât creşte temperatura se reduce timpul necesar pentru inactivare. Formele vegetative ale microorganismelor sunt mai sensibile decât formele sporulate. De asemenea, celulele tinere, care au şi un conţinut mai mare de apă în citosol, sunt mai rapid inactivate decât cele mature. Formele cu cea mai ridicată termorezistentă sunt formele sporulate ale bacteriilor din genurile Bacillus şi Clostridium, care necesită încălzirea la 120°C, timp de 5-20 min, în medii umede, şi 160...180 °C, timp de 45-60 min, în mediu uscat. Compoziţia mediului şi valoarea pH-ului influenţează viteza de distrugere termică a celulelor. Astfel, medii sau produse alimentare cu pH acid se sterilizează mai uşor, iar produsele bogate în proteine, glucide, lipide, cu rol protector, la aceeaşi temperatură de sterilizare necesită un timp prelungit. Un factor biologic important pentru eficienţa sterilizării este concentraţia de celule în produsul supus sterilizării, deoarece denaturarea termică este un proces de prim ordin şi în fiecare fracţiune de timp se distruge o fracţiune din numărul total de celule din produs. 43

în practica microbiologică de laborator se aplică următoarele regimuri de sterilizare: -20 min, la 121°C, în mediu de vapori (autoclav), pentru medii de cultură;

- 1-2 ore, la 170°C, sau 45 min, la 180°C, în aer (etuvă), pentru sticlărie; - flambarea la roşu aplicată în tehnici aseptice pentru ansă şi fir. în practica microbiologică se mai aplică şi tindalizarea, care constă în 2-3 pasteurizări repetate, alternate cu perioade în care proba este menţinută în condiţii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni. Tindalizarea se aplică mediilor ce conţin substanţe termolabile. Umiditatea. Viaţa microbiană este posibilă numai atunci când în mediul nutritiv există apă liberă care participă ca solvent, ca mediu de reacţie pentru enzimele celulare şi pentru transportul bidirecţional al produselor de metabolism. Dacă conţinutul de apă liberă intracelulară se reduce, celulele trec în stare de preanabioză, continuată cu anabioza, în care enzimele trec în stare inactivă iar metabolismul este mult redus, intervenind starea latentă de viată. Microorganismele se pot dezvolta într-un domeniu.larg de aw situat între 0,62 şi 1,00, şi, în funcţie de adaptare, în raport cu limitele de aw, se pot împărţi în trei categorii: - microorganisme xerofite - aw = 0,62...0,75, din care fac parte mucegaiuri din genul Xeromyces, genul Aspergillus, drojdii osmotolerante, bacterii halotolerante; - microorganisme mezofite - aw= 0,75...0,85, majoritatea fungilor, bacterii; - microorganisme hidrofite - aw = 0,85...0,99, predominant bacterii. Cunoaşterea comportării celulelor în raport cu umiditatea ca factor extrinsec - ce condiţionează cantitatea de apă liberă accesibilă pentru desfăşurarea proceselor vitale se aplică la conservarea prin uscare a produselor alimentare. Dacă acestea se păstrează în condiţii în care creşte treptat umiditatea, primele microorganisme care se dezvoltă aparţin grupului xerofitelor. Concentraţia de oxigen. Microorganismele necesită oxigen pentru biosinteza compuşilor organici şi pentru desfăşurarea proceselor de oxidoreducere biologice. în funcţie de necesarul în oxigen procurat din aer (ce conţine aproximativ 20% oxigen) se disting 5 tipuri de comportare diferenţiată a microorganismelor şi anume ; - aerobe, care sunt dependente de oxigenul din aer; se dezvoltă la suprafaţa lichidelor; - facultativ anaerobe, care se dezvoltă în medii lichide (oxigenul din aer este puţin solubil); - aerotolerante anaerobe, pe care oxigenul dizolvat în lichid le lasă indiferente; - microaerofile, care se dezvoltă la distanţă de suprafaţă, când concentraţia în oxigen este de 5-10%; - anaerobe, pentru care oxigenul din aer este toxic, deoarece nu pot descompune apa oxigenată care are efect distructiv asupra celulei. Energia radiantă. Lumea vie este bombardată de radiaţii electromagnetice cu lungimi de undă între 10"4 şi 106 nm; în acest domeniu microorganismelesunt influenţate de radiaţii în mod specific: Radiaţii Ionizante (a, p, y), cu lungimi de undă mai mici de 12 nm, au energie radiantă intensă ce acţionează prin ionizare cu eliberarea de ioni, radicali liberi ce acţionează prin ruperea legăturilor de hidrogen, oxidarea şi formarea dublelor legături, modificări în structură, polimerizări. în prezenţa oxigenului, acţiunea radiaţiilor ionizante este

amplificată prin generarea de radicali OH". Sunt intensificate procesele de oxidare, denaturarea ADN-ului, ceea ce conduce la moartea celulei. Radiaţiile y, 44

emise de Co, au o putere mare de penetrare şi, de aceea, se pot folosi pentru sterilizarea ambalajelor. Eficienţa acestor radiaţii depinde de forma şi starea celulei; celulele cu forma coccus sunt mai rezistente decât formele bacilare, iar formele vegetative sunt mai sensibile decât în stare sporulată. Succesiunea în sensul creşterii rezistenţei la efectul distructiv al radiaţiilor este următoarea; bacterii Gram-negative > > bacterii Gram-pozitive > fungi > virusuri. Deşi efectul radiaţiilor ionizante se manifestă asupra, tuturor micro organismelor, acestea au o radiosensibilitate diferită, care se poate aprecia prin determinarea valorii D10 (adică doza absorbită care produce distrugerea a 90 % din populaţia iniţială). Valori D10 pentru bacterii întâlnite pe alimente Bacterii Clostridium botulinum Escherichia coli Lactobacillus sp. Micrococcus radiodurans Pseudomonas sp D10 (kGy) 1,5-2,5 0,2-0,45 0,8-2,2 2,1-8 0,07-0,32

Radiaţii ultraviolete (10-400 nm). în condiţii normale pe Tera nu ajung radiaţii cu lungimi mai mici de 287 nm, deoarece acestea sunt reţinute de stratul de ozon protector cu o grosime de aproximativ 40 km. Acest lucru are o semnificaţie deosebită, deoarece radiaţiile UV, cu A între 260 şi 254 nm, au efect letal sau mutagen asupra celulelor vii. Radiaţiile ultraviolete, în funcţie de doză şi starea microorganismelor, au efect letal maxim la A = 254 nm şi produc degradarea triptofanului cu formarea de compuşi toxici ce conduc la moartea fiziologică a celulei expuse. Dacă doza este subletală, radiaţiile induc modificări de structură ale ADN-ului, favorizând cuplarea moleculelor de timinâ, informaţia genetică se transmite eronat şi se pot obţine mutanţi. Microorganismele pot să-şi refacă structura iniţială prin fotoreactivare când, în prezenţa luminii, sunt activate enzimele care desfac dimerii timinei, sau la întuneric, când celula are capacitatea de a elimina porţiunea denaturată. în practică, radiaţiile UV se pot folosi pentru sterilizarea aerului şi pentru obţinerea de mutanţi valoroşi, performanţi prin produşii lor de biosinteză. Radiaţiile luminoase (1-103 nm) sunt utile bacteriilor din diviziunea Photobacteria. Microorganismele chimiosintetizante preferă să se dezvolte în întuneric. Dintre acestea, unele microorganisme pot produce pigmenţi cu rol protector, ceea ce le permite dezvoftarea în prezenţa luminii.

Radiaţiile infraroşii (A > 103 nm) acţionează prin energie calorică şi induc transformări ireversibile ale protidelor. Energia sonică. Ultrasunetele cu frecvenţă mică (960 kHz) pot să producă distrugeri fizice ale celulei, într-un procent de 30-50%, datorate fenomenului de cavitaţie ultrasonoră şi efectelor termice. Se pot folosi la sterilizarea apei şi pentru distrugerea pereţilor celulari ai microorganismelor, în scopul extragerii unor compuşi intracelulari. La intensităţi ultrasonore mici, undele au un efect stimulativ asupra metabolismului celular. Factorii mecanici. Dintre operaţiile utilizate în tehnica de analiză microbiologică se aplică frecvent centrifugarea, filtrarea şi agitarea. 45

Centrifugarea este folosită pentru separarea biomasei de drojdii din medii de cultură, când se folosesc viteze de centrifugare de 4 000-6 000 rot/min, iar pentru separarea celulelor bacteriene, viteze de 6 000-12 000 rot/min. Se mai aplică lichidelor ce conţin un număr redus de celule, în scopul concentrării lor în centrifugat, în vederea controlului microbiologic. Filtrarea realizează reţinerea mecanică a celulelor microbiene, atunci când diametrele porilor materialului filtrant sunt mai mici decât dimensiunea celulelor. Separarea prin filtrare se mai poate realiza prin adsorbţie electrostatică, atunci când materialul filtrant cu sarcină pozitivă reţine bacteriile cu sarcină negativă. în practica de laborator se foloseşte sterilizarea prin filtrare a mediilor de cultură lichide ce conţin în compoziţie compuşi termolabili (de exemplu, vitamine). Filtrarea se poate aplica pentru determinarea numărului de bacterii din apă sau din alte medii lichide, când se face filtrarea unui volum determinat din produsul de analizat prin membrane filtrante din acetat de celuloză. După filtrare, membrana poate servi pentru numărarea directă a celulelor sau poate fi transferată pe suprafaţa unui mediu nutritiv solidificat repartizat în placă şi după termostatare se numără coloniile dezvoltate. Agitarea se aplică la cultivarea microorganismelor în condiţii de laborator, pentru obţinerea culturilor pe agitator, sau la cultivarea submersă în condiţii industriale, deoarece asigură un mai bun contact între celule şi mediul de nutriţie şi avantajează concomitent aerarea mediului şi a culturii. Factorii chimici. Substanţele chimice cunoscute prezintă o mare diversitate de compoziţie şi se diferenţiază în funcţie de efectul pe care îl manifestă asupra celulelor microbiene, şi anume: - efect stimulator, benefic, la concentraţii mici, deoarece numeroase substanţe conţin elemente majore sau minore ce intră în componenţa compuşilor celulari; - efect de stagnare a creşterii (microbiostatic), ca rezultat al acţiunii unor substanţe asupra enzimelor microbiene cu rol în metabolismul celulei vii;

- efect letal (microbicid) atunci când substanţa, în funcţie de doză, conducQ la modificări ireversibile şi, deci, se produce distrugerea fizică sau inactivarea enzimelor (moartea fiziologică). Toxicitatea este caracteristica rezultată din manifestarea biologică a organismului în care a pătruns o substanţă toxică şi este consecinţa a două reacţii şi anume acţiunea toxicului asupra celulei vii şi acţiunea celulei asupra toxicului. Din punct de vedere ale toxicităţii şi ale efectului produs de substanţele chimice cu efect antimicrobian, acestea pot fi împărţite în patru grupe. Substanţele chimioterapice au efect negativ asupra microorganismelor patogene şi nu sunt toxice pentru organismul uman la dozele la care sunt aplicate în terapeutică. Substanţe ca antibiotice, sulfamide ş.a. acţionează prin activarea enzimelor litice din lizozomi, inhibă sinteza peretelui celular (de exemplu, strepto-micina acţionează prin blocarea biosintezei protidelor în ribozomi), distrugerea permeabilităţii membranei plasmatice sau interferează prin dereglarea biosintezei polimerazelor cu rol în sinteza acizilor nucleici. Substanţele antiseptice cuprind un grup mare de substanţe cu rol în combaterea sepsieii (infecţie)..în medicină, prin antiseptice se înţeleg substanţele toxice pentru organismul uman (administrate pe cale orală) folosite pentru uz extern împotriva patogenilor de infecţie (stafilococi, streptococi patogeni ş.a.) Substanţele conservante sunt substanţe netoxice pentru organismul uman şi în concentraţii mici au efect microbiostatic, folosite în industria alimentară. pentru conservarea prelungită a calităţii produselor alimentare. Numărul conservanţilor utilizaţi în industria alimentară este limitat de OMS şi FAO, în funcţie de condiţiile pe 46

care aceştia trebuie să le îndeplinească şi anume: să prezinte un spectru larg de acţiune, să aibă putere microbiostatică la concentraţii mici, să fie stabili, solubili, netoxici, economici. Conservanţii determină încetinirea creşterii microbiene acţionând prin inactivarea unor enzime specifice, blocarea unor căi metabolice, prelungind astfel intervalul de timp până ce se constată alterarea microbiană a produsului. Substanţele dezinfectante cu efect microbicid sunt toxice pentru organismul animal şi folosite în industria alimentară pentru dezinfecţia utilajelor, a spaţiilor de producţie, a ambalajelor, pentru unele materii prime. Modul de acţiune al substanţelor chimice folosite în industria alimentară, în funcţie de natura substanţei chimice şi a microorganismelor, efectul substanţelor chimice poate fi efect microbiostatic, ce se manifestă prin reducerea vitezei de desfăşurare a metabolismului şi oprirea înmulţirii celulelor. Conservanţii, în funcţie de compoziţie, pot să producă următoarele efecte: - blocarea activităţii unor enzime: acidul benzoic, acidul sorbic (inhibă activitatea dehidrogenazelor); - scăderea valorii de pH la limite disgenezice (cu acizii lactic, acetic). Efectul microbicid (germicid) este produs de către dezinfectanţi ce pot acţiona prin :

- denaturarea ireversibilă a proteinelor şi enzimelor produse de acizi, baze, săruri; - blocarea grupărilor amino din structura protidelor, aminoacizilor, cu formarea de punţi metilenice şi inactivarea de enzime(aldehida formică); - permeabilizarea învelişurilor celulare, cu pierderea compuşilor intracelulari şi pătrunderea substanţei toxice, în cazul folosirii de săpunuri, detergenţi, săruri cuatemare de amoniu ş.a. Factori care influenţează efectul antimicrobian al substanţelor chimice. Efectul unor substanţe chimice este condiţionat de factori biologici, fizico-chimici şi factori dependenţi de mediu Factorii biologici. Efectul unei substanţe chimice este dependent de natura microorganismelor, starea în care se află şi numărul de microorganisme prezente în mediul ce urmează a fi conservat. Microorganismele sunt mai sensibile la acţiunea substanţei chimice, atunci când se află în stare vegetativă şi mai rezistente în starea lor sporulată. Celulele tinere cu un conţinut mai mare de apă liberă sunt mai sensibile decât celulele mature. Eficienţa este dependentă de numărul de microorganisme în momentul utilizării, deoarece fiecare celulă absoarbe şi reţine o cantitate din doza adăugată. Astfel, prin adăugarea unei doze constante, eficienţa acesteia se reduce când încărcarea microbiană este mare. Un factor biologic cu implicaţii practice este fenomenul de adaptare al microorganismelor la adaosul de substanţe chimice. în practică se pot utiliza culturi starter adaptate la doze crescute din substanţa la care alte microorganisme sunt sensibile. Un exemplu ar fi folosirea de dioxid de sulf la fermentarea mustului de struguri cu drojdii de cultură sulfitorezistentg. Pentru a evita adaptarea microorganismelor, în practică se recomandă alternarea substanţelor dezinfectante. Factori fizico-chimici. Fiecare substanţă chimică acceptată în practică se caracterizează prin spectru de acţiune şi putere antiseptică (conservantă). Spectrul de acţiune reflectă efectul specific sau generalizat. Astfel, pentru conservanţi, efectul poate fi general (fungistatic) sau specific (levuristatic, bacteriostatic), în timp ce pentru dezinfectanţi efectul poate fi microbicid (general), bactericid, virulicid, fungicid. Prin putere antiseptică se apreciază efectul substanţei chimice în raport cu o substanţă etalon, stabilindu-se astfel o scară de apreciere. Ca substanţă etalon se foloseşte fenolul, în funcţie de care se stabileşte coeficientul fenolic: Gf= Doza letală a fenolului / Doza letală a substanţei analizate. 47

în calitate de microorganisme-test se pot folosi Salmonella typhi sau Staphy-lococcus aureus. în timp ce alcoolul etilic de 70° are coeficientul fenolic egal cu 0,04, clorul gazos are valoarea 200. Puterea antiseptică este dependentă de temperatură şi anume, cu creşterea temperaturii cu 10 grade a soluţiei dezinfectante, puterea creşte de 20 ori; de aceea, în industria alimentară dezinfecţia se face cu soluţii la temperaturi de 60-70°C, când eficienţa este maximă. Factori dependenţi de mediu. Eficienţa substanţei chimice depinde de solubilitate şi de factorii care o influenţează. Substanţele chimice nu trebuie să

reacţioneze cu componentele mediului. Multe substanţe cu efect antimicrobian nu pot fi folosite, ca urmare a faptului că reacţionează cu protidele. De exemplu, clorul şi hipocloriţii îşi reduc efectul antiseptic, dacă se introduc în ape cu grad ridicat de impurificare. Eficienţa substanţelor conservante poate creşte ca urmare a unui efect de sinergism, efect cooperant ce permite utilizarea în amestec a mai multor substanţe în concentraţii mai mici decât cele necesare la folosirea lor separată, pentru a avea aceeaşi eficienţă Influenţa factorilor intrinseci asupra microorganismelor Factorii intrinseci se referă la diferitele componente chimice şi la structura produselor alimentare care influenţează activitatea microorganismelor prezente peAn produs. în funcţie de prezenţa concomitentă a mai multor factori, din totalul microorganismelor ce pot fi prezente în produs, este favorizată activitatea unui număr restrâns, de obicei a 1-4 specii care vor produce şi alterarea specifică a produsului alimentar. Produsele alimentare au o compoziţie chimică foarte diversificată şi un grad de încărcare cu microorganisme foarte diferit, ce depinde de cel al materiilor prime şi auxiliare, precum şi de factorii extrinseci ce intervin la prelucrare şi păstrare. Dintre factorii intrinseci, dependenţi de alimentul care va reprezenta substratul pentru activitatea microorganismelor (adăugate prin culturile starter sau provenite din contaminări), mai importanţi sunt cei prezentaţi în continuare. Compoziţia chimică a alimentelor. Aceasta reprezintă un factor important, deoarece microorganismele necesită pentru creştere surse de carbon, azot, săruri minerale, factori de creştere şi apă disponibilă. Cu cât alimentul este mai complex, cu atât mai mult asigură condiţii favorabile pentru creşterea mai rapidă a unui număr mai mare de microorganisme şi este mai alterabil. Produsele alimentare lichide se alterează mai rapid decât cele sojide, pentru că celulele microbiene vin în contact direct cu nutrienţii solubili. Produsele vegetale (fructe, legume) cu un pH acid şi lipsite de vitamine din grupul B sunt alterate preferenţial de către mucegaiuri care nu necesită factori de creştere şi care pot produce hidroliza enzimatică a poliglucidelor din învelişul lor protector. Produsele bogate în glucide simple sunt, de obicei, fermentate cu formare de alcooli, acizi, încât prin scăderea de pH este inhibată activitatea bacteriilor de putrefacţie, care necesită pentru dezvoltare pH neutru. Carnea, care conţine cantităţi importante de substanţe azotate având un pH apropiat de neutru, va favoriza dezvoltarea bacteriilor de putrefacţie ce pot folosi ca sursă de azot protidele. Alimentele ce conţin grăsimi vor fi alterate preferenţial de microorganisme producătoare de lipaze: Pseudomonas, Bacillus, Candida; Geo-trichum, Aspergillus, Rhizopus etc. Structura anatomică. Influenţează activitatea microbianâ ca urmare a menţinerii la distanţă a microorganismelor faţă de nutrienţii accesibili. Astfel, oul se alterează greu, deoarece coaja poroasă şi membrana împiedică pătrunderea unor 48

microorganisme. Seminţele oleaginoase sau ale cerealelor prezintă un înveliş celulozic protector ce nu poate fi degradat decât de microorganisme celulozolitice. Prin absorbţie de apă, acestea suferă mucegăirea, deoarece mucegaiurile sunt cele ce au condiţii favorizante. La fructele cu înveliş ceros, greu penetrabil, alterarea intervine în zonele în care se produc leziuni mecanice, înţepături de insecte etc. Valoarea pH-ului. Este o proprietate inerentă a unor produse naturale ce conţin cantităţi ridicate de acizi organici sau devin acide prin procese fermentative dirijate (produse conservate prin murare). Microorganismele se dezvoltă în limite largi de pH (între 1,5 şi 11). în acest interval, microorganismele acidotolerante - drojdii, mucegaiuri, bacterii lactice şi acetice preferă un pH = 2,5-5,5 şi se vor dezvolta în produse acide care, astfel, pot suferi fermentaţia sau mucegăirea. Bacteriile de putrefacţie, care preferă un pH neutru, nu se pot dezvolta în medii acide, medii care sunt astfel protejate. Valori limită de pH pentru creşterea microbiană Grupe die microorganisme Drojdii Mucegaiuri Bacterii Valori minime 1,5-3,5 1,5-3,5 4,5 Valori optime 4-6,5 4,5-6,8 6,5-7,5 Valori maxime 8-8,5 8-11 11

Acţiunea pH-ului asupra creşterii microbiene se explică prin faptul că disponibilitatea unor nutrienţi este modificată de echilibrul ionic. Astfel, la pH acid, ionii de magneziu formează complexe insolubile, în timp ce la pH bazic sunt complexaţi ionii de calciu, zinc şi ionii ferici, elemente cu rol de cofactori ai enzimelor microbiene. Valori extreme de pH influenţează permeabilitatea membranelor celulare. în mediu acid, permeazele cationice sunt saturate cu ioni de H+ care limitează sau anulează transportul cationilor indispensabili pentru celule; în mediu alcalin, membrana este saturată cu OH" şi este împiedicat transferul de anioni necesari. La modificări de pH se modifică şi cinetica reacţiilor enzimatice care se desfăşoară optim la anumite valori specifice. Microorganismele patogene, de exemplu Campylobacter şi Clostridium, sunt mai sensibile decât cele din genul Escherichia, Salmonella, Staphylococcus. Clostridium botulinum are pH-ul minim pentru producerea de neurotoxine egal cu 4,8, iar Staphylococcus aureus are pH-ul minim pentru creştere de 4,2. Valoarea pH-ului. Este dependentă de prezenţa în aliment a substanţelor cu caracter oxidant sau reducător. Se poate exprima valoarea A?H în funcţie de valoarea de pH cu relaţia: pH = (EH + 0,058 pH) / 0,029. Alimentele cu potenţial de oxidoreducere scăzut (pH = 0-12) favorizează dez- voltarea anaerobilor, de exemplu în lapte, în timp ce fructele cu pH ridicat (18,5-28) favorizează dezvoltarea microorganismelor aerobe. Diverse lichide cu valori medii de pH (12-18,5) permit activitatea fermentativă a drojdiilor, a bacteriilor lactice. Potenţialul de oxidoreducere EH depinde atât de raportul între substanţele cu caracter reducător şi oxidant cât şi de tensiunea de oxigen la contactul produsului cu aerul.

Oxigenul influenţează potenţialul de oxidoreducere din mediu şi are efect specific asupra metabolismului; în prezenţa oxigenului are loc oxidarea glucidelor, aminoacizilor, acizilor graşi cu formarea de apă şi gaze: C02, NH3, în timp ce în 49

absenţa oxigenului se formează produse intermediare: alcooli, acizi, glicerol, acizi graşi, NH3, H2S. Potenţialul de oxidoreducere, în volţi, măsoară facilitatea cu care un mediu pierde sau câştigă electroni. Dacă mediul pierde electroni, este reducător şi potenţialul de oxidoreducere este negativ, dacă mediul câştigă electroni, este oxidant iar potenţialul de oxidoreducere este pozitiv. în timp ce sucurile din plante au un EH pozitiv (+ 200...+ 300) şi sunt alterate de mucegaiuri, bacterii aerobe, brânzeturile care au EH negativ (-20..-200) sunt alterate de către bacteriile butirice anaerobe. Indicele de activitate al apei (aw). Acest indice din produsele alimentare reflectă conţinutul de apă liberă pusă la dispoziţia microorganismelor pentru reacţii chimice, biochimice, transfer de metaboliţi prin membrane semipermeabile. Domeniul general de aw pentru dezvoltarea microorganismelor este 0,620-0,99; cele mai pretenţioase sunt bacteriile care necesită cantităţi mari de apă liberă, în timp ce drojdiile osmotolerante şi mucegaiurile xerofite se dezvoltă la valorile minime ale domeniului. între conţinutul de umiditate al produselor alimentare, determinat prin uscare la etuvă la temperaturi de 105°C, până la masă constantă, şi indicele de awnu se pot stabili relaţii de interdependenţă. De exemplu, un indice awegal cu 0,7 corespunde la următoarele produse: lapte praf cu 7% umiditate, carne deshidratată cu 10% umiditate, legume deshidratate cu 11-22% umiditate. O soluţie de sare 7% şi o soluţie de zahăr 25% au acelaşi aw = 0,96 şi concentraţiile trebuie să crească la 23% şi, respectiv, la 63% pentru ca acest indice să scadă la valoarea de 0,8 la folosirea lor separată. Microbiota produselor conservate prin uscare este formată din: mucegaiuri ale genurilor Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Alternam, Scopulariopsis; drojdii cu genurile Hanseniaspora, Saccharomyces, Pichia; bacterii cum ar fi: cele sporulate, lactice, micrococi. în siropuri cu aw = 0,62-0,65 se pot dezvolta drojdii osmotolerante din genul Zygosaccharomyces. Alimentele cu aw între 0,62 şi 0,85 suferă alterări datorită drojdiilor osmotolerante şi mucegaiurilor xerofite. Se consideră că un aliment prezintă garanţia stabilităţii atunci când are un aw = 0,7. Conservarea prin uscare, în soluţii de zahăr sau sare, se explică prin aceea că diminuarea aw antrenează plasmoliza celulelor microbiene. Valori minimale ale aw Limite de aw alimentare Microorganisme Produse

1-0,95 Bacterii Gram-negative, bacterii sporulate, unele drojdii Produse cu 20% zahăr sau 7% sare

(salamuri, produse panificaţie) 0,95-0,91 Micrococi, bacterii lactice, bacterii sporulate, forme vegetative Produse cu 55% zahăr sau 12% sare (brânzeturi, salamuri afumate) 0,91-0,87 15% sare 0,87-0,80 0,80-0,70 0,75-0,65 0,65-0,60 0,50 0,40 0,20-0,30 50 Majoritatea drojdiilor Majoritatea mucegaiurilor Majoritatea bacteriilor halofile Mucegaiuri xerofite Drojdii osmofile Nu se dezvoltă microorganisme Nu se dezvoltă microorganisme Nu se dezvoltă microorganisme Produse cu 65% zahăr sau Făinuri, orez cu 15-17% apă Alimente cu 26% sare Produse cu 10% apă Fructe uscate cu 15-20% apă Caramele cu 8% apă Produse cu 3-5% apă Produse cu u % < 5%

Mucegaiurile necesită un aw mai ridicat pentru formarea de spori şi micotoxine pentru germinarea sporilor sau pentru creştere. Valori minime ale aw pentru specii/genuri de microorganisme Microorganisme Clostridium botulinum Bâcillus cefeus StaphylocoCcus aureus Pseudomonas, Achromobacter Escherichia coli Bacterii halofile Saccharomyces cerevisiae Zygosaccharomyces rouxii, rosei, mellis Penicilium expansum Aspergillus flavus Aspergillus repens Indice de activitate al apei 0,95-0,97 0,93 0,9-0,85 >0,95 0,95 0,75 0,94 0,62 -0,65 0,85 0,78 0,70

în timp ce produsele conservate prin uscare suferă frecvent mucegăirea, deoarece mucegaiurile necesită cele mai mici cantităţi de apă pentru germinare şi creştere, în produsele cu valori ridicate ale aw, alterarea este frecvent produsă de bacterii care au o viteză mai mare de reproducere şi câştigă în competiţie. Unele microorganisme se pot adapta la scăderea de aw, iar dacă produsul alimentar este^ păstrat la temperatura optimă de creştere, acestea îşi extind domeniul valorilor ( eugenezice de aw. Substanţele naturale cu efect antimicrobian Unele produse vegetale folosite în alimentaţie conţin substanţe denumite fitoncide. Astfel, ceapa conţine alicină; usturoiul, alil sulfonat; de asemenea, hreanul, muştarul, cuişoarele, scorţişoara conţin fitoncide. Unele fructe pot conţine benzoat, salicilat, aşa cum este cazul fructelor de pădure. în unele produse de origine animală, cum ar fi ouăle, este prezent lizozimul, iar în laptele proaspăt sunt prezente, pe lângă lizozim, lactenine, lactoperoxidază. Desigur că aceste substanţe au un spectru specific şi pot influenţa doar activitatea microorganismelor sensibile. Influenţa factorilor Impliciţi Interrelaţiile ce pot apărea în condiţii naturale între microorganisme care trăiesc în acelaşi mediu sau pe acelaşi aliment sunt foarte complexe. Din cauza proprietăţilor variate ale diferitelor specii şi a intensităţii cu care decurg procesele lor metabolice, aceste relaţii au un rol important asupra vieţii microorganismelor şi indirect asupra modificărilor pe care le suferă alimentele. Calitatea produselor finite şi conservabilitatea (of aste dependentă de corelaţiile care se stabilesc între microorganismele existente la un moment dat pe alimentul care le asigură necesităţile nutritive. Dintre relaţiile ce se pot stabili între diferite grupe de microorganisme, mai importante sunt cele prezentate în edfrtîrtuard, 51

Neutralismul corespunde unor relaţii de indiferenţă între două sau mai multe specii, atunci când acestea se deosebesc mult prin exigenţele nutritive. Foarte puţine specii sunt strict neutrale, de obicei se formează asocieri care au caracter temporar sau accidental, reacţionând unele faţă de altele în mod favorabil şi sinergie sau, dimpotrivă, antagonic. Mutualismul (simbioza) reprezintă un tip de relaţie care permite dezvoltarea simultană pe un substrat comun a unor specii diferite, care exercită una asupra alteia o influenţă bilateral favorabilă. Un exemplu îl oferă bacteriile lactice şi drojdiile folosite în culturi mixte la fabricarea produselor lactate acide, la prepararea culturilor starter de producţie în panificaţie. Drojdiile produc vitamine ale grupului B, care sunt factori de creştere pentru

bacteriile lactice, iar acestea produc acid lactic, care asigură drojdiilor un pH optim pentru activitatea lor. Comensalismul (metabioza) este caracterizat prin creşterea împreună a două sau mai multe specii de microorganisme aflate într-o relaţie în care una profită de asociere iar cealaltă, în aparenţă, nici nu profită nici nu este influenţată negativ. Comensalismul se realizează fie prin elaborarea de către unul din parteneri a unor substanţe care favorizează dezvoltarea celorlalţi, fie prin modificarea mediului care devine mai favorabil pentru speciile asociate. Comensalismul se întâlneşte frecvent la păstrarea laptelui, la fermentarea lactică a produselor vegetale, la fabricarea vinului, a brânzeturilor ş.a. Sinergismul este o relaţie de tip cooperant în care două sau mai multe specii produc împreună un efect pe care, în mod izolat, nu î| pot realiza. De exemplu, putrezirea lemnului este posibilă numai prin asocierea cooperantă a mucegaiurilor şi a bacteriilor celulozolitice. Antagonismul se manifestă sub forma unor corelaţii complexe între grupe de microorganisme în care una din specii se comportă ca agresor şi profită de pe urma asociaţiei cu celelalte specii care sunt prejudiciate. Se consideră că nu există microbi fără antagonişti. Fenomenul de antagonism microbian poate fi datorat mai multor cauze: - viteză diferită de creştere şi multiplicare a speciilor antagonice. Atunci când mediul conţine substanţe accesibile tuturor microorganismelor, de obicei, predomină bacteriile care au un timp de generaţie mai mic decât cel al fungilor; - insuficienţa în mediu a substanţelor'nutritive. în medii cu un conţinut redus într-o substanţă utilă, aceasta este consumată de specia cea mai adaptată la mediu; - acţiunea unor substanţe de metabolism ce pot produce un antagonism nespecific, atunci când efectul se exercită asupra tuturor asociaţilor (de exemplu, acidul lactic format prin fermentaţie inhibă prin reducerea de pH activitatea tuturor bacteriilor de putrefacţie), sau un antagonism specific, când substanţa produsă (de exemplu, antibioticele) are efect selectiv asupra unui grup restrâns. Relaţii antagonice între microorganisme Microorganisme patogene Microorganisme antagonice Clostridium botullnum Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. Clostridium perfringens Clostridium sporogenes, Lactobacillus sp. Staphylococcus Streptococcus, Pseudomonas, Enterobacter Salmonella Escherichia coli Parazitismul reprezintă un tip de relaţie antagonică în care un microorganism se dezvoltă pe seama celuilalt. Se manifestă prin liza celulelor microbiene ca rezultat al acţiunii fagilor (bacteriofagi, micofagi). Cunoaşterea factorilor impliciţi care condiţionează creşterea şi multiplicarea microorganismelor aflate în produse alimentare permite alegerea condiţiilor optime la utilizarea culturilor mixte, dirijarea relaţiilor microbiene, în scopul asigurării calităţii alimentelor. 52

PROCESE METABOLICE ALE MICROORGANISMELOR ŞL APLICAŢII ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ Metabolismul microbian - funcţii de bază Viaţa celulei microbiene, în condiţii compatibile oferite de mediu, este determinată de caracterele genetice care îi imprimă un anumit metabolism, determinat de totalitatea reacţiilor biochimice catalizate secvenţial de enzimele celulei vii, prin care se asigură transferul de masă şi energie între celulă şi mediul ambiant. Viaţa microorganismelor şi continuitatea lor genetică este asigurată de desfăşurarea concomitentă a celor două laturi interdependente ale metabolismului: catabolismul şi anabolismul. Catabolismul. Denumit şi metabolism degradativ, catabolismul este rezultatul reacţiilor biochimice catalizate enzimatic prin care compuşii macromoleculari sunt transformaţi în produşi uşor asimilabili cu eliberarea concomitentă a energiei potenţiale a compuşilor cu rol de nutrient (reacţii exergonice). Cele două funcţii specifice ale reacţiilor de catabolism sunt: - eliberarea energiei chimice din nutrienţi (sau, generalizat, din molecule-combustibil) şi stocarea acestei energii, prin reacţii de fosforilare, în compuşi macroergici; - conversia substanţelor nutritive ale mediului ambiant în molecule precursori (glucide, aminoacizi, purine, pirimidine), respectiv subunităţi constitutive ce servesc drept material de construcţie pentru biostructura compuşilor celulari. Aceasta a doua funcţie se desfăşoară concomitent cu eliberarea de energie. Anabolismul. Denumit şi metabolism constructiv, de biosinteză, anabolismul reprezintă totalitatea reacţiilor biochimice, endergonice, catalizate de enzime, prin care se realizează biosinteză compuşilor celulari, creşterea şi reproducerea microbiană. Funcţia specifică anabolismului este cea de asamblare a subunităţilor rezultate prin catabolism, în compuşi cu rol plastic şi funcţional, (acizi nucleici, protide, lipide, polioze). Biosinteză acestor compuşi necesită din partea celulei un consum de energie. în cadrul metabolismului microbian are loc şi biosinteza/biodegradarea intracelulară a unor biomolecule de tipul proteine/enzime, care nu îşi mai îndeplinesc funcţiile în mod eficient şi sunt transformate în biomolecule noi prin procese de turn-over. Microorganismele au potenţialul genetic de a codifica şi de a sintetiza peste 1 000 de tipuri de enzime care catalizează specific reacţii metabolice proprii. Echipamentul enzimatic complex al celulei microbiene este alcătuit din enzime constitutive, sintetizate în mod necondiţionat şi obligatoriu în toate celulele microbiene, şi enzime adaptive (inductive) sintetizate în mod condiţionat, când mediul ambiant, prin nutrientii oferiţi, le impune adaptarea. Prin reglarea metabolismului, concentraţia în enzime adaptive poate creşte de 10-1 000 ori în prezenţa substratului inductiv. 53

Majoritatea enzimelor microbiene acţionează endogen în citosol, în mediu apos sau lipidic, şi sunt localizate în mitocondrii pe suprafaţa internă a cristelor (enzime de oxidoreducere), în lizozomi (proteaze, lipaze, fosfataze), în ribozomi (ARN-polimeraza, sintetaze), în plasmalemă (permeaze) sau în stratul intern al peretelui celular (invertaza, amilaze, celulaze). Enzimele de tipul hidrolazelor acţionează exogen, ceea ce permite utilizarea de către celula microbiană a compuşilor macromoleculari din mediu după conversia lor în molecule cu dimensiuni accesibile pentru transport în interiorul celulei. Căile metabolice ale celulei microbiene. Pentru îndeplinirea funcţiilor de bâză ale metabolismului microbian, enzimele constitutive şi inductibile ale celulei participă în calitate de biocatalizatori la realizarea diverselor căi metabolice ce pot reprezenta secvenţe de reacţii catalizate de 2-20 enzime, ce pot fi grupate în: - căi catabolice, care grupează reacţii degradative, de simplificare, puternic exergonice, catalizate de enzime prin care moleculele mari sunt transformate etapizat în produse intermediare, iar acestea pot, prin oxidare, să fie transformate până la produşi finali (H20, C02 şi alte gaze). Degradarea catabolică se poate realiza în trei etape succesive . - etapa I, ce are loc în exteriorul celulei prin conversia macromoleculelor (polioze, protide, lipide) în compuşi simpli solubili (aminoacizi, hexoze, pentoze, acizi graşi ş.a.), prin care se eliberează aproximativ 1% din energia potenţială a compuşilor organici, energie care se pierde sub formă de căldură în mediul exterior celulei; - etapa a IIa, care are loc intracelular şi constă în catabolizarea parţiala a compuşilor simpli în intermediari metabolici, cu eliberarea în mod cuantificat a unei treimi din energia lor. Această energie este folosită de celulă atât pentru biosinteză Cât şi pentru formarea prin fosforilare a compuşilor macroergici. Pe căile catabdlice cunoscute, cum ar fi calea glicolizei, Embden Mayerhof-Pamas, şuntul pentozo-foâfat, calea tagatozei. calea Leloir, Entner Doudoroff ş.a., compuşii diversificaţi converg spre simplificare, cu formarea unor cataboliţi „cheie", cum ar fi piruvatul, ce este metabolizat în condiţii anaerobe, prin fermentaţie, în alcool, acid lactic, acid propionic, acid butiric ş.a, sau în acetil-Co-A; - etapa a lll-a, care constă în degradarea aerobă a compuşilor intermediari pe o cale unică, prin procese de respiraţie, la compuşi finali CO& HsO, şi mume prin ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs) şi este puternic exergonică. Prin metabolizarea completă până la C02 şi H20 a unei molecule de glucoza, celula poate să stocheze o cantitate importantă de energie; - căi anabotice, care sunt căi biosintetice prin care celula foloseşte compuşii simpli pentru construcţia de biomolecule ce intră în structura înalt organizată a celulei. Caracteristic acestor căi este că sunt consumatoare de energie, eliberată direct sau stocată în compuşii macroergici; - căi amfibolice, care constau în desfăşurarea simultană a proceselor de degradare şi biosinteză, ceea ce explică transformările rapide ce se produc în celuia microbiană în condiţii optime de viaţă.

Căile anaplerotice (colaterale). Sunt căi alternative ce pot fi folosite de celulă atunci când, accidental, s-a produs inhibarea sau blocarea căii metabolice centrale. 54

Bioenergetica microbiană (metabolismul oxidativ energetic) Procurarea energiei este o proprietate vitală a celulei microbiene, care se realizează prin eliberarea energiei chimice a diferitelor alimente şi formarea compuşilor macroergici prin procesul de fosforilare Fosforilarea poate fi de trei tipuri: - fotosintetică, întâlnită la bacteriile din diviziunea Photobacteria care folosesc energia radiantă; - oxidativă, când formarea compuşilor macroergici cu fosfor are loc prin înmagazinarea energiei eliberate prin reacţii de oxidare, în procese de respiraţie aerobă sau anaerobă; - de substrat, în urma formării de compuşi macroergici prin reacţii de oxidoreducere, prin care glucidele sunt transformate, prin procese de fermentaţie anarerobă, în compuşi intermediari, acceptorul de H sau electroni fiind un compus organic. La fosforilarea oxidativă, eliberarea energiei potenţiale din diverse substraturi de natură organică se realizează prin procese de oxidare, care se pot desfăşura astfel: - reacţii de oxidare prin pierdere de electroni, caz în care are loc un transfer de electroni de la substanţe cu potenţial de oxidoreducere negativ (maximum -0,41 pentru hidrogen), la substanţe cu potenţial de oxidoreducere pozitiv (maximum +0,82 pentru oxigen); - reacţiii de oxidare prin transfer de hidrogen (electroni şi protoni).Acest tip de oxidare este folosit de unele microorganisme anaerobe şi aerobe şi transferul este realizat de enzime active la diferite valori ale potenţialului de oxidoreducere. Enzimele implicate în reacţiile de oxidoreducere sunt dehidrogenazele aerobe (aldehid-dehidrogenaza) şi anaerobe (alcool-dehidrogenazele), care au drept coenzime NAD-ul sau NADP-ul şi care preiau atomii de hidrogen trecând din forma oxidată (NAD+) în forma redusă (NADH + H+); - reacţii de oxidare prin câştig de 02, când, în prezenţa enzimelor care acţionează la un potenţial de oxidoreducere pozitiv, are loc transferul de H la 02 provenit din aer şi se formează apa; această reacţie de oxidare este caracteristică microbiotei aerobe. Respiraţia aerobă este un metabolism oxidativ dependent de oxigenul din aer, iar produsele finale sunt C02 şi apa, întreaga energie a substratului oxidat eliberân-du-se prin produsele finale ale respiraţiei. Respiraţia aerobă este din punct de vedere energetic foarte avantajoasă pentru celula microbiană; de aceea, atunci când urmărim obţinerea de celule în cantităţi mari (drojdie comprimată) sau obţinerea de substanţe intracelulare, cultivarea se face în condiţii de aerare. Microorganismele aerobe dispun de o catenă respiratorie diversificată, în

componenţa căreia intră dehidrogenaze, citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze. Numeroase bacterii pot oxida hidrogenul (Pseudomonas), amoniacul până la N02 {Nitrosomonas), sulful şi H2S până la sulfat fThiobacilIus), sau fierul Fe2+ la Fe3+ (Thiobacillus ferooxidans), reacţii cu rol important în circuitul natural al elementelor. Respiraţia anaerobă este un metabolism oxidativ în care substratul este transformat până la C02, iar electronii sunt cedaţi prin oxidare unor compuşi anorganici. Acest tip de respiraţie este întâlnit la bacteriile strict anaerobe. Astfel, bacteriile denitrificatoare pot transforma N03 la azot molecular, cele metanogene pot transforma dioxidul de carbon în metan, bacteriile acetogene ale genului Clostridium pot transforma dioxidul de carbon în acid acetic. Aceste bacterii obţin o cantitate mică de energie şi pot creşte în absenţa oxigenului molecular, la un potenţial de oxidoreducere de -0,2...-0,3 V. Ţinând cont că mediile ce vin în contact cu 02 âu un potenţial redox de +0,2...+0,4 la'pH = 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, în mediu se adaugă substanţe cu caracter reducător ca: tioglicolat de sodiu, cistein-SH, sulfura de sodiu. Substanţele reducătoare permit menţinerea unui potenţial de oxidoreducere scăzut, care permite dezvoltarea anaerobilor în plăci, chiar când mediul vine în contact cu aerul. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi şi vase speciale numite anaerostate, în care 02 este legat chimic, sau cultura se menţine în atmosferă de gaze inerte (C02, N2). 55 Putem considera celula microbiană ca o fabrică biochimică autonomă, care prelucrează nutrienţii având ca avantaj obţinerea de energie şi de compuşi, rezultaţi din prelucrare, ce pot fi folosiţi pentru noi investiţii, în timp ce reziduurile din aceasta prelucrare, care nu sunt necesare, sunt eliminate din fabrică (celulă). în cursul acestor prelucrări metabolice, în funcţie de faza de dezvoltare a celulei, rezultă produşi de metabolism, care pot fi împărţiţi în: - produşi primari, care se formează în faza de creştere exponenţială a celulelor (trofofaza) şi sunt produşi esenţiali pentru celulă; - produşii secundari, care sunt formaţi în faza de declin a creşterii celulelor (idiofază) şi nu sunt esenţiali celulei (toxine, alcaloizi). Aceşti produşi de metabolism se formează, în mod natural, în diferite habitaturi în care trăiesc şi s-au adaptat microorganismele sau, în mod dirijat, în condiţii industriale, în vederea obţinerii produselor de metabolism microbian cu valoare economică. Procesele fermentative utilizate în industria alimentară, produse de culturi selecţionate, sunt prezentate în tabelul de mai jos. Fermentaţii microbiene Fermentaţii anaerobe şi produse Microorganisme Fermentaţii Microorganisme

de fermentaţie selecţionate oxidative şi produse de fermentaţie selecţionate Alcoolică (alcool etilic şi dioxid de carbon) Saccharomyces sp. Acetică (acid acetic, H20) Acetobacter Lactică (acid lactic, diacetil) Gluconică (acid gluconic) Gluconobacter Aspergillus niger Lactobacillus, Lactococcus

Propionică (acid propionic, acetic, CO2) Propionibacterium Citrică (acid citric) Butirică (acid butiric, CO2, H2) Aspergillus 56 Clostridium

Aspergillus niger Oxalică, fumarică

Fermentaţia alcoolică Fermentaţia alcoolică este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reacţii de oxidoreducere, sub acţiunea echipamentului enzimatic al drojdiei, în produşi principali (alcool etilic şi C02) şi produşi secundari (alcooli superiori, acizi, aldehide ş.a.) Agenţii tipici ai fermentaţiei alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care, prin fermentarea glucidelor, pot să producă mai mult de 8° alcool etilic. Fermentaţia alcoolică este un proces întâlnit şi la alte microorganisme: Bacillus macerans, Clostridium acetonoetilicus, Zymomonas mobilis, dar acestea produc, prin fermentare, cantităţi mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile şi nu sunt considerate agenţi tipici.

Proprietăţi biotehnologice ale drojdiilor fermentative. Pentru a putea fi folosite în practică, drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate şi selecţionate în funcţie de unele proprietăţi care le recomandă pentru utilizare industrială, cum ar fi: - puterea alcooligenă, care se referă la concentraţia mare de alcool ce se poate acumula când în mediu există zahăr în exces. Drojdiile sunt sensibile la creşterea concentraţiei în alcool. în timp ce drojdiile cu putere alcooligenă slabă (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentraţie în alcool de 4-6°, drojdiile de vin şi spirt (Saccharomyces cerevişiae var.ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae-cerevisiae) au o putere alcooligenă mare şi produc fermentaţie alcoolică până se acumulează 16-18° alcool; - alcoolorezistenţa, care se referă la capacitatea drojdiei de a continua fermentaţia la creşterea concentraţiei de alcool, deoarece alcoolul etilic poate acţiona ca un denaturant al proteinelor şi produce inactivarea enzimelor sensibile; - sulfitorezistenţa, o proprietate importantă a drojdiilor de vin de a se adapta la concentraţii de 200-500 mg S02/dm3, concentraţii care pot influenţa negativ activitatea altor drojdii din must, neadaptate (drojdii peliculare sau oxidative), ca urmare a scăderii potenţialului de oxidoreducere; - capacitatea de fi oculare şi pulverulenta, proprietăţi datorate structurii peretelui celular şi modificării de pH şi /H din timpul fermentaţiei. Drojdiile floculante pot forma asociaţii ce se depun mai uşor, în timp ce drojdiile pulverulente se menţin mai mult timp în suspensie şi produc o fermentaţie mai avansată. Pentru drojdiile de şampanie se urmăreşte ca acestea să se depună uşor în gâtul sticlei şi, prin operaţia de degorjare, să se separare sedimentul, obţinându-se o şampanie limpede; - osmotoleranţa, care se referă la capacitatea drojdiilor de a produce fermentaţia în mediu cu concentraţie crescută de zahăr. Această proprietate este recomandată drojdiilor folosite la obţinerea spirtului din melasă; - frigofilia, o adaptare a drojdiilor de vin de a produce fermentaţia la temperaturi scăzute (10...15°C); astfel sunt evitate fermentaţiile secundare, iar vinul conţine mai multe substanţe de aromă; - caracterul killer, întâlnit la unele drojdii capabile de a acumula intracelular o toxină cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. în selecţionarea drojdiilor de vin, culturile care au acest caracter dau randamente superioare, deoarece în cursul fermentaţiei se produce o autoselecţie naturală. Factorii care influenţează dinamica fermentaţiei alcoolice. Fermentaţia alcoolică în condiţii industriale foloseşte substraturi naturale bogate în glucide fermentescibile, iar viteza de fermentare şi transformare a glucidelor în produşi primari 57

şi secundari este dependentă de numeroşi factori care pot fi împărţiţi în două mari categorii: factori biologici, dependenţi de microagenţii fermentării, şi factori fizico-

chimici, dependenţi de compoziţia mediului supus fermentării şi de condiţiile mediului ambiant. Factorii biologici. încă din 1885-1887 a fost stabilit, de către fraţii Buchner, că fermentaţia alcoolică este cauzată de enzimele elaborate de celula de drojdie, demonstrându-se natura enzimatică a fermentaţiei. Complexul zimazic acelular obţinut prin mojararea celulelor de drojdie este format din 15 enzime care catalizează, în diferite etape, procesele de oxido-reducere ale glucidelor fermentescibile şi, în final, formarea de alcool etilic. Enzimele cele mai importante sunt dehidrogenazele: glicerat-aldehid-dehidro-genaza şi alcool dehidro-genaza, care au drept coenzimă NAD, cu rol în transferul de hidrogen în reacţiile de catabolism. Fermentaţia decurge rapid dacă celulele sunt în faza de creştere exponenţială sau la începutul fazei staţionare de creştere, în timp ce drojdiile autolizate îşi pierd proprietăţile fermentative, ca rezultat al hidrolizei proteinelor intracelulare (inactivarea enzimelor). Viteza de fermentare depinde şi de numărul de celule/cm3 mediu; viteza creşte cu numărul de celule, prin viteză înţelegând conţinutul de alcool format la 100 ml lichid în unitatea de timp. în practică, această concentraţie este bine stabilită din raţiuni economice, ea fiind de 106-107 celule/cm3, pentru declanşarea rapidă a fermentaţiei. Un alt factor îl constituie spectrul de fermentare al glucidelor. Din studiul caracterelor fiziologice se cunoaşte că drojdiile produc fermentarea unui număr limitat de glucide, diferenţe apărând şi între specii. Glucidele direct fermentescibile sunt formele dextrogire ale glucozei şi fructozei şi, în mai mică măsură, ale galactozei care, sub forma esterilor fosforici, prin translocatie de grup sunt transferaţi în celulă şi are loc transformarea metabolică la produşi de fermentare. Datorită importanţei pe care o prezintă alcoolul etilic de fermentare în practica industrială, în afara glucidelor fermentescibile se pot folosi substraturi naturale ce conţin poliglucide (amidon, celuloză), care sunt hidrolizate în prealabil pe cale chimică sau enzimatică până la formarea de glucide fermentescibile. Această zaharificare prealabilă este obligatorie, deoarece drojdiile de fermentare nu produc amilaze/celulaze şi nu pot produce hidroliza enzimatică a poliglucidelor. Un alt factor biologic este corelat cu comportarea drojdiilor fermentative, în funcţie de accesul oxigenului în mediul supus fermentării. în condiţii anaerobe, prin imersare în must, celulele de drojdie produc fermentarea glucidelor, obţinând o cantitate mică de energie (2 moli ATP/mol glucoza fermentată). De aceea, ele trebuie 58

să prelucreze o cantitate mai mare de zahăr pentru a obţine energie, iar creşterea numărului de celule are loc foarte lent. Dacă mediul de fermentare este puternic aerat, atunci are loc efectul Pasteur, prin care se observă conversia fermentaţiei în respiraţie, deoarece, în prezenţa oxigenului, oxidarea se

face până la produşi finali (C02 şi H20), iar cantitatea de energie este mult mai mare, pentru acelaşi echivalent energetic consumându-se o cantitate mai mică de zahăr. în practica vinificării, atunci când fermentaţia decurge lent, ca rezultat al prezenţei în mediu a unui număr mai mic de celule, se poate stimula creşterea de celule prin aerare. în industriile fermentative (spirt, vin, bere) nu se urmăreşte obţinerea de biomasă celulară; de aceea, condiţiile sunt anaerobe, astfel încât o cantitate mai mare de zahăr este transformată în alcool etilic, iar cantitatea de drojdie reziduală obţinută la sfârşitul fermentării este în cantitate mai mică. Procesul de aerare este folosit la cultivare atunci când interesează obţinerea unei cantităţi mai mari de drojdie, de exemplu la fabricarea drojdiei comprimate sau a drojdiei furajere. Factorii fizici şi chimici. Fermentaţia alcoolică este influenţată şi de factori chimici şi fizici, care acţionează atât asupra vitezei de fermentare cât şi asupra bilanţului masic şi a raportului dintre produşii primari şi secundari. Cei mai importanţi factori sunt prezentaţi în cele ce urmează. Compoziţia mediului de fermentare. Diferitele componente ale mediului pot fi metabolizate în mod diferit. De aceea, mai ales la vinuri, în funcţie de calitatea mustului, care este influenţată de soiul şi gradul de coacere a strugurilor, apar diferenţe de aromă, buchet. Din punct de vedere al compoziţiei interesează: - concentraţia în zahăr, care influenţează direct proporţional viteza de fermentare atunci când se situează în limitele 5-12%. Cu creşterea concentraţiei de zahăr, anumite drojdii mai sensibile suferă o inhibare în activitate, prin procese de represie catabolică sau prin modificări la nivel de membrană datorate plasmolizei. Drojdiile de fermentare sunt osmotolerante şi produc fermentarea în bune condiţii a mustului de struguri cu o concentraţie de 170-250 g zahăr/dm3: în fermentaţia alcoolică industrială se folosesc diferite substraturi bogate în zahăr, medii naturale ce conţin şi alte substanţe necesare pentru un metabolism activ: - mustul de struguri este folosit ca lichid fermentescibil la fabricarea vinului, iar mustul de malţ ce conţine maltoză (80% din substanţa solubilă) se foloseşte la fabricarea berii; - în industria spirtului şi la obţinerea drojdiei comprimate se foloseşte ca mediu de bază melasa, care are un conţinut de 45-55% zaharoză necristalizată; - plămezile amidonoase pentru a putea fi folosite în fermentaţie trebuie să sufere, mai întâi, o hidroliză enzimatică, în urma căreia se obţin glucoza, maltoză, , dextrine cu molecule mici, care sunt apoi transformate în alcool etilic; - zerul rezultat la fabricarea brânzeturilor, cu un conţinut de 4,7% lactoză, poate fi utilizat la obţinerea de alcool etilic, folosindu-se drept agenţi de fermentare drojdii din genul Kluyveromyces producătoare de lactază; - celuloza poate fi folosită drept substrat la obţinerea alcoolului carburant, după ce suferă o hidroliză chimică/enzimatică din care rezultă celobioză şi cello-dextrine, care pot fi fermentate de către drojdii; - concentraţia în alcool. în mediile fermentate cu microbiotă naturală, dacă se ajunge la o concentraţie alcoolică de 4-6°, se produce o încetinire a fermentaţiei dată de drojdiile care nu au rezistenţă la alcool (Kloeckera,Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuată de drojdii alcoolorezistente, până la acumularea a 18-20° alcool (g alcool absolut/100 ml).

59 - pH-ul mediului. Are un rol important în formarea compuşilor de fermentare, în funcţie de pH cunoscându-se două forme ale fermentării: fermentarea alcoolică propriu-zisă, ce se desfăşpară la pH = 3,5...5, când produsul principal este alcoolul etilic şi dioxidul de carbon, cu produşi secundari în cantităţi mici, echilibrate, şi fermentarea la pH alcalin, când, în afară de alcool etilic şi dioxid de carbon, se formează în cantitate mai mare glicerol (până la 30% din zahărul fermentat). Mustul de struguri are un pH acid (= 3,6); de aceea, la fabricarea vinurilor, drojdiile sunt avantajate şi au cele mai bune condiţii de dezvoltare şi activitate metabolică. Substanţele chimice. Substanţele chimice existente sau adăugate mediului pot influenţa procesul fermentativ. Astfel, fosfaţii au o influenţă pozitivă, deoarece participă la formarea acizilor adenilici şi la formarea esterilor fosforici ai glucidelor, forme în care acestea sunt transportate în celulă şi fermentate. Dioxidul de sulf se adaugă în cantităţi de 200-500 mgdm"3 pentru a favoriza activitatea drojdiilor fermentative care, spre deosebire de alte drojdii, sunt sulfitorezistente. în concentraţii admise de tehnologie, S02 influenţează viteza de fermentare, favorizând activitatea drojdiilor tipice. Dacă doza de S02 introdusă este accidental mai mare, fermentarea alcoolică este deviată de la forma de bază, deoarece dioxidul de sulf se combină cu aldehida acetică, conducând la formarea în exces a glicerolului, a acidului acetic şi a unor cantităţi mai mici de alcool etilic. Temperatura. Enzimele componente ale sistemului zimazic prezintă fiecare un optim de activitate, iar proprietăţile sunt determinate genetic de caracterele de specie. Fermentarea alcoolică poate avea loc între 0 şi 35°C. în funcţie de specia de drojdie predominantă sau folosită în cultură pură, temperaturile optime pentru fermentaţia alcoolică se situează la: - 28...30°C, pentru drojdia de spirt şi de panificaţie (Saccharomyces cerevisiae); - 6...12 °C, pentru drojdia de bere (Saccharomyces carjsbergensis); - 15...20 °C, pentru drojdiile de vin (Saccharomyces cerevisiae var ellipsoideus şi oviformis), care produc o fermentare mai lentă la aceste temperaturi, dar conduc la obţinerea unui vin de calitate, deoarece la temperaturi mai scăzute se evită pierderile de substanţe volatile. Consideraţii generale privind microbiota alimentelor şi incidenţa microorganismelor contaminante Produsele alimentare conţin, în mod constant şi în număr destul de mare. diferite microorganisme. Studiul microbiotei alimentelor a condus la stabilirea în diferite ţări a unor norme microbiologice privind încărcarea cu microorganisme a alimentelor, formarea microbiotei în condiţiile proceselor tehnologice de prelucrare a alimentelor, rolul microorganismelor la creşterea valorii biologice şi alimentare şi rolul etiologic al unor alimente în transmiterea microoganismelor patogene.

Valoarea alimentară este dată de: valoarea nutritivă, valoarea senzorială şi gradul de inocuitate (absenţa din alimente a microorganismelor patogene, a substanţelor toxice microbiene şi a organismelor care produc infestarea: ouălor de paraziţi, insecte). Poluarea microbiană se referă la căile prin care, în produsele alimentare, pot ajunge, ocazional, microorganisme de alterare a alimentelor, ce pot forma în aliment substanţe toxice sau microorganisme patogene/toxicogene, agenţi ai îmbolnăvirilor prin consum de alimente contaminate. 60

Microorganismele benefice, introduse în mod dirijat sub formă de culturi pure pentru creşterea calităţii produselor alimentare, nu sunt considerate contaminanţi deşi, în funcţie de condiţiile de activitate şi de durata în care ele sunt active, acestea pot să producă uneori defecte senzoriale. Microbiota alimentelor poate fi diferenţiată în microbiotă specifică şi nespecifică. Microbiota specifică. Este alcătuită din microorganisme (culturi starter) introduse dirijat în produs în scopul obţinerii unor transformări dorite. în aceeaşi categorie intră şi microbiota care se formează în etape tehnologice determinate (la murarea verzei şi a altor legume, la fermentarea mustului ş.a.) şi care realizează însuşiri senzoriale şi de compoziţie obligatorii, cu o influenţă pozitivă asupra alimentelor. Microbiota nespecifică. Include microorganismele care ajung în organe şi în ţesuturi ale organismelor vii, în cazul îmbolnăvirii sau distrugerii funcţiilor de barieră, în condiţii de traume, înfometare, supraîncălzire/suprarăcire a acestora. Când nu se păstrează condiţiile sanitare în etapele de pregătire, prelucrare, transport şi păstrare este posibilă o contaminare secundară. Microbiota nespecifică poate fi reprezentată de microorganisme organotrofe (saprofite) şi patogene. Microorganismele saprofite prezente în produse pot condiţiona, într-o serie de cazuri, dezvoltarea unor procese biochimice obligatorii şi, deci, să condiţioneze calitatea alimentelor. în acest caz, ele devin specifice pentru microbiota dată a produsului. Având însuşiri antagoniste în raport cu alte microorganisme, acestea, adesea, asigură conservarea produselor alimentare şi consumul este lipsit de pericol epidemiologie. Clasificarea microorganismelor contaminante. Microorganismele conta- minante pot fi grupate, în funcţie de proprietăţile fiziologice şi de acţiunea lor asupra alimentelor, în următoarele categorii: organotrofe, patogene/facultativ patogene şi strict patogene. Microorganismele organotrofe (saprofite). Sunt foarte răspândite în natură şi produc degradări ale alimentelor când se află în număr mare, ca rezultat al acţiunii lor asupra compuşilor organici din aliment. Microorganismele care produc alterarea produselor alimentare au mai ales activitate proteolitică. Contaminarea produselor alimentare şi înmulţirea microorganismelor în produse este nedorită, deoarece ele scad valoarea nutritivă şi biologică şi, în unele cazuri, fac imposibilă folosirea produsului în nutriţie. Alături de modificarea însuşirilor senzoriale, microorganismele pot produce compuşi toxici. Din această categorie de microorganisme fac parte cele prezentate în continuare.

Bacteriile de putrefacţie degradează alimentele bogate în proteine în care, prin acest proces, se pot acumula substanţe toxice (amine biogene toxice). Aminele produc şi modificări de gust şi miros, ceea ce avertizează consumatorul de prezenţa produşilor de putrefacţie. Histamina, însă, este lipsită de gust şi miros, astfel încât 61

este posibilă consumarea produselor şi îmbolnăvirea. Histamina este produsă prin acţiunea lui Achromobacter histaminicus în produsele de carne, dar a fost detectată şi în vinuri, unde se formează sub acţiunea bacteriilor din genul Pediococcus. Microorganismele toxicogene cauzează îmbolnăviri prin consum de alimente în/pe care sau dezvoltat, producând metaboliţi cu efect toxic asupra celor care le consumă. Perioada de incubaţie şi simptomele evidenţiate prin investigaţii pot fi corelate cu alimentul ingerat. Dintre agenţii intoxicaţiilor prin alimente contaminate fac parte următoarele microorganisme: - Clostridium botulinum, care produce intoxicaţii grave (botulism) datorate elaborării în alimente de neurotoxine ce produc sindrom neuroparalitic cu efect letal. Manifestarea stării de boală (uscăciunea gurii, viziunea dublă, constipaţie, moartea datorită paraliziei muşchilor ce funcţionează reflex) are loc după 1-iO zile şi cazurile letale ajung până la 68%. Toxinele botulinice au o toxicitate ridicată, încât o doză de 1 pg poate omorî un om de 70 kg. Intoxicaţia se produce mai ales prin consum de peşte şi conserve de peşte, produse vegetale, conserve insuficient sterilizate. Aceasta se explică prin faptul că bacteriile sporulate sunt inactivate la 120°C, în timp de 4-10 min, în timp ce la fierbere sunt necesare 6 h pentru inactivarea lor pe cale termică. Dacă sterilizarea nu este suficientă la pregătirea conservelor, endosporii supravieţuitori ai tratamentului termic pot germina la păstrare şi, în stare activă de creştere, produc toxine. Tulpini non-proteolitice tip E au un minim de creştere la temperatura de 3°C şi prezintă risc la conservarea produselor refrigerate; Staphylococcus aureus, care produce intoxicaţii cu rată redusă de letalitate şi cu o perioadă scurtă de incubare, chiar după 30 min de la ingerare. Se transmite de la indivizii purtători de tulpini enterotoxice prin intermediul unor alimente gata preparate păstrate la temperatura camerei: creme, produse de patiserie, carne, lapte de la animale bolnave. Specia S. aureus se dezvoltă şi se înmulţeşte bine la 37°C, dar poate creşte în domeniul 6...45°C. Deşi bacteriile pot fi distruse uşor, au indicele de reducere decimală D60 = 2-5 min, enterotoxinele sunt mai termostabile, astfel încât la 60°C sunt inactivate în 16h, iar la 80°C în 5-19 min. Toxinele sunt exogene, iar starea de boală se manifestă la scurt timp după ingerare. Riscul de intoxicaţie creşte deoarece, prin dezvoltarea acestor bacterii, nu apar în mod# obligatoriu modificări de gust şi miros ale alimentului. Specii ale genului Staphylococcus: S. faecalis, S. bovis, S. durans provoacă posibile stări de toxiinfecţie, când concentraţia bacteriilor în produs estedelO -107/g;

Bacillus cereus şi, în ultimii ani, Bacillus licheniformis şi Bacillus subtilis pot fi implicate în producerea de intoxicaţii. B. cereus poate produce două tipuri de toxine. Astfel, poate produce sindrom emetic (greţuri, stări de vomă) observat după 1-5 ore de la consum, frecvent prin consum de orez fiert/prăjit sau sindrom manifestat prin stări diareice, după 8-16 ore, ca urmare a consumului de alimente reîncălzite, preparate cu boia de ardei sau alte condimente ce pot conţine un număr mare de spori; Mucegaiurile toxicogene produc intoxicaţii denumite micotoxicoze, cu o perioadă de incubare prelungită, încât este dificilă asocierea îmbolnăvirii cu alimentul incriminat. Mucegaiurile pot forma colonii la suprafaţa produsului şi în etapa de creştere colonială, o dată cu apariţia sporilor, pot să sintetizeze produşi secundari de metabolism de natură hidrocarbonată, cu o toxicitate deosebit de ridicată. Omul şi animalele pot să sufere intoxicaţii prin consum de alimente mucegăite, intoxicaţii care se manifestă prin îmbolnăviri ale diferitelor organe (ficat, rinichi). Dintre bolile produse se amintesc: ergotism, aleucie toxică alimentară (ATA), hepatocarcinogeneză, nefrotoxicoze, sindrom hemoragie, poliurie ş.a. Mico-toxinele fungice au o toxicitate 62

ridicată şi concentraţia maximă admisă pentru produse mucegăite pentru a fi acceptate în consum este foarte redusă (CMA = 5-30 pg/kg produs alimentar). Majoritatea micotoxinelor acţionează prin inhibarea acţiunii enzimelor implicate în sinteza de proteine, pot produce modificări în structura acizilor nucleici şi efectul se manifestă printr-o înmulţire anarhică a celulelor cu apariţia tumorilor maligne. Deoarece aceste micotoxine nu conţin azot în moleculă, ele nu pot fi inactivate pe cale termică, fiind deosebit de termostabile. Sunt rezistente la acţiunea factorilor de mediu, se oxidează foarte greu şi efectul lor se poate manifesta ani de zile. Acelaşi mucegai poate să producă mai multe tipuri de micotoxine şi aceeaşi micotoxină poate fi produsă de mai multe specii sau genuri. Nu se cunosc metode eficiente pentru eliminarea totală a micotoxinelor din alimente. Calea unică pentru evitarea formării lor este prevenirea dezvoltării mucegaiurilor pe alimente. Deşi nu toate mucegaiurile produc micotoxine, este recomandat a nu se consuma produse mucegăite pentru eliminarea riscului de intoxicaţie. Produc micotoxine specii aparţinând următoarelor genuri: - genul Aspergillus - reprezentanţii genului produc aflatoxine denumite astfel de la specia Aspergillus flavus; se cunosc 12 aflatoxine, dintre care cele mai toxice sunt: Bi, B2, G1t G2. Iniţialele provin de la fluorescenta pe care o dau aceste toxine prin expunerea plăcii cromatografice la radiaţii UV cu  = 360 nm (blue = albastru, green = verde), în timp ce numerele se referă la ordinea de migrare pe cro- matogramă. Aflatoxinele Mi, M2, cu toxicitate mai redusă, pot fi detectate în laptele provenit de la animale hrănite cu furaje mucegăite cu specii toxicogene. Mai produc aflatoxine tulpini ale speciilor: Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus wenti. Aflatoxinele au efect toxicogen asupra animalelor şi produc ciroze în 3 săptămâni de la hrănirea acestora cu 1 mg /kg corp. încălzirea la 120°C, timp de 4 h, nu distruge în totalitate aceste micotoxine. Aflatoxinele nu sunt solubile în apă, ci

în solvenţi organici, dar aceştia nu pot fi folosiţi pentru îndepărtarea micotoxinelor, deoarece prin extracţie se pierde valoarea alimentară a produsului. Alte micotoxine (sterigmatocistine, ochratoxine, clavacina) au o toxicitate mai redusă şi sunt produse de unele tulpini aparţinând speciilor: Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus ochraceus; - genul Penicillium - specii ale genului pot produce peste 60 de toxine, mai ales când se dezvoltă pe cereale şi furaje. Dintre speciile producătoare fac parte: P. işlandicum care se dezvoltă pe orez şi produce 2 micotoxine: islanditoxina şi luteoskirina. Pe fructe se dezvoltă P. expansum, care produce putrezirea albastră şi sticloasă a merelor şi sintetizează patulina. Patulina este rezistentă la temperaturi ridicate, la pH acid şi are efect cancerigen. Dacă sucul de fructe este supus fermentaţiei, o parte din toxină se elimină din lichidul fermentat. Alte specii: P. citrinum produce citrinina; P. citreoviridae - citreoviridina; P. cyclopium cyclopiazina; - genul Fusarium, care produce trichotecene ce pot fi sintetizate şi la temperaturi scăzute, deosebit de rezistente în timp (mucegaiurile pot să moară dar toxina rezistă ani de zile). Specii toxicogene: F. sporotrichoides produce sporofu- sariogenina; F nivali produce nivalenol. Prin consum de produse alimentare contaminate se produce ATA; - genul Rhizopus - specii ale genului produc micotoxine care determină stări de oboseală şi poliurie. Mucegaiuri din genurile Cladosporium, Ustilago, Stachybotrls, Walemia produc toxine la mucegâirea cerealelor. Consumul de furaje contaminate cu mucegaiuri toxicogene poate cauza moartea animalelor (cazuri mai frecvent întâlnite 63

la oi şi de cai), iar dacă animalul nu a ingerat doza letală, micotoxinele se acumulează în diverse ţesuturi/ organe, sau se pot elimina prin lapte, iar în cazul păsărilor, prin ouă. Microorganismele patogene/facultativ patogene transmisibile prin alimente. Microrganismele care produc toxiinfecţii alimentare sunt patogene sau facultativ patogene. Ele se dezvoltă pe alimente şi produc îmbolnăviri la om, atunci când gradul de contaminare al alimentului respectiv este mare. Starea de boală apare în scurt timp de la ingerarea alimentului (2-12 h) şi se caracterizează prin stări de vomă, diaree, dureri abdominale acute care determină scăderea capacităţii de muncă a omului şi, funcţie de cantitatea de substanţă toxică ingerată şi de starea organismului, efectul este letal. în general, starea de toxiinfecţie poate dura câteva zile, după care are loc vindecarea. Dintre agenţii toxiinfecţiilor alimentare fac parte bacterii aparţinând următoarelor genuri/specii: Salmonella, care cuprinde specii ce sunt agenţi importanţi ai toxiinfecţiilor alimentare: Salmonella enteridis, S. dublin, S.virchow, S. typhymurium ş.a. Toxinele sunt intracelulare, deci se formează şi rămân în celula bacteriei. După consumul produsului are loc, sub acţiunea HCI din stomac, distrugerea celulei bacteriene şi eliminarea toxinei din celule. Aceste bacterii se pot înmulţi pe alimente, dar nu produc

modificări senzoriale. Dintre alimentele cu risc de contaminare fac parte produsele lactate, carnea de pui, ouăle. în gastroenterite, bacteriile se multiplică în lumenul intestinal şi sindromul este evident după 12-24 ore de la consum. Pot produce febra enterică, când infecţia se face cu Salmonella typhişi Salmonella paratyphr, - Listeria monocytogenes, care produce rar listerioze (letalitate în 30-50% din cazuri), cu o perioadă de incubaţie de câteva săptămâni. Recent s-a stabilit că aceste bacterii, foarte răspândite în apă, sol, plante, pot fi vehiculate prin alimente. Este o bacterie psihrotrofă şi creşte în alimente păstrate prin refrigerare, alimente gata preparate, consumate după reîncălzire, în care produc listeriolizină; - Escherichia coli, care poate prezenta tulpini oportunist patogene cu serotipuri enterotoxice - agenţi ai enteritei infantile, enteropatogene care se pot dezvolta pe epiteliul intestinal, verocytotoxice - produc colite hemoragice (se transmit prin alimente şi produc infecţia chiar atunci când numărul de celule este foarte redus) şi serotipuri enteroinvazive asemănătoare taxonomic cu bacterii din genul Shigella dysenterie. Majoritatea tulpinilor normal întâlnite în microbiota intestinală, aparţinând lui E. coli, sunt lipsite de risc şi pot fi folosite ca indicatori igienico-sanitari în controlul microbiologic al alimentelor; - Yersinia enterocolitica, care produce enterite caracterizate prin diaree, febră şi dureri abdominale (manifestări similare apendicitei), în special la copii. La bătrâni poate produce septicemii şi complicaţii cum ar fi artrite, meningite. Este o bacterie psihrotrofă şi poate creşte şi la temperaturi de 0...4°C; a fost izolată din lapte, îngheţată, carne de porc; - Vibrio parahemolyticus, care este o bacterie halofilă izolată din ape marine (zone tropicale). Se transmite prin scoici, crustacee, peşte. După consumul produsului contaminat, după o perioadă de 12-24 ore, toxiinfecţia se manifestă prin diaree, asociată cu dureri abdominale acute; - Vibrio cholerae, care poate produce holera şi o diaree explozivă, cu efect letal în peste 40% cazuri, dacă nu se aplică un tratament adecvat. Poate creşte pe diferite alimente şi se consideră că holera demarează ca o toxiinfecţie alimentară; 64

- Aeromonas, care cuprinde bacterii ce sunt contaminaţi comuni ai alimentelor cu aciditate redusă şi aw ridicat, păstrate la temperatura camerei sau prin refrigerare. Produce cytotoxina şi hemolizina dând stări diareice la copii; - Clostridium perfringens, care se elimină prin materiile de dejecţie şi, prin nerespectarea condiţiilor de igienă, poate contamina alimentele. Creşterea lui pe produse (alimente cu carne gata preparate, insuficient tratate termic) este asociată cu formare de acid butiric şi gaze; CI. perfringens tip C produce enterite necrotice. în calitate de agenţi ai toxiinfecţiilor alimentare, sunt vizate şi genuri mai puţin studiate ca: Citrobacter, Hafnia, Klebsiella, şi altele cărora în ultimii ani li se acordă o mare importanţă.

Microorganismele strict patogene. Acestea nu se pot înmulţi în alimente, dar pot fi transferate de la om şi animale bolnave, prin ingerare de produse ocazional contaminate, la indivizi sănătoşi, dând prin infecţie, după o perioadă de incubare, îmbolnăviri specifice. Răspândirea patogenilor poate fi oprită fie prin evitarea căilor de acces la aliment, fie prin tratamente care asigură distrugerea sau eliminarea lor. Bacteriile-agenţi ai toxiinfecţiilor şi intoxicaţiilor prin consum de alimente contaminate pot pătrunde în organism atât pe cale digestivă cât şi pe cale sanguină, devenind strict patogene, producând boli ca: furunculoze şi infecţii cutanate (Staphylococcus aureus), colibaciloze (Escherichia coli), febra tifoidă (Salmonella sp.). în unele cazuri, alimentele produse de la animale bolnave pot fi o sursă de infecţie cu bacterii-agenţi ai tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis), ai brucelozei (Brucella abortus, Brucella melitens), ai difteriei (Corynebacterium diphteriae), diareei infecţioase (Campylobacter), antraxului (Bacillus anthracis). Ricketsiile pot produce febra Q. Dintre acestea, Coxiella burnetii se poate transmite prin laptele provenit de la vaci bolnave, are o termorezistentă ridicată şi poate supravieţui în produse insuficient pasteurizate. Virusurile (enterovirusuri, adenovirusuri, rotavirusuri) pot produce gastro-enterite, hepatite (Enterovirus 72 tip A), encefalite, poliomielită ş.a. Microbiologia produselor de origine animală Pentru diverse subramuri ale industriei alimentare, în tratarea microbiologiei produselor de origine animală şi vegetală se prezintă sursele posibile de contaminare (internă sau externă), utilizarea culturilor starter în biotehnologii alimentare şi rolul proceselor microbiologice în fabricarea, conservarea şi asigurarea calităţii produselor alimentare. Microbiologia laptelui Datorită compoziţiei sale, laptele este un mediu excelent pentru dezvoltarea numeroaselor microorganisme, condiţii mai favorabile avându-le bacteriile lactice. Contaminarea laptelui se poate produce din două surse: internă şi externă. Contaminarea internă Contaminarea internă are loc în timpul producerii laptelui, ca urmare a pătrunderii unor microorganisme patogene transmisibile prin lapte, de la animalul bolnav. Alte microorganisme pot ajunge de pe canalele galactofore ale animalului, 65

unde formează o microbiotă naturală ce este antrenată la mulgere. Dintre microorganismele ce provin din surse interne fac parte cele patogene şi nepatogene.

Microorganisme patogene. Din această categorie fac parte: - genul Mycobacterium cu specia M. tuberculosis (tip bovis), care se transmite de la animalele bolnave de tuberculoză. Nu se înmulţeşte în lapte, dar poate supravieţui chiar zile şi săptămâni. Deşi se pare că tipul bovis nu ar provoca îmbolnăviri la om, au existat situaţii în care indivizii cu imunitate scăzută s-au îmbolnăvit prin consum de lapte contaminat. Pentru evitarea oricărui risc, laptele posibil contaminat este preluat de către întreprinderea de industrializare a laptelui pe linii separate şi, în mod obligatoriu, este supus unui tratament termic corespunzător pentru a distruge această bacterie patogenă, care are o termorezistenţă superioară altor patogeni transmisibili prin lapte. Când laptele colectat de la animale cu TBC are o încărcătură microbiană mare şi nu poate suferi pasteurizarea, se poate folosi la fabricarea caşului cu o perioadă de maturizare prelungită, sau la fabricarea brânzei topite, când se foloseşte un tratament termic adecvat pentru inactivarea bacteriilor-agenţi ai tuberculozei; - genul Brucella cu speciile B. abortus, B. melitens, care se pot transmite prin lapte de vacă, ovine, caprine şi pot produce îmbolnăviri manifestate prin avort spontan şi septicemii. Bacteriile din genul Brucella sunt inactivate rapid la temperaturi mai mari de 60...65°C, în schimb în laptele nepasteurizat pot rezista mult timp; - genul Streptococcus cu specia Streptococcus pyogenes, care produce inflamaţii ale ţesuturilor; Streptococcus agalactiae este agentul mastitei (inflamarea ugerului); - genul Staphylococcus cu specia Staphylococcus aureus, care poate produce ulceraţii ale ugerului sau pielii; se înmulţeşte în lapte şi poate produce enterotoxine. Prin lapte se mai pot transmite şi virusuri, agenţi ai bolilor virale ca: poliomielita, hepatita şi altele. Microorganismele nepatogene. Dintre acestea fac parte: streptococii lectici, genul Lactococcus - prezenţa lor este normală în lapte, în timp ce bacterii ale genului Lactobaccillus sunt mai rar întâlnite. Numărul microorganismelor ce ajung în lapte din surse interne poate varia între 1000 şi 1500 celule cm-3; când are loc recoltarea primelor porţiuni din lapte, indiferent de condiţiile igienico-sanitare aplicate. Prin contaminare internă mai pot ajunge, accidental, în lapte antibiotice, atunci când animalele au fost sub tratament care influenţează negativ activitatea bacteriilor lactice, sensibile la antibiotice. Când animalele au fost furajate cu produse mucegăite şi au ingerat eventual micotoxine, acestea pot fi transformate în organismul animal şi eliminate în lapte sub formă de aflatoxine: M^ M2 cu efect toxic mai scăzut decât al celor de tip B1f B2. Alte substanţe ce se pot elimina în mod normal prin lapte (intrând în compoziţia acestuia) sunt: - imunoglobulinele - substanţe cu efect antimicrobian; - lizozimul - cu activitate litică asupra peretelui celulei microbiene; - sistemul lactoperoxidază - tiocianat - apă oxigenată; - lactoferina; - aglutininele (lacteninele). Aceste substanţe fac ca laptele să protejeze fătul în prima perioadă de viaţă de îmbolnăviri şi determină o stagnare a creşterii bacteriilor în lapte imediat după muigere (faza bacteriostatică).

66

Contaminarea externă Acesta contaminare are loc în timpul mulgerii până în momentul prelucrării laptelui, prin contact cu vasele, aparatele de muls, aerul, sau în timpul transportului. O sursă importantă o reprezintă părul animalului şi pielea (108-18 • 109 celule/g păr). Contaminarea prin intermediul aerului din grajd este mai mare dacă s-a făcut furajarea, datorită prafului, motiv pentru care mulgerea se face înainte de hrănirea animalelor. Contaminarea poate avea loc, frecvent, prin intermediul apei, al bălegarului (109-1010 celule/g) şi prin intermediul vaselor de colectare, deoarece laptele formează pe suprafaţa vaselor o peliculă, iar pe suprafaţa recipientului în care se face încălzirea se formează piatra de lapte (un amestec de fosfaţi, săruri minerale), deosebit de rezistentă, care face dificilă îndepărtarea microorganismelor aderente. Prin intermediul materiilor fecale, de la om şi de la animalele bolnave se pot transmite microorganisme patogene şi anume: Bacillus anîhracis (produce antraxul); genul Salmonella - microorganismele se pot înmulţi în lapte sau rezistă în lapte, fiind agenţi ak toxiinfecţiilor alimentare; genul Shigella microrganismele din acest gen sunt agenţi ai dizenteriei; genul Proteus; Pseudomonas; genul Klebsiella. Contaminarea externă este ocazională cu numeroase alte grupe de microorganisme care pot fi, în marea lor majoritate, agenţi de alterare. Grupele de microorganisme din lapte şi semnificaţia lor Dintre grupele de microorganisme ce alcătuiesc microbiota laptelui şi pot fi active în lapte fac parte: - bacteriile factice; prezenţa bacteriilor lactice este de neevitat; dintre acestea fac parte streptococii lactici din genul Lactococcus şi reprezentanţii genului Lactobacillus; - bacteriile propionice provin din surse externe, se dezvoltă lent în lapte şi pot fi utilizate industrial la maturarea brânzeturilor speciale; - bacteriile coliforme; au habitatul în colon. în condiţii neigienice de recoltare a laptelui pot ajunge şi în lapte. Au caracterul comun de a fermenta lactoza cu formare de acid lactic, dioxid de carbon şi hidrogen şi sunt folosite în controlul microbiologic ca indicator al gradului de igienă la recoltarea şi păstrarea laptelui. Din grupul coliform fac parte bacteriile din genurile: Escherichia (Escherichia coli), Enterobacter (E. aerogenes), Klebsiella, Citrobacter. Prezenţa lor în cantităţi mari în lapte denotă o stare precară de igienă. Dacă nu sunt distruse la pasteurizare, pot cauza defectul de balonare timpurie a brânzeturilor; - bacteriile de putrefacţie care acţionează asupra proteinelor laptelui şi provin din surse externe. Pot produce numeroase defecte la păstrarea şi prelucrarea laptelui; bacteriile din

genul Pseudomonas se pot dezvolta într-o gamă largă de temperaturi (inclusiv la refrigerare). Dintre specii, se amintesc P. fluorescens, P. mephita, P. fragi, P. syncyanea, P. aeruginosa. Prin acţiunea lor asupra lipidelor, laptele capătă un miros „de încins", neplăcut; prin oxidarea lactozei produc acidul lactobionic cu gust amar: genul Bacillus cu specia B. cereus se poate înmulţi în lapte, poate produce o coagulare neacidă şi un gust amar. Când se găseşte în cantitate mare, produce starea de toxiinfectie alimentară. Bacterii din genul Proteus cu speciile P. vulgaris, P. mirabillis pot produce degradarea cazeinei; - bacteriile butirice care sunt bacterii ale genului Clostridium, cu speciile: CI. butyricum, CI. sporogenes, CI. tyrobutiricum, CI. perfringens; pot da balonarea târzie a brânzeturilor; - bacteriile peptonizante care pot produce degradări ale proteinelor cu formare de peptone şi peptide amare şi dau coagulare neacidă (enzimatică). Fac parte din aenurile: Microbacterium. Enterococcus (streptococi fecali); 67

- drojdii, care apar ocazional şi fac parte din genul Torulopsis, Kluyve-romyces, Yarowia; activitatea lor în lapte este redusă, deoarece bacteriile se înmulţesc mai rapid; - mucegaiurile, care apar ocazional din aer; pot fi contaminanţi ai utilajelor, ai spaţiilor de depozitare din întreprinderi şi pot produce mucegăirea brânzeturilor. Frecvent, apare specia Geotrichum candidum. Dacă, după mulgere, laptele este păstrat fără tratament termic, din punct de vedere microbiologic se constată o anumită succesiune a fazelor determinată de factorii intrinseci şi de natura şi concentraţia microorganismelor prezente: în faza bacteriostatică se constată o stagnare a creşterii numărului de celule, ca urmare a prezenţei substanţelor antimicrobiene. Poate dura 1-6 h la 20°C sau 24-48 h la 1...4°C. în faza microbiotei heterogene, microorganismele prezente în lapte încep să se înmulţească şi, în funcţie de temperatură, se pot dezvolta bacterii psihrofile din genurile: Pseudomonas, Âlcaligenes, Flavobacterium, prin păstrarea în condiţii de refrigerare; bacteriile mezofile, aparţinând genului Lactococcus, sau bacteriile termofile ale genului Lactobacillus se dezvoltă la temperaturi >40°C. Faza de dezvoltare a bacteriilor tactice. Lactococii se dezvoltă până când pH-ul scade de la 6,5 la 4,5, după care activitatea lor este inhibată; lactobacilii se dezvoltă până la pH = 3,5 (pot produce maximum 350°T). Streptococii au şi activitate peptidazică şi produc peptide ce servesc drept sursă de azot pentru lactobacili. Urmează faza de dezvoltare a drojdiilor şi mucegaiurilor care consumă acidul lactic, sursele de azot şi are loc o creştere a pH-ului până la valori de 6-7, ceea ce face posibilă dezvoltarea în continuare a bacteriilor de putrefacţie care mai pot degrada substanţele proteice ale laptelui. între toate aceste microorganisme se stabilesc relaţii de comensalism, ce pot fi dirijate tehnologic, pentru obţinerea diferitelor produse din lapte.

Microbiota laptelui pasteurizat. Laptele pasteurizat mai conţine o mic rob iotă alcătuită din microorganisme termorezistente în care predomină enterococii (număr admis prin standard: 3 • 105/cm3 la sticle; 5 • 105/cm3 la bidoane), şi bacteriile coliforme (3 coli/cm3 la sticle; 300 coli/ cm3 la bidoane). Din microbiota laptelui pasteurizat au fost izolate bacterii din genul Micrococcus (M. luteus), Micobacterium lacticum, bacterii ale genului Âlcaligenes. Laptele pasteurizat nu conţine microorganisme patogene deoarece, prin pasteurizare, sunt inactivate toate bacteriile patogene transmisibile prin lapte. în laptele pasteurizat pot fi active unele enzime termostabile de natură microbiană ce pot produce defecte de gust la păstrare . Valori ale lui D pentru enzime termostabile din lapte Bacterii Enzime termostabile Valori ale lui D Timp de încălzire pentru pierderea a 90% din activitate Pseudomonas sp. Lipaze D74 54 minute Proteaze D74 160 minute Proteaze D130 8,8 minute Proteaze D149 1,5 minute Âlcaligenes sp. Lipaze D74 16 minute 68

Microbiologia laptelui praf. Laptele praf are o umiditate de 3-3,5%, care nu permite înmulţirea microorganismelor. Laptele praf este un produs higroscopic încât, dacă, după deschiderea ambalajului, umiditatea creşte la > 11% se produce mucegăirea şi sunt catalizate procese ce duc la râncezirea şi modificarea gustului. Din punct de vedere microbiologic se admit până la 2000 de microorganisme per cm3 lapte reconstituit 1/10, iar Escherichia co//să fie absent. Defectele de natură microbiană ale laptelui şi ale laptelui pasteurizat în timpul păstrării laptelui sau laptelui pasteurizat apar anumite defecte datorate activităţii microorganismelor care au ajuns în lapte şi nu au fost inactivate prin pasteurizare. Dintre defecte amintim: - acidifierea şi coagularea, are loc o acidificare prin acumulare de acid lactic, proteinele din lapte pot să precipite şi are loc coagularea acidă a laptelui şi separarea de zer. Când are loc acest proces, laptele este dirijat spre fabricarea brânzeturilor; - proteoliza şi lipoliza, care au loc prin menţinerea laptelui la temperaturi scăzute şi sunt produse de bacterii coliforme, bacterii ale genului Pseudomonas şi de către bacterii lipolitice din genul Bacillus şi genul Acinetobacter, - colorarea, care apare la laptele crud în timpul verii în urma dezvoltării unor microorganisme producătoare de pigmenţi astfel: Chromobacterium cianogenum şi

Pseudomonas syncyanea produc pigmenţi albaştri; Brevibacterium prodigiosus şi Brevibacterium erytropeus dau pigmenţi roşii; - gustul amar, care poate fi întâlnit în laptele proaspăt, atunci când încărcătura microbiană este foarte mare înainte de pasteurizare, şi este dat de bacterii peptonizante din genul Microbacterium, genul Enterobacter, genul Enterococcus. Aceste microorganisme produc peptide amare prin hidroliza proteinelor laptelui. Gustul amar poate proveni şi în urma activităţii de oxidare a lactozei la acid lacto-bionic sub acţiunea bacteriilor din genul Pseudomonas; - gustul de caramel, care poate fi dat prin dezvoltarea în lapte a lui Lacto-coccus lactis var. maltigenes; - defectele de consistenţă, care se datorează coagulării cazeinei sub acţiunea bacteriilor lactice. Poate avea loc şi mărirea vâscozităţii laptelui datorită dezvoltării unor microorganisme ce produc substanţe de natură poliglucidică (Alcaligenes viscolactis, genul Micrococcus, genul Enterobacter). Microbiologia produsele lactate acide Tehnologiile de preparare a acestor produse au la bază utilizarea de culturi de bacterii lactice selecţionate ce se folosesc sub formă de monoculturi sau culturi mixte, cu proprietăţi biotehnologice corespunzătoare pentru obţinerea unor produse de calitate superioară. Culturile pure de bacterii lactice se obţin în laboratoarele de cercetări specializate în care se menţine puritatea culturilor, se fac studii de selecţionare şi conservare a proprietăţilor optime pentru utilizarea industrială. Modul de livrare a culturilor Culturile pure de bacterii tactice se pot livra sub diverse forme. Culturile lichide. în acest caz se face pasteurizarea laptelui, inocularea cu cultura pură, se aplică un regim de termostatare optim şi, după ce are loc coagularea laptelui, etapă ce coincide cu numărul maxim de celufe rezultate prin înmulţire în lapte, se face repartizarea în flacoane de 100 ml, în condiţii aseptice. Aceste culturi 69

trebuie folosite repede, deoarece, dacă aciditatea creşte, are loc inactivarea parţială a bacteriilor lactice. Culturile de lactococii mezofili, după inoculare, se menţin la 20°C, timp de 12-24 h, cele pentru lactobacili la 42°C, 4-6 h. în timpul verii, pentru a preveni creşterea acidităţii, se adaugă carbonat de calciu, astfel încât acesta neutralizează o parte din acid şi se formează lactatul de calciu şi dioxid de carbon, ceea ce face ca, la deschiderea sticlei, să se observe o uşoară spumare. Culturile uscate. Se obţin din culturi lichide, prin uscare la temperaturi sub 70°C. Prin uscare are loc o reducere a numărului de celule vii, iar viabilitatea streptococilor este de aproximativ 40%.

Concentratele bacteriene. Se obţin din culturi lichide, prin centrifugarea mediului la 15 000 rot/min, când se elimină zerul şi are loc o concentrare a celulelor la valori de 5109/g . Pot fi livrate ca atare sau se pot congela şi livra sub formă de concentrat bacterian. Culturile liofilizate. După pasteurizarea laptelui, se face inocularea şi termostatarea, iar cultura se repartizează în fiole de sticlă, astfel încât, prin liofilizare, să rămână o cantitate de 1 - 5 g. în prima etapă are loc o congelare lentă cu viteza de 1°C/min, până la -17°C, se continuă congelarea rapidă până la -50...-70°C, apoi are loc uscarea în vacuum. Flacoanele sunt închise ermetic şi se obţine o pulbere în care bacteriile sunt adsorbite pe substanţa uscată a laptelui, iar procentul de viabilitate a celulelor este 10-60%. Culturile liofilizate pot fi uşor transportate şi utilizate în producţie. Pentru obţinerea produselor lactate acide, în prima etapă se realizează, în laboratorul uzinal, activarea culturilor pure în scopul obţinerii cantităţii de inocul necesar pentru declanşarea fermentaţiei lactice. Inoculul de producţie sau maiaua trebuie preparat(ă) în cantităţi suficiente, încât prin inocularea laptelui pasteurizat să existe un număr de celule de bacterii lactice care să depăşească de cel puţin 1000 de ori numărul microorganismelor existente în microbiota reziduală a laptelui. Pentru activarea culturii pure de bacterii lactice, în fabrică se execută 2-4 pasaje sau inoculări succesive, inoculări care se fac la intervale în care se asigură timpul necesar şi temperatura optimă pentru creşterea şi activitatea celulelor inoculate . Pasajul de la volume mici la volume mari, în vederea obţinerii inoculului de producţie, se realizează după ce a avut loc coagularea laptelui, etapă în care concentraţia de celule este maximă şi corespunde cu sfârşitul fazei exponenţiale de creştere bacteriană. între etape se face controlul calităţii culturii şi se determină aciditatea, iar prin examen microscopic se determină puritatea şi concentraţia de celule prin metoda Breed. în tabelul de mai jos se dau condiţiile necesare pentru reactivarea culturilor liofilizate prin pasaje repetate (2-3 pasaje) pe lapte pasteurizat. în funcţie de natura culturii pure diferă cantitatea necesară de inocul, condiţiile de termostatare şi aciditatea în grade Thorner, la care se recomandă repicarea. Condiţii pentru reactivarea culturilor de bacterii lactice (înainte de obţinerea culturilor intermediare şi a culturii de producţie) Culturi de bacterii Cantitatea de inocul (%) Temperatură CC) Timp (ore)

Aciditate (°T) Lactococcus lactis 1-2 20...3 Lactococcus cremoris 1-2 25...30 Streptococcus salivarius thermophillus 1-2 37...40 6-10 90-100 Lb.delbrueckii bulgaricus 1-2 40...42 130 Lb. acidophillus 2-3 37...40 180 Cultură pentru iaurt 1-2 43...45 Culturi pentru smântână şi unt 1-2 22...24 70

17-20 18-24 5-8 7-10 2-2,3 16-18

90-95 86-92 11012090-95 90-95

O particularitate deosebită faţă de celelalte produse lactate o prezintă chefirul în care, pentru preparare, se foloseşte un amestec de streptobacterii mezofile asociate cu drojdii din genul Torulopsis, microorganisme care sunt fixate pe aglomeratele de cazeină coagulată sub forma „granulelor de chefir". între aceste culturi apar relaţii de simbioză, deoarece bacteriile lactice beneficiază de vitaminele din grupa B produse de drojdii, iar drojdiile au activitate fermentativă optimă la valori acide de pH. Defecte de natură microbiană. în cazul produselor lactate acide păstrate mai mult timp sau ca urmare a procesului tehnologic defectuos, acestea pot suferi diferite tipuri de alterări microbiene: - brânza proaspătă de vaci poate suferi defectul de acrire, când se păstrează la temperaturi ridicate, gustul amar atunci când predomină bacterii sporulate (acumulare a peptonelor şi peptidelor amare) sau mucegăire cu Geotrichum candidum; Alterări microbiene ale brânzeturilor. în condiţii de nerespectare a procesului tehnologic şi a condiţiilor igienico-sanitare la prelucrarea laptelui, în urma activităţii microorganismelor de contaminare pot avea loc alterări ale brânzeturilor cu modificarea calităţilor senzoriale şi pierderea valorii alimentare. Dintre defectele ocazionale întâlnite la conservarea brânzeturilor, mai frecvente sunt următoarele: - balonarea timpurie a brânzeturilor, care apare după 1 -2 zile de la formare şi este datorată prezenţei în număr mare a bacteriilor coliforme: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis, Hafnia sp. ş.a. Aceste bacterii se pot înmulţi concomitent cu bacteriile lactice şi produc fermentaţia lactozei cu formare de acid lactic, acid acetic, C02 şi H2. Ca urmarea a degajării intense de gaze, în condiţiile în care coaja nu este penetrabilă, apare balonarea calupului de brânză, iar în secţiune pasta este buretoasă, cu alveole mici, neuniforme. Deoarece aceste bacterii au activitate cazeolitică, pot produce o hidroliză avansată a proteinelor şi determină apariţia unui gust şi a unui miros „de leşie", atipice. Prezenţa în concentraţie ridicată a celulelor de Escherichia coli, facultativ patogen, producător de enterotoxine poate conduce prin consumul brânzei alterate la starea de toxiinfecţie;

- balonarea târzie, care poate apărea după 20-60 de zile, în timpul maturării brânzeturilor şi este datorată bacteriilor butirice cu activitate zaharolitică, cu speciile: Clostridium butyricum şi Clostridium tyrobutyricum. Aceste bacterii pot proveni din sol, apă, furaje, cheag ş.a., rezistă la pasteurizarea laptelui şi rămân în stare de endospori până când pH-ul creşte la valori mai mari de 6, prin neutralizarea acidului lactic de fermentaţie. în condiţii anaerobe şi de pH optim, are loc germinarea, formarea celulelor vegetative care produc fermentaţia butirică a lactatului de calciu. în urma activităţii lor, prin formare de gaze (C02 şi H2), are loc balonarea, deformarea, cu rupturi inestetice neordonate în pastă şi sesizarea gustului iute, sălciu, prin acumularea acidului butiric. Pentru prevenirea acestui defect, în afara factorilor tehnologici se pot folosi şi metodele biologice. Se recomandă folosirea la fabricarea brânzeturilor a culturii de Lactobacillus plantarum sau a tulpinilor de Lactococcus lactis producător de nisină, cu efect antagonic faţă de bacteriile butirice; - cancerul cojii, care apare prin degradarea protidelor de către bacterii anaerobe: Clostridium sporogenes, Bacillus putrificus, cu apariţia sub coajă a unor zone în care s-a produs putrefacţia; - gustul amar, care este datorat activităţii unor bacterii proteolitice ce aparţin genului Micrococcus, genului Mammococcus, sau activităţii drojdiei Torulopsis amara care favorizează formarea peptidelor amare; -pătarea brânzeturilor, datorată bacteriilor din genul Pseudomonas; în condiţii de păstrare a brânzei în mediu umed, ca rezultat al proteolizei se formează tirozina care, prin oxidare, formează melanine de culoare cenuşiu-brun; - mucegăirea brânzeturilor, care este un defect frecvent ce duce la deprecierea unor cantităţi mari de produse şi se caracterizează prin apariţia de pete colorate specific, miros caracteristic, degradarea cojii şi a zonelor adiacente, risc de formare a micotoxinelor şi de difuzie a lor în. pastă. Dintre mucegaiurile izolate din microbiota brânzeturilor alterate fac parte: 71

Din culturile microbiene utilizate la fabricarea brânzeturilor fac parte următoarele microorganisme: - bacterii tactice, dintre care lactococi (streptococi lactici) cu speciile: Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis diacetilactis şi Streptococcus salivarius varietatea thermophillus. Dintre lactobacili se folosesc speciile Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticum, Lactobacillus plantarum şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Leuconostoc cremoris. în lapte are loc înmulţirea bacteriilor lactice favorizată de prezenţa lactozei, a surselor asimilabile de azot (aminoacizi şi peptide), a potenţialului de oxido-reducere. Cantitatea existentă în lapte a compuşilor cu azot este limitată şi se consumă după 2-3 generaţii. De aceea, pentru obţinerea unor concentraţii maxime de celule, se recomandă cultivarea mixtă a lactococilor producători de peptidaze şi a lactobacililor producători de proteaze exogene. La fabricarea brânzeturilor, după fermentarea lactozei, bacteriile

lactice imobilizate în masa de coagul pot, după autoliză, să fie o sursă de enzime cu rol în maturarea brânzeturilor; - bacterii propionice. Aceste bacterii se folosesc în culturi pure la fabricarea brânzeturilor cu pastă tare şi desen, deoarece fermentează lactoza şi lactaţii cu formarea de acid propionic, C02 care se degajă lent şi formează alveole caracteristice. Măresc valoarea brânzeturilor, prin producerea de vitamină B12, bacterii aparţinând speciei Propionibacterium freudenreichi var. shermani; - bacterii alcalinizante, numite şi „bacterii ale roşului", care sunt active la pH = 6,5-8,5, produc un pigment roşu şi se dezvoltă sub forma unor colonii pigmentate la suprafaţa brânzeturilor cu pastă moale (Brie, Camembert). Dintre bacterii se folosesc speciile Brevibacterium linens şi Arthrobacter globiformis; - mucegaiuri selecţionate ale genul Penicillium cu speciile: • Penicillium camemberti, folosit la fabricarea brânzeturilor de tip Brie, Camembert, cunoscut şi cu denumirea de P.candidum sau P. caseicolum. Este un mucegai alb, caracterizat prin acidotoieranţă şi se dezvoltă şi la valori de pH = 4,5. Are activitate proteolitică şi se dezvoltă la suprafaţa brânzeturilor cu pastă moale, folosind ca sursă de carbon acidul lactic, şi formează un fetru alb, caracteristic. Cultura de mucegai se introduce în lapte înainte de coagulare, sub formă de suspensie de spori (103-105 spori • cm"3) sau se procedează la pulverizarea superficială a formelor de brânză. Prin activitatea enzimatica a culturii are loc o maturare avansată a brânzeturilor de acest tip, caracterizate prin gust picant; • Penicillium roquefortii, folosit la fabricarea brânzeturilor tari (brânză roquefort, brânză cu pastă albastră) în care se dezvoltă intern sub formă de miceliu. în scopul obţinerii sporilor pentru inocul, cultivarea se face pe bucăţi de pâine de secară, timp de 47 zile, până când se produce sporularea. Uscarea se face la temperaturi care să nu inactiveze sporii, apoi are loc măcinarea cu obţinerea unei pulberi bogate în spori, folosită în cantitate de 50 mg/100 dm3 lapte. P.roquefortii este un mucegai acidotolerant şi se dezvoltă pe medii cu 5% acid lactic. Este microaerofil şi se dezvoltă în atmosferă cu 20-40% C02. Brânzeturile de tip roquefort au un grad ridicat de maturare şi o aromă specifică, ca urmare a produşilor rezultaţi prin activitatea enzimatica (proteolitică şi lipolitică) a culturii. Pentru a favoriza dezvoltarea internă a culturii se înţeapă masa de brânză cu ace lungi în diferite direcţii şi, ca urmare a pătrunderii oxigenului, are loc dezvoltarea miceliului şi formarea sporilor coloraţi caracteristic (verde-albastru). 72

Alterări microbiene ale brânzeturilor. în condiţii de nerespectare a procesului tehnologic şi a condiţiilor igienico-sanitare la prelucrarea laptelui, în urma activităţii microorganismelor de contaminare pot avea loc alterări ale brânzeturilor cu modificarea calităţilor senzoriale şi pierderea valorii alimentare. Dintre defectele ocazionale întâlnite la conservarea brânzeturilor, mai frecvente sunt următoarele:

- balonarea timpurie a brânzeturilor, care apare după 1 -2 zile de la formare şi este datorată prezenţei în număr mare a bacteriilor coliforme: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis, Hafnia sp. ş.a. Aceste bacterii se pot înmulţi concomitent cu bacteriile lactice şi produc fermentaţia lactozei cu formare de acid lactic, acid acetic, C02 şi H2. Ca urmarea a degajării intense de gaze, în condiţiile în care coaja nu este penetrabilă, apare balonarea calupului de brânză, iar în secţiune pasta este buretoasă, cu alveole mici, neuniforme. Deoarece aceste bacterii au activitate cazeolitică, pot produce o hidroliză avansată a proteinelor şi determină apariţia unui gust şi a unui miros „de leşie", atipice. Prezenţa în concentraţie ridicată a celulelor de Escherichia coli, facultativ patogen, producător de enterotoxine poate conduce prin consumul brânzei alterate la starea de toxiinfecţie; - balonarea târzie, care poate apărea după 20-60 de zile, în timpul maturării brânzeturilor şi este datorată bacteriilor butirice cu activitate zaharolitică, cu speciile: Clostridium butyricum şi Clostridium tyrobutyricum. Aceste bacterii pot proveni din sol, apă, furaje, cheag ş.a., rezistă la pasteurizarea laptelui şi rămân în stare de endospori până când pHul creşte la valori mai mari de 6, prin neutralizarea acidului lactic de fermentaţie. în condiţii anaerobe şi de pH optim, are loc germinarea, formarea celulelor vegetative care produc fermentaţia butirică a lactatului de calciu. în urma activităţii lor, prin formare de gaze (C02 şi H2), are loc balonarea, deformarea, cu rupturi inestetice neordonate în pastă şi sesizarea gustului iute, sălciu, prin acumularea acidului butiric. Pentru prevenirea acestui defect, în afara factorilor tehnologici se pot folosi şi metodele biologice. Se recomandă folosirea la fabricarea brânzeturilor a culturii de Lactobacillus plantarum sau a tulpinilor de Lactococcus lactis producător de nisină, cu efect antagonic faţă de bacteriile butirice; - cancerul cojii, care apare prin degradarea protidelor de către bacterii anaerobe: Clostridium sporogenes, Bacillus putrificus, cu apariţia sub coajă a unor zone în care s-a produs putrefacţia; - gustul amar, care este datorat activităţii unor bacterii proteolitice ce aparţin genului Micrococcus, genului Mammococcus, sau activităţii drojdiei Torulopsis amara care favorizează formarea peptidelor amare; -pătarea brânzeturilor, datorată bacteriilor din genul Pseudomonas; în condiţii de păstrare a brânzei în mediu umed, ca rezultat al proteolizei se formează tirozina care, prin oxidare, formează melanine de culoare cenuşiu-brun; - mucegăirea brânzeturilor, care este un defect frecvent ce duce la deprecierea unor cantităţi mari de produse şi se caracterizează prin apariţia de pete colorate specific, miros caracteristic, degradarea cojii şi a zonelor adiacente, risc de formare a micotoxinelor şi de difuzie a lor în pastă. Dintre mucegaiurile izolate din microbiota brânzeturilor alterate fac parte: • Geotrichum candidum cu activitate proteazică şi lipazică, lipsit de potenţial toxicogen; • Geotrichum auranticum şi Monascus purpureus, Aspergillus sp.f Penicillium sp.f care produc pete diferit colorate (portocaliu, roşu, brun, verzui). Concomitent cu mucegaiurile, pe suprafaţa brânzeturilor se pot dezvolta drojdii care dau modificări de culoare şi care aparţin genurilor; Rhodotorula, Candida, Yarowia, Debaryomyces. 73

Procese microbiologice la prelucrarea şi conservarea cărnii Carnea este un aliment valoros din punct de vedere nutritiv, datorită prezenţei surselor de carbon şi de energie (glicogen, acid lactic rezultat prin glicoliză), surselor de azot (proteine asimilabile), sărurilor minerale, vitaminelor, unui conţinut de apă liberă de 67% (carnea de vită) - 71% (carnea pui), încât asigură condiţii favorabile pentru creşterea microorganismelor, în special a bacteriilor de putrefacţie. După sacrificarea animalului, carnea poate să sufere procese aseptice datorate enzimelor din ţesutul muscular, care pot să producă prin maturare îmbunătăţirea valorii cărnii, sau procese microbiologice, care pot să ducă la alterarea cărnii şi la risc în consum . Surse de contaminare microbiană a cărnii. Animalul viu şi sănătos conţine în muşchi un număr foarte redus de microorganisme (absente sau o celulă la 100 g). Dacă animalul este obosit înainte de sacrificare sau este bolnav, microorganismele, care sunt vehiculate prin circuitul sanguin, nu mai sunt distruse de către fagocite şi se pot concentra şi localiza în anumite organe: rinichi, ficat, splină. Când animalul este bolnav, microorganismele patogene răspândite în organism pot fi transmise după sacrificare prin intermediul cărnii contaminate. Dintre microorganismele patogene, care se pot transmite pe cale digestivă prin consum de carne contaminată, fac parte: - Mycobacterium tuberculosis (tip bovis), agent al tuberculozei, care este inactivat prin tratamentul termic al cărnii la 80...85°C, timp de 10 minute. Astfel, animalele bolnave sunt sacrificate separat şi carnea este pasteurizată la 85°C timp de 30 minute; - Bacillus anthracis, agent al anthraxului, care se poate transmite prin carne de ovine; - alte specii, care pot aparţine genurilor: Francisella, Leptospira, Brucella, Coxiella ş.a. care produc infecţia pe cale cutanată. Contaminarea cărnii se poate produce şi în momentul sacrificării; prin contactul cuţitului cu plaga jugulară pot fi antrenate microoganisme de pe suprafaţa pielii şi părului, care sunt transmise în organismul în starea de agonie, prin circulaţia sângelui. Dacă, după sacrificare, nu se face rapid răcirea şi eviscerarea, ca urmare a creşterii permeabilităţii pereţilor celulari şi ca urmare a stresului suferit de animal, la sacrificare se poate produce un transfer al microorganismelor din viscere şi are loc contaminarea cu microorganisme de origine intestinală, entero-bacterii, din care sunt facultativ patogene/patogene: Salmonella typhi, Klebsiella, Listeria monocitogenes, Yersinia enterocolitica, Proteus, Escherichia coli. Contaminarea internă a ţesutului muscular, care se produce post-mortem, este redusă. în funcţie de condiţiile mediului ambiant şi de păstrarea condiţiilor igienice la procesarea

cărnii (jupuire, eviscerare, despicare, toaletare), are loc contaminarea externă. Dacă în urma contaminării interne în carne poate exista 1 celulă la 10 g sau 1 celulă la 100 g, prin contaminare externă numărul de celule poate ajunge la 102-103 • cm"2 suprafaţă carne/carcasă. 74

în cazul bovinelor, contaminarea externă se poate produce la jupuire, atunci când, accidental, părul care are o încărcătură microbiană de 107-10 • g vine în contact cu carnea, din surse umane, prin mâini murdare şi mai ales când eviscerarea este defectuoasă. în cazul porcinelor, contaminarea microbiană poate avea loc mai intens dacă opărirea se face pe orizontală, prin imersare în bazine cu apă la 64...65°C. Prin repetarea opăririi, apa se încarcă cu microorganisme şi există pericolul ca pulmonii să se încarce cu un număr mare de microorganisme, mărind riscul de contaminare, la prelucrare. Din punct de vedere microbiologic, prin contaminarea externă pot ajunge pe carne bacterii din genurile: Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Acineto-bacter, Bacillus, Clostridium, Micrococcus ş.a., bacterii de putrefacţie, care se pot dezvolta pe carne în condiţii de refrigerare. Factorii care condiţionează dezvoltarea microorganismelor în carne. Transformările pe care le pot produce microorganismele contaminante ale cărnii sunt dependente de factori intrinseci (compoziţie, aw, pH, rH) şi extrinseci (temperatura de păstrare a cărnii). Accesul microorganismelor, situate la suprafaţa cărnii, la nutrienţi este difteil, ca urmare a izolării acestora de către pereţii celulelor din ţesut. Carnea în carcasă este mai greu alterabilă decât carnea tocată, tocmai datorită acestor bariere naturale. Carnea are un aw de 0,98-0,99 optim pentru dezvoltarea tuturor micro- organismelor, inclusiv a bacteriilor care necesită cele mai ridicate valori. Prin zvântarea cărnii în carcase, aceste valori optime se reduc şi sunt create condiţii favorizante pentru microorganisme xerofile (mucegaiuri). în ţesutul viu şi, imediat după sacrificare, valoarea potenţialului de oxido-reducere este în domeniul pozitiv, deci este favorizată dezvoltarea microbiotei aerobe. După 4-6 ore de la sacrificare, deoarece oxigenul nu mai este furnizat prin circulaţia sângelui, potenţialul redox devine negativ (-50 mV) şi este posibilă dezvoltarea bacteriilor anaerobe de putrefacţie. Valoarea pH-ului cărnii joacă un rol important în demararea proceselor de alterare a cărnii. Carnea are un pH = 6,5-7, favorabil dezvoltării bacteriilor de putrefacţie. După sacrificare, la animalul sănătos, se instalează rigiditatea, deoarece în urma procesului de glicoliză catalizat de enzime ale ţesutului se formează acid lactic, iar din acizii adenilici se eliberează grupări fosfat. Prin acest proces se formează complexe rigide asociate cu o scădere a pH-ului la 5,5-5,7, cu efect inhibitbr asupra înmulţirii bacteriilor. Faza de rigiditate, care poate dura câteva ore, este continuată cu o maturare biochimică datorată

activităţii enzimelor proteolitice tisulare, cu formare de proteine mai solubile, uşor asimilabile şi, ca rezultat al reacţiilor de dezaminare, creşte pH-ul la valori de 6-6,5, favorabile bacteriilor de putrefacţie. 75

Dintre factorii extrinseci, temperatura are un rol major la conservarea calităţii cărnii. Prin răcirea cărnii, imediat după sacrificare şi păstrarea în condiţii de refrigerare, este încetinită atât înmulţirea microorganismelor cât şi producerea de toxine bacteriene. Astfel, dacă păstrarea se face la +10°C, producerea de toxine de către specii ale genului Clostridium este oprită, iar, la păstrarea la temperaturi sub +3°C, producerea de toxine este inhibată pentru toate bacteriile toxicogene. Pentru păstrarea cărnii şi oprirea înmulţirii bacteriilor de putrefacţie se recomandă temperatura de 0°C (în condiţii de vacuum), iar la temperatura de -18°C este oprită total înmulţirea microorganismelor în carne. Se consideră că Listeria monocyto-genes, agent al listeriozei, poate suferi modificări neletale sau subletale în carnea de vită tocată, congelată la-18°C. Alterările microbiene ale cărnii sunt dependente de natura şi de concentraţia de microorganisme, de tipul de carne, de umezeala relativă din depozit şi de temperatura de păstrare. Astfel, alterarea cărnii este specifică şi, în funcţie de factorii enumeraţi, aceasta poate fi provocată de 1-4 specii, deşi pe carne există o micrdbiotă mult mai complexă. Se pot întâlni următoarele tipuri de alterări: •Alterarea superficială prin păstrarea cărnii la temperaturi de 0...10°C, care se produce lent, deoarece temperaturile scăzute scad viteza de metabolism a microorganismelor iar modul de alterare este dependent de umezeala relativă a aerului din depozit. Dacă acesta este mai mare de 80-90% şi suprafaţa cărnii este umedă, este favorizată înmulţirea bacteriilor psihrofile şi psihrotrofe ale genului Pseudomonas. în carnea alterată, la creşterea numărului de bacterii la valori de aproximativ 107 • cm"2 este sesizat mirosul de putrefacţie iar la creşterea peste 108* cm"2, acesta este asociat cu formarea de mucus. Mucusul rezultă în urma juxtapunerii sau coalescenţei între coloniile de bacterii şi a modificării structurii proteinelor din zona superficială. Dintre bacteriile producătoare de mucus fac parte cele ce aparţin genului Pseudomonas, bacterii Gram-negative, aerobe, cu activitate lipolitică şi proteolitică, cu speciile Ps. fluorescens, Ps. ambigua, Ps. fragi, Ps. putida, şi genuri: Aeromonas, Micrococcus. La păstrarea cărnii în depozit cu umezeală relativă a aerului mai mică de 75%, când suprafaţa cărnii este zvântată, alterarea poate fi produsă de către drojdii şi mucegaiuri. • Mucegăirea, care apare vizibilă după 1-2 săptămâni de păstrare, atunci când awr-ul este suficient de scăzut pentru a nu permite creşterea bacteriană. Dacă în prima fază de dezvoltare mucegaiurile se pot îndepărta prin spălare, o dată cu sporularea se constată o pătrundere a hifelor în carne, pe distanţe de 1-2 cm, şi prin spălare rămân pete inestetice, având loc deprecierea cărnii. Dintre mucegaiurile care se pot dezvolta pe carne în condiţii de refrigerare fac parte: Cladosporium herbarum, Sporotrichum carnis (care se poate dezvolta pe carne la temperatura minimă de creştere de -5,7°C), Thamnidium elegans,

specii ale genului Penicillium. Mucegăirea este uneori asociată cu creşterea drojdiilor psihrotrofe din genurile: Candida (produce lipaze ce catalizează râncezirea), Rhodotorula, Debaryomyces. • Alterarea superficială şi de profunzime, care poate avea loc prin menţinerea cărnii la temperaturi de 10...25°C (casnic, pe reţeaua de livrare etc). Această alterare are loc şi atunci când răcirea se face lent după sacrificare şi păstrarea se face la temperatura mediului ambiant. Poate să fie evidenţiată după 2-3 zile de la sacrificare şi este datorată dezvoltării bacteriilor aerobe de putrefacţie psichrotrofe şi mezofile aparţinând genurilor: Pseudomonas, Lactobacillus (Lb. vir'hdiscens, Lb. fermenţi),* Brochothrix thermosphacta, formatoare de mucus. 76

Pe lângă alterarea de suprafaţă, în etapa finală se poate produce o alterare de profunzime, mai frecvent în partea posterioară a carcaselor, unde răcirea are loc lent şi este produsă de bacterii ale genului Bacillus şi Clostridium (Clostridium perfringens). Carnea alterată prezintă o culoare cenuşiu-verzui, ca urmare a formării de către microorganisme a apei oxigenate care reacţionează cu pigmenţii cărnii, formând choleglobina, sau prin eliberarea de H2S prin putrefacţie, care transformă oxihemoglobina în sulfomioglobină (thiomethemoglobină) de culoare verzuie. în cazul în care concentraţia de bacterii ale genului Bacillus cu speciile: Bacillus megatherium, Bacillus subtilis-mesentericus este mai mare de 103 g~\ în urma formării de acid propionic prin fermentaţie ca şi prin eliberarea de acizi graşi prin hidroliza grăsimilor din ţesutul adipos, carnea capătă un miros acru, de „încins". • Alterarea profundă, care poate avea loc în carne cu contaminare internă, la temperaturi de 20...45°C. Această alterare se produce când nu se face răcirea după sacrificare şi climatizarea spaţiilor de depozitare a cărnii este necorespunzătoare. Alterarea poate să fie sesizată după 4-8 ore, mai ales dacă eviscerarea nu este făcută imediat după moartea animalului şi este datorată bacteriilor anaerobe ale genului Clostridium. în prima etapă sunt active clostridii glucidolitice care pot folosi în nutriţie glicogenul cu specia predominantă Clostridium perfrin-gens; în această fază nu este sesizat mirosul neplăcut dar, datorită formării prin fermentaţie a gazelor C02 şi H2, muşchiul devine buretos. în etapa a ll-a, activitatea predominantă aparţine bacteriilor anaerobe de putrefacţie: Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens ş.a care formează, prin degradarea protidelor din carne, amine toxice şi alţi produşi finali care dau un miros dezagreabil, specific. Particularităţi ale microbiotei cărnii de pasăre. Carnea de pasăre are valoare nutritivă ridicată şi umidităţi de până la 70%, încât este un produs uşor alterabil. Carnea păsărilor vii poate suferi o contaminare internă, în special cu bacterii ale genurilor: Salmonella.Corynebacterium, Flavobacterium şi Moraxella. în timp ce contaminarea internă este ocazională şi limitată, contaminarea externă este frecventă şi are loc în cursul diferitelor operaţii tehnologice. Astfel, la opărire şi deplumare se poate produce o

contaminare masivă cu microorganisme (provenite din sol, apă, materii de dejecţie), aflate pe suprafaţa penelor. Eviscerarea în abatorul de păsări se face prin vacuumare şi dacă au loc, accidental, rupturi ale intestinelor, se produce contaminarea cu bacterii din microbiota intestinală, respectiv enterococi şi enterobacterii: Escherichia, Salmonella, Campylobacter ş.a. O reducere a numărului de microorganisme are loc la clătirea carcaselor cu apă potabilă sau cu apă clorinată. Alterarea cărnii de pui se face mai rapid decât cea a cărnii de vită şi este datorată bacteriilor din genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella. în carnea de pasăre ambalată prin vacuumare se poate produce acrirea cărnii datorată activităţii bacteriilor facultativ anaerobe din genurile Lactobacillus şi Brohothrix. în cazul în care prin activitatea bacteriilor de putrefacţie au rezultat amine toxice, consumul cărnii este riscant, deoarece aminele sunt termostabile şi rezistă la tratamente termice lejere. Particularităţi ale microbiotei cărnii de peşte. Peştele viu prezintă o microbiota similară în componenţă cu cea a apei în care trăieşte. Microorganismele sunt reţinute, prin procesul de filtrare al apei, pe suprafaţa branhiilor sau sunt adsorbite de mucus. Mucusul natural situat la suprafaţa peştelui are însuşiri bactericide în raport cu unele specii, dar acestea se pierd după ce peştele este recoltat. Alterarea peştelui se produce rapid, datorită migrării microorganismelor din intestine ca urmare a permeabilizării post-mortem a acestora, motiv pentru care este obligatorie eviscerarea rapidă a peştelui. în timp ce peştii de apă dulce au în cantitate 77

mare bacterii de putrefacţie ale genului Alcaligenes, la peştii din ape sărate predomină genul Flavobacterium. Din microbiota intestinală prin migrare în came se pot întâlni specii ale genurilor: Pseudomonas, Clostridium, Bacillus, Escherichia, Vibrio, Campylobacter. Alterarea peştelui la păstrare în condiţii de refrigerare se produce mai lent şi este dată de bacterii ale genulrilor Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium ş.a. şi mai rapid la temperatura camerei,când se produce putrefacţia dată de bacterii din genurile: Proteus, Escherichia. Peştele păstrat neeviscerat suferă alterarea asociată cu umflarea, datorată formării de gaze: C02, H2, H2S, de către bacterii din genul Clostridium. Prin consum de peşte alterat se pot produce intoxicaţii grave, ca urmare a prezenţei de toxine produse de bacterii toxicogene sau a aminelor biogene toxice. Alterarea sesizabilă a cărnii de peşte are loc la creşterea numărului total de bacterii peste 105g"1, iar dacă numărul depăşeşte valoarea de 106 celule • g"1, peştele nu se admite în consum. Microorganisme transmisibile prin carne şi factori de risc. Prin consum de carne contaminată, există riscul de transmitere a următoarelor grupe de micro- organisme: - microorganisme patogene provenite prin contaminare internă în timpul vieţii şi vehiculate prin carne, microorganisme care produc stări de infecţie după ingerare şi învingerea forţelor de apărare a organismului, dând boli ca, de exemplu: bruceloza, rujetul, tuberculoza, leptospiroza ş.a.;

- microorganisme patogene şi facultativ patogene ce provin din contaminare externă prin contact direct la manipularea cărnii, din diferite surse: sol, apă, insecte, sursă umană. Din acest grup fac parte specii ale genurilor: Salmonella, Staphy-lococcus, Listeria, Clostridium, Escherichia ş.a. Microbiologia preparatelor din carne Preparatele din carne se obţin într-o gamă largă de sortimente ce diferă prin compoziţia chimică, conţinutul de apă liberă şi din punct de vedere microbiologic. Microbiota materiilor prime şi auxiliare suferă modificări importante în etapele tehnologiei de preparare. La fabricarea preparatelor din carne se foloseşte carne tocată, care poate prezenta o contaminare bacteriană (104-106g~1)- O carne tocată cu peste 107g~1 celule bacterii nu este admisă la fabricare. Dintre materiile auxiliare, o sursă importantă de microorganisme o prezintă sarea (102'106g~1) care aduce în compoziţie bacterii sporulate, bacterii tolerante la sare, inclusiv drojdii halotolerante. Cu cât sarea este mai purificată şi se elimină componentele anorganice ale solului, numărul microorganisme este mai restrâns. Condimentele, deşi se adaugă în proporţii mici, au o încărcătură microbiologică foarte mare, mai ales în cazul plantelor aromatice care se încarcă cu microorganisme în timpul creşterii. Piperul, ienibaharul pot conţine 105-106 celule • g~1. Din microbiota condimentelor au fost izolate bacterii sporulate şi mucegaiuri ce produc micotoxine; de aceea, există orientarea de a fi sterilizate pe cale chimică înainte de folosire (etilen oxid). Utilizarea extractelor condimentare, a diferitelor uleiuri care conţin substanţe aromatizante, este avantajoasă, deoarece pot fi dozate cu o mai mare precizie şi sunt lipsite de microorganisme. în acest caz, anumite componente naturale pot avea un efect microbiostatic sau microbicid asupra microorganismelor. Membranele folosite pentru marea majoritate a preparatelor din carne, atunci când sunt naturale (conservate prin sărare), au o încărcătură microbiană ridicată, deoarece au venit în contact cu microbiota intestinului (bacterii coliforme şi alte 78

bacterii de putrefacţie). Din punct de vedere microbiologic, membranele artificiale au o încărcătură foarte redusă şi, deci, nu contribuie la încărcarea produsului cu microorganisme de alterare. La obţinerea preparatelor din carne, o primă etapă constă în omogenizarea ingredientelor, care asigură o dispersie a microorganismelor în pastă. După umplere, în funcţie de sortiment, se pot aplica diferite procese ca: afumarea la cald când temperatura în pastă ajunge la 50...52°C, iar la afumare ca rezultat al evaporării apei precum şi al prezenţei substanţelor din fum, unele cu efect micro-biostatic, poate avea loc o reducere a

numărului de microorganisme, în special în zona exterioară a batoanelor; fierberea (pasteurizarea), când temperatura în centrul batonului este de 68°...72°C, temperatură care inactivează eventualii patogeni nesporulati ce s-ar putea transmite prin carne, reducând, de asemenea, şi o parte din microbiota bacteriană nesporulată. în funcţie de condiţiile de păstrare, de calitatea microbiologică a materiei prime şi auxiliare şi de procesul tehnologic, în timpul păstrării în condiţii ce favorizează formarea de apă liberă, sau dacă în depozit umezeala relativă a aerului este > 80-85%, se pot produce diferite alterări datorate activităţii microorganismelor care rămân active în produsul finit. Defecte şi alterări microbiene. Se pot întâlni tipurile de defecte şi de alterări prezentate în continuare. Formarea de mucus la suprafaţa batoanelor, datorată dezvoltării bacteriilor sau drojdiilor, este favorizată de umiditatea ridicată sau de apariţia apei de condens. Se poate forma frecvent la suprafaţă sau sub membrană; formarea este datorată bacteriilor aerobe şi facultativ anaerobe din genurile/speciile: Pseudo-monas, Aeromonas, Lactobacillus viridiscens, Microbacterium thermosphactum. în anumite condiţii, formarea de mucus şi apariţia petelor albe pot fi datorate dezvoltării de drojdii halotolerante cu specia Debaryomyces hansenii. Mucegăirea este un defect de suprafaţă şi poate fi datorată mucegaiurilor ce se pot dezvolta în domeniul de refrigerare şi care pot proveni din contaminare externă (aer, mâini, utilaje). Dintre mucegaiurile ce dau pete inestetice şi colorate fac parte genurile: Penicillum, Cladosporium, Sporotrichum, Thamnidium, Aspergilllus. Colorarea cu apariţia de pete albastre, rar întâlnită, este determinată de unele bacterii din genul Chromobacterium cianogenum ce pot proveni din sare sau aer. Acrirea şi înverzirea pastei este un defect întâlnit la prospături (parizer, polonez) şi se datorează dezvoltării bacteriilor lactice heterofermentative, care se pot înmulţi în anumite condiţii, dând acrirea ca rezultat al formării de acid lactic. Deoarece aceste bacterii produc apă oxigenată, în absenţa catalazei inactivate prin pasteurizare, aceasta poate produce oxidarea pigmenţilor roşii ai cărnii cu formare de porfirine de culoare verde. înverzirea poate fi: superficială, sub formă de inel situat la o anumită distanţă de suprafaţă, sau în zona centrală a umpluturii, în funcţie de viabilitatea bacteriilor heterolactice, activitatea lor fermentativă şi activitatea catalazică. Acest defect se caracterizează şi prin modificarea gustului şi este dat de bacterii lactice din genul Leuconostoc şi Lactobacillus cu speciile: Lb. viridiscens, Lb. plantarum, Lb. leichmani; apare frecvent ia preparatele din carne cu adaos de ficat, splină. Umflarea apare la prospături şi este un defect rar întâlnit atunci când în pastă sunt prezente bacterii ale speciei Clostridium perfringens. în cazul în care concentraţia în celule este mare, are loc o fermentaţie cu producere de gaze (C02 şi H2), care determină umflarea, pasta este buretoasă şi, prin consum, există riscul de toxiinfectie alimentară. 79

Culturi starter utilizate în industria preparatelor din carne. în tehnologia preparatelor din carne se pot folosi microorganisme cu rol util, sub formă de culturi „starter", care se pot adăuga în pastă înainte de umplere sau sunt folosite la maturarea salamurilor uscate. Culturile starter sunt reprezentate de: culturi de bacterii lactice selecţionate din genurile: Pediococcus (P. cerevisiae, P. acidilactici), Micrococcus (M. varians), Lactobacillus sp. Culturile se adaugă într-un mediu nesteril; de aceea, cantitatea culturii de producţie adăugate trebuie astfel calculată, încât numărul de celule introduse în pasta de carne să fie de cel puţin 1000 de ori mai mare decât cel existent în microbiota cărnii. Aceste culturi produc o fermentaţie lactică, determinând astfel o scădere a pH-ului care inhibă activitatea bacteriilor de putrefacţie, iar acidul lactic format contribuie la obţinerea gustului plăcut. Unele culturi prezintă avantajul că produc nitrat reductază (cele care conţin micrococi), care catalizează formarea nitritilor ce se combină cu pigmentii din carne, formând nitrozo-hemoglobina care menţine o culoare roşie plăcută şi au activitate lipolitică şi proteolitică limitată, deci contribuie la acumularea de componente de gust şi aromă. Dintre culturile fungice folosite drept culturi starter, cele mai importante sunt cele din genul Penicillum (Peniciilium nalgiovensis) folosite la obţinerea salamurilor crude, care influenţează pozitiv uscarea naturală şi maturarea. Aceste microorganisme se dezvoltă ca un fetru de culoare albă la suprafaţa batoanelor şi, prin intermediul hifelor penetrante, asigură o difuzie a umidităţii şi o uscare uniformă, iar prin intermediul enzimelor (lipaze, proteaze) contribuie la formarea compuşilor de gust şi de aromă specifici acestor produse. Culturile de P.nalgiovensis au înlocuit culturile de P. expansum Link folosite mult timp datorită vivacităţii lor; înlocuirea a fost determinată de faptul că, în mediu de cultură optim pentru biosinteza de micotoxine, P. expansum poate produce patulina (clavacina), cu efect cancerigen, fără ca aceasta să fi fost detectată în salamuri maturate. Dintre procesele microbiologice utile întâlnite în industria preparatelor din carne, cel mai important este maturarea bradtului. Bradtul se menţine la maturat 12-24 h, în acest timp fiind avantajată activitatea microorganismelor prezente şi anume a micrococilor, care produc nitrat reductază şi contribuie la formarea şi menţinerea culorii roşii naturale a pastei de carne şi a bacteriilor lactice homo- şi heterofermentative, care pot produce cantităţi foarte reduse de acid lactic şi substanţe de aromă. Microbiologia ouălor Oul este un aliment foarte valoros folosit în alimentaţie şi în industrie, pentru obţinerea prafului de ou, a produselor de patiserie, a pastelor făinoase, a maionezelor, a shortening-urilor, a sosurilor. Structura anatomică a oului îi asigură protecţia, astfel încât conservarea calităţii este asigurată un timp limitat în funcţie de temperatura şi durata păstrării. Coaja oului asigură protecţia mecanică , iar la oul proaspăt aceasta are un strat de mucină cu efect antimicrobian, ceea ce face ca dezvoltarea microor ganismelor să fie limitată; efectul se reduce după 1-2 săptămâni sau după îndepărtarea prin spălare a

stratului de mucină. Coaja prezintă numeroşi pori a căror dimensiune este mai mare decât a celulelor microbiene, încât, în anumite condiţii, celulele pot penetra coaja. în medie, pe 1 cm2 de coajă se găsesc 110 pori cu diametrul mai mare decât diametrul celulei bacteriene. Membrana internă bogată în keratină este permeabilă pentru vaporii de apă şi pentru unele bacterii şi impermeabilă pentru sporii de mucegaiuri. 80

Albuşul nu este un mediu optim, datorită pH-ului de 9,3 şi a prezenţei unor substanţe ce influenţează negativ activitatea microbiană. Astfel, este prezent lizozimul, substanţă cu efect bactericid, avidina, substanţă care blochează vitaminele din grupa B ce au rol de factor de creştere pentru bacterii, conalbumina, proteină care complexează fierul, element important pentru nutriţia lor minerală. Gălbenuşul reprezintă un mediu excelent pentru înmulţirea microorganismelor, are un pH = 6,9, este bogat în substanţe nutritive şi nu conţine substanţe cu efect ihibitor. Experienţele efectuate prin inocularea în gălbenuş a bacteriilor din genul Salmonella au stabilit că acestea se înmulţesc foarte bine şi pot ajunge la valori de 108/g gălbenuş. In timpul păstrării are loc o difuzie a apei din albuş în gălbenuş, se produce o omogenizare şi conţinutul oului devine un mediu foarte bun pentru înmulţirea bacteriilor care au pătruns în interior. Contaminarea microbiană a ouălor poate fi de 2 tipuri, care sunt prezentate în continuare. Contaminarea internă este ocazională şi poate fi dată, în special, de microorganisme patogene şi facultativ patogene ce pătrund în ou în perioada de formare (la păsări bolnave), sau de apa contaminată care pătrunde în oviduct, contaminare întâlnită în special la gâşte şi raţe. Dintre microorganismele de contaminare internă amintim: - genul Salmonella cu speciile: Salmonella enteridis, Salmonella galinarium, bacterii nesporulate, Gram-negative, facultativ patogene care se pot înmulţi în gălbenuş, deoarece pot acţiona asupra glucozei cu formare de acizi şi gaze. Nu fermentează lactoza şi zaharoza, se prezintă sub formă de bastonaşe scurte, mobile; pot să folosească în nutriţie aminoacizi şi pot produce hidrogen sulfurat. Acestea pot să provină fie de la păsări care au suferit îmbolnăvirea, fie din contaminare externă (dejecţia altor păsări). Bacteriile din genul Salmonella care se răspândesc prin ouă pot produce endotoxine; de aceea, prin ingerarea preparatelor din ouă insuficient tratate termic, acestea ajung pe cale digestivă în organism, sub acţiunea sucului gastric are loc liza pereţilor celulari şi eliberarea de toxine, producându-se starea de toxiinfecţie alimentară caracterizată prin diaree, dureri de cap şi chiar moarte. în timp ce ouăle de găină au o contaminare redusă (0-7%), ouăle de raţă pot fi contaminate în proporţie de 1-26 %; de aceea, la prelucrare şi comercializare se impun condiţii de fierbere de minimum 10 minute, pentru a avea certitudinea distrugerii salmonelelor şi a inactivării toxinelor (posibilă la 62...64°C în câteva minute);

- genul Proteus, cu specia Proteus mirabilis; în concentraţii mari produc boli infecţioase şi toxiinfecţii alimentare (gastroenterite). Bacteriile se înmulţesc în ou şi produc hidrogen sulfurat prin degradarea proteinelor. Prin inocularea de bacterii (103 • g"1) în praf de ouă, după 2 luni de păstrare acestea nu au mai fost detectate în 10 grame produs; - genul Clostridium, cu specia Clostridium perfringens, care poate proveni din contaminare externă. în prezenţa fosfolipidelor din gălbenuş pot produce toxine (6 tipuri de enterotoxine). Prin dezvoltarea acestor bacterii în cremele preparate cu ouă contaminate, se produce eliberarea de toxine şi îmbolnăvirea dacă aceste toxine nu -sunt distruse prin tratament termic; - genul Mycobacterium tuberculosis (tip aviar); se produce o contaminare a ouălor provenite de la păsări bolnave. Contaminarea externă are loc prin intermediul apei poluate, a aerului din cuibarul contaminat cu dejecţiile păsărilor. După expulzare, oul are o temperatura de 81

35...37°C, iar dacă în cuibar este rece, prin contracţia conţinutului, aerul este aspirat şi pătrund microorganisme din stratul de aer înconjurător. Alterări microbiene ale ouălor. în timpul păstrării ouălor, ca urmare a activităţii microorganismelor de contaminare se pot produce diferite alterări: - putrefacţia verde - conţinutul oului capătă o culoare verzuie şi prezintă un miros de varză acră; este datorată microorganismelor din genul Pseudomonas cu speciile: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ambigua, Pseudomonas convexa. Ele produc pioverdina, pigment de culoare verzuie, cu proprietăţi fluorescente; - putrefacţia neagră, care este profundă, cu modificarea culorii şi degajarea puternică de hidrogen sulfurat datorată bacteriilor din genul Proteus, cu speciile: Proteus vulgaris, Proteus melanovogens; - putrefacţia portocalie, atunci când oul se păstrează la temperatura camerei şi este dată de Bacillus megatherium ce produce pigmenţi portocalii, gaze, amine toxice; -putrefacţia roşie, dată de bacterii din genul Serratia, care produc un pigment roşu, denumit prodigiosină; - mucegăirea sub coajă, în camera de aer ce se formează prin pierderea apei; este dată de reprezentanţi ai genurilor Penicilium, Cladosporium. Pentru industrializare se folosesc numai ouăle de găină care sunt dezinfectate prin spălare, iar spargerea se face sub control, pentru a nu permite introducerea de ouă alterate în procesul tehnologic. Micrologia berii

La fabricarea berii, materia primă de bază este orzul şi/sau orzoaica, care suferă, în prealabil, un proces de malţificare în scopul activării şi formării de enzime amilolitice şi proteolitice. Malţul obţinut după germinare se combină cu nemalţificate (porumb), ce măresc cantitatea de amidon care, prin zaharificare enzimatica, contribuie la obţinerea mustului de malţ, cu un conţinut ridicat de glucide fermentescibile. Pentru obţinerea malţului, orzul sau orzoaica trebuie să fie de calitate bună, iar la păstrare în siloz să se evite procesele microbiologice nedorite. Orzul prezintă la suprafaţa învelişului o microbiotă heterogenă alcătuită din mucegaiuri (103-104-g"1), bacterii nesporulate din genurile: Pseudomonas, Lactobacillus; bacterii aerobe sporulate ale genului Bacillus. în condiţii necorespunzătoare, prin păstrarea orzului şi prin creşterea umidităţii acestuia, poate avea loc mucegăirea şi încingerea cerealelor. în zona embrionară se pot dezvolta mucegaiurile genului Penicillium şi Aspergiilus, ce produc modificări ireversibile în embrion. în acest caz, orzul îşi pierde capacitatea de germinare şi nu mai poate fi folosit pentru obţinerea de malţ. în microbiotă orzului au fost identificate specii de: Fusarium, Nigrospora, Helmin-thosporium, Aspergiilus, Penicillium, Rhizopus. Când mucegăirea este produsă de mucegaiuri toxicogene, există riscul ca, prin prelucrare, micotoxinele să se regăsească în bere. De exemplu, prin introducerea de ochratoxină marcată în cantitate de 10 mg/kg, s-a constat că aceasta nu se distruge în cursul procesului tehnologic; cantitatea cea mai mare se regăseşte în borhot, 8-10%, este reţinută de celule de drojdii, iar 14% a fost detectată în bere. Prin folosirea de citrinină, aceasta nu s-a mai regăsit la plămădire, ea fiind distrusă probabil la germinare. Aceste experienţe arată obligativitatea de a se folosi o materie primă de calitate bună la fabricarea berii. 82

Pentru obţinerea malţului, orzul se spală, se îndepărtează o mare parte din microbiota boabelor, se înmoaie până la umiditatea de 40-42%, şi are loc germinarea, când o parte din enzimele din orz trec din starea inactivă în starea activă sau sunt sintetizate „de novo" sub acţiunea acizilor giberellici. După ce a avut loc germinarea (3-4 zile), în scopul conservării malţului, se face uscarea în trepte, fără a se depăşi temperatura de 80°C în bob, pentru a preveni inactivarea enzimelor. în timpul uscării se reduce o parte din microbiota malţului, dar, după uscare (prin transport, în silozul de malţ), are loc o recontaminare a boabelor. După uscare se îndepărtează radicelele uscate, ce pot fi folosite în industria de biosinteză ca sursă de factori de creştere pentru cultivarea microorganismelor. Malţul este mai higroscopic decât orzul, are un conţinut mai mare în substanţe asimilabile; de aceea, prin creşterea umidităţii prin procese de termo-hidrodifuzie, mucegăirea şi încingerea malţului poate avea loc mai rapid decât în cazul orzului. La plămădire, malţul măcinat cu adaos de nemalţificate măcinate şi tratate termic se amestecă într-o anumită proporţie cu apă şi, conform unei diagrame de plămădire, este

favorizată acţiunea enzimelor din malţ care degradează componentele din făină şi se acumulează în must substanţe asimilabile cu azot, în etapa de proteoliză (45°C), şi maltoza în etapa de amiloliză a amidonului (60...70°C). în perioada de plămădire, microorganismele de la suprafaţa boabelor trec în must, dar această perioadă este scurtă şi, de aceea, nu se constată o înmulţire a microorganismelor. După separarea mustului, borhotul rezultat reţine cea mai mare cantitate de microorganisme. Borhotul este folosit în nutriţia animalelor şi este foarte uşor alterabil prin acrire (fermentaţie lacticâ) sau prin formarea de acid butiric (fermentaţie butirică). Mustul de malţ obţinut este bogat în maltoză, surse de azot asimilabile, vitamine. în cazul mustului contaminat se poate produce dezvoltarea bacteriilor termofile: Bacillus stearothermophillus şi Bacillus coagulans care pot forma acid tactic. După filtrare, mustul de malţ este fiert în prezenţă de hamei, în scopul aromatizării lui. Hameiul, prin răşinile pe care le conţine, poate avea un efect antimicrobian manifestat mai ales asupra bacteriilor Gram-pozitive. Efectul cel mai puternic îl are humulonul, pe când lupulonul are doar 1/3 din activitatea humulonului. în urma fierberii cu hamei, mustul poate deveni steril. în continuare se face răcirea lentă a mustului (în tăvi de răcire, operaţie în care riscul de contaminare este mai ridicat) în sisteme tubulare în care riscul de contaminare este mai redus. Mustul răcit este introdus în linuri închise şi se face inocularea cu drojdia de cultură. în mustul nefermentat, în mod accidental, se pot întâlni bacterii conforme din genul Escherichia, Enterobacter (E. cloacae, E. agglomerans) şi Klebsiella (K. Aero-genes, K. terrigena, K. oxytoca), Citrobacter, Hafnia (Hafnia protea), ce au condiţii să se înmulţească în must, mai ales dacă acesta nu se răceşte rapid. Prin activitatea lor produc opalescentă, imprimă mustului un gust străin, produc reducerea nitratului, iar drojdiile inoculate într-un astfel de must au o activitate fermentativă diminuată. Inocularea mustului, una din etapele importante ale procesului, se face cu drojdii aparţinând speciei Saccharomyces cerevisiae de fermentaţie inferioară, drojdii cunoscute cu denumirea de Saccharomyces uvarum (carlsbergensis). Pentru obţinerea culturii de drojdie se porneşte de la cultura pură, au loc etape de multiplicare în laborator prin transferul celulelor în mustul de malţ steril. Multiplicarea celulelor se face la temperatura de refrigerare pentru a crea drojdii adaptate la condiţiile de fermentare şi se obţine aşanumitul „cuib de drojdii" în laborator. Apoi, înmulţirea drojdiei are loc în multiplicatorul de drojdie şi se obţine cultura de producţie folosită pentru însământarea mustului răcit; cantitatea de cultură folosită este de aproximativ 400-450 g/hl must . 83 Fermentaţia primară este prima etapă după însămânţare când pH-ul mustului este 5-6. Perioada de fermentaţie este de 7 zile, timp în care drojdiile câştigă în competiţia cu alte microorganisme contaminante şi produc fermentaţia maltozei şi a unor dextrine cu molecule mici. în stadiul iniţial este posibilă o dezvoltare a bacteriilor din specia Flavobacterium proteus, bacterii care pot proveni din apă sau de pe utilaje şi care se pot înmulţi în must fără să fie inhibate de hamei, dând modificări de gust. La fermentaţia primară, în afară de fermentaţia alcoolică mai are loc şi înmulţirea cantităţii de drojdie, obţinându-se de 3 ori mai multă faţă de cantitatea inoculată. Prin degajarea de C02, la

suprafaţa linurilor de fermentaţie se formează o spumă, apoi, pe măsură ce se reduce extractul mustului, viteza de fermentare scade şi are loc depunerea drojdiei. Fermentaţia primară are loc la 6...8°C, temperatură care protejează fermentaţia şi împiedică dezvoltarea eventualelor bacteriilor mezofile/termofile. Mustul de fermentaţie este transvazat de pe sedimentul de drojdie în tancuri închise, pentru fermentaţia secundară. Drojdia rămasă în urma fermentaţiei primare poate fi valorificată pentru însămânţarea unor noi cantităţi de must. în acest caz, stratul inferior care conţine un număr mare de impurităţi este eliminat, stratul median care conţine proporţia cea mai mare de celule vii şi active este recoltat în vane, iar stratul superficial ce conţine celule mici, autolizate şi răşini amare este, de asemenea, eliminat. Drojdiile din stratul median se spală cu apă rece şi pură din punct de vedere microbiologic, se face controlul microscopic şi, dacă procentul de celule autolizate este mic şi sunt absente bacteriile de contaminare, este refolosită pentru inocularea mustului la fermentaţia primară. Astfel, în condiţii igienice, când nu are loc contaminarea drojdei, în practica fabricării berii se pot folosi 6-20 de recirculări (generaţii) ale drojdiei. Drojdia reziduală poate fi valorificată prin obţinerea de plasmolizate, sau poate fi folosită ca sursă de vitamine în nutriţia animalelor Fermentaţia secundară are loc la 3...4°C, timp de 4-42 zile. Celulele de drojdii ce mai rămân în suspensie continuă să fie active din punct de vedere enzimatic şi are loc saturarea cu dioxid de carbon rezultat prin fermentaţie ; au loc o serie de reacţii enzimatice şi procese fizico-chimice care contribuie prin produşii rezultaţi la formarea compuşilor de aromă. Filtrarea berii are loc la sfârşitul fermentaţiei secundare. Filtrarea poate fi sterilizantă mai ales dacă materialul filtrant este steril şi prezintă pori ce asigură reţinerea microorganismelor. După filtrare, recontaminarea se poate realiza pe circuitul de transport (lămpi de control, garnituri de etanşare a furtunurilor ş.a.). îmbutelierea se face în sticle sau în butoaie (din lemn, aluminiu). La îmbuteliere există un risc mai mare de contaminare a berii, în special datorită ambalajelor, dacă spălarea şi dezinfecţia acestora nu este corect aplicată. Alterări microbiene ale berii. Berea, în funcţie de sortiment, prezintă o compoziţie variată, cu valoare nutritivă ridicată, iar diferitele componente ale berii pot servi drept substrat pentru activitatea microorganismelor ce contaminează berea. Alterarea poate fi dată de un număr restrâns de microorganisme, deoarece în bere există anumiţi factori defavorizanţi, pentru dezvoltarea acestora, şi anume: o cantitate mică de extract uşor asimilabilă, prezenţa de alcooli, pH-ul acid, anaerobioză, o presiune ridicată dată de dioxidul de carbon, temperaturi reduse la păstrare (4... 15°C). Alterarea microbiologică a berii poate fi dată de drojdii şi bacterii. 84

Dezvoltarea drojdiilor de cultură. Când filtrarea nu a fost eficientă, drojdii din genul Saccharomyces carlsbergensis pot continua fermentaţia în recipient. în acest caz de

tulburare, formează rapid un sediment stabil, iar la deschiderea recipientului spumarea este mai intensă, berea are extractul mai redus şi o cantitate mai mare de alcool; berea poate fi consumată. Dezvoltarea drojdiilor fermentative de contaminare. Unele drojdii atipice, Saccharomyces pasteurianus, Saccharomyces turbidans, pot produce contaminarea drojdiei de cultură şi dau un gust specific; berea este tulbure. Tulburarea este mai stabilă deoarece aceste drojdii au celule mai mici ce rămân mai mult timp în suspensie, iar sedimentul este pulverulent. Alte drojdii de alterare aparţin genurilor: Brettanomyces (produc esteri şi acetat), Candida, Debaryomyces, Filobasidium, Hanseniaspora, Hansenula (produc esteri), Kloeckera (produce tulburare persistentă), Kluyveromyces, Pichia (produce voal), Torulaspora, Zygosa-ccharomyces. Prezenţa lor poate avea efect negativ asupra stabilităţii spumei, deoarece ele pot elibera proteaze prin autoliză. Unele specii pot câştiga în competiţie datorită avantajului de a utiliza dextrine sau de a avea caracter killer. Alterările bacteriene sunt produse de bacterii adaptate la condiţiile existente în bere şi se caracterizează prin opalescenţă (turbiditate) persistentă şi importante modificări ale gustului, iar berea nu este acceptată în consum. Bacteriile de alterare a berii pot prezenta două forme de bază (bastonaşe şi coci) şi proprietăţi tinctoriale distincte. Bacteriile sub formă de bastonaşe pot fi: - Gram-pozitive: lactobacili homofermentativi (Lb. plantarum) şi lactobacili heterofermentativi (Lb. brevis, Lb. pasteurianus, Lb. buchneri, Lb. fermenţi ş.a.), care sunt mai puţin sensibili la acţiunea microbiostatică a răşinilor din hamei, pot produce diacetil, opalescenţă şi creşterea vâscozităţii; - Gram-negative: • aerobe (Acetobacter rancens, Acetobacter viscosis), care sunt active dacă berea este păstrată cu gol de aer; produc acid acetic, peliculă sau zooglee şi opalescenţă; 85

• facultativ anaerobe - Zymomonas, care nu pot folosi maltoza ca sursă de carbon şi energie, produc aldehidă acetică şi hidrogen sulfurat, Enterobacter agglomerans, Achromobacter anaerobica; • anaerobe - genul Pectinatus, care produc în bere H2S, acid acetic, acid propionic şi opalescenţă. Bacteriile sub formă de coci care alterează berea pot fi: Gram-pozitive: genul Micrococcus cuspecia M. kristinae, care este sensibilă la răşini din hamei şi la pH scăzut, genul Pediococcus (P. dextrinicus, P. inopinatus, P. damnosuscerevisiae, P. pentosaceus); se prezintă sub formă de diplococi şi tetrade, produc fermentarea lactozei la acid lactic, pot produce, în condiţii de aerare şi pH acid, cantităţi sesizabile de diacetil ce imprimă berii un gust dezagreabil. Bacteriile aparţinând genului Pediococcus sunt favorizate de prezenţa în bere a amidonului nehidrolizat;

Gram-negative: Megasphera, coci mari rezistenţi la hamei, anaerobe, care produc acid butiric, caproic şi opalescenţă. Bacteriile sporulate nu au fost detectate în bere. Bacteriile patogene şi facultativ patogene nu rezistă în bere. Prin inocularea berii cu Escherichia coli, celulele şi-au pierdut viabilitatea după 48 ore. Microbiologia vinului Diversitatea sortimentelor de vinuri este dependentă de compoziţia şi caracteristica soiurilor de struguri, de calitatea şi cantitatea microorganismelor care acţionează în must şi de factorii tehnologici de dirijare a activităţii microorganismelor de interes. Formarea vinului este condiţionată de activitatea enzimatică a microorganismelor care ajung în mustul de struguri şi care pot fi arbitrar încadrate în următoarele grupe: -microorganisme permanent utile: drojdii de fermentaţie denumite şi drojdii de cultură sau drojdii tipice care aparţin genului Saccharomyces, cu specia Sacch. cerevisiae subsp.ellipsoideus (Sacch. vini), la care se adaugă tulpini cu capacitate fermentativâ variată cu rol în formarea substanţelor de aromă, Sacch. italicus, Sacch. florentinus, Sacch. chevalieh, Sacch. fructum. Drojdia de cultură Saccharomyces bayanus cu var. bayanus şi var. oviformis este folosită la obţinerea şampaniei; -microorganisme condiţionat utile: drojdii cu putere alcooligenă redusă, drojdii anascogene aparţinând genului Kloeckera (K. apiculata, K. magna) şi din genul Torulopsis (T. stelata şi T. bacilaris). Aceste drojdii se înmulţesc în must şi produc fermentaţia alcoolică a glucidelor până când în mustul fermentat se acumulează 6...8° alcool etilic, concentraţie care le inhibă activitatea. Unele drojdii pot folosi ca sursă de carbon acidul malic, în mustul obţinut din struguri necopţi, şi pot fi folosite la reducerea acidităţii vinului: genul Schizosaccharomyces cu speciile Schiz. pombă şi Schiz. bailii. Sunt bacterii sulfitorezistente şi, în anumite condiţii, pot produce defectul de refermentare a vinurilor. Bacteriile malo-lactice pot acţiona la sfârşitul fermentaţiei mustului după separarea vinului de pe drojdie, în scopul reducerii acidităţii. în cazul în care aciditatea este normală, fermentaţia produsă de aceste bacterii nu este dorită; - microorganisme dăunătoare, în care pot fi incluse drojdiile oxidative care dau defectul de floare al vinurilor, bacteriile acetice şi unele specii de bacterii lactice care dau alterări ale vinului la păstrare, unele mucegaiuri care, în mod indirect, influenţează negativ calitatea vinurilor. 86

Microbiota strugurilor şi a mustului. Boabele de struguri la maturitate conţin pe suprafaţa lor o microbiota heterogenă ce provine din surse externe: solul viei, aer, ape meteorice, insecte. Pieliţa bobului prezintă la suprafaţă un strat protector de pruină, încât, dacă

bobul este intact, microorganismele epifite nu pot pătrunde în interior şi bobul este steril. O excepţie o prezintă Botrytis cinerea (Botryotinia fuckeliana) care poate pătrunde prin porii membranei şi se dezvoltă sub pieliţă, dând pătarea în violet a bo&belor. în fazar'de creştere, acest mucegai poate elabora o substanţă cu efect antifungic (botrioticina), cu efect asupra unor drojdii sensibile. Pe boabe de struguri mucegăite, treptat, se reduce numărul de drojdii aparţinând genului Kloeckera, în timp ce drojdiile genului Torulopsis nu sunt inhibate. Cantitatea şi natura microorganismelor pe boabe depinde de gradul de coacere, de vârsta viţei de vie, de condiţiile microclimatului la cultivare şi recoltare etc. Numeroşi fungi fitopatogeni care produc boli ale viţei de vie (mana, făinarea ş.a.) pot afecta atât producţia^ât şi calitatea strugurilor. în toamne ploioase, ca urmare a turgescenţei boabelor, se poate produce crăparea acestora şi, prin eliberarea de suc, are loc mucegăirea vulgară sau mucegăirea cenuşie, prin dezvoltarea miceliului de Botrytis cinerea pe boabe şi ciorchine. Folosirea strugurilor mucegăiţi la fabricarea vinului conduce la apariţia de defecte, deoarece la obţinerea mustului prin presare trec în must enzime fungicejpolifenoloxidaza şi laccaza), enzime ce reduc stabilitatea la oxidare a vinurilor. în zonele viticole în care zile însorite alternează cu zile ploioase, Botrytis cinerea produce aşa-numita „putrezire nobilă" cu o creştere limitată a miceliului vegetativ, stafidirea boabelor şi acumularea în boabe a acidului gluconic, a fructozei, din care se obţin vinuri de calitate superioară. După recoltare se recomandă prelucrarea imediată (în limita a 4 ore) a strugurilor, pentru a preveni pierderile de suc la transport şi deteriorarea boabelor. Pentru obţinerea mustului se face desciorchinarea şi zdrobirea boabelor cu obţinerea mustului răvac şi, ulterior, a mustului de presă. Prin aceste operaţii, cea mai mare parte din microbiota strugurilor alcătuită din drojdii, bacterii, mucegaiuri ajunge în must, dar condiţii favorizante pentru activitate fermentativă le au drojdiile ca urmare a prezenţei următorilor factori: - compoziţia mustului, care asigură drojdiilor cantităţi importante de glucide, în medie 180-250 g • dm3, formate din glucoza şi fructoză în raport de 1:1, cu cantităţi mici de zaharoză (0,5 g) precum şi surse de azot asimilabile sub formă de peptide, aminoacizi; - pH-ul acid de 2,9-3,5 favorabil drojdiilor, un factor important în selectarea microorganismelor active în must. Mustul are caracter reducător, cu un potenţial de oxidoreducere de aproximativ 400 mV, motiv pentru care microorganismele facultativ anaerobe sunt avantajate în competiţie cu cele aerobe. Prin adăugarea de dioxid de sulf în doze de 70-250 mg • dm"3 are loc menţinerea unui rfH scăzut în must, favorizând procese fermentaţi ve anaerobe la care se adaugă efectul său antimicrobian asupra unor bacterii aerobe (acetice) şi asupra drojdiilor oxidative. Rolul drojdiilor în fermentarea mustului. La începutul campaniei de vinificaţie se selectează struguri bine copţi, se obţine mustul şi prin păstrare 24-72 ore, cu aerare ocazională, se asigură înmulţirea drojdiilor. Mustul fermentat, bogat în celule de drojdii, se foloseşte în proporţie de 2/3 în calitate de inocul pentru demararea fermentaţiei alcoolice în mustul de producţie. Pentru a asigura continuitatea procesului, se completează din nou cu must «proaspăt, pentru a favoriza înmulţirea şi activizarea

celulelor de drojdii rămase în cantitatea de 1/3 de must fermentat. Inocularea cu culturi de drojdii indigene, ce provin din zona viticolă din care s-au recoltat strugurii, se mai 87

recomandă când fermentaţia naturală demarează lent, ca urmare a existenţei unui număr mic de celule, sau când are loc oprirea fermentaţiei, deşi există încă zahăr fermentescibil. Utilizarea de culturi pure de drojdii cu proprietăţi biotehnologice cunoscute este practicată pe scară restrânsă. Selecţionarea se face în institute de cercetare, în laboratoare centrale de vinificaţie şi sunt livrate în funcţie de necesităţi. Dintre drojdiile recomandate în vinificaţie fac parte: - drojdiile pentru vinuri albe, în care intră toate culturile pure ce găsesc condiţii favorabile pentru fermentaţia mustului obţinut din struguri copţi, care se înmulţesc rapid, fermentează complet zahărul şi se depun uşor la sfârşitul fermentaţiei; - drojdiile pentru vinuri roşii, care trebuie să aibă aceleaşi calităţi ca şi cele pentru vinuri albe; în plus trebuie să fie rezistente la concentraţii mai ridicate în substanţe tanante şi colorante; - drojdii alcoolorezistente, tulpini ce aparţin speciei Saccharomyces bayanus (oviformis), care se înmulţesc bine în prezenţa de alcool format prin fermentaţie la care se adaugă alte calităţi; - drojdii pentru şampanie, care sunt tulpini alcoolorezistente ce pot produce fermentarea la presiuni ridicate de dioxid de carbon, până la 0,6 MPa, dând vin cu o bună spumare. Drojdiile se depun uşor şi nu rămân lipite de pereţii sticlei, la şampanizarea clasică; - drojdii sulfitorezistente, drojdii care pot produce fermentaţia la concentraţii ridicate în dioxid de sulf (150-200 mg • dm"3), obţinute prin cultivarea lor în medii cu creş- terea concentraţiei de S02 până se produce adaptarea; - drojdii termotolerante şi psihrofile, care produc fermentaţia la 30...35°C şi, respectiv, la4...10°C; - drojdii tip Xeres, tulpini ce aparţin speciei Saccharomyces bayanus-oviformis care, la accesul aerului, formează rapid la suprafaţa vinului o peliculă cu producerea de substanţe de gust şi aromă ce dau caracterul acestor vinuri speciale. Avantajele fermentării mustului cu culturi pure sunt următoarele: mustul fermentează rapid, are loc fermentarea completă a glucidelor; ca rezultat se formează cu 0,5 -1% mai mult alcool decât în fermentaţia naturală, vinul conţine mai puţini acizi şi esteri volatili, are un gust şi un miros ce permit evidenţierea soiului de struguri. Este mai puţin sensibil la alterări microbiene, se limpezeşte uşor. Fermentaţia spontană a mustului de struguri. Datorită condiţiilor din must favorizante pentru drojdii, în prima etapă a fermentaţiei se poate produce o înmulţire a acestora, proces prin care are loc un consum de zahăr, asimilat prin respiraţie:în must sunt prezente în concentraţii ridicate drojdii din genul KIoeckera apiculata şi Torulopsis bacilarls, care

pot să reprezinte până la 90% din microbiota mustului intrat în fermentaţie; după acumularea alcoolului etilic (4-6°) se dezvoltă în continuare drojdiile tipice de fermentaţie alcoolorezistente, denumite şi drojdii fundamentale, ce aparţin genului Saccharomyces cu drojdia de vin Saccharomyces cerevisiae subsp. elipsoideus. Sub acţiunea drojdiilor fundamentale are loc, în anaerobioză, fermentaţia alcoolică propriu-zisă, prin care glucidele fermentescibile ale mustului sunt meta-bolizate pe calea EMP în alcool etilic, C02 şi produse secundare (de fermentaţie sau rezultate din metabolismul azotat al drojdiei) ce dau vinului aroma specifică. Fermentaţia alcoolică a mustului din struguri poate să dureze un timp variabil, între 2 şi 4 săptămâni, determinat de compoziţie, temperatură, natura şi densitatea celulelor de drojdie. După amorsarea fermentaţiei are loc etapa fermentaţiei tumultuoase, caracterizată prin degajarea intensă de C02 şi de spumare. Pe măsură ce se reduce 88

conţinutul în glucide ferementescibile, scade viteza de fermentaţie şi are loc sedimentarea drojdiilor şi limpezirea vinului. Dacă vinul se menţine în continuare în contact cu sedimentul de drojdie, ca urmare a autolizei celulelor de drojdie, se eliberează în vin compuşi asimilabili cu azot. Acest proces se recomandă atunci când vinul este prea acru şi se urmăreşte stimularea creşterii bacteriilor-agenţi ai fermentaţiei malo-lactice. în caz contrar, vinul capătă gust de drojdie, se poate produce hidrogen sulfurat şi se modifică însuşirile senzoriale ale vinului. De aceea, la sfârşitul fermentaţiei se face separarea de drojdie prin operaţia de filtrare, condiţionarea şi îmbutelierea vinului. In funcţie de sortiment, se poate face păstrarea sau învechirea vinului cu îmbunătăţirea calităţii, ca rezultat al unui complex de procese fizico-chimice şi biochimice ce au loc. Fermentaţia malo-lactică. Este o fermentaţie secundară ce poate avea loc în vin după fermentaţia alcoolică şi este produsă de către bacterii. Este recomandată la vinurile roşii seci şi la vinurile albe obţinute din struguri necopţi, recoltaţi, de exemplu, la sfârşitul perioadei de vinificaţie. Pentru demararea naturală a fermentaţiei malo-lactice, vinul se păstrează pe drojdie la temperatura de 20...25°C, pentru a se îmbogăţi în compuşi cu azot necesari dezvoltării bacteriilor. Se poate face inocularea vinului cu culturi pure de bacterii malo-lactice ce pot aparţine speciilor: Leuconostoc oenos, Leuconostoc gratiile, Micrococcus acidovorax sau se introduce.în calitate de inocul, un vin în care se produce activ această fermentaţie. Boli şi defecte microbiene ale vinurilor. Vinul, după condiţionare, poate să fie lipsit de microorganisme vii şi, prin învechire, îşi poate îmbunătăţi caracteristicile senzoriale (armonizarea gustului, formarea buchetului specific vinurilor vechi). în vin există factori restrictivi pentru activitatea unor microorganisme, cum ar fi concentraţia în alcool etilic > de 12-14° alcool, condiţii de anaerobioză, pH acid, prezenţa unor compuşi cu acţiune bacteriostatică: S02, tanin precum şi absenţa unor surse de C şi N uşor asimilabile. Un vin de calitate din punct de vedere microbiologic poate să fie steril atunci

când s-a produs îndepărtarea totală a microorganismelor prin filtrare sau conţine un număr redus, de 800-900 celule de drojdie . Defecte produse de drojdii. în continuare se descriu trei dintre defectele produse de drojdii. Refermentarea poate avea loc în vinurile dulci şi poate fi datorată drojdiilor sulfitorezistente ale genului Schizosaccharomyces, ce produc fermentarea zahărului rezidual cu formarea pe lângă alcool etilic, dioxid de carbon, acid acetic şi a acetatului de etil. Prin refermentare, vinul se tulbură, spumează energic la deschiderea recipientului şi are un gust acru. Dezvoltarea iui Schiz. bailii poate fi asociată cu o scădere a acidului malic folosit de drojdii ca sursă de carbon şi energie. 89

Defectul „de floare" se produce la vinuri cu grad alcoolic redus, la temperaturi mai mari de 12°C, în prezenţă de aer, condiţii care favorizează dezvoltarea la suprafaţa vinului a drojdiilor oxidative aparţinând următoarelor specii: Candida mycoderma (valida), Pichia membranefaciens, Pichia fermentans, specii ale genului Hansenula. La început, la suprafaţă se dezvoltă celule în lanţ cu formarea de pseudohife şi, prin asociere, formează un voal subţire; prin creşterea suprafeţei, voalul se cutează, este fragil şi se" destramă uşor, dând tulburare şi sediment. Drojdiile oxidative asimilează alcoolul etilic cu eliberare de apă şi dioxid de carbon încât, prin acţiunea lor, vinul devine fad, apos, cu deprecierea calităţilor psiho-şenzoriale. Drojdiile de floare pot să producă şi oxidarea acizilor organici la produşi finali. Sunt sensibile la tratare cu S02. în stadii incipiente, ca urmare a localizării defectului sub voal, se pot aplica metode de recuperare a vinului. Defectele de gust şi miros pot fi produse de unele drojdii care pot forma hidrogen sulfurat din sulfiţi şi sulfaţi prin procese de reducere, sau pot să formeze mercaptani (CH3 - CH2 - SH ) prin înlocuirea atomului de oxigen din alcoolul etilic cu atomul de sulf, care dau vinului un gust dezagreabil. Drojdiile din genul Brettanomyces pot degrada glicerolul, în condiţii de anaerobioză, în vinuri păstrate timp îndelungat şi, prin reacţii ce au loc în prezenţa substanţelor azotate eliberate prin autoliza celulelor microbiene, rezultă acetamida care imprimă vinului aşa-numitul „iz de şoarece" şi deprecierea calităţii. Defecte produse de bacterii. Dintre bacteriile care au condiţii să se dezvolte în vin fac parte bacteriile aerobe şi anaerobe. Oţetirea vinurilor este produsă de bacterii aerobe ale genului Acetobacter. Este considerată o boală a vinului care se poate produce când nu se menţine o igienă corespunzătoare şi poate avea loc în vinuri cu grad alcoolic < 10°. Dezvoltarea bacteriilor este optimă la temperaturi de 24...30°C dar, o dată declanşată fermentaţia acetică, aceasta se desfăşoară şi la temperaturi scăzute, temperatura minimă fiind de 0...4°C. Dintre bacteriile acetice izolate din vinuri oţetite fac parte: Acetobacter pasteurianus care

formează un voal fragil, transparent, uşor ascendent pe pereţii sticlei, Acetobacter rancens şi Acetobacter xylinum şi xylinoides producătoare de voal gelatinos. Răspândirea bacteriilor acetice se realizează uşor prin intermediul musculiţei de oţet, Drosophilla cellaris, care preia bacteriile din medii contaminate şi le inoculează în vin. Defectul de oţetire este evident în tot volumul de vin, deoarece acidul acetic format prin oxidarea în zona situată sub voal, având o densitate mai mare decât a alcoolului etilic, se deplasează spre straturile inferioare ale vasului, fiind înlocuit în mod continuu de cantităţi de vin şi alcool etilic, ce reprezintă substratul oxidabil. în 90

stadiile iniţiale este sesizat mirosul de acetat de etil format prin esterificare şi se pot lua măsuri tehnologice de recuperare. Pentru prevenirea oţetirii se poate face sulfitarea vinurilor, pasteurizarea, păstrarea vinurilor fără gol de aer. Bacteriile anaerobe şi facultativ anaerobe care produc defecte sunt predominant bacterii lactice care folosesc ca sursă de carbon acizii din vin (malic, tartric, citric) şi glicerolul. Dintre defectele diferenţiate în funcţie de bacteriile predominante şi de activitatea lor, fac parte cele prezentate în continuare. Manitarea este un defect întâlnit la vinuri roşii, în special, care mai conţin zahăr nefermentat. Bacteriile care provoacă manitarea sunt: Bacterium manitopeum, Bacterium intermedium, Bacterium gayoni, care devin active când temperatura de păstrare a vinurilor este mai ridicată şi, uneori, chiar în timpul fermentaţiei mustului. De exemplu, Bacterium gayoni este activă şi la 38°C. Prin fermentarea glucidelor produc acid lactic, acid acetic, iar prin reducerea fructozei se acumulează manitol în concentraţii ce pot atinge valori de 30 g • dm3. Vinul capătă un gust acru-dulceag şi suferă modificări de culoare (de la roşu la cenuşiu-cărămiziu). Defectul poate fi evidenţiat dacă pe o sticlă de ceas se lasă să se evapore o cantitate mică de vin, când se pot observa cristale specifice de manitol. Borşirea sau înăcrirea este datorată bacteriilor lactice ale genului Lacto-bacillus, cu speciile Lb. brevis, Lb. lindneri, Lb. plantarum care produc prin fermentarea glucidelor acid lactic; în vin creşte cantitatea de azot aminic, ceea ce favorizează creşterea altor bacterii asociate, care produc tulburare. Acest defect poate fi asociat cu băloşirea, ca urmare a formării de către Bacterium viscosis vini, Leuconostoc sp. a unor poliglucide care modifică consistenţa vinului. Boala presiunii axe loc în vase fără acces de aer, în vinuri seci, fiind datorată bacteriilor: Bacterium saprogenes vini, Bacterium tartarophtorum, Leuconostoc gracille care pot produce degradarea acidului tartric cu formarea de acid lactic, acetic, propionic şi dioxid de carbon. Astfel scade aciditatea fixă a vinului, se măreşte presiunea în recipient, au loc modificări de gust şi de culoare, cu deprecierea totală a vinului. Amăreala vinului este un defect datorat activităţii bacteriilor care pot produce degradarea glicerolului cu formarea de acroleină. Aceasta se poate combina la cald cu taninuri, cu

formarea gustului amar, care se intensifică la pasteurizare. Bacteria izolată din vinuri cu gust amar este Bacterium amaracrylis. Defecte produse de mucegaiuri. Mucegaiurile pot avea o influenţă indirectă asupra calităţii vinului la păstrare. Botrytis cinerea prin eliberarea de oxidaze, în cazul vinului obţinut din boabe mucegăite, poate produce la transvazarea vinului, în contact cu oxigenul din aer, cassa oxidazică, cu modificarea culorii, apariţia de precipitat şi gust de oxidat sau de vin fiert. în mustul fermentat au condiţii să se dezvolte, în anaerobioză, sporan-giospori ai genului Mucor, cu formarea de celule similare drojdiilor care pot produce 1% alcool etilic prin fermentaţie. Mucegaiuri din genul Aureobasidium pot produce, în must, poliglucide mucilaginoase. Mucegaiuri din genul Penicillium, în pivniţe cu umezeală relativă a aerului de peste 75%, pot produce mucegâirea dopurilor de plută şi a lemnului. Cladopsporium cellare se dezvoltă preferenţial pe pereţii pivniţelor, pe lemn, pe dopuri. Este adaptat la condiţiile existente, folosind în nutriţie substanţele volatile ce se degajă, azotul din aer sau obţinut prin digerarea insectelor (în prezenţa chitinazei). Formează un fetru măsliniu - negru caracteristic pivniţelor vechi. Merulis lacrimans este un micromicet care poate produce hidroliza enzimatică a celulozei şi ligninei până la produşi finali şi contribuie la putrezirea lemnului. Spherulina intermixta se poate dezvolta pe lemn, formând pete negre mucilaginoase foarte rezistente în timp; se poate dezvolta şi în vin. 91

MICROBIOLOGIA PREVIZIONALĂ Microbiologia previzională este un domeniu al microbiologiei produselor alimentare în care răspunsurile microorganismelor la acţiunea controlată a factorilor de mediu sunt exprimate sub formă de modele matematice, pe baza cărora se pot elabora previziuni cu privire la răspunsul microorganismelor în condiţii ce nu au fost testate practic. Elaborarea previziunilor microbiologice reprezintă o nouă modalitate de stabilire a calităţii şi siguranţei alimentelor, care, spre deosebire de analiza microbiologică clasică, are avantajul rapidităţii de obţinere a unui răspuns cu cheltuieli mai mici. Deşi microbiologia previzională este considerată un domeniu nou, microbiologia produselor alimentare a constituit din totdeauna o disciplină în care modelarea matematică şi-a găsit numeroase aplicaţii (calculul rezistenţei termice a microorganismelor, determinarea duratei tratamentelor termice ş.a.). în ultimii ani, creşterea interesului pentru microbiologia previzională se datorează: a) preferinţei consumatorilor pentru produse alimentare proaspete sau minim prelucrate, ceea ce a condus la crearea unei noi tehnologii de conservare a produselor alimentare, tehnologia obstacolelor, pentru aplicarea căreia este nevoie să se creeze modele matematice capabile să simuleze numeroasele interacţiuni ce se pot stabili între diverşii factori care asigură integritatea microbiologică a produselor; - necesităţii de a stabili limitele critice în punctele cheie ale prelucrării sau manipulării alimentelor, ceea ce constituie una din etapele analizei hazard (HACCP);

- anvergurii procesului de creare de produse noi şi dorinţei de a beneficia de informaţii cu privire la încărcarea microbiană dintr-un cât mai mare număr de alimente sau ingrediente alimentare prezente în comerţul internaţional, ceea ce ar uşura luarea de decizii la stabilirea gradului de securitate a alimentelor; - dezvoltării tehnicii de calcul, care a permis prezenţa calculatoarelor personale pe masa de lucru a numeroşi oameni de ştiinţă şi utilizarea de programe care au stimulat dezvoltarea aplicaţiilor matematice în microbiologie. Etapele modelării creşterii microbiene Identificarea parametrilor care limitează conservarea produsului. Deoarece modelele microbiologice sunt utilizate pentru a determina data limită până la care produsul îşi va păstra caracteristicile senzoriale şi va fi sigur pentru consum, trebuie să se stabilească ce microorganisme limitează durata de păstrare a produsului şi care sunt limitele pe care acestea nu trebuie să le depăşească. Parametrii limitanti vor fi identificaţi pe baza normativelor microbiologice ale produselor alimentare şi pe baza informaţiilor furnizate de întreprinderi cu privire la cauzele retururilor. Delimitarea câmpului experimental. Această etapă cuprinde următoarele acţiuni: - selectarea factorilor ce vor fi luaţi în considerare (temperatură, aw, pH, inhibitori, atmosferă); - determinarea pentru fiecare factor a intervalului de valori ce permite multiplicarea microorganismelor; - delimitarea limitelor de variaţie a factorilor în produsul alimentar luat în considerare. Planificarea experimentelor. în această etapă se va stabili, pentru fiecare factor, atât numărul de niveluri ce urmează a fi testate cât şi distribuţia acestor niveluri 92

(progresie aritmetică sau geometrică) şi se vor alege combinaţiile de factori (planuri experimentale) adecvate fiecărui produs. Culegerea de date. După stabilirea mediului de cultură pe care vor fi variaţi factorii luaţi în considerare, a tipului de inocul folosit şi a concentraţiei acestuia şi după alegerea metodei de numărare a microorganismelor, se realizează experimentele ce vor furniza datele necesare creării modelelor. Datele obţinute vor fi introduse într-o bază de date. în baza de date mai pot fi incluse date provenind din experimentele realizate în laboratoarele universităţilor, a diferitelor asociaţii de cercetare a produselor alimentare sau din laboratoarele fabricanţilor de produse alimentare. Modelarea propriu-zisă. Aceasta presupune construirea unui model care să stabilească o legătură între condiţiile experimentale şi creşterea microbiană, pornind de la rezultatele obţinute experimental, astfel încât pe baza lui să se poată realiza previziunile microbiologice. Modelul trebuie definit de un număr limitat de parametri,

X (perioada de latenţă), u. (viteza de creştere) şi A (numărul maxim de indivizi dintr-o populaţie microbiană) fiind cei preferaţi. Validarea modelului Se realizează în două etape: - validarea matematică, în care se verifică dacă diferenţele dintre valorile teoretice prevăzute de model şi cele obţinute în condiţiile ce au servit la realizarea modelului nu sunt exagerate; - validarea în produse, în care se verifică dacă diferenţele dintre valorile teoretice prevăzute de model şi cele reale, obţinute pe produsul fabricat industrial şi contaminat natural, nu sunt prea mari, Previziunea. Modelele validate sunt introduse într-o bază de date, prin intermediul căreia modelele sunt puse la dispoziţia diferitelor categorii de utilizatori. Acestea pot fi utilizate pentru elaborarea previziunilor microbiologice, cu condiţia ca variaţia factorilor să se situeze în limitele pentru care s-a făcut validarea. Un model creat pentru un anumit tip de produs va putea servi la elaborarea de previziuni microbiologice numai pentru produse de acelaşi tip. Clasificarea modelelor Modelele matematice folosite de microbiologia previzională se pot clasifica în funcţie de evenimentul microbiologic studiat, de ipoteza folosită în conceperea modelului şi de numărul sau de tipul variabilelor conţinute. Dacă se ia în considerare tipul evenimentului microbiologic pe care modelele îl descriu, acestea pot fi modele de creştere microbiană şi modele de inactivare microbiană. Din punct de vedere al conceptului folosit la crearea modelelor, acestea pot fi modele probabilistice şi modele cinetice. Modelele probabilistice se bazează pe ipoteza că probabilitatea multiplicării unei celule microbiene într-un anumit mediu este dependentă de proprietăţile fizico-chimice ale mediului. Aceste modele caută să identifice combinaţii de „obstacole" capabile să reducă la un nivel acceptabil şansa ca un microorganism de interes să se dezvolte într-un anumit aliment. Modelele de acest tip sunt utilizate pentru a estima probabilitatea ca patogenii să germineze, să crească, să se multiplice sau să producă toxine într-un anumit produs. Modelele cinetice se sprijină pe ipoteza că multe din alimentele perisabile reprezintă un mediu propice dezvoltării microorganismelor şi că multiplicarea bacteriilor într-un astfel de mediu seamănă cu o cultivare statică. în această ipoteză, 93

nutrienţii nu vor limita creşterea până la producerea alterării sau până când limita de contaminare admisă nu va fi depăşită, iar factori ca temperatura, pH-ul, aw, compoziţia atmosferei, conservanţii vor dicta viteza şi gradul de proliferare al microorganismelor. Astfel, cunoaşterea în detaliu a modului în care creşterea microbiană este influenţată de factorii de mediu stă la baza previziunilor de proliferare a microorganismelor în alimente

în timpul prelucrării, transportului şi depozitării, în cazul monitorizării condiţiilor de rriediu în care sunt plasate alimentele în timpul acestor operaţii. Modelele sunt realizate pe baza creşterii numărului de indivizi ai unei populaţii microbiene sau pe baza creşterii cantităţii de biomasă formate de aceasta, pentru o combinaţie de factori de interes, pentru a elabora previziuni cu privire la durata fazei de lag, viteza de creştere a microorganismelor şi densitatea maximă a populaţiei formate. Recent, a fost propusă o clasificare suplimentară a modelelor în: primare, secundare şi terţiare. Modelele primare sunt expresii matematice ale curbelor de creştere sau de supravieţuire a microorganismelor, acestea descriind răspunsul în timp al unui microorganism la un set specific de condiţii. Modelele secundare descriu impactul variabilelor culturii şi ale mediului asupra creşterii microrganismelor sau asupra caracteristicilor de supravieţuire a acestora. Modelele terţiare sunt utilizate pentru incorporarea modelelor primare, secundare sau a unei combinaţii a acestora, în programe de aplicaţii şi sisteme-expert. Aplicaţiile microbiologiei previzionale Formularea produselor alimentare. Modelarea permite să se determine dacă o anumită reţetă conferă unui produs alimentar o rezistenţă intrinsecă la acţiunea microorganismelor sau dacă este necesară modificarea ei; dacă este necesară o reformulare a unui produs, mai multe variante pot fi evaluate comparativ cu reţeta iniţială, cu mai puţine cheltuieli. Utilizarea previziunilor microbiologice în acest caz permite eliminarea problemelor potenţiale încă înainte de începerea fabricării unui produs. Proiectarea de lanţuri de fabricare, conservare şi distribuţie. Proiectele pot fi supuse evaluării modelistice înainte de a fi realizate practic. Conceperea de tehnologii noi. Aceste tehnologii minimalizează riscurile microbiologice pe căi mai rafinate decât un tratament termic brutal sau adăugarea unui conservant într-o doză masivă. în această situaţie, previziunea microbiologică constituie o unealtă preţioasă, care permite apropierea de idealul creării de produse, unde calitatea şi securitatea produsului este garantată de modul în care este conceput. Determinarea duratei limită de consum (DLC). Modelarea permite determinarea unei DLC rezonabile sau obţinerea unei anumite DLC prin modificarea reţetei sau procesului tehnologic. De asemenea, previziunea microbiologică poate ajuta la stabilirea modului de utilizare a produsului de către consumatori. Punerea în aplicare a metodei HACCP. Previziunea microbiologică intervine în trei din etapele analizei hazard. în etapa de de analiză a fazelor procesului de fabricaţie şi localizarea punctelor critice, care necesită colectarea de date tehnice privind comportamentul microorganismelor într-o mare varietate de condiţii, previziunea microbiologică evaluează posibilitatea supravieţuirii microorganismelor patogene, a ieşirii acestora din starea de latenţă şi a multiplicării lor în anumite condiţii sau într-un anumit punct al procesului. 94

La alegerea criteriilor ce trebuie aplicate în punctele critice şi stabilirea limitelor de toleranţă ce li se atribuie, previziunea microbiologică permite înlocuirea criteriilor microbiologice, care necesită o durată mare de răspuns, cu criterii fizico-chimice măsurabile pe flux, datorită relaţiei pe care modelele o stabilesc între aceste două tipuri de criterii. Această substituire permite determinarea în avans a acţiunilor corective ce trebuie aplicate în cazul unui accident tehnologic. în etapa de verificare şi documentare, modelarea dă posibilitatea să se dovedească unui inspector că un anumit tratament aplicat la fabricarea unui produs este suficient pentru a garanta securitatea produsului. Formarea cadrelor de specialişti. Utilizarea modelelor microbiologice în procesul de instruire a tehnologilor le dezvoltă acestora capacitatea de înţelegere a efectelor caracteristicilor produselor şi a procedeelor de fabricaţie asupra microorganismelor, ceea ce facilitează luarea de decizii. Realizarea reglementărilor de către organismele abilitate. Previziunile microbiologice oferă un fundament ştiinţific reglementărilor ce vizează siguranţa produselor alimentare. Baze de modele în prezent sunt accesibile două baze de date: Pathogen Modeling Program şi Food Mi crom odei. Baza Pathogen Modeling Program a fost realizată de Grupul pentru Securitate Alimentară al Departamentului pentru Agricultură al Statelor Unite (USDA), de la Eastern Regional Research Centre din Philadelphia. Ea include modele privind efectul temperaturii, pH-ului, acului, concentraţiei de nitriţi şi compoziţiei atmosferei asupra creşterii următoarelor microorganisme: Listeria mono-cytogenes, Salmonella, Clostridium botulinum, Aeromonas hydrophila, Shigella flexneri, Escherichia coli 0157 şi Yersinia enterocolitica. Cu acest sistem se pot genera curbe care estimează creşterea microorganismelor selectate în condiţii determinate de: temperatură, pH, concentraţie de NaCI, concentraţie de nitriţi, atât în aerobioză, cât şi în anaerobioză. Sistemul poate estima durata perioadei de latenţă, timpul de generaţie şi timpul necesar pentru ca o populaţie microbiană să atingă o anumită densitate. Programul este distribuit gratuit pe dischete. Baza Food Micromodel este rezultatul programului coordonat de Ministerul Agriculturii, Pescuitului şi Alimentaţiei (MAFF) din Marea Britanie. Acest sistem, la care se poate accede prin intermediul dischetelor, dar pentru care se plăteşte o taxă anuală, a beneficiat deja de o validare largă. Microorganismele de interes pentru care au fost create modelele din această bază de date şi domeniile în care variază factorii luaţi în considerare sunt prezentate în tabelul următor. La Wageningen, în Olanda, este în curs de elaborare o bază de modele, iar alte baze de date existente, ca cea a societăţii UNILEVER, sunt private. în ce priveşte utilizarea bazelor de modele, specialiştii sunt unanim de acord că

ele trebuie utilizate ca sisteme de ajutor în luarea deciziilor, şi nu ca oracole. Se speră ca previziunile elaborate pe baza modelelor, cu privire la determinarea duratei de conservare a produselor alimentare, a securităţii şi calităţii acestora, să se dezvolte pe măsură ce bazele de modele vor deveni mai accesibile şi validarea modelelor se va face pentru un număr mai mare de alimente, în cadrul colaborărilor internaţionale. 95

IGIENIZAREA ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ

Probleme generale ale igienizării în industria alimentară Igiena în industria alimentară trebuie să asigure: - securitatea produselor alimentare din punct de vedere microbiologic ; - ameliorarea proprietăţilor senzoriale şi nutritive ale produselor; - prelungirea duratei limită de vânzare (DLV), de consumare (DLC) şi de utilizare optimă (DLUC). In cazul produselor alimentare ca atare, strategia aplicării igienei implică: - evitarea aportului exterior de microorganisme dăunătoare la materia primă (grad de infectare redus al materiei prime); - distrugerea microorganismelor pe diferite căi, distrugere care este cu atât mai eficace cu cât numărul iniţial de microorganisme este mai redus; - inhibarea dezvoltării microorganismelor care nu au putut fi distruse., Având în vedere că producţia se realizează de operatori care lucrează într-o incintă unde se găsesc utilaje, instalaţii, recipiente etc. şi unde pot avea acces şi insectele şi chiar rozătoarele, se pot face următoarele precizări: - zidurile exterioare reprezintă un obstacol în calea penetrării microorganismelor din mediul exterior, respectiv în calea particulelor de praf pe care sunt fixate, dar, în acelaşi timp, se constituie şi ca o barieră pentru protecţia mediului exterior de eventualii contaminanţi rezultaţi din producţie (deşeuri, subproduse etc); - incinta (pereţii, plafonul, pardoseala), utilajele şi instalaţiile, recipiente, operatorii, rozătoarele şi insectele (dacă au pătruns în incintă) se constituie atât ca „depozite" de microorganisme cât şi ca surse de contaminare, respectiv de diseminare a microorganismelor; - microorganismele pot adera la diferite suprafeţe în funcţie de interacţiunile fizicochimice dintre suprafeţele respective şi constituenţii pereţilor celulari ai microorganismelor. După aderare, microorganismele se pot multiplica cu formarea unui

biofilm care permite o aderenţă şi mai mare a microorganismelor la suprafeţele respective; - fenomenul de diseminare corespunde unei emisii-dispersări de microorganisme de pe o suprafaţă în aerul încăperii, fenomen ce este provocat de un curent de aer sau de un jet de apă. în funcţie de gradul de contaminare iniţială a materiilor prime X0 şi de igiena spaţiilor de producţie, de igiena procesului de'producţie, a operatorilor şi, respectiv, în funcţie de existenţa sau nonexistenta rozătoarelor şi insectelor, produsele finite pot ieşi din fabrică cu o anumită calitate microbiologică, care să asigure anumite valori pentru DLV, DLC şi DLUC. Pentru a avea o contaminare cât mai redusă a încăperilor de fabricaţie, aerul din încăpere trebuie în permanenţă filtrat şi condiţionat la parametrii de temperatură şi umezeală relativă optimi pentru desfăşurarea procesului tehnologic, dar care să asigure şi un anumit confort tehnologic pentru operatori. Raportul dintre volumul aerului ce trebuie filtrat Q şi volumul încăperii se va alege în funcţie de gradul de igienă cerut, iar încărcătura microbiană a aerului Q, care intră în încăpere după filtrarea finală, va depinde de eficienţa filtrului final care trebuie să fie de 99,99% şi chiar 99,999% pentru un nivel ele igienă foarte ridicat, precum şi de raportul QA/, care trebuie să fie cât mai mare. 96 La igienizarea întreprinderilor de industrie alimentară, este necesar să se cunoască: substanţele chimice utilizate şi proprietăţile acestora; felul (natura) impurităţilor (murdăriei) ce trebuie eliminate de pe o anumită suprafaţă; natura suportului murdăriei, respectiv materialul din care este confecţionat ambalajul, utilajul, instalaţia, recipientele, respectiv suprafaţa care trebuie spălată şi dezinfectată; apa utilizată la prepararea soluţiilor de spălare şi pentru clătire; procedeul de spălare adoptat: manual sau mecanizat. La utilizarea substanţelor chimice pentru spălare, în industria alimentară, trebuie avută în vedere comportarea lor în soluţie cu referire la: capacitatea de udare şi pătrundere (trebuie să fie mare); capacitatea de emulsionare şi solubilizare; capacitatea de şaponificare a grăsimilor; capacitatea de defloculare a proteinelor; capacitatea de dedurizare; capacitatea de scădere a tensiunii superficiale. în ceea ce priveşte murdăria, trebuie să se aibă în vedere compoziţia acesteia (proteine, grăsime, glucide, substanţe minerale), compoziţie care se poate schimba în pazul tratamentelor termice. în această direcţie, caracteristicile de îndepărtare a componentelor care constituie murdăria înainte şi după aplicarea tratamentului termic (pşşteurizare, sterilizare) sunt diferite substanţial .

Suportul murdăriei, respectiv materialul din care este confecţionat ambalajul, utilajul, instalaţia, recipientele etc. poate fi: - suprafaţă metalică din inox (tancuri, utilaje, tăvi, conducte etc); - suprafaţă metalică din aluminiu (bidoane, ambalaje, recipiente etc); - suprafaţă din sticlă (ambalaje din sticlă); - suprafaţă din material plastic Suprafeţele sunt caracterizate prin gradul de finisare (lustruire). în ceea ce priveşte suprafeţele construite, acestea pot fi: gresia antiacidă pentru pardoseli, respectiv mozaicul şi faianţa pentru placare pereţi până la o anumită înălţime, aceste materiale fiind uşor de igienizat. Procedeul de spălare adoptat este în funcţie de dotarea tehnică a întreprinderii şi poate fi manual sau mecanizat, ultimul putând să funcţioneze în sistem automatizat, în cazul în care fabrica dispune de o unitate CIP (NEP). La igienizarea unor utilaje din industria laptelui, care funcţionează în regim termic (pasteurizatoare, concentratoare, sterilizatoare, conducte de legătură), trebuie să se aibă în vedere că se formează şi aşa-numita „piatră de lapte", care conţine fosfaţi de calciu şi carbonat de calciu. Pentru a îndepărta această depunere (murdară), este necesar să se folosească doi detergenţi, dintre care unul alcalin şi altul acid. Se foloseşte mai întâi detergentul alcalin, dacă murdăria este predominant de natură organică (proteine, grăsimi) şi invers, se va folosi mai întâi detergent acid, dacă „piatra" de lapte este predominantă în murdărie. Această „piatră" de lapte poate să fie sub diferite forme şi anume: - un strat fin şi uniform, care capătă aspect vitros la temperaturi ridicate, strat care poate avea şi unele asperităţi; - un depozit voluminos de filamente paralele sau flocoane alungite ; - un depozit voluminos şi foarte spongios. Factorii care influenţează formarea „pietrei" de lapte sunt principali şi secundari. Factorii principali sunt: - viteza de curgere: dacă viteza de curgere a laptelui este > 1,5 m/s, depozitul se află sub forma a; dacă 0,4 < v < 1,5 m/s, depozitul se află sub forma b; dacă v < 0,4 m/s, depozitul se află sub forma c; 97

- temperatura laptelui; - diferenţa (At) dintre temperatura mediului de încălzire şi temperatura laptelui. Factori secundari sunt: - compoziţia laptelui; - wteza de încălzire a laptelui; - acidita tea laptelui; - conţinutul în 02 al laptelui; - rugozitatea şi compoziţia materialului în contact cu laptele; - durata de păstrare a laptelui înainte de încălzire.

Etapele igienizării Etapele igienizării sunt: curăţirea şi dezinfecţia, fiecare din ele având scopuri şi necesităţi de realizare diferite. Pregătirea zonei pentru curăţire. Se dezasamblează părţile lucrative ale echipamentului tehnologic şi se plasează piesele componente pe o masă sau pe un rastel. Se acoperă instalaţia electrică cu o folie de material plastic. Curăţirea fizică. Se colectează resturile solide de pe echipamente şi pardoseli şi se depozitează într-un recipient. Prespălarea. Se spală suprafeţele murdare ale utilajelor, pereţilor şi în final pardoseala, cu apă la 50...55°C. Prespălarea se începe de la partea superioară a echipamentelor de procesare sau a pereţilor, cu evacuarea reziduurilor în jos, spre pardoseală. în timpul prespălării se va evita umectarea motoarelor electrice, a contactelor şi cablurilor electrice. Prespălarea nu trebuie realizată cu apă fierbinte, deoarece aceasta ar coagula proteinele pe echipamentele de procesare şi nici cu apă rece, deoarece în acest caz nu se vor îndepărta grăsimile. Curăţirea chimică (spălarea chimică). Curăţirea chimică (spălarea chimică) este operaţia de îndepărtare a murdăriei cu ajutorul unor substanţe chimice aflate în soluţie, operaţia fiind favorizată de executarea concomitentă a unor operaţii fizice (frecare cu perii, tratarea cu ultrasunete, tratarea cu abur prin intermediul dispozitivelor de pulverizare). Soluţia de curăţire trebuie să aibă temperatura de 50...55°C şi poate fi aplicată la suprafaţa de curăţire prin intermediul măturilor şi teului, în cazul pardoselilor, sau cu ajutorul aparatelor de stropire sub presiune, care lucrează în sistem individual sau centralizat. Substanţa de curăţire se poate aplica şi sub formă de spumă sau gel. Durata de acţiune a substanţei de curăţire cu suprafaţa respectivă trebuie să fie de ~ 5-20 min. Clătirea. Clătirea se face cu apă la 50...55°C prin stropirea suprafeţei curăţite în prealabil chimic, clătirea trebuind să fie executată până la îndepărtarea totală a substanţei de curăţire, componentă a soluţiei chimice (de spălare) folosite, respectiv 20-25 min. Controlul curăţirii. Acest control se face prin inspecţia vizuală a tuturor suprafeţelor şi retuşarea manuală acolo unde este necesar. Curăţirea „bacteriologică" sau dezinfecţia se realizează prin aplicarea unui dezinfectant pe toate suprafeţele, în prealabil curăţite chimic şi clătite, în vederea distrugerii bacteriilor. înainte de începerea lucrului, a doua zi, se face o spălare intensă cu apă caldă (50...55°C) şi cu apă rece pentru îndepărtarea dezinfectantului. 98

Agenţi de curăţire

La curăţirea chimică a murdăriei trebuie să se aibă în vedere ca soluţia de curăţire să realizeze: - umectarea depozitului de murdărie în vederea reducerii forţelor de atracţie dintre depozit şi suprafaţa de curăţit; - dispersia depozitului de murdărie în soluţia de curăţire; - peptizarea substanţelor proteice şi trecerea lor sub formă coloidală; - dizolvarea substanţelor solubile; - menţinerea în suspensie a particulelor nesolubilizate; - saponificarea grăsimii. Depozitele de murdărie, de pe echipamente, pereţi, pardoseli din industria laptelui sunt formate din proteine, glucide (lactoză) şi grăsimi în care se pot găsi microorganisme, iar factorii care influenţează curăţirea (spălarea) chimică se referă la: -factori care determină gradul de acţiune al soluţiei de spălare aleasă; - factori dependenţi de natura impurităţilor (depozitelor de murdărie); -factori care caracterizează suprafaţa supusă curăţirii (spălării chimice). în prima categorie de factori se au în vedere: concentraţia substanţei de curăţire în soluţie, temperatura soluţiei, duritatea apei în care s-a solubilizat substanţa de curăţire, intensitatea acţiunii mecanice în timpul aplicării soluţiei de curăţire, gradul de impurificare al soluţiei de curăţire în timpul folosirii ei. în cea de a doua categorie de factori se au în vedere: natura depozitului de murdărie, starea depozitului de murdărie, mărimea depozitului de murdărie. în cea de a treia categorie de factori se au în vedere: felul suprafeţei (de sticlă, oţel inox, plastic, aluminiu), starea suprafeţei (suprafaţă netedă sau rugoasă). Agenţii de curăţire, în mod ideal, trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: - să aibă o capacitate de umectare mare; - să fie solubili în apă, iar după clătirea suprafeţelor curăţite, să nu rămână urme de substanţă de curăţire; - să fie capabile să emulsioneze şi să degreseze impurităţile în particule din ce în ce mai fine, să menţină particulele în suspensie (cele nesolubilizate) şi să nu permită depunerea lor; - să aibă toxicitate cât mai redusă şi să fie aprobate de organele sanitare; - să aibă efecte reduse (sau să fie fără efect) asupra instalaţiei, utilajului supuse operaţiei de curăţire chimică; - să fie cât mai inodor; - să fie ieftin; - să fie manipulat uşor; - să poată fi regenerat; - să prezinte capacitate de solubilizare şi de complexare a sărurilor de Ca2+ şi Mg2+ din apa folosită şi din impurităţi; - să nu fie sensibilă la variaţiile de duritate ale apei folosite; - să aibă capacitate de dizolvare a sărurilor organice şi să le mărească solubilitatea în apă; - să nu formeze depuneri pe suprafeţele care au fo.st tratate cu soluţia chimică de curăţire; - să nu aibă capacitate de spumare prea mare;

- să aibă şi capacitate antiseptică; - să poată fi degradat pe cale biologică. 99

Agenţii de curăţire pot fi bazici şi acizi. Aceşti agenţi intră în constituţia reţetelor care mai pot conţine şi substanţe neutre (sechestrante şi emulgatori sau surfactanţi). Substanţele bazice de curăţire. Sunt cele mai utilizate şi au proprietatea de a peptoniza substanţele proteice şi de a saponifica grăsimile şi uleiurile. Cele mai importante substanţe bazice folosite la curăţire sunt prezentate în cele ce urmează. Soda caustică (NaOH) are capacitatea de a îndepărta crustele, de a dizolva depozitele proteice şi de a saponifica grăsimile şi uleiurile. NaOH are şi un efect germicid care se amplifică o dată cu creşterea temperaturii soluţiei. NaOH acţionează, în principal, prin ionii OH. Are acţiune corosivă asupra suprafeţelor metalice (excepţie oţelul inox), unde rămâne sub forma unei pelicule care se îndepărtează numai la o clătire foarte intensă şi de durată. Are acţiune corosivă şi asupra betoanelor. Se utilizează soluţii de concentraţie 1%. La dizolvarea NaOH trebuie să se folosească o apă cu duritate mică, deoarece în caz contrar în soluţie se depune un sediment de culoare cenuşie, rezistent. Carbonatai de sodiu (soda calcinată) este ieftin, dar acţiunea sa detergentă este mai redusă decât a NaOH. Soluţia de carbonat de sodiu are capacitate de saponificare şi peptizare, dar capacitatea de „umectare" şi de dispersare a murdăriei este mai redusă. Soluţia de carbonat de sodiu este mai puţin corosivă în comparaţie cu cea de NaOH şi exercită şi un efect antimicrobian. Se utilizează soluţii cu concentraţii de 5-6%. Fosfaţii (fosfatul trisodic şi polifosfaţii) acţionează atât ca substanţe puternic alcaline cât şi ca sechestranţi. Au capacitate de umectare şi de suspendare a murdăriei în soluţie. Sunt puternic peptonizante, saponificante şi emulsionante. Pot acţiona sinergetic cu substanţele tensioactive anionice. Sunt compatibile şi cu carbonatii, silicatii. Se utilizează în soluţie 0,5% la temperatura de 50°C. Silicatii alcalini sunt caracterizaţi prjntr-o putere de penetrare mare a murdăriei (capacitate mare de umectare) şi de menţinere a murdăriei în suspensie. Deşi sunt substanţe alcaline, silicatii nu sunt corosivi, din contră, ei inhibă acţiunea alcaliilor faţă de anumite metale, în special aluminiu, fiind adesea incluşi în reţetele de detergenţi alcalini. Cel mai adesea utilizat este silicatul de sodiu (Na2Si03). în reţetele de detergenţi cu pH acid, silicatul poate deveni insolubil şi, deci, precipită. Se utilizează în soluţie 0,1%. Substanţele acide de curăţire. Sunt mai puţin utilizate decât cele bazice. Substanţele acide de curăţire sunt foarte eficiente în îndepărtarea depozitelor minerale şi proteice de pe echipamente. Temperatura şi duritatea apei folosite influenţează acţiunea acestor substanţe. Principalele substanţe acide de curăţire sunt prezentate în continuare. Acid azotic (HN03) se utilizează în soluţie 0,5% pentru spălarea conductelor de inox în circuit închis, la temperatura de 60...70°C. HN03 este foarte eficace în

îndepărtarea depozitelor minerale şi proteice. Are acţiune corosivă asupra multor metale. Cu aluminiul şi metalele feroase formează o peliculă protectoare de oxizi. în prezenţă de hipocloriţi, acidul azotic reacţionează violent cu eliberare de clor gazos din hipoclorit. Acidul fosforic (H3P04) are o bună capacitate de îndepărtare a depozitelor minerale şi proteice, nefiind corosiv pentru oţel inox, cauciuc. Poate fi utilizat şi în amestec cu o substanţă tensioactivă sau cu acidul azotic, în care caz amestecul are şi acţiune bacteriostatică. Se mai pot folosi ca substanţe acide de curăţire acidul sulfuric şi hipocloritul de sodiu, acesta din urmă fiind şi un bun dezinfectant. în condiţii alcaline, capacitatea de 100

oxidare a hipocloritului este utilă pentru solubilizarea filmelor proteice. Poate, însă, provoca coroziunea suprafeţelor metalice. Substanţe de curăţire complexe (substanţe detergente). Aceste substanţe aparţin următoarelor categorii: agenţi anionici, agenţi cationici, agenţi neionici şi agenţi amfolitici. Substanţele de curăţire complexe sunt, în general, necorosive, având (unele din ele) şi acţiune dezinfectantă (agenţii cationici de tipul sărurilor cuaternare de amoniu). Au o capacitate de „umectare" foarte bună şi se pot folosi în amestec cu substanţe alcaline. - bunătăţirea acţiunii de curăţire a diferitelor substanţe se realizează prin introducerea în reţetă a următoarelor substanţe: - umectanţi (se folosesc substanţe cationic active); - emulgatori (se folosesc substanţele amfolitice); - antispumanţi (se utilizează hidrocarburi cu lanţ lung); - dispersanţi (se utilizează carboximetilceluloza). Substanţe pentru dezinfecţie După ce a fost îndepărtată murdăria, pe suprafeţele curăţate va fi aplicat un dezinfectant pentru distrugerea microorganismelor. Substanţele dezinfectante trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: - să nu fie toxice pentru om la dozele care se utilizează; - să nu imprime miros şi gust produselor alimentare; - să nu fie periculoase la manipulat; - să nu aibă acţiune corosivă; - să fie solubile în apă; - să aibă efect antimicrobian, indiferent de duritatea apei în care se solubilizează; - să aibă efect bactericid cât mai mare; - să aibă o bună capacitate de pătrundere; - să fie cât mai ieftine.

Principalele substanţe dezinfectante sunt prezentate în continuare: Compuşii clorului. Sunt cel mai des utilizaţi şi cei mai ieftini dintre dezinfectanţi. Acţionează rapid şi nu lasă reziduuri. Sunt mai puţin eficienţi în mediu bazic (pH > 8,3) şi sunt rapid inactivaţi în prezenţa materiilor organice (în caz de curăţire chimică necorespun-zătoare). Aceşti compuşi sunt corosivi pentru metale şi pot irita pielea. «Compuşii cu clor mai importanţi sunt: - clorul lichid, care se prezintă ca un lichid limpede de culoare galben -verzuie, ce conţine 99,5% clor activ şi se livrează în butelii de oţel sub presiune. Se recomandă la clorinarea apei cu folosirea aparaturii de clorinare. - hipocloritul de sodiu (NaOCI) sub formă lichidă, având 12% clor activ. Hipocloritul de sodiu este stabil în soluţii slab alcaline (pH = 7-9) şi acţiunea lui dezinfectantă nu este influenţată de duritatea apei. Nu lasă reziduu activ, este antimicrobian cu spectru larg de acţiune, inclusiv faţă de spori şi virusuri. Este corosiv, cu acţiune iritantă pentru piele şi ochi. Este inactivat de substanţele organice. Poate decolora suprafeţele din material plastic; - fosfatul de sodiu clorinat [(Na3P04.11 H20)4.NaOCI, NaCI] sub formă de pulbere, este, de asemenea, o sursă de clor activ; 101

Produsul este netoxic, necorosiv şi nu produce decolorări; - clorura de var, care este un amestec de hipoclorit de calciu, clorură de calciu şi hidroxid de calciu. Acest amestec trebuie să conţină 20% clor activ. Se prezintă ca o pulbere amorfă, puţin solubilă în apă. Are o stabilitate redusă, dacă nu se păstrează în ambalaj de plastic, la întuneric şi în loc uscat. Clorura de var este dezinfectant bun, eliminând cu uşurinţă clor cu efect bactericid, atunci când este pusă în mediu de aer umed. Dezavantajul clorurii de var este că are acţiune corosivă, decolorantă, irită mucoasele şi imprimă miros străin produselor alimentare. Soluţia de clorură de var conţinând 5% clor activ se prepară cu 24 de ore înainte de folosire pentru sedimentarea varului, iar după filtrare, soluţia se foloseşte prin pulverizare; - cloraminele, care sunt produşi organici ai clorului. De regulă, se utilizează mono- şi diclorsulfamidele aromatice (cloramina T şi dicloramina T). Cloraminele au o activitate bactericidă mai lentă, deoarece clorul este eliberat mai lent din cloramine, ceea ce înseamnă o durată de contact mult mai mare cu suprafaţa ce urmează a fi dezinfectată. Cloraminele sunt mai stabile decât hipocloriţii. Pentru creşterea eficacităţii lor bactericide, cloraminele se utilizează în amestec cu clorura de amoniu (raport 1:1). Compuşi care eliberează oxigenul. Din această categorie fac parte: - acidul peracetic, care este insolubil în apă şi complet biodegradabil. Este corosiv, cu miros iritant, nu formează spumă. în soluţie nu este foarte stabil, reacţionând cu materiile organice. Atacă materialele de cauciuc. Are efect antibacterian (inclusiv sporii) şi antiviral; - peroxidul de hidrogen, care are acţiune bactericidă şi fungicidă. Acţionează lent, fiind deci necesară o durată de contact mare cu suprafaţa ce se dezinfectează. Substanţe dezinfectante neoxidante. în această categorie sunt clasificaţi:

- compuşii cuaternari de amoniu, care, pe lângă acţiunea de curăţire, au şi acţiune antimicrobiană, însă mult mai redusă în comparaţie cu dezinfectanţii oxidanţi. Nu sunt prea activi faţă de spori şi sunt foarte puţin activi faţă de virusuri. La concentraţii mai mari sunt activi faţă de drojdii şi mucegaiuri. Nu sunt corosivi, dar pun probleme de decolorare; - biguanidinele (derivaţi ai guanidinei), care sunt atât agenţi de curăţire cât şi dezinfectanti. Nu sunt corosive, dar pun probleme de decolorare. în soluţie sunt afectate de murdăria de natură organică şi de duritatea apei. Au acţiune antibacteriană faţă de bacteriile Gram-negative şi pozitive, dar sunt ineficace faţă de spori şi virusuri. Compuşii cu iod (iodoforii). Acţionează rapid, dar sunt mai scumpi decât compuşii clorului. Compuşii cu iod au un spectru larg de acţiune antimicrobiană, dar sunt mai puţin eficace faţă de spori. Au acţiune iritantă asupra pielii, mucoaselor şi colorează suprafeţele plastice cu care vin în contact. Un compus utilizat este polivinilpirolidona complexată cu iod şi cu alţi agenţi tensioactivi (agenţi anionici, agenţi cationici sau agenţi neionici), în care caz se diminuează şi acţiunile negative ale iodoforului respectiv. Se utilizează prin pulverizare. Bromoclordimetiihidantina. Este, de asemenea, un bun dezinfectant, în soluţie eliberând acid hipobromos şi hipocloros, care, la rândul lor, eliberează brom şi clor în stare gazoasă. în cazuri speciale, pentru dezinfecţia depozitelor etc. se pot utiliza şi dezinfectanti gazoşi cum ar fi: S02, HCN, CCI4 (tetraclorura de carbon), cloropitrina, 102

oxidul de etilen, CH3Br. Folosirea acestor dezinfectanţi necesită măsuri speciale cu referire la ermetizarea spaţiilor, gazarea acestora de către echipe speciale dotate cu echipamente de protecţie, în final depozitele respective trebuind să fie bine ventilate (aerisite). Pentru dezinfecţie se poate utiliza şi apa fierbinte (77...83°C), mai ales pentru dezinfecţia ustensilelor, a tăvilor de aluminiu şi inox, a pieselor componente ale utilajelor care vin în contact cu laptele (site, şnecuri). Reguli de igienizare pentru personalul operativ Activităţile desfăşurate de angajaţii unităţii economice sunt foarte importante pentru controlul dezvoltării bacteriilor. Angajaţii trebuie să respecte următoarele cerinţe generale: - să păstreze zonele de prelucrare a materiilor prime şi de manipulare foarte curate; - să spele şi să dezinfecteze frecvent ustensilele în timpul lucrului. Ei nu trebuie să lase ca ustensilele să vină în contact cu pardoseala, hainele murdare etc; - să nu lase produsele să intre în contact cu suprafeţele ce nu au fost igienizate; să utilizeze numai cârpe de unică folosinţă pentru ştergerea mâinilor şi a

ustensilelor; - să-şi asigure curăţenia corporală şi a îmbrăcămintei în mod permanent; - să poarte capişon sau beretă curată pe cap pentru a evita o eventuală contaminare a produselor datorită căderii părului pe suprafaţa lor; - înainte de a intra în WC, trebuie să-şi scoată şorţul, halatul, mănuşile sau orice alte obiecte de îmbrăcăminte ce pot intra în contact cu produsele; - la părăsirea WC-ului trebuie să-şi spele şi să-şi dezinfecteze mâinile; - personalul care lucrează cu materia primă nu trebuie să aibă acces în spaţiile în care se manevrează produsele finite, pentru a se preveni contaminarea încrucişată; - persoanele care suferă de afecţiuni contagioase nu trebuie să aibă acces în zonele de producţie (persoane cu răni infectate, cu răceli, afecţiuni ale gâtului, ale pielii); - să nu fumeze în zonele în care se prelucrează produsele alimentare; - să păstreze îmbrăcămintea şi obiectele personale în vestiare, departe de orice zonă de producţie. 103

TRASABILITATEA PRODUSELOR ALIMENTARE

Aspecte generale privind trasabilitatea Conform ISO 22005:2007, „trasabilitatea reprezintă capacitatea de a urmări istoricul, aplicaţia sau locaţia unui articol prin intermediul informaţiilor înregistrate." Trasabilitatea poate fi considerată în patru contexte, în fiecare dintre acestea având o aplicaţie uşor diferită: • pentru produse, trasabilitatea face o legătură între materiile prime, originea lor, prelucrarea, distribuţia şi locaţia lor după comercializare; • pentru date, trasabilitatea se referă la calcule şi date de-a lungul drumului calităţii şi prin care se face legătura cu cerinţele calităţii de început; • în calibrare, trasabilitatea se referă la aparatura de măsurare a mărimilor fizice sau proprietăţilor sau cu referire la materialele înscrise în standardele naţionale şi internaţionale; • în IT şi programare, trasabilitatea se referă la proiectarea şi implementarea proceselor în conformitate cu cerinţele unui sistem. Conform CÂC 60-2006 (CAC = Codex Alimentarius Commission), prin trasabilitate se înţelege capacitatea de a urmări deplasarea unui produs alimentar în diferite etape specifice ale producţiei, prelucrării şi distribuţiei. Cerinţele trasabilitătii în articolul 18 al Reglementării 178/2002 a Parlamentului

European se menţionează clar cerinţele trasabilitătii: • Trasabilitatea unui produs alimentar, nutreţ, animal producător de alimente şi orice altă substanţă ce se intenţionează sau se aşteaptă de a fi încorporată în alimente sau nutreţuri trebuie să fie stabilită în toate stadiile de producţie şi prelucrare; • Operatorii de alimente şi furaje trebuie să identifice orice persoană de la care s-a făcut aprovizionarea cu alimente, nutreţuri, animale producătoare de alimente şi orice substanţă ce va fi încorporată în alimente sau nutreţuri şi, de asemenea, trebuie să deţină sisteme/proceduri care vor permite ca informaţiile să fie puse la dispoziţia autorităţilor care le solicită; • Operatorii de afaceri de alimente şi nutreţuri trebuie să deţină sisteme/proceduri pentru identificarea altor operatori cărora le-au fost livrate aceste produse. Informaţiile vor fi oferite autorităţilor competente la cererea lor. 104

• Alimentele/nutreţurile care sunt plasate pe piaţă sau care vor fi plasate pe piaţă în cadrul Uniunii Europene vor fi etichetate adecvat/identificate, pentru a facilita trasabilitatea lor. Conform Reglementării 128/2002, responsabilitatea principală pentru asigurarea conformităţii alimentului/nutreţului şi siguranţa acestora revin operatorilor afacerilor cu alimente/nutreţuri la toate nivelurile (producţie, prelucrare şi distribuţie) Utilitatea sistemelor de trasabilitate Sistemele de trasabilitate interesează consumatorii, producătorii şi procesatorii de alimente, precum şi puterea executivă a statului. Sistemele de trasabilitate sunt utile pentru consumatori deoarece: • fac posibilă evitarea cu uşurinţă a unor alimente specifice şi ingrediente alimentare care pot produce alergii, intoleranţă alimentară, respectiv a celor care nu corespund unui anumit stil de viaţă; • fac posibilă ca alegerea să fie exercitată între diferite alimente fabricate în diferite feluri; • fac posibilă protejarea siguranţei alimentare prin recunoaşterea produsului, în caz de necesitate. Prin urmare, sistemul de trasabilitate permite consumatorului să cumpere numai alimentele sigure din punct de vedere al salubrităţii acestora. Sistemele de trasabilitate sunt parte a sistemelor care fac ca producătorii şi procesatorii: - să respecte legislaţia în vigoare în domeniu;

- să ia măsuri prompte de a îndepărta de pe piaţă produsele de calitate inferioară şi care nu îndeplinesc condiţiile de siguranţă alimentară, apărându-se în acest fel reputaţia brand-ului; - să minimalizeze cantitatea produselor retrase de piaţă, prin urmare să minimalizeze costurile de recuperare, lichidare, recondiţionare a produselor retrase de pe piaţă; - să diagnosticheze problemele de producţie care au condus la produse de calitate slabă sau nesigure şi să ia măsurile de remediere; - să minimalizeze răspândirea bolilor la animale şi păsări; - să protejeze lanţul alimentar de efectele bolilor animalelor; - să creeze produse diferite pentru piaţă prin modul în care acestea sunt fabricate. Sistemele de trasabilitate sunt de interes deosebit şi pentru guverne, ca parte a sistemului care: • protejează sănătatea publică prin retragerea produselor alimentare de la vânzare • ajută la prevenirea fraudelor atunci când analizele nu pot fi folosite pentru autentificare (de exemplu, alimente organice) • controlează bolile zoonotice cum ar fi tuberculoza, salmoneloza, encefalopatia spongiformă bovină prin Direcţia de Sănătate Animală a ANSVSA (Autoritatea Naţională Sanitara Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor); 105

face posibil controlul cu privire la sănătatea oamenilor şi animalelor în cazuri de urgenţe; de exemplu, contaminarea solului, a materiilor prime); facilitează controlul epizootie şi enzootic al bolilor şeptelului prin identificarea rapidă a surselor de boli şi contactelor periculoase; monitorizează/controlează numărul de animale în vederea acordării de subvenţii. Tipurile de trasabilitate în interiorul unui lanţ de producţie Trasabilitatea este diferenţiată în: • trasabilitatea internă, reprezentată de informaţiile ce permit urmărirea produsului în cadrul unei întreprinderi sau companii; trasabilitatea internă are loc atunci când partenerii trasabilităţii primesc una sau mai multe materii şi ingrediente care sunt supuse procesării interne (în cadrul companiei, întreprinderii). Procesarea internă implică mişcare, transformare, depozitare, distrugere; • trasabilitatea externă, reprezentată de informaţiile pe care compania (întreprinderea) le primeşte sau furnizează altor membri ai lanţului alimentar, cu privire la un anumit produs;

• trasabilitatea lanţului alimentar, respectiv trasabilitatea dintre legăturile lanţului, atenţia fiind îndreptată asupra informaţiilor care însoţesc produsul de la un punct al lanţului la alt punct al acestuia, astfel încât trasabilitatea este extinsă pentru orice produs, în toate etapele producţiei, prelucrării şi distribuţiei. Componentele trasabilităţii sunt următoarele: > trasabilitatea furnizorului, reprezentată de totalitatea înregistrărilor şi documentelor pe baza cărora se poate dovedi provenienţa tuturor materiilor prime, ingredientelor, aditivilor etc; > trasabilitatea procesului, reprezentată de înregistrările realizate pe parcursul procesului tehnologic, care asigură posibilitatea identificării tuturor materiilor prime, ingredientelor, aditivilor etc. din care s-a obţinut un anumit produs şi a operaţiilor pe care acestea le-au suferit în fluxul tehnologic. > trasabilitatea clientului, prin care se asigură identificarea tuturor clienţilor produsului. Caracteristicile sistemelor de trasabilitate Caracteristicile de bază ale sistemelor de trasabilitate se referă la identificarea şi informarea şi legătura dintre acestea, aceste caracteristici fiind comune tuturor sistemelor indiferent de produs, producţie şi sistem de control. Atât produsele, cât şi procesele sunt componentele cheie ale sistemului de trasabilitate şi, în legătură cu acestea, informaţiile pot fi esenţiale şi ajutătoare. Identificarea reprezintă abilitatea de a vedea obiectele care se deplasează: paleţi, ambalaje mari (cartoane), unităţi de produs. Cel mai simplu mijloc de identificare este marcarea cu un număr sau nume înscris pe entităţile în mişcare. în prezent, se folosesc maşini de marcare care prezintă numeroase avantaje: - viteză mare de manipulare; 106

- reducerea erorilor prin folosirea înregistrărilor pe hârtie sau de înregistrare manuală; - mişcarea încărcăturii şi îmbunătăţirea logisticii; - simplificarea documentelor şi respectiv a datelor care intră în calculator; - comanda şi plata electronică a produselor, ceea ce contribuie la reducerea erorilor şi la creşterea eficienţei. Modalităţi de identificare a produselor Succesul unui proces de trasabilitate constă în modalitatea de identificare a produselor şi a informaţiilor atribuite acestora.

Sistemele de identificare sunt următoarele: 1. coduri cu bare: codurile cu bare reprezintă sisteme de reprezentare codificată a informaţiilor care sunt apoi descifrate automat. Codificarea se face cu ajutorul cifrelor reprezentate sub formă de bare albe şi negre, cu grosimi diferite, iar citirea codului se realizează cu un scanner. Codul cu bare a fost introdus iniţial în SUA şi Canada (1973) sub denumirea de Codul Uniform de Produs (UPC - Uniform Product Code), cu scopul identificării articolelor comerciale. în 1978, în Europa, s-a înfiinţat Asociaţia de Numerotare a Articolelor (EAN -European Article Numbering), asociaţie care a promovat un sistem de codificare a articolelor asemănător codului cu bare american, sistem care în scurt timp a fost acceptat voluntar în Asia, America de Sud, Africa şi Australia ca sistem de identificare în distribuţie şi comerţ. Pentru a nu apărea erori prin folosirea a două sisteme de codificare diferite, Consiliul Codului Uniform din America de Nord (UCC - Uniform Code Council) şi EAN International din Europa au hotărât să compatibilizeze cele două sisteme şi au pus bazele sistemului internaţional EAN-UCC de codificare a produselor. în funcţie de informaţia pe care trebuie să o codifice, codurile pot fi mai scurte (cu 8 cifre) sau mai lungi (cu 12, 13 sau 14 cifre). Cifrele codului sunt astfel grupate încât să se obţină o anumită structură . Structura standard a codurilor EAN-UCC Tipul de cod indicator Identificatorul de tară Identificatorul producătorului Identificatoru 1 produsului Cifra de verificare EAN-UCC-14 1 cifră cifră EAN-UCC-13 1 cifră EAN-UCC-12 1 cifră EAN-UCC-8 1 cifră 3 cifre 3 cifre 2 cifre 3 cifre 4 cifre 4 cifre 4 cifre 5 cifre 1 5 cifre 5 cifre 4 cifre Cifră

în funcţie de numărul de cifre al numărului de identificare a ţării şi companiei, acest sistem poate identifica individual de la 1 000 până la 100 000 de produse unice. Cifra de verificare este calculată automat prin procesarea cifrelor de către programul de etichetare şi acţionează ca un instrument de verificare a erorilor.

Codul EAN-UCC 14 este compus din 14 cifre şi reprezintă numărul complet al acestui sistem de codificare. Se utilizează pentru a identifica obiectele comercializate care nu trec printr-un punct de desfacere (în general, este utilizat pentru mărfurile transportate în vrac). Codul EAN-UCC 13, spre deosebire de codul EAN-UCC 14, nu conţine cifra indicator. s Codul EAN-UCC 12 este cunoscut drept codul universal al produselor (UPC Universal Product Code) şi este similar codului EAN-UCC 13, dar are doar un număr de două cifre drept număr de identificare a ţării. Se utilizează exclusiv în SUA şi Canada, în punctele de desfacere (pe eticheta de desfacere). 107

Codul EAN-UCC 8 este un cod trunchiat pentru identificarea obiectelor, care se utilizează în magazine. Cifrele iniţiale sunt înlocuite de zerouri astfel încât formatul să fie identic cu codurile EAN-UCC 12,13 sau 14. Codul EAN-UCC 128 este un cod creat pe baza succeselor repurtate de sistemele anterioare. Acest sistem măreşte cantitatea de informaţie care poate fi codificată într-un cod de bare pentru a include şi informaţii suplimentare, cum ar fi codurile loturilor, data producţiei, etc. Acest lucru poate fi realizat prin introducerea de prefixe adiţionale denumite identificatori de aplicaţie (Al - Application Identifiers). Identificatorii de aplicaţie furnizează un standard deschis care poate fi utilizat şi citit de toate companiile din lanţul alimentar, nu numai de compania care a realizat codificarea iniţială. Sistemul se bazează pe Codul 128, un sistem compact, cu trei seturi de caractere (A, B şi C), care facilitează codificarea unui set de 128 caractere în format ASCII. în setul de caractere C, datele numerice pot fi reprezentate într-un mod cu densitate dublă (două cifre sunt reprezentate de un singur caracter). De asemenea, există două trăsături independente de autoverificare, care reduc erorile de tipărire şi scanare. FNC1 este un caracter nepurtător de date, care urmează întotdeauna caracterului cu care începe codul de bare. Acesta permite scanerelor şi programelor de procesare să identifice codul ca fiind de tip EAN-UCC-128, astfel încât să existe siguranţa că datele sunt prelucrate corect. Codul EAN-UCC-128 nu este utilizat la ieşirea din punctele de desfacere deoarece scanerele în uz nu sunt capabile de a citi sau procesa informaţia adiţională. Importanţa informaţiei adiţionale se face simţită în lanţul de aprovizionare, unde trasabilitatea produselor este considerată esenţială. Codul lotului (în acest caz un număr serial)

( 01

Codul cu bare EAN-UCC 128 Aplicate iniţial doar produselor, pentru a le identifica în lanţul comercial, codurile cu bare sunt utilizate de câţiva ani şi pe parcursul prelucrării materiilor prime, din motive de trasabilitate. în prezent, pentru realizarea codurilor cu bare se folosesc identificatorii GTIN (Global Trade Item Number - număr al articolului pentru comerţ global), dezvoltaţi de GS1, instituţie ce reuneşte fosta EAN International şi Uniform Code Council. Identificatorii GTIN utilizează 14 cifre şi pot fi utilizaţi şi cu alte suporturi de date (ex. RFID). Aducerea codurilor mai scurte la 14 cifre se realizează prin adăugarea de zerouri în partea stângă a codului. Familia de identificatori GTIN include: -GTIN-12(UPC); -GTIN-13(EAN-13); - GTIN-14 (EAN/UCC-128 sau ITF-14); - GTIN-8 (EAN-8). 108

Legătura dintre structura identificatorilor GTIN şi terminologia moştenită, simboluri şi posibilitatea de utilizare a lor în punctele de vânzare (POS-uri) este prezentată în tabelul următor. Legătura dintre identificatorii GTIN şi codurile EAN/UCC Identificator Terminologie veche Simbol Posibilitate de utilizare la POS-uri GTIN-8 EAN-8 EAN-8 Da GTIN-12 UPC, UCC-12 UPC-A, UPC-E Da GTIN-13 EAN,JAN, EAN-13 EAN-13 Da GTIN-14 EAN/UCC-14 GS1 Databar Nu încă GTIN-14 ITF Symbol, SCC-14, DUN-14, UPC Case Code, UPC Shipping Container Code, UCC Code 128, EAN Code 128

ITF-14

Nu în mod obişnuit

în România, din 7 mai 2007, atribuirea de coduri cu bare prin sistemul GS1 se face cu ajutorul aplicaţiei CODALOC V.2. Aplicaţia este disponibila la adresa codaloc.gs1.ro, şi întâmpină utilizatorul cu o interfaţă prietenoasă, care uşurează munca de formulare a cererii de coduri. Pentru solicitarea de coduri de identificare GS1, principalele etape care trebuie parcurse sunt următoarele: • obţinerea unui prefix GS1 pentru companie; • atribuirea numerelor; • alegerea unei metode de editare a codului cu bare; • selectarea mediului în care se face citirea codului cu bare; • alegerea tipului de cod cu bare; • alegerea mărimii codului cu bare; • formularea textului asociat codului cu bare; • alegerea culorii codului cu bare; • alegerea locului în care va fi plasat codul cu bare; • realizarea unui plan de calitate pentru codul cu bare. Tehnologia codificării cu bare permite eficientizarea operaţiilor de trasabilitate prin: a) Viteză de operare: transmiterea automată a datelor către calculatoare se face de 610 ori mai rapid prin intermediul scanerelor, decât în cazul introducerii datelor manual. b) Precizie: sistemul codurilor de bare lucrează cu grad de eroare extrem de scăzut, o greşeală la 3 milioane de operaţii, faţă de cazul introducerii manuale a codurilor, în care se produce o eroare la 3 sute de operaţii. înregistrarea fiecărui cod se face în timp real, ceea ce face ca sistemul de gestionare a stocurilor să poată furniza în orice moment date complete, corecte şi actuale. Când facturarea se bazează pe codurile citite automat se elimină sursele de erori, ceea ce elimină şi cheltuielile suplimentare generate de eforturile de remediere a erorilor. (ex. produse livrate greşit). 109

c) Automatizare: folosirea acestei tehnologii de stocare a informaţiei oferă posibilitatea de asumare şi întrebuinţare a datelor în mod automat în circuitele industriale. De exemplu, depozitarea materiilor prime sau a produselor finite se poate face cu mai multă eficienţă. Sistemele de gestiune bazate pe codurile de bare pot indica imediat locul unde se află marfa căutată. Implementarea sistemului codurilor de bare creează în primul rând economii de timp şi de personal. în timp, datorită monitorizării exacte a stocurilor, nivelul de siguranţă al acestora poate fi micşorat, lucru foarte important, mai ales în cazul produselor perisabile, care necesită condiţii speciale de depozitare.

Domeniile în care se utilizează colectarea automată a datelor utilizând codurile cu bare sunt: • inventarierea stocurilor, mijloacelor fixe şi a obiectelor de inventar. Se realizează prin scanarea etichetelor ataşate, indiferent de ordinea de citire, obţinându-se astfel înregistrarea lor. T gestiunea intrărilor, ieşirilor şi stocurilor de mărfuri din magazii şi depozite. Operaţia se realizează prin scanarea etichetelor şi introducerea automată a datelor colectate în sistemul informaţional «" urmărirea şi controlul producţiei în punctele de lucru şi pe flux. Fiecare operaţie executată poate fi înregistrată prin scanarea codului asociat operaţiei, produsului sau executantului, putându-se urmări fluxul şi ordinea de executare a operaţiilor ■ monitorizarea vânzărilor mobile, în care caz se pot folosi terminale portabile ce pot fi conectate la o imprimantă, realizându-se astfel facturarea în momentul livrării ■ controlul accesului, prezenţa şi pontarea personalului în instituţii, societăţi comerciale, etc. Accesul se efectuează pe baza unor legitimaţii speciale, care au înscris un cod de recunoaştere. ■ transmisii de date în timp real cu ajutorul Internet-ului sau telefoniei mobile. 2. Identificarea pe bază de frecvenţă radio. RFID (Radio Frequency Identification), identificarea pe bază de frecvenţă radio, este o formă a tehnologiei de captură de date şi identificare automată (AIDC - Automated Identification and Data Capture), care se realizează fără fir. Sistemele RFID (Radio Frequency Identification) utilizează unde radio cu anumite frecvenţe (135kHz, 13,65 MHz, 915 MHz şi 2,45 GHz) pentru a citi şi/sau modifica datele păstrate în circuite electronice sau microcipuri, care, în mod obişnuit, sunt încastrate în plastic dur pentru a forma o „etichetă electronică". Sistemul RFID este alcătuit deci din transmiţător şi etichete electronice (RF). Transmiţătorul transmite energie sub formă de unde radio prin intermediul unei antene. Când undele întâlnesc eticheta RF, aceasta emite un semnal radio care poate fi preluat de transmiţător şi decodat pentru a revela informaţia conţinută. Transmiţătorul poate fi încorporat în diferite tipuri de echipamente, de la portaluri, scanere portabile similare cu scanerele pentru codurile cu bare, cântare şi chiar mănuşi cu care muncitorii manipulează ambalajele produselor alimentare. Etichetele electronice (engl. tags) utilizate pot fi de două tipuri: - pasive, care operează fără o baterie internă şi care se folosesc de energia aparatului utilizat pentru citirea informaţiei. Virtual, etichetele electronice din 110

această categorie pot avea o durată de viaţă infinită. Din acest motiv şi pe considerente de costuri, acest tip de etichetă electronică este cel mai utilizat. - active, care sunt mai mari şi mai scumpe decât cele pasive şi care conţin o baterie internă. Etichete electronice active au durata de viaţă limitată (cea. 10 ani), dependentă de numărul de cicluri de citire/scriere, temperatura de operare şi gradul de uzură. Etichetele electronice active au capacitate mai mare de înmagazinare a informaţiei şi permit comunicarea în domenii mai mari. Etichetele electronice pot codifica şi înmagazina cantităţi diferite de informaţii. Cea mai simplă şi mai ieftină etichetă înmagazinează doar un număr unic de identificare, care, în baza de date, poate fi asociat cu detalii privitoare la un anumit produs. Alte etichete pot codifica mai multe informaţii legate de produs într-un format similar cu cel utilizat pentru codurile cu bare. Etichetele electronice pot fi ataşate la cutii, rasteluri, aparate şi sunt utilizate pentru a transporta informaţia necesară în trasabilitate într-un format care să poată fi citit automat şi de la distanţă. Avantajul acestei metode este că, pentru citirea informaţiei de pe cutii, e nevoie doar ca acestea să fie plasate pe un cântar sau să fie trecute printr-un detector pentru identificarea automată a informaţiei. Un alt avantaj estre constituit de faptul că pe etichetele electronice se poate adăuga informaţie suplimentară (ex. detalii despre un furnizor sau informaţii despre produs, cum ar fi denumirea speciei de carne utilizate în reţeta produsului sau utilizarea de carne proaspătă sau congelată ş.a.). Introducerea datelor se poate realiza prin intermediul meniului de pe un ecran ce funcţionează prin atingere (tehnologie touch screen). Mai nou, etichetele electronice au început să fie ataşate şi echipamentelor de prelucrare, pentru a facilita controlul operaţiilor desfăşurate cu ajutorul acestora şi a îmbunătăţi achiziţia de date privitoare la modul în care s-au desfăşurat. Un astfel de exemplu îl reprezintă cartuşele de filtrare Millipore Viresolve® NFR, care integrează o etichetă RFID, într-o poziţie situată în afara fluxului de filtrare, astfel încât procesul de filtrare să nu fie influenţat de prezenţa ei şi îndepărtarea ei să nu fie posibilă. Informaţiile colectate de etichetele electronice sunt transferate către clienţi prin intermediul cititorului de etichete RFID AccuSMART®, capabil să citească şi să prelucreze informaţia prezentă pe etichetă. Informaţia poate fi vizualizată pe ecranul cititorului şi apoi tipărită. Dacă echipamentele implicate în obţinerea unui produs sunt legate la un calculator sau o reţea de calculatoare atunci se poate: - reduce nevoia de a înregistra manual informaţia, ceea ce reduce posibilitatea de a greşi şi îmbunătăţeşte productivitatea angajaţilor. - asigură monitorizarea continuă a unui proces, făcând posibilă corectarea oricărei devieri înainte de a deveni critică. - păstrează înregistrările într-o bază centrală de date, în vederea colării şi analizei. Tehnologia RFID a fost utilizată pentru prima oară în timpul celui de al doilea război mondial, de către armata britanică, drept mijloc de diferenţiere a avioanelor inamice de cele proprii care se reîntorceau la bază (sistemul de identificare „Friend or Foe" - Prieten sau duşman). în acest scop, pe avioanele britanice fuseseră montate transpondere. Dacă nu se primea semnal de răspuns, se ştia că se apropie un avion inamic. în ciuda evidentelor avantaje de utilizare a acestei tehnologii în industria alimentară, reprezentanţii lanţului alimentar au fost iniţial reticenţi în a o implementa, deoarece au

considerat-o prea scumpă. în plus, la momentul respectiv nu existau standarde internaţionale pentru acest tip de identificare. 111

în prezent, preţurile nu mai reprezintă un obstacol (etichetele electronice pasive au un preţ de cea. 5 eurocenti, în timp ce cele active costă 10-20 euro), iar EAN International şi UCC au creat un standard internaţional pentru sistemele RFID. Transmiţătorul RFID citeşte automat informaţia conţinută de o etichetă electronică şi o transferă într-o bază de date. Avantajul cu privire la trasabilitate este că, din momentul introducerii informaţiei în baza de date, se poate face legătura între aceasta şi produs, fie în cadrul bazei de date, fie prin reactualizarea informaţiei purtate de o anumită cutie cu produs, prin tipărirea unei noi etichete de identificare a lotului (cu cod de bare) sau reactualizarea datei pe o etichetă electronică (RFID). într-un sistem de trasabilitate realizat pe bază de tehnologie informaţională, nu este necesar de a ataşa fizic codul de identificare a lotului de produs. Ca şi în cazul sistemului cu cod de bare, identificarea lotului este făcută în cadrul bazei de date şi codul de identificare este plimbat de-a lungul fabricii, pe măsură ce progresează prelucrarea, iar acest lucru este monitorizat de către echipamentul legat la baza de date. Se recomandă însă ca produsul să fie etichetat cu informaţie de identificare sub formă de etichetă de produs, astfel încât şi lucrătorii să poată identifica produsul. 1. Marcaje comestibile. Pentru produsele alimentare, în special pentru cele la care trebuie să se ateste originea geografică sau pentru cele care au suferit un tratament deosebit, este util să se folosească marcaje biodegradabile invizibile, ce pot fi plasate direct pe sau în matricea comestibilă. Acest tip de marcaj, care poate furniza o cantitate de informaţie la fel de mare precum un un cod cu bare, aduce industriei alimentare şi alte avantaje. între avantajele pe care un astfel de marcaj le poate aduce se numără: 2. furnizarea dovezii, în orice punct al lanţului alimentar, că produsul este ceea ce indică eticheta plasată pe ambalaj; furnizarea dovezii că, la un moment dat, produsul a suferit un anumit tratament (ex. iradiere); înlocuirea protocoalelor de trasabilitate de tipul „un pas înainte, un pas înapoi", ceea ce determină ieftinirea produsului datorită diminuării substanţiale a cheltuielilor cu produsul respectiv. Invizibilitatea marcajului se obţine prin reducerea dimensiunilor lui la valori mai mici decât puterea de rezoluţie a ochiului uman (0,5 mm). Pentru a putea fi aplicat direct pe/în aliment, marcajul trebuie realizat dintr-o substanţă comestibilă, general recunoscută sau dovedită ştiinţific ca fiind sigură pentru consum uman, substanţă care se amestecă cu aditivi acceptaţi, pentru a-i regla viteza de descompunere spontană. Deoarece suprafaţa celor mai multe alimente este greu de a fi menţinută într-o formă stabilă, necesară pentru a găzdui un marcaj microscopic, informaţia trebuie codificată

pe suprafaţa rigidă a unei particule microscopice, de preferat cu formă plată, care se ataşează ulterior alimentului dorit. Aceste particule purtătoare ale marcajului se ataşează alimentelor în diverse moduri prin: - atracţie electrostatică; - adeziune prin intermediul agenţilor de umidificare, a proteinelor sau lipidelor; - amestecare cu un material, care, la rândul lui, este amestecat în/sau aplicat pe alimentul de marcat. Metoda de ataşare a marcajului se alege în funcţie de condiţiile în care alimentul va fi păstrat, astfel încât condiţiile de mediu (temperatură, umezeală) sau transport să nu-i afecteze gradul de aderare la aliment. 112

Marcajele vor fi purtătoare de coduri. Codurile binare sunt preferate celor analoage (coduri care utilizează forme, culori, materiale trasabile sau secvenţe de acizi nucleici) pentru a stoca informaţii, deoarece codurile binare sunt scrise, păstrate şi citite mai uşor de către maşinile de codare/decodare. Acest lucru devine mai evident pe măsură ce creşte cantitatea de informaţie ce trebuie codificată, iar spaţiul de codificare rămâne neschimbat sau se restrânge. Materialele pentru marcajele comestibile pot fi celuloza şi derivaţii acesteia precum şi acidul polilactic. în proiectarea marcajelor comestibile pentru alimente, mărimea lor constituie un element critic de design. Cu cât marcajul este mai mare şi cu cât trebuie plasaţi mai mulţi pe alimentul marcat, cu atât ei vor fi mai uşor de identificat şi de citit. Totuşi, pentru alimente, dimensiunea şi masa marcajelor trebuie să aibă valori care să nu influenţeze masa sau textura produsului marcat. Pentru a nu influenţa masa produselor, marcajele nu trebuie să depăşească 0,1%*din masa sau volumul produsului marcat. Pentru a nu influenţa textura produselor, concentraţia marcajelor trebuie aleasă astfel încât consumatorul să nu detecteze nici un efect pe care l-ar putea avea asupra turbidităţii sau gustului apei distilate. Cea mai scăzută valoare a mărirtiii unui marcaj microscopic este determinată de cantitatea de informaţie pe care o poartă. Mărimea modelelor complexe de pe polimerii termoplastici comestibili nu poate fi redusă sub 4 pm2 per bit de informaţie. Aceasta este mărimea unui cerc cu diametrul de 1 pm plasat în centrul unui pătrat cu latura de 2 |jm. Un cod de bare ce conţine 14 cifre necesită 47 de biţi pentru reprezentare binară (1014 este ceva mai mic faţă de 247). Marcajul trebuie să fie asimetric astfel încât ordinea biţilor să poată fi determinată fără a fi necesară o anumită orientare a marcajului către cititor (spre exemplu, cu vârful în sus sau cu vârful în jos) şi să mărească cu cel puţin un bit numărul de biţi pe care marcajul trebuie să-i poarte. Un marcaj realizat din material biodegradabil va necesita cel puţin 200 pm2 de suprafaţă lizibilă pentru a purta un cod de bare.

Sistemele de identificare particulare. Printre aceste sisteme sunt menţionate: => Metoda de identificare vasculară a retinei, care se face prin utilizarea unei camere digitale speciale. Metoda se bazează pe faptul că modelul vascular al retinei rămâne acelaşi de la naştere până la moarte şi este unic pentru fiecare animal. în ambele cazuri imaginile sunt transformate într-o înregistrare unică pentru fiecare animal, care poate fi stocată într-o bază de date şi care poate fi conectată cu alte informaţii în acelaşi mod în care se foloseşte eticheta de identificare. => Testele ADN, care pot fi efectuate la animale în oricare stadiu al vieţii, pe sânge, carne, păr, salivă etc. Etapele de depozitare, purificare şi analiză a probelor depind de tipul de probă prelevată, de metodele folosite pentru prelevare şi depozitare (stocare). Pentru bovine, analiza ADN (amprenta genetică) conduce la o identificare unică, cu specificaţia că ADN de la gemeni poate fi identic. Atunci când există o bază de date privind amprenta genetică, atunci analiza ADN poate fi folosită pentru identificarea unui animal şi chiar a cărnii de la animalul sacrificat. în prezent, se face şi extracţia şi purificarea ADN din carnea supusă tratamentului termic şi chiar dintr-un amestec de cărnuri provenite de la mai multe animale . Datorită utilizării unor sisteme de markeri specifici, costul testelor ADN devine din ce în ce mai redus, în vederea trasabilităţii animalelor. => Scanarea irisului este de asemenea făcută ca şi în cazul precedent.

=> Semnăturile optice. Acestea pot fi codificate pe materiale plastice în timpul fabricaţiei, putând fi citite în lumină fluorescentă. în acest fel citirea pe orice loc al ambalajului furnizează aceiaşi identificare unică. => Semnăturile chimice. Acestea pot fi utilizate în acelaşi mod, „nasurile" electronice dezvoltate putând să permită ca semnăturile chimice volatile să poată fi utilizate. 113 Pentru materialele artificiale, inclusiv ambalaje, aceste semnături pot furniza aceiaşi trasabilitate unică, ca şi cea cu ADN. Tehnologia semnăturilor chimice este încă în faza de dezvoltare, iar costul actual al metodei este foarte ridicat. Componentele sistemului de trasabilitate internă Etapele implementării

Implementarea unui sistem de trasabilitate internă este realizată cu ajutorul codurilor, documentelor şi înregistrărilor, modalităţilor de management a datelor şi procedurii de retragere a produselor. Deoarece unei companii i se cere nu numai să utilizeze un sistem de trasabilitate, ci şi să furnizeze dovezi că face acest lucru, este esenţial ca sistemul să fie documentat. în majoritatea fabricilor, elemente ale sistemului de trasabilitate sunt deja în operare ca parte a altor proceduri ale companiei, cum ar fi achiziţiile, asigurarea calităţii etc. Prima etapă în stabilirea unui sistem de trasabilitate documentat este de a analiza procedurile şi operaţiile curente pentru a stabili ce elemente sunt deja prezente şi a identifica unde există vreo deficienţă în transferul de informaţii necesare pentru trasabilitate. Termenul de „operaţie" este folosit pentru a descrie toate categoriile de activităţi pe care o companie le poate desfăşura ca parte a rutinei zilnice, ceea ce poate include operaţii tehnologice, activităţi de management, acţiuni de vânzare sau cumpărare, etc. în vederea implementării unui sistem de trasabilitate se vor parcurge mai multe etape. Acestea vor include: □ Stabilirea unei echipe administrative. Este esenţial ca implementarea unui sistem de trasabilitate documentat să reprezinte efortul unei echipe şi este de dorit ca orice persoană care are cunoştinţele şi experienţa necesare să fie inclusă în proiect. Acest lucru este necesar datorită naturii diverse a operaţiilor dintr-o companie. O Realizarea diagramei de flux. Diagrama de flux va cuprinde toate operaţiile care se desfăşoară într-o companie, de la achiziţia materiilor prime, la livrarea produsului final. □ Identificarea procedurilor existente. Pe baza diagramei de flux se vor identifica toate procedurile documentate din care se pot culege informaţii utile despre produs. Acestea pot include procedurile de achiziţie, modul de monitorizare a calităţii, procedurile de codare a loturilor, etc. □ Identificarea înregistrărilor existente. Este necesar să se identifice ce înregistrări sunt ţinute şi cum sunt aceste înregistrări asociate cu anumite produse şi operaţii. Această informaţie trebuie colată şi scrisă pentru a furniza documentaţia pentru sistemul de trasabilitate. Procedurile şi înregistrările trebuie să includă nu numai denumirea documentului, ci şi o referinţă a locaţiei ei în cadrul documentelor companiei. □ Confirmarea in situ. Este esenţial să se confirme că toată informaţia de mai sus se poate găsi în anumite registre/documente, care sunt ţinute în secţiile de fabricaţie sau în birouri. 114

Analiza operaţiilor dintr-o companie poate fi înregistrată ca o diagramă de proces sau ca înregistrare scrisă sub forma unui tabel, care are avantajul că introduce referiri la proceduri scrise specifice sau la înregistrări, ceea ce e uşor de realizat . Analiza procedurilor şi înregistrărilor existente

Operaţia Procedurile înregistrările Cumpărare Factură Data Semnătura Recepţie Verificarea calităţii Desemnarea unui număr de cod pentru lot Asigurarea calităţii Data Semnătura Depozitare refrigerată Registrul stocurilor înregistrări depozit refrigerat Data Semnătura Prelucrare Procedura de prelucrare înregistrări de la prelucrare Ambalare Procedura de ambalare înregistrări de la ambalare Etichetele produsului Data Semnătura Data Semnătura Evaluarea trasabilitătii în fabrică

Verificat

Având implementate în fabrică procedurile şi realizate înregistrările pentru identificarea informaţiei despre produs, următorul pas este de a evalua dacă sistemul curent permite trasabilitatea informaţiei de-a lungul companiei. Metoda recomandată pentru a realiza acest lucru este utilizarea unui arbore decizional şi a unei fişe de înregistrare pentru a fi siguri că analiza este realizată sistematic pentru toate operaţiile şi este complet documentată

Managementul datelor într-o fabrică, trasabilitatea este legată în principal de managementul informaţiei. Când un produs suferă o operaţie de prelucrare, informaţia care are legătură cu acel produs trebuie şi ea să sufere o prelucrare, astfel încât legătura dintre produs şi informaţie să se păstreze. Operaţiile pe care le pot suferi informaţiile sunt: transferul, adiţia, unificarea şi divizarea. Transferul este cea mai simplă dintre operaţiile de prelucrare a informaţiilor. în cazul transferului, codurile de identificare ale produsului sunt transferate cu produsul în timpul prelucrării acestuia.

Exemplu. Filetarea peştelui. Peştele întreg este luat dintr-o cutie etichetată cu codul de identificare a lotului, filetat şi apoi plasat într-o cutie curată.^ Pentru trasabilitate, este esenţial să se transfere codul produsului pe noua cutie. în cazul folosirii codurilor cu bare, atât cutiile noi, cât şi cele vechi sunt scanate, astfel încât să se facă o conexiune cu identitatea produsului. Adiţia de informaţie este necesară când în timpul procesului tehnologic se adaugă ingrediente noi produsului sau acesta este supus unor operaţii care modifică produsul din punct de vedere chimic sau microbiologic. în această situaţie, se continuă să se folosească codgl de identificare a produsului, care este încă unic, dar în înregistrările de proces vor apărea codurile de identificare ale ingredientelor utilizate sau ale operaţiei executate. Exemplu. Operaţia de afumare a produselor din came. Preparatele vor purta acelaşi cod de identificare şi după afumare, deşi înregistrările de proces vor conţine şi codul de identificare al agentului de afumare, concentraţia acestuia şi durata operaţiei. 115 Unificarea informaţiei se practică în cazul în care o etapă de proces combină câteva Ipţiuri, fiecare având un cod de identificare unic. în acest caz, pentru noul fot obţinut se va stabili un nou cod de identificare, iar înregistrările vor indica coejurile de identificare ale unităţilor componente. Exemplu. Câne) un procesator nu are suficientă materie primă dintr-o sursă, pentru a onora o comandă, va trebui să utilizeze materii prime cu cod de identificare djferit, pentru a le putea combina şi a forma un lot cu un cod de identificare unic, pentru care înregistrările demonstrează codurile de identificare ale materiilor prime originare. Divizarea se practică atunci când o unitate de trasabilitate (lot) este împărţită pentru utilizare în procese şşu produse diferite. în această situaţie, pentru fiecare unitate rezultată prin divizare vor fi atribuite coduri noi de identificare, deşi în practică, noul cod nu va fi atribuit până când nu are loc următoarea etapă de procesare. Exemplul 1. O cantitate de mazăre ce constituie un lot, poate fi supusă congelării în trei reprize, ca urmare a capacităţii limitate a echipamentului de congelare. în aşteptarea congelării, mazărea din depozitul refrigerat va purta un cod de identificare până în momentul în care va fi transferată la congelare. în urma congelării vor rezulta trei loturi diferite, care vor purta coduri noi, diferite de cel atribuit iniţial mazării, astfel încât pe baza lor să se poată identifica modul în care a decurs congelarea, dar şi apartenenţa la acelaşi lot de mazăre. Codurile vor permite identificarea părţii din lotul iniţial ce a fost supus congelării (prima, a doua sau a treia parte) şi setului de temperaturi corespunzătoare ei, înregistrate la congelare. în plus, este de dorit să se înregistreze timpul de începere a congelării, astfel încât să se poată determina durata de păstrare în depozitul refrigerat. Procedura de retragere a produselor

O importanţă crucială în stabilirea unui sistem de trasabilitate este necesitatea utilizării informaţiei privind produsul, informaţie obţinută în sistem, pentru a rechema orice produs care se găseşte că are potenţialul de a pune în pericol siguranţa consumatorilor. Din acest motiv, este esenţial ca o companie să aibă bine definită şi documentată procedura de retragere a produselor, ca parte a sistemului de trasabilitate. Agenţia de Inspecţie a Alimentelor din Canada a realizat un model de procedură de retragere, care conţine nouă elemente. Acestora li se pot adăuga elemente specifice pentru operaţiile şi sistemele de management ale unei companii individuale. Cele nouă elemente obligatorii ale procedurii sunt: > întrunirea echipei de management pentru retragerea produselor Identitatea şi detaliile privind contactarea fiecărui membru al echipei şi a înlocuitorilor acestora trebuie listate împreună cu responsabilităţile lor privind procedurile de retragere. Echipa trebuie să includă membri ai managementului superior din toate departamentele implicate (asigurarea calităţii, vânzări, producţie etc), jurişti şi experţi mass-media. 116

> întocmirea dosarului de sesizări/reclamaţii Trebuie stabilită o procedură oficială pentru înregistrarea sesizărilor şi specificarea neconformităţilor, astfel încât natura sesizărilor să fie înregistrată împreună cu acţiunile întreprinse de companie pentru a investiga cauza şi a preveni repetarea ei. > întocmirea listei de contacte pentru retragerea produselor Detaliile privind persoanele şi organizaţiile care trebuie contactate în caz de retragere a unui produs trebuie păstrate într-un dosar, care va fi verificat regulat şi reactualizat, când este cazul. Lista va include: a) Autoritatea competentă, deoarece există o cerinţă legală de a informa autorităţile asupra unui incident care justifică retragerea unui produs. b) Clienţii, pentru a localiza produsul de-a lungul lanţului alimentar şi a informa următoarea verigă a lanţului alimentar. Furnizorii, pentru a fi informaţi asupra oricărui produs care nu îndeplineşte specificaţiile, astfel încât să se poată lua măsuri adecvate. Mass-media. Dacă produsul a fost deja vândut, va fi necesar de a informa consumatorii cu detalii despre produs şi riscul potenţial generat de consumul lui. > Urmărirea (trasarea) produselor Urmărirea produselor se face pe baza documentelor privind procedurile de trasabilitate care au fost create de către companie. > Realizarea înregistrărilor de aprovizionare şi distribuţie

Din înregistrările privind trasabilitatea, o companie trebuie să fie capabilă să determine ce furnizor a afectat materiile prime şi unde au fost livrate produsele care au fost obţinute din acelaşi lot de materii prime. De asemenea, trebuie identificată persoana responsabilă de compilarea acestor liste. > Stabilirea procedurii de retragere Ca parte a acestei proceduri, trebuie definite diversele niveluri de răspuns la neconformităţi. Acest lucru. poate însemna de la rambursarea sau înlocuirea produsului de calitate proastă la retragerea întregii cantităţi de produs existente pe piaţă, în cazul unui incident care constituie un risc serios pentru sănătatea consumatorilor. în eventualitatea unei retrageri de produs, este important să fie stabilită o secvenţă clară de evenimente, care să fie parcurse. Pentru fiecare secvenţă trebuie să existe o procedură scrisă care să detalieze ce trebuie realizat, cum şi de către cine. > înregistrarea ale produselor retrase Din motive de responsabilitate, trebuie ţinute înregistrări ale produselor retrase astfel încât să existe siguranţa că toate produseje au fost retrase din lanţul alimentar şi să se măsoare eficienţa planului de retragere. înregistrările trebuie să includă detalii despre produs, cantitatea retrasă, data retragerii şi a scoaterii produsului din lanţul alimentar şi detalii cu privire la ce s-a făcut cu produsul. > Evaluarea eficienţei procedurii de retragere O practică bună de management e ca pe lângă realizarea procedurii de retragere să se evalueze eficienţa ei şi, dacă este oportun să i se aducă îmbunătăţiri. > Testarea planului de retragere Dacă este necesară retragerea unui produs, este prea târziu să se descopere că sistemul nu funcţionează. Din acest motiv, este important ca procedura de retragere să fie testată periodic. Acest lucru poate constitui o parte a procedurii de verificare a trasabilităţii sau poate fi realizat în mod regulat. Un test simplu se realizează prin selectarea unui cod de identificare a loturilor, dintre cele de care se ştie că au ajuns la unitatea de desfacere, şi că au purces la declanşarea procedurii de retragere. Acest test va avea avantajul că va testa procedura şi, în acelaşi timp, va furniza experienţă personalului şi-l va pregăti pentru rolurile individuale pe care le are de jucat. înregistrările testului, problemele identificate şi acţiunile corective luate pentru a le soluţiona, trebuie păstrate. 117 Documente şi înregistrări

Deşi un sistem de trasabilitate implică numeroase componente din alte sisteme de management, deja implementate de o companie, se recomandă companiei să adopte politici şi proceduri separate, care sunt specifice pentru trasabilitate. Acestea vor forma planul de trasabilitate, care include următoarele secţiuni: •=> declaraţie privind politica de trasabilitate, care detaliază hotărârea companiei de a asigura trasabilitatea; <=> diagramă sau tabel cu fluxul procesului; > fişa de înregistrare a analizei sistemului, care furnizează un rezumat al procedurilor utilizate şi a referinţelor comune cu sisteme de management complementare; «=ţ> procedura de retragere a produsului. în plus faţă de aceste proceduri scrise, care formează planul de trasabilitate, trebuie păstrate înregistrări referitoare la: > audituri de trasabilitate realizate de însăşi compania sau de organizaţi) externe, cum ar fi autorităţi competente, clienţi etc. > probleme apărute, neconformităţi şi acţiuni corective. > modificări ale sistemului urmare a: instalării de utilaje/proceduri noi; acţiuni corective; cereri din partea clienţilor. 118

ANALIZA RISCULUI IN SIGURANŢA ALIMENTELOR

Consideraţii generale Bolile transmise prin alimente rămân o mare problemă atât în ţările dezvoltate cât şi în curs de dezvoltare, conducând nu numai la suferinţa umană dar şi la pierderi economice importante. în fiecare an 33% din populaţia ţărilor dezvoltate şi >33% din cea a ţărilor în curs de dezvoltare poate fi afectată de boli diareice transmise prin apă sau alimente, estimându-se că în fiecare an mor circa 2,2 mii. oameni, cel mai adesea copii. Trebuie avut în vedere că sistemele de siguranţa alimentului la nivel naţional sunt influenţate de factori globali cum ar fi: > creşterea volumului şi densităţii comerţului internaţional cu produse alimentare; > extinderea autorităţilor internaţionale şi naţionale şi a obligaţiilor legale ce rezultă din acestea; > creşterea complexităţii tipurilor de alimente şi a resurselor geografice; > Intensificarea şi industrializarea agriculturii şi respectiv a creşterii de animale (modificări în practica agricolă şi a climatului); > creşterea călătoriilor de afaceri şi a turismului; > modificări în ceea ce priveşte modelele de tratament şi manipulare;

> modificări în ceea ce priveşte modelele de hrană (dietă) şi preferinţele de preparare a alimentelor (modificări în comportamentul uman şi ecologie); > noi metode de procesare a alimentelor; > noi alimente şi tehnologii agricole; > creşterea rezistenţei bacteriilor la antibiotice; > modificări ale interacţiunilor oameni/animale cu potenţial de transmitere a bolilor. Indiferent de gradul de satisfacere al sistemelor de control la nivel naţional, elementele de bază ale sistemelor de siguranţă alimentară la nivel naţional trebuie să aibă în vedere că responsabilitatea pentru siguranţa alimentelor care revine atât producătorilor de materii prime de origine vegetală/animală, procesatorilor, reglementatorilor, distribuitorilor en-gros şi en-detail, precum şi consumatorului, dar şi sistemului guvernamental de control: Autoritatea Naţională Sanitar Veterinară pentru Siguranţa Alimentelor, Autoritatea Naţională pentru Protecţia Consumatorului. Elementele de siguranţă a alimentelor la nivel naţional sunt următoarele: • Legi alimentare, politici alimentare, reglementări şi standarde; • Instituţii cu responsabilităţi clar definite privind managementul controlului alimentului şi sănătate publică; • Capacitatea ştiinţifică; • Management integrat asemănător; • Inspecţie şi certificare; • Laboratoare de diagnostic şi analiză; 119

• Standarde cadru; • Echipament pentru infrastructură; • Structuri monitorizate şi capabilităţi; • Capacitate pentru răspuns în cazul extrem; • Examinarea problemelor de sănătate umană care sunt în legătură cu ingerarea de alimente; • învăţare; • Informarea publicului, educaţie şi comunicaţie. Pentru a fi siguri că produsele alimentare nu prezintă nici un risc pentru sănătatea oamenilor este necesară analiza riscului în siguranţa alimentului, această analiză constituind de altfel şi primul principiu al HACCP (Hazard Analysis Criticai Control Point) care se referă la analiza riscului. Conform Codex, hazardul este definit ca reprezentând orice agent biologic, chimic şi fizic care se găseşte într-un produs alimentar sau care poate ajunge în acesta şi care are potenţial de a produce un efect negativ asupra sănătăţii omului. Trebuie menţionat că orice hazard poate prezenta un anumit grad de risc. Riscul reprezintă estimarea probabilităţii şi severităţii reacţiilor adverse asupra sănătăţii populaţiei expuse prezenţei hazardului (urilor) din aliment (e).

Tipuri de hazarduri Hazardurile sunt numeroase în cadrul aceleiaşi grupe şi ele pot fi clasificate în trei grupe: Hazarduri biologice Hazardurile biologice se referă la: <=> Bacterii patogene infecţioase <=> Organisme producătoare de toxine (referitoare la bacterii) => Mucegaiuri, în principal cele toxicogene <=> Virusuri <=> Paraziţi => Prioni Hazarduri chimice Hazardurile chimice sunt: <=> Toxine care se găsesc în mod natural în produse alimentare; => Unii aditivi şi în special unii coloranţi şi conservanţi; <=> Micotoxine produse de mucegaiuri toxicogene; => Contaminanţi care provin din mediul înconjurător: metale grele, compuşii difenilpolicloruraţi, dioxină, hidrocarburi policiclice aromatice; => Contaminanţi chimici care proveniţi din ambalaje; <=$ Substanţe toxice care se formează la procesarea alimentelor (nitrozamine, hidrocarburi policiclice aromatice, acrilamidă, produşi ai reacţiei Maillard); => Alergeni de natură alimentară şi nealimentară. 120 Unele caracteristici ale hazardurilor microbiologice şi chimice care influenţează metodologia de evaluare a riscului Hazarduri microbiologice Hazarduri chimice alimentar (de la producător la

Hazardul intră în aliment în orice punct al lanţului consumator)

Prevalenta şi concentraţia hazardului se modifică marcant în diferite stadii ale lanţului alimentar

Riscurile pentru sănătate sunt acute şi pot fi rezultatului consumului unei singure porţii de aliment Indivizii prezintă o mare varietate de răspunsuri la diferite niveluri de hazard Hazardul intră în produs când acesta este în materia primă sau ingredient, respectiv întrun anumit stadiu de procesare (ex. acrilamida care se formează la tratament termic şi diferite substanţe care migrează din ambalaj în produs la depozitare) Nivelul hazardului prezent în aliment după pătrunderea semnificativ concentraţia şi structura Riscurile pentru sănătate pot fi acute, dar în general, sunt cronice Tipurile de efecte toxice sunt în general similare de la o persoană la alta, dar sensibilitatea individuală diferă Hazarduri fizice Hazardurile fizice sunt: => produse de origine agricolă: nisip, pământ, pietriş, sâmburi, frunze, lemn; => produse de origine animală: oase şi aşchii de oase; => sticlă provenită de la ambalaje de sticlă, becuri, ecrane ale aparatelor de măsură; => metale: bolţuri, şuruburi, cuie, clame, ace de siguranţă, ace de seringă, bolduri, părţi din ustensile ca lame de cuţit, abrazive; => plastic, hârtie de ambalaj, ambalaj, inele de închidere; => dăunători: păianjeni, muşte, şoareci; => materiale folosite la întreţinere: cabluri electrice, capse, perii, organe de asamblare, fragmente rezultate din găurire etc; => obiecte personale: pahare de plastic, cercei, inele, monede, agrafe de păr etc. Având în vedere importanţa asigurării siguranţei alimentare, guvernele şi alte organisme implicate în controlul alimentului sunt obligate să aplice şi să îmbunătăţească sisteme administrative existente, infrastructura şi alte facilităţi în vederea menţinerii siguranţei alimentare la cel mai înalt nivel posibil. în această direcţie, autorităţile trebuie să asigure: ■ creşterea încrederii faţă de ştiinţa care trebuie să stea la baza principiului care guvernează dezvoltarea standardelor de siguranţă; • deplasarea responsabilităţii primare în ceea ce priveşte siguranţa alimentului către industrie; ■ adoptarea lanţului producţie-consumator în vederea eficienţei controlului alimentului; 121 acestuia, nu-şi modifică

■ permisiunea pentru industrie de a fi mai flexibilă în implementarea controlului; ■ asigurarea unui control eficient şi operativ de către funcţiile guvernamentale; ■ creşterea rolului consumatorului în luarea de decizii; ■ recunoaşterea necesităţii privind extinderea monitorizării controlului alimentului; ■ adoptarea unui sistem integrat de lucru care să aibă legături şi cu alte sectoare (sănătatea animală şi sănătatea plantelor); ■ adoptarea analizei riscului ca o disciplină esenţială pentru îmbunătăţirea siguranţei. Componentele analizei riscului Analiza riscului este recunoscută ca fiind metodologia fundamentală în vederea realizării standardelor privind siguranţa alimentelor. Analiza riscului cuprinde trei componente separate dar totuşi integrate şi anume: ■ evaluarea riscului; ■ managementul riscului; ■ comunicarea riscului.

Evaluarea riscului Evaluarea riscului este un proces ştiinţific care constă din: identificarea hazardului; caracterizarea hazardului; evaluarea expunerii la hazard; caracterizarea riscului. Evaluarea riscului este bazată pe date ştiinţifice, dar poate utiliza judecăţi şi mijloace care nu sunt în întregime ştiinţifice. Evaluarea calitativă este exprimată în termeni descriptivi cum ar fi ridicată, medie, redusă. Evaluarea cantitativă a riscului poate fi deterministică şi probabilistică (stocastică), tipul de evaluare depinzând de date şi de tipul de întrebări la care trebuie să răspundă managerul de risc. în cazul evaluării deterministice a riscului microbiologic se asociază germeni patogeni (hazardul) cu sisteme alimentare specifice aletjându-se o singură valoare furnizată pentru a caracteriza acele valori care reprezintă mai bine factorii sistemului alimentar. în cazul evaluării probabilistice (stocastice) a riscului microbiologic valorile furnizate sunt distributive şi reflectă variabilitatea şi/sau nesiguranţa. Metoda procură mai multe informaţii asupra efectului riscului estimat asupra variabilităţii şi nesiguranţei asociate cu „input-urile" evaluării riscului. Managementul riscului

Managementul riscului este un proces ce se deosebeşte de evaluarea riscului prin politica de cântărire a alternativelor, în consultare cu toate părţile interesate, considerând evaluarea riscului şi alţi factori relevanţi pentru protecţia sănătăţii 122

consumatorilor şi pentru promovarea unor practice curate de comerţ şi, dacă este necesar să selecteze opţiuni de prevenţie şi control corespunzătoare. Definiţia managementului riscului aşa cum a fost propusă a fi inclusă în Codex Procedural Manual include consideraţii ale tuturor elementelor care trebuie incluse în procesul de management al riscului: evaluarea riscului; evaluarea opţiunii de management al riscului; implementarea şi managementul deciziei; monitorizarea şi corectarea. Opţiunea de management al riscului înseamnă că managerul de risc (sau managera) are disponibil un domeniu de acţiuni potenţiale sau intervenţii, cu alte cuvinte opţiuni, care potenţial pot fi implementate. Este rolul managerului de risc de a se asigura că asemenea opţiuni sunt identificate şi acceptabile pentru selectare în vederea implementării. Realizând acest lucru, managerul de risc consideră corespunzătoare opţiunea de management potenţial al riscului pentru al reduce la un nivel acceptabil în ceea ce priveşte siguranţa alimentelor. Principiile managementului riscului Principiile managementului riscului sunt: Principiul I. Managementul riscului trebuie să urmărească o structură ale cărei elemente sunt: evaluarea riscului; evaluarea opţiunii de management de risc; implementarea deciziei managementului; monitorizarea şi corectarea. Principiul II. Protecţia sănătăţii umane trebuie să fie consideraţia principală în managementul deciziilor riscului. Deciziile privind nivelurile acceptabile de risc trebuie să fie determinate în principal pe considerente de sănătate umană, diferenţele arbitrare/nejustificate în ceea ce priveşte nivelul de risc trebuie să fie evitate. Principiul III. Deciziile managementului şi practicile adoptate trebuie să fie transparente (Managementul riscului trebuie să includă: identificarea şi documentarea sistematică a tuturor elementelor procesului de management al riscului, inclusiv deciziile de creare, astfel încât totul să fie raţional şi transparent pentru toate părţile interesate). Principiul IV. Politica de evaluare a riscului trebuie să fie inclusă ca un component specific în managementul riscului (seturile de îndrumătoare de politici de evaluare a riscului trebuie să fie aplicate la puncte de decizie specifice în procesul de evaluare a

riscului şi preferabil trebuie să fie determinate în avans de evaluarea riscului, în colaborare cu toţi evaluatorii de risc). Principiul V. Managementul riscului trebuie să asigure integritatea ştiinţifică a procesului evaluării riscului prin menţinerea separaţiei funcţionale a managementului riscului şi evaluarea riscului. (în acest fel se reduce conflictul de interese dintre evaluarea riscului şi managementul riscului). Principiul VI. Deciziile managementului riscului trebuie să ia în consideraţie incertitudinea capacităţii (randamentului) de evaluare a riscului (dacă riscul estimat este în mare măsură nesigur, decizia de management a riscului trebuie să fie mai conservatoare). Comunicarea riscului Comunicarea riscului reprezintă un schimb interactiv de informaţii şi opinii pe tot parcursul procesului de analiză a riscului, factorii legaţi de risc, percepţia riscului printre evaluatorii de risc, managerii de risc, consumatori, industrie, comunitatea academică şi alte părţi interesate, inclusiv explicaţii pentru problemele găsite la evaluarea riscului şi baza deciziilor managementului riscului . 123 Analiza riscului la nivel internaţional Analiza riscului siguranţei alimentului este realizată la nivel naţional, regional şi internaţional de către autorităţile specializate în siguranţa alimentelor. La nivel internaţional, în cadrul Comitetului Codex pe probleme generale, legătura strânsă cu problemele de siguranţă a alimentelor o au următoarele Comitete Codex: • Comitetul Codex pentru aditivi (CCFA = Codex Committee on Food Additives); • Comitetul Codex pentru igienă alimentară (CCFH = Codex Committee on Food Hygiene); • Comitetul Codex pentru reziduurile de pesticide (CCPR = Codex Committee on Pesticide Residues); • Comitetul Codex pentru reziduurile de medicamente veterinare (CCRVDF = = Codex Committee on Residues of Veterinary Drugs in Foods); • Comitetul Codex pentru contaminanţi (CCC = Codex Committee on Food Contam inants). Aceste comitete sunt în subordinea Comisiei Codex Alimentarius, care acţionează ca manageri ai riscului. Evaluarea riscului, pentru a avea suportul realizării standardelor, se face de către următoarele corpuri de experţi FAO/WHO (OMS): - pentru aditivi lucrează Joint FAO/WHO (OMS) Expert Committee on Food Additives (JECFA)

- pentru reziduuri de pesticide lucrează Joint FAO/WHO Meetings on Pesticide Residues (JMPR) - pentru microorganisme lucrează Joint FAO/WHO (OMS) Expert Meetings on Microbiological Risk Assessment (JEMRA). în plus, evaluarea riscului poate fi făcută ocazional de experţi consultanţi ad-hoc, de către echipe de evaluare ale guvernelor naţionale. Aşa cum s-a arătat, Comitetele Codex acţionează ca manageri de risc în sensul că organizează şi direcţionează procesul de luare de decizii care rezultă la evaluarea riscurilor şi a altor factori legitimi cum ar fi opţiunile de fezabilitate a managementului riscului ţinându-se cont de interesele membrilor Codex în a recomanda standarde pentru protejarea sănătăţii publice şi asigurarea de bune practici în comerţul cu alimente. în activităţile lor pot fi incluse şi dezvoltarea de instrumente pentru riscul managementului precum texte, ghiduri, standarde pentru combinaţii de hazarduri în alimente specifice. Toate propunerile de lege ale diferitelor comitete, pe probleme generale, sunt trimise în final către CAC (Codex Alimentarius Commission) pentru adoptarea finală şi publicarea în Codex Alimentarius. Activitatea JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) din cadrul Comitetului Codex are ca punct de plecare un dosar care cuprinde numeroase informaţii primite de la o comisie de analiză formată din specialişti în domeniul sănătăţii, nutriţiei, igienei, toxicologiei, comisie care activează în cadrul JECFA. Pentru un aditiv se propune: • Doza zilnică ingerată acceptabilă - cantitatea de aditiv alimentar (mg) raportată la kilocorp, care poate fi ingerată zilnic, pe toată durata vieţii, fără a avea un risc apreciabil pentru sănătate (se are în vedere individul standard de 60 kg). • Doza zilnică ingerată acceptabilă temporar (ADI temporar) reprezintă acea doză pentru care, după JECFA, există date suficiente ca substanţa să fie considerată sigură pentru o perioadă scurtă de timp, dar aceste date sunt [nsuficiente pentru a considera că substanţa este sigură pentru toată viaţa. în acest caz, la stabilirea ADI temporar se foloseşte un factor de siguranţă mai mare decât în cazul ADI. ADI temporar se exprimă în mg/kilocorp. • Doza zilnică ingerată acceptabilă „nespecificată" (ADI-nespecificat) se referă la un aditiv care are o toxicitate foarte scăzută pe baza datelor disponibile şi care prin ingerare nu prezintă un risc pentru sănătate. Un aditiv trebuie folosit conform bunei practici de producţie (GMP - Good Manufacturing Practice). Pentru a evalua ADI este necesară ca pe animalele de experienţă să se stabilească NOAEL (No Observed Adverse Effect Level - Nivelul care nu produce un efect advers observabil). Pentru a determina ADI, valoarea NOAEL se divide cu factorul de siguranţă (FS) care este egal cu 100. Pentru majoritatea aditivilor alimentari sunt stabilite valorile ADI. • Doza maximă teoretică ingerată zilnic (TMDI) - reprezintă doza care este

calculată prin înmulţirea mediei zilnice de aliment care este ingerat din fiecare grupă cu nivelul maxim de aditiv folosit într-un produs alimentar, în conformitate cu Standardele Codex. 124 La stabilirea TMDI se presupune că: toate alimentele la care este permisă folosirea aditivilor conţin, într-adevăr, aditivii respectivi; nivelul de aditiv este la nivelul maxim permis în produsul alimentar; alimentele ce conţin aditivi sunt consumate de indivizi în fiecare zi, pe toată durata vieţii lor, la un nivel mediu/consumator; aditivul nu scade în concentraţia sa iniţială datorită proceselor termice sau altor tehnici de procesare (în realitate unii aditivi suferă transformări); alimentele care conţin aditivi sunt ingerate în totalitate, nefiind nimic îndepărtat înainte de ingerare. Pentru unii aditivi se folosesc noţiunile: • PTWI: Provisional Tolerable Weekly Intake = Doza Tolerabilă Previzionată Ingerată Săptămânal (bazată pe evaluarea riscului); • PMTDI: Provisional Maximum Tolerable Daily Intake = Doza Maximă Tolerabilă Previzionată Ingerată Zilnic; • doza de încorporare în produs (mg/kg) se stabileşte pe baza ADI de către CCFAC. Doza trebuie să asigure efectul tehnologic dorit. CCFAC a realizat un standard general pentru aditivii alimentari (General Standard for Food Additives = GSFA) care acoperă utilizarea aditivilor în toate produsele alimentare. Se are în vedere Codex Standard 192/195 revizuit cu Codex Standard 72/2006. Activitatea JMPR pentru pesticide. în cazul pesticidelor, analiza riscului este, de regulă, iniţiată de Codex Committee on Pesticide Residues (CCPR) în calitate de manager iar evaluarea riscului este făcută de JMPR (Joint FAO/WHO Meetings on Pesticide Residues) pe baza evaluării toxicologice a reziduurilor de pesticide din produs, evaluare care conduce la TDI - Tolerable Daily Intake (Doza zilnică ingerată tolerabilă). în plus, JMPR propune şi limitele maxime (Maximum Residue Limits - MRLs) în produse. MRLs se estimează în condiţiile în care pesticidele sunt folosite în concordanţă cu ghidul de bună practică în agricultură (GAP). Activitatea JECFA pentru reziduuri de medicamente veterinare. Având în vedere importanţa pentru sănătatea umană a reziduurilor de medicamente de uz veterinar, analiza de risc este iniţiată de Codex Committee on Residues of Veterinary Drugs in Food (CCRVDF). Procesul poate fi cerut şi de reprezentantele FAO/WHO din ţările membre UE, stabilindu-se un ADI pentru medicamentul respectiv având în vedere factorul de siguranţă (NOAEL) care are la bază animalul model cel mai sensibil. La stabilirea ADI se are în vedere şi activitatea antimicrobiană a reziduurilor medicamentului ingerat odată cu alimentul şi care poate modifica flora intestinală cu impact asupra sănătăţii oamenilor. Această etapă se constituie ca fiind etapa de caracterizare a riscului. JECFA estimează şi cantitatea potenţială de medicament veterinar ce poate fi ingerată de om (TMDI) respectiv PMTI din carne şi lapte şi, în consecinţă, propune MRL (Maximum Residue Limits) în condiţiile în care se are în vedere o bună practică a

folosirii medicamentelor veterinare (GPVD). MRL propus de JECFA este trimis de CCRVDF la guvernele ţărilor membre ale UE. Conform Reglementărilor Consiliului, medicamentele veterinare sunt clasificate în două grupe: - grupa de substanţe pentru care există fixată o limită maximă de reziduuri (MRL): substanţe cu acţiune antiinfecţioasă, substanţe cu acţiune faţă de endoparaziţi, substanţe cu acţiune ectoparazitică, substanţe cu acţiune asupra sistemului nervos 125

central, substanţe cu acţiune antiinflamatorie, substanţe cu acţiune asupra sistemului reproductiv. - grupa de substanţe pentru care nu este necesară fixarea de limită maximă de reziduuri (MRLprov)\ în această grupă sunt fixate o serie de substanţe anorganice, organice, diferite substanţe considerate ca fiind nesigure, substanţe organice homeopatice, diferite substanţe considerate ca sigure, extracte din produse de origine vegetală. Analiza riscului şi terorismul alimentar în cadrul bioterorismului poate exista un bioterorism direct prin folosirea şi răspândirea în aglomerările urbane a unor germeni extrem de patogeni cum ar fi Ci botulinum sub formă de spori sau toxina botulinică precum şi Bacillus anthracis. O formă a bioterorismului este terorismul alimentar care foloseşte alimente infectate cu hazarduri din categoria A (foarte periculoase) cum ar fi CI. botulinum, Bacillus anthracis precum şi patogeni din categoria B care se diseminează uşor şi produc morbiditate şi mortalitate moderată. în această direcţie sunt periculoase diferite specii de Salmonella, Shigella dysenterie, E. coli 0157:H7. Pe parcursul vremii au fost evenimente de terorism alimentar (SUA 1984,1996, 2003, China 2002, Germania şi Olanda 1978). Contaminarea deliberată a alimentelor cu agenţi biotogici, pe lângă efectul direct al îmbolnăvirii, are şi puternice implicaţii sociale şi politice deoarece bioterorismul alimentar produce panică în rândul populaţiei şi se poate ajunge la destabilizare politică. în plus, se înregistrează costuri economice directe în vederea combaterii actului terorist şi costuri economice indirecte datorită embargoului impus ţărilor în care s-a produs terorismul alimentar. în caz de terorism alimentar se impune în primul rând identificarea hazardului (depistarea agentului biologic şi alimentele incriminate şi caracterizarea hazardului pentru a stabili severitatea şi durata efectelor adverse asupra populaţiei care a consumat alimentele infectate intenţionat). Managementul riscului implică luarea tuturor măsurilor pentru depistarea făptaşilor, distrugerea alimentelor incriminate, tratarea populaţiei care a fost îmbolnăvită etc. Informarea populaţiei (comunicarea) din toate punctele de vedere este obligatorie, fără însă a produce o stare de panică generală. în cazul analizei riscului sunt deja executate studii de caz privind:

- prezenţa metil mercurului în peşte; - prezenţa Listeria monocytogenes în alimentele gata pentru consum (ready to eat). Siguranţa alimentară în timpul dezastrelor naturale Principalele dezastre naturale sunt reprezentate de: cutremurele de pământ cu magnitudinea peste 6° pe scara Richter; inundaţiile de mari proporţii din cauza revărsării apelor datorită ploilor abundente/topirii bruşte a zăpezilor, producerea de tsunami; producerea de cicloane devastatoare care devin catastrofale când sunt însoţite de inundaţii (a se vedea ciclonul care a afectat oraşul New-Orleans din SUA); 126

în toate aceste cazuri, alimentele (mai ales materiile prime) din zonele afectate pot fi contaminate cu microorganisme sau agenţi chimici şi, în consecinţă, populaţia din aceste zone poate fi expusă riscului izbucnirii de boli de origine alimentară (toxiinfecţii şi intoxicaţii), inclusiv hepatita A, febra tifoidă, boli diareice precum holera şi dizenteria. Riscurile legate de siguranţa alimentelor sunt în strânsă legătură cu: depozitarea necorespunzătoare a alimentelor, manipularea şi mai ales prepararea improprii. în caz de dezastre naturale, de regulă nu mai există facilităţi pentru pregătirea termică a hranei, starea sanitară devine precară din cauza lipsei apei potabile şi a grupurilor sanitare. Dezastrele naturale grave pot conduce la malnutriţie, la şocuri psihice şi alte traume. Pentru a ajuta guvernele diferitelor ţări în ceea ce priveşte măsurile ce trebuie luate în cazul dezastrelor naturale, WHO a elaborat un ghid denumit „Asigurarea Siguranţei Alimentare ca urmare a dezastrelor naturale" care răspunde la patru obiective, şi anume: • Asigurarea sănătăţii publice şi înarmarea autorităţilor cu un ghid privind principalele sarcini ce trebuie luate în consideraţie în situaţiile de dezastru natural. • Atenţionarea autorităţilor privind necesitatea de a restabili şi a menţine infrastructura siguranţei alimentare. • Creşterea vigilenţei faţă de riscurile de apariţie a unor noi boli transmisibile prin alimente. De a servi ca un ghid de referinţă pentru cei implicaţi în ajutorarea rapidă cu alimente, respectiv pentru conducătorii de tabere de refugiaţi şi pentru centrele de distribuţie a alimentelor. Ghidul „Asigurarea Siguranţei Alimentare ca urmare a dezastrelor naturale" prevede următoarele: > Măsuri preventive de siguranţă alimentară în urma dezastrelor naturale. Aceste măsuri se iau având în vedere că apele de suprafaţă devin contaminate cu bacterii patogene din apele menajere, ape reziduale, animale şi oameni morţi. Măsurile preventive ce trebuie luate imediat se referă la:

- apa pentru băut şi pentru prepararea alimentelor trebuie să fie tratată, chiar dacă contaminarea acesteia nu a fost confirmată. Cea mai simplă metodă de tratare este fierberea apei folosite pentru băut sau ca ingredient pentru prepararea alimentelor; - identificarea producţiei agricole care a fost afectată, a ariilor (suprafeţelor) de pe care se pot încă recolta materiile prime şi a locurilor unde se depozitează acestea după recoltare; - ce produse agricole au fost contaminate cu microorganisme din apele menajere şi cu substanţe chimice; - dacă recolta a fost contaminată trebuie să se ia măsurile necesare pentru a reduce riscul de transmitere a patogenilor şi a substanţelor chimice toxice. > Inspectarea şi salvarea alimentelor; Această acţiune implică: - inspectarea alimentelor stocate şi evaluarea siguranţei lor (ideal ar fi ca acestea să fie etichetate sau separate de cele contaminate sau neinspectate); 127

- alimentele salvate trebuie recondiţionate pentru a fi redate consumului şi etichetate corespunzător; - materiile prime rămase intacte de pe ariile inundate trebuie să fie mutate în încăperi uscate; - alimentele depozitate şi găsite a fi apte consumului se distribuie la consumatori care vor fi informaţi şi asupra măsurilor pe care trebuie să le ia la pregătirea lor pentru consum; - conservele deteriorate vor fi distruse iar cele găsite nedeteriorate vor fi igienizate înainte de deschidere; - se inspectează depozitele frigorifice pentru a se verifica dacă alimentele depozitate au rămas în stare congelată şi dacă acestea sunt sigure pentru consum; - alimentele mucegăite nu trebuie consumate. > Aprovizionarea cu alimente după dezastrul natural: De regulă, după un dezastru natural, populaţia din zona calamitată trebuie aprovizionată cu: - apă potabilă cu ajutorul cisternelor respectiv apă minerală; - alimente sub formă de conserve (vegetale, peşte, carne); - alimente sub formă deshidratată/uscată (lapte praf, făinuri, biscuiţi, paste etc); - pâine, în special preambalată; Pentru pregătirea culinară este necesară refacerea rapidă a instalaţiilor electrice şi de distribuţie a gazului metan. Alternativ pot fi utilizate bucătării mobile pentru mai multe familii sinistrate.

> Identificarea focarelor de epidemii. Identificarea acestor focare este vitală pentru a limita răspândirea epidemiilor. Faptele care arată izbucnirea unui focar de o boală transmisă prin alimente se referă la: - creşterea numărului de persoane cu simptome clinice de boală, în special diaree şi ale afecţiuni gastrointestinale; - rapoartele lucrătorilor din sănătate privind simptomele de toxiinfecţii alimentare din teren; - rapoartele farmaciştilor privind cererea mai mare de medicamente antidiareice şi anti-emetice respectiv pentru alte afecţiuni gastrointestinale (de exemplu cererea mare de antibiotice); - rapoarte privind cazuri de deces neobişnuite; - absenteism mare la şcoli, la locurile de muncă, în special din marile întreprinderi. > Investigaţii şi acţiuni privind focarele de toxiinfecţii alimentare. în această direcţie este necesar să se realizeze: - tratamentul rapid al bolilor apărute; - retragerea de pe piaţă a alimentelor contaminate; - identificarea rapidă a agenţilor cauzatori de toxiinfecţii/intoxicaţii alimentare şi a alimentelor suspecte prin analize de laborator şi chestionarea pacienţilor; - investigarea epidemiologică pentru identificarea agentului cauzator, a alimentului incriminat şi a modului în care acesta a fost contaminat; - informarea publicului privind toxiinfecţia/intoxicaţia alimentară şi acţiunile pe care publicul trebuie să le realizeze pentru a se minimaliza riscurile. 128

> Educarea şi informarea consumatorului Aceste acţiuni se referă la: - avizarea consumatorilor despre situaţia locală şi condiţiile existente; - avizarea consumatorilor în ceea ce priveşte măsurile de igienă în legătură cu prepararea hranei şi consumul de apă, astfel ca aceştia să evite consumul de alimente şi apă contaminate microbiologic/chimic; - informarea populaţiei asupra riscurilor bolilor provocate de alimentele contaminate datorită efectelor provocate de dezastrul natural petrecut. De menţionat că statul, prin ministerele de resort, este obligat să se implice rapid şi total în a reduce la minimum riscurile ce rezultă în cazul unui dezastru natural, intervenţiile acestuia trebuind să fie extinse şi în alte direcţii, altele decât siguranţa alimentară (asigurarea de medicamente, materiale de construcţie, înlăturarea cadavrelor de animale şi oameni din zona calamitată, refacerea infrastructurii, asigurarea securităţii sinistraţilor etc). 129

BIBLIOGRAFIE 1. Adams, G., Meirzon, S., RFID - reducing errors and effort, Filtration + Separation, July/August 2007, 17-19. 2. Boyer, M., Parrini, D. Modelling the choise between regulation and liability in terms of social welfare, Canadian Journal of Economics, 2004, 37, 590. 3. Brown, J.P. Toward an economic theory of liability, The Journal of Legal Studies, 1973, 2, 323. 4. Buzby, J.C. Product liability and microbial foodbome illness, Agricultural Economic Report no.799, Washington D.C, 2001. 5. Cunningham, E,P. şi Meghen, CM. Biological Identification systems: genetic markers, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 2001, 20 (2), p. 491. 6. Derrick, S., Dillon, M. A guide of traceability in the fish industry, Eastfish, Fachpresse Verlag, Hamburg, 2004. 7. Fueriu, T. Stocarea informaţiei: codurile de bare, Calita, 2001,12, p. 6. 8. Golan, E. Traceability in the US Food Suppiy: Dead End or Superhighway, Choices, 2003, 18,17. 9. Hobbs, J.E. Information asymmetry and the role of traceability systems, Agribussines, 2004, 20, 397. 10. Joppen, L. Getting results with tags, Food Engineering & Ingredients, 2003, 38, 4, p. 36. 11. Meuwissen, M.P.M. Traceability and Certification in Meat Suppiy Chains, Journal of Agribussiness, 2003, 21,167. 12. Morrison, C. Traceability improves profitability across the board, Eurofish Magazine, 2003, 1,p.42. 13. Nightingale, S.D., Christens-Barry, W. Placing Bar Codes Directly onto Foods, Food Technology, 2005, 59 (2), p. 36. 14. Pettit, R.G. Traceability in the food animal industry and supermarket chains, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 2001, 20 (2), p. 582. 15. Pouliot, S., Summer, D.A. Traceability, Liability and Incentives for Food safety and Quality, Agricultural Marketing Resource Center (Agricultural Issues Center University of California), 2006. 16. Stanford, K. ş.a. Traceability in cattle and small ruminants in Canada, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 2001, 20(2), p. 510. 17. *** EC Regulation no. 178/2002 of the European Parliament and of the Council, Official Journal of the European Community, 2002, L31:1-24. 18. Comisia Europeană. Directoratul General de Sănătate şi Protecţia Consumatorilor, Final Report of a mission carried out in Greece, from 26 November to 6 December 2002

in order to evaluate the operatioh of controls over the traceability of beef and beef products, DG (SANCO)/8660/2002-MR final. 19. *** Traceability in the Food Chain. A preliminary study, Food Standard Agency Food Chain Strategy Division, 2002. 20. *** Principles for traceability/product tracing as a tool within a food inspection and certification system,. CAC/GL 60-2006, 2006. 21. *** Traceability of beef, Application of EAN-UCC Standards in implementing EC Regulation 1760/2000. 22. Comisia Europeană. Directoratul General de Sănătate şi Protecţia Consumatorilor. Overview report of a series of missions carried out in all member states during 2002 in order to evaluate the operation of controls over the traceability and labeling of beef and mincedbeef, DG(SANCO)/9505/2003. 23. *** Traceability enhances consumer safety, Eurofish Magazine, 2003,1, p. 50. 24. *** Transparency in Traceability, Meat Processing Global, July/August, 2003, p. 26. 25. Commission of the European Communities. Communication from the Commission to the European Parliament, the Council, the European Economic and Social Committee and the Committee of the Regions. Radio Frequency Identification (RFID) in Europe: step towards a policy framework, SEC 2007/312, Brussels 15.03.2007.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->