COMO ABORDAR Y RESOLVER ASPECTOS PRCTICOS DE MICROBIOLOGA

4. CLCULO DE LOS PARMETROS QUE DEFINEN EL CRECIMIENTO BACTERIANO

Ins Arana, Maite Orruo e Isabel Barcina

Departamento Inmunologa, Microbiologa y Parasitologa Universidad del Pas Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea

4. CLCULO DE LOS PARMETROS QUE DEFINEN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

En condiciones controladas, en el laboratorio, se puede seguir la evolucin del nmero de clulas a lo largo del tiempo de un cultivo microbiano en un sistema cerrado. Si representamos los resultados obtenidos obtendremos la denominada curva de crecimiento que comprende cuatro fases: fase de latencia o de adaptacin, fase de crecimiento exponencial o logartmico, fase estacionaria y fase de muerte.

LATENCIA LAG

EXPONENCIAL LOG

ESTACIONARIA

MUERTE

Crecimiento neto

Log N

>0
tiempo

<0

inculo El concepto de crecimiento microbiano y las expresiones matemticas que lo definen pueden consultarse en cualquier texto de Microbiologa (Brock Biology of Microorganisms 2012, Prescott's Microbiology 2011). Fase de crecimiento exponencial es la fase de crecimiento propiamente dicha y, simplificando el desarrollo matemtico, dN/dt = N N=N0 e se caracteriza mediante la siguiente ecuacin: Ln N-LnN0 = (t-t0) log N - log N0= / 2,303 (t-t0)
(t-t0)

siendo la constante de proporcionalidad , un ndice de la velocidad de crecimiento que se denomina constante especfica de velocidad de crecimiento (velocidad de crecimiento por unidad de biomasa) y tiene unidades de tiempo (h-1).

Es posible utilizar otros parmetros como por ejemplo, el tiempo que tarda en duplicarse la poblacin o tiempo de generacin, g.

g = 0,693/

Al inverso del tiempo de generacin se le denomina velocidad de crecimiento (K) y sus dimensiones son generaciones/hora.

K = 1/g Podemos calcular el valor de max (velocidad mxima) de crecimiento para un microorganismo y un sustrato dado. Para ello se realizan curvas de crecimiento con concentraciones crecientes de sustrato y se determinan los valores de para cada concentracin estudiada. = max S/(Ks + S) siendo, Ks la constante de saturacin para ese sustrato e igual a la concentracin de sustrato para la cual = max. Tambin podemos utilizar la siguiente transformacin de la ecuacin:
1/ = 1/max + (Ks/max) (1/S)

En la fase estacionaria se pueden determinar dos parmetros interesantes: cosecha mxima y rendimiento.

Cosecha mxima es la biomasa mxima obtenida. Su clculo se realiza mediante la expresin siguiente:

M = Mt M0

siendo, Mt la biomasa en el tiempo t y se calcula en el momento en de la fase estacionaria en el que el nmero de clulas es ms elevado y M0 la biomasa del inculo. El resultado se expresa en gramos, miligramos, etc

Rendimiento es la biomasa producida por cantidad de sustrato consumida. Para su clculo se utiliza la siguiente expresin:

Y = Biomasa producida/Sustrato consumido = (Mt M0)/(S0 St) siendo, S0 la cantidad de sustrato al inicio del cultivo y St la cantidad de sustrato en el tiempo (t) en el que se obtiene el nmero de clulas ms elevado. El resultado se expresa como g de clulas/g de sustrato consumido. Hasta aqu los aspectos tericos del estudio del crecimiento microbiano, pero cmo se analizan los resultados obtenidos en el laboratorio o planteados en un problema? A continuacin veremos como trabajar los datos. Los problemas ms sencillos que nos pueden plantear son aquellos en los que conocidos varios trminos (p.e. densidad inicial de microorganismos, valor de y tiempo) nos pidan resolver una incgnita (en este ejemplo, densidad final de microorganismos). Para ello nos bastar con sustituir en las ecuaciones anteriores los trminos conocidos y resolver. Estos problemas son muy sencillos pero deberemos tener cuidado con las unidades o con la necesidad de transformar algn dato, expresado de forma que no est recogida en la frmula (p.e. desconocemos pero nos dan el valor de g). Con esta base, se deben proponer soluciones para los problemas siguientes: 4.1. Si partimos de 104 UFC/ml en un cultivo que tiene un tiempo de generacin de 2 h, cuntas clulas cultivables tendremos al cabo de 4, 24 y 48 h de cultivo? 4.2. Cul es el tiempo de generacin de un cultivo que tiene una constante especfica de velocidad de crecimiento de 0,01 min-1? Cul ser su velocidad de duplicacin? 4.3. Si se quiere conseguir que un cultivo crezca hasta una densidad celular de 108 clulas/ml en 3 h, y el tiempo de generacin es de 30 min., cul debe ser la densidad celular al comienzo del cultivo? 4.4. Tenemos un cultivo de densidad 108 clulas/ml, con un tiempo de generacin de 30 min. Si la densidad inicial fue de 106 clulas/ml, que tiempo de incubacin ha sido necesario para alcanzar la densidad final mencionada?

4.5. Supongamos un cultivo en fase exponencial que en un momento dado tiene 10.000 clulas/ml y cuatro horas ms tarde 100.000.000 clulas/ml. Calcular y g. 4.6. En una comida campestre se contamin la paella con 46 clulas de Propionibacterium acnes. Si P. acnes tiene un tiempo de generacin de 90 minutos y una fase de latencia (fase lag) de 1,5 h cuntas clulas de esta bacteria estarn presentes en la paella al cabo de 10 h? 4.7. Un carnicero, portador asintomtico de Salmonella, pic carne sin proteger sus manos con guantes. La carne picada se contamin con 25 clulas de Salmonella spp. y con 32 clulas de S. enterica. Sabiendo que Salmonella spp. Tiene un tiempo de generacin de 30 minutos y una fase de latencia de 3 h y que la constante especfica de la velocidad de crecimiento de S. enterica en la carne es 0,17 h-1 y la duracin de su fase de latencia 5 h calcule el nmero de clulas del gnero Salmonella que habr en la carne 10 h despus de ser picada. 4.8. Se produce un vertido de aguas residuales urbanas en una playa. La densidad de E. coli y de Enterococcus faecalis en las aguas residuales es de 7,8 1010 y 6,2 109 clulas/100 ml, respectivamente. El factor de dilucin del vertido al incorporarse a la playa es de 1/1000. Dado que la concentracin de nutrientes en la playa es baja, el crecimiento de ambos microorganismos est ralentizado. El tiempo de generacin de E. coli es de 3 horas mientras que la constante especfica de la velocidad de crecimiento de Ent. faecalis es 0,11h-1. Con los datos que se indican podra indicar cual ser el nmero de clulas por mililitro, de cada una de estas bacterias, en el agua de la playa 24 horas despus del vertido? 4.9. Calcular el rendimiento de produccin de biomasa por gramo de carbono consumido de un cultivo que produce 20 gramos por litro de clulas cuando utiliza como nica fuente de carbono una solucin de glucosa al 10% (peso/volumen).

Sin embargo, en el laboratorio, cuando estudiamos el crecimiento microbiano, los problemas no son tan sencillos o de resolucin tan directa. Veamos un ejemplo: En el laboratorio se inocula un matraz que contiene 100 ml de medio de cultivo X con el microorganismo Y. Se incuba a XXC con agitacin y peridicamente se recogen alcuotas para determinar el nmero de UFC/ml. Los datos se expresan una tabla como la del siguiente ejemplo (datos en negro):

Tiempo (h) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

N UFC/ml 2,05 106 2,04 106 2,01 106 2,14 106 2,34 106 2,69 106 3,80 106 5,25 106 7,41 106 1,07 107 1,51 107 1,82 107 1,99 107 2,04 107 1,91 107 2,02 107

Ln N UFC/ml (1) 14,53 14,53

Ln Dx - Ln Dx-1 (2) 0 -0,02

14,51 0,07 14,58 0,09 14,67 0,14 14,81 0,34 15,15 0,32 15,47 0,35 15,82 0,37 16,19 0,34 16,53 0,19 16,72 0,09 16,81 0,02 16,83 -0,06 16,77 0,05 16,82 (3)

Pasos a seguir para definir los parmetros de crecimiento de este microorganismo XX: a. Transformar el N de UFC/ml (en este caso) a log decimal o Ln (datos en rojo) (1). b. Determinar el incremento en densidad de un tiempo al siguiente (2). c. Buscar aquellos tiempos en los que la variacin del crecimiento es constante (3). d. Calcular la recta que relaciona, en este intervalo (3), tiempo vs densidad: Ln N/ml = 0,3486 t + 13,0752. La pendiente nos da el valor de = 0,3486 h-1. e. Para calcular la cosecha mxima debemos calcular la densidad mxima, en fase estacionaria, y la densidad inicial. Podemos determinar un valor mximo (en este caso 2,04 107 UFC/ml) y un valor inicial (2,05 106 UFC/ml) o, asumiendo que las fases estacionarias y lag estn representados por la media de los valores mximos y mnimos en los que no hay variacin (1,88 107 y 2,14 106 UFC/ml, respectivamente). En el primer caso, el valor de M sera 1,835 107 UFC/ml; y en el segundo, 1,666 107 UFC/ml. Es decir, una variacin mnima. Teniendo en cuenta esta informacin, se deben proponer soluciones para los problemas siguientes:

4.10.

Los datos de la fase exponencial de crecimiento de tres especies bacterianas que utilizan

glucosa como fuente de carbono son los siguientes:

Especie A Tiempo (h) Log N 4 4,64 5 4,81 6 4,98 7 5,15 8 5,32 Especie B Tiempo (h) Log N 3 5,30 4 5,44 5 5,58 6 5,72 7 5,86 Especie C Tiempo (h) Log N 5 6,22 6 6,37 7 6,52 8 6,67 9 6,82

Indique cual de las tres especies crecer ms rpidamente. Razone la respuesta 4.11. Los resultados para E. coli en dos medios diferentes (mismas condiciones de incubacin) son los reflejados en la tabla. Cul de los dos medios seleccionara para estudios posteriores?
N de clulas/ml Tiempo (horas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Medio A 2,09 10 2,04 106 1,99 106 2,63 106 3,47 106 4,68 106 6,17 106 7,94 106 8,32 106 8,51 106 8,33 106 8,13 106
6

Medio B 2,29 105 2,24 105 2,25 105 2,19 105 2,23 105 3,16 105 4,47 105 6,46 105 9,33 105 1,32 106 1,29 106 1,26 106

4.12. Con el objetivo de hacer una curva de crecimiento de la bacteria E. coli en caldo nutritivo se inocula un matraz con caldo nutritivo (37C, 100 r.p.m.). Cada hora se extraen 2 ml del matraz y se mide la absorbancia, obteniendo los siguientes resultados:
Tiempo (h) 0 1 2 3 4 5 Absorbancia 0,0022 0,0021 0,0088 0,0192 0,0315 0,0506 Tiempo (h) 6 7 8 9 10 11 Absorbancia 0,1108 0,1643 0,1905 0,2732 0,2603 0,2611

Paralelamente, a partir de un cultivo de E. coli, se preparan diferentes suspensiones celulares en las que se determina el nmero de bacterias/ml y la absorbancia, obtenindose siguiente ecuacin: Ln N clulas/ml = 20,688 Abs + 15,387, r = 0,97. 4.13. Previamente a la realizacin de una curva de crecimiento de la levadura Kloeckera apiculata en caldo YNB, se establecieron las relaciones Absorbancia vs. Densidad celular y Absorbancia vs. Peso seco. Para ello, a partir de una suspensin densa de levadura, se prepararon 10 diluciones a las que se mide la absorbancia (600 nm), y se determinaron la densidad celular y el peso seco, obtenindose los siguientes resultados:
Absorbancia 0,203 0,076 0,079 0,325 0,11 0,095 0,47 0,237 0,865 0,68 Densidad celular (x105cel/ml) 15,43 7,08 7,18 28,80 10,90 5,33 47,00 24,90 87,50 68,00 Peso seco (mg/ml) 0,06 0,02 0,02 0,08 0,038 0,035 0,169 0,06 0,40 0,25

Posteriormente, se inocul un matraz con 100 ml de caldo YNB con aproximadamente 106 levaduras/ml. El matraz se incub a 37C con una agitacin de 100 r.p.m. Peridicamente se extrajeron submuestras de 2 ml del matraz para medida de la absorbancia:
Tiempo (h) 0 1 2 3 4 5 6 Absorbancia 0,11 0,25 0,47 1,01 1,03 1,10 1,05

Cul es la densidad del cultivo cuando entra en fase estacionaria? Cul es el peso seco del cultivo cuando entra en fase estacionaria? 4.14. Teniendo estos datos referidos a un cultivo bacteriano, calcular , g y cosecha mxima
Tiempo (h) Clulas/ml Tiempo (h) 0 1 2 3 1000000 1100000 1600000 2620000 4 5 6 7 Clulas/ml 3650000 6080000 9900000 18000000 Tiempo (h) Clulas/ml 8 9 10 11 28100000 39100000 70100000 102000000 Tiempo (h) 12 14 Clulas/ml 121000000 105000000

Tras calcular , g y cosecha mxima y, sabiendo que la concentracin de sustrato inicial es de 5 mg S/ml y se agota durante el crecimiento, calcular el rendimiento.

Cuando nos piden calcular max, podemos hacerlo a partir de la representacin grfica de los valores de obtenidos cuando el microorganismo crece con diferentes concentraciones de sustrato, si bien, podemos obtener este valor a partir de la recta que la relaciona 1/ vs 1/S .

max

max S Ks + S

Ks

[S]

1/ 1 = Ks/max 1/max 1/[S] Para calcular el rendimiento (Y), debemos obtener en primer lugar los valores de M (cosecha mxima) para cada curva realizada con una concentracin determinada de sustrato y obtener la recta que relaciona M vs S (concentracin de sustrato). Y ser la pendiente de esa recta. max 1 + max S Ks 1

M=YS+b M

Pendiente = Y

4.15. Se pretende obtener biomasa a partir de Candida utilis. El sustrato que se utilizar en la produccin industrial es suero de leche (concentracin de lactosa en el suero, 4%). Previamente, para establecer las condiciones adecuadas, se realizan cultivos discontinuos con 10 concentraciones distintas de lactosa, obtenindose los siguientes datos:
Concentracin de lactosa (g/l) 1 2 4 6 8 (1/h) 0,083 0,143 0,221 0,273 0,310 Concentracin de lactosa (g/l) 10 12 14 16 20 (1/h) 0,332 0,351 0,367 0,366 0,368

Calcule: La constante de saturacin del microorganismo para ese sustrato y la velocidad especfica de crecimiento mxima. Al representar la cosecha mxima (mg clulas/ml) obtenidas en cada cultivo discontinuo frente a la concentracin de lactosa (mg lactosa/ml) se obtuvo la siguiente recta: y = 0,0383 + 0,409 x (r = 0,999). Cul es el rendimiento de Candida utilis? y Cul ser la cosecha obtenida usando como sustrato el suero de leche?

Bibliografia
Madigan, M.T., J.M. Martinko, D.A. Stahl, D.P. Clark. 2012. Brock Biology of Microorganisms, 13 ed. Benjamin Cummings. Willey, J.M., L.M. Sherwood, C.J. Woolverton. 2011. Prescott's Microbiology Companion Site, 8 ed. McGraw-Hill Ryerson Ltd.

PROPUESTAS DE RESOLUCIN
4.1. N0 = 104 UFC/ml, g = 2 h, cuntas clulas cultivables tendremos al cabo de 4, 24 y 48 h de cultivo? log N - log N0= /2,303 /2,303 . (t(t-t0) log N = [ [ /2,303 /2,303 . (t(t-t0)] + log N0 4 h: h: 24 h: h: 48 h: h: log N = [0,3465 [0,3465 /2,303 /2,303 . (4)] + 4 log N = [0,3465 [0,3465 /2,303 /2,303 . (24)] + 4 log N = [0,3465 [0,3465 /2,303 /2,303 . (48)] 48)] + 4 y y g = 0,693/ = 0,693/g 0,693/g

= 0,3465 h-1

N = 3,99 104 UFC/ml N = 4,09 10 107 UFC/ml N = 1,67 1011 UFC/ml

4.2. = 0,01 min-1g? K? g = 0,693/ g = 69,3 min = 1,155 h

K = 1/g

K = 0,8685 h-1

4.3. N = 108 clulas/ml, t = 3 h, g = 30 min.N0? log N - log N0= /2,303 /2,303 . (t(t-t0) log N - [ [ /2,303 /2,303 . (t(t-t0)] = log N0 y y g = 0,693/ = 0,693/g 0,693/g

= 1,386 h-1

N = 1,56 106 clulas/ml clulas/ml

4.4. N0 = 104 clulas/ml, N = 108 clulas/ml, g = 30 min.t? log N - log N0= /2,303 /2,303 . (t(t-t0) y t = 3,323 h g = 0,693/

4.5. N0 = 10.000 clulas/ml, N = 100.000.000 clulas/ml, t = 4 h.? g? = 2,303 h-1 g = 0,3 h

4.6. N0 = 46 clulas, g = 1,5 h, fase lag = 1,5 h Clulas trs 10 h? t = 10 h 1,5 h = 8,5 h log N - log N0= /2,303 y = 0,693/g = 0,462 h/2,303 . (t(t-t0) h -1 log N = [ [ /2,303 /2,303 . (t(t-t0)] + log N0 = [0,462/2,303 [0,462/2,303 (8,5)] + 1,663 = 3,368 2,33 103 Propionibacterium acnes

4.7. Salmonella spp., N0 = 25 clulas, g = 0,5 h, fase lag = 3 h. S. enterica, N0 = 32 clulas, = 0,17 h-1, fase lag = 5 h Clulas de Salmonella (Salmonella spp. + S. entrica) trs 10 h?

Salmonella spp. Fase lag (h) (h-1) g (h) N0 (clulas) (clulas) Tiempo de crecimiento (h) (h) N (clulas) (clulas) N (Salmonella) 3 1,386 0,50 25 7 3,98 105

Salmonella enterica 5 O,170 4,08 32 5 74,8

(Salmonella spp. + S. enterica) 3,98 105

4.8. Tras 24 h despus del vertido densidad por ml?

E. coli Aguas residuales: clulas/100 ml Vertido: clulas/100 ml (h-1) g (h) Tiempo Tiempo de crecimiento (h) N (clulas/100 (clulas/100 ml) N (clulas/ml) (clulas/ml) 7,8 1010 7,8 107 0,231 3 24 1,99 1010

Enterococcus 6,2 109 6,2 106 0,11 6,3 24 8,71 107

1,99 108

8,71 105

4.9. Rendimiento? Solucin de glucosa = 10 % (p/v) = 10 g/100 ml = 100 g/l Biomasa = 20 g/l l Y = Biomasa producida/Glucosa consumida 20 g clulas/l = 0,2 g clulas/g glucosa 100 g glucosa/l

4.10. Que especie crece ms rpido?

Especie A Tiempo (h) 4 5 6 7 8 (h-1) g (h) Log N 4,64 4,81 4,98 5,15 5,32 0,3915 1,77

Especie Especie B Tiempo (h) 3 4 5 6 7 (h-1) g (h) Log N 5,30 5,44 5,58 5,72 5,86 0,3224 2,15

Especie C Tiempo (h) 5 6 7 8 9 (h-1) g (h) Log N 6,22 6,37 6,52 6,67 6,82 0,3455 2,01 2,01

4.11. En que mdio de cultivo crece mejor?

Medio A Tiempo (horas) (horas) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Fase lag (h) (h-1) g (h) M (clulas/ml) Clulas/ml 2,09 106 2,04 106 1,99 106 2,63 106 3,47 106 4,68 106 6,17 106 7,94 106 8,32 106 8,51 106 8,33 106 8,13 106 3 0,2809 2,47 6,28 106 Ln clulas/ml 14,55 14,53 14,50 14,78 15,06 15,36 15,64 15,89 15,93 15,96 15,94 15,91 2,29 105 2,24 105 2,25 105 2,19 105 2,23 105 3,16 105 4,47 105 6,46 105 9,33 105 1,32 106 1,29 106 1,26 106

Medio B Clulas/ml Ln clulas/ml 12,34 12,32 12,32 12,30 12,31 12,66 13,01 13,38 13,75 14,09 14,07 14,05 5 0,3583 1,93 1,07 106 Fase exponencial

4.12. Ln N clulas/ml = 20,688 Ab s + 15,387, r = 0,97. Densidad del cultivo en fase estacionaria? Tiempo (h) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Absorbancia 0,0022 0,0021 0,0088 0,0192 0,0315 0,0506 0,1108 0,1643 0,1905 0,2732 0,2603 0,2611 Ln clulas/ml 15,43 15,43 15,57 15,78 16,04 16,43 17,68 18,79 19,33 21,04 2077 20,79 Clulas/ml 5,03 106 5,03 106 5,78 106 7,13 106 9,25 106 1,37 107 4,77 107 1,45 108 2,48 108

Fase estacionaria

1,37 109
1,05 109 1,07 109

Media fase estacionaria

1,16 109

4.13. Densidad del cultivo en fase estacionaria? Peso seco del cultivo en fase estacionaria? Absorbancia 0,203 0,076 0,079 0,325 0,11 0,095 0,47 0,237 0,865 0,68 Densidad Densidad celular (x105cel/ml) 15,43 7,08 7,18 28,80 10,90 5,33 47,00 24,90 87,50 68,00 Peso seco (mg/ml) 0,06 0,02 0,02 0,08 0,038 0,035 0,169 0,06 0,40 0,25

Ln N clulas/ml = 3,391 Abs Abs + 13,433 Peso seco/ml = 0,444 Abs 0,026 Tiempo (h) 0 1 2 3 4 5 6 Absorbancia 0,11 0,25 0,47 1,01 1,03 1,10 1,05 Ln clulas/ml 13,81 14,28 15,03 16,86 16,93 17,16 16,99 Clulas/ml 9,95 105 1,59 106 3,37 106 2,10 107 2,25107 2,84 107 2,39107 2,395 107 Peso seco/ml 0,023 0,085 0,183 0,423 0,431 0,463 0,440 0,439

Fase estacionaria

Media Fase estacionaria

4.14. , g y cosecha mxima? Tiempo (h) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 Clulas/ml 1000000 1100000 1600000 2620000 3650000 6080000 9900000 18000000 28100000 39100000 70100000 102000000 121000000 105000000 Ln clulas/ml 13,816 13,911 14,286 Fase exponencial 14,779 15,11 15,621 16,108 16,706 17,151 17,482 18,065 18,44 18,611 18,469

18,5 18 17,5

y = 0,47x + 13,4 r2 =0,997

Ln clulas/ml

17 16,5 16 15,5 15 14,5 14 13,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

= 0,47 h-1 g = 1,47 h Cosecha = 1,21 108 1 106 = 1,20 108 cel/ ml
1,20108 clulas/ clulas/ ml Y= 5 mg/ml
Tiempo (h)

=2,4 clulas/mg sustrato

4.15. Constante de saturacin para la lactosa? Concentracin de lactosa (g/l) 1 2 4 6 8 10 12 14 16 20 (1/h) 0,083 0,143 0,221 0,273 0,310 0,332 0,351 0,367 0,366 0,368 1/ lactosa (l/g) 1 0,5 0,25 0,166666667 0,125 0,1 0,083333333 0,071428571 0,0625 0,05 1/ (h) 12,0481928 6,99300699 4,52488688 3,66300366 3,22580645 3,01204819 2,84900285 2,72479564 2,73224044 2,7173913

1/ = 9,9646 1/S + 2,0486

R = 0,9994

max = 1/2,0486 = 0,4881 h-1 Ks = 9,9646 max = 4,864 g/l mg clulas/ml = 0,0383 + 0,409 mg lactosa/ml (r = 0,999) Y = 0,409 mg clulas/mg lactosa Lactosa en suero de leche = 4 % = 4 g/100 ml = 40 mg/ml Msuero de leche = 16,4 mg clulas/ml