Lucrarea nr.

1 Msurarea concentraiei de glucoz din snge

Introducere Sangele uman are o structura extrem de complexa, continand numeroase substante organice (proteine, grasimi, glucoza, enzime, hormoni, vitamine) si substante minerale (calciu, fosfor, sodiu, potasiu, etc). Analizele biochimice cerceteaza compozitia chimica fie a sangelui total, fie numai a serului sau plasmei sanguine. Glucoza este una din componentele sngelul uman alturi de alte zaharuri: fructoza i lactoza. Glucoza este cea mai importanta zaharida care se gaseste in mod normal in organele si sangele omului si constituie combustibilul cel mai pretios pentru obtinerea energiei necesare activitatii omului. Din arderea unui gram de glucoza, de catre organism, rezulta 4 calorii. Glucoza in organism provine din alimentele consumate de catre om. Cele mai bogate alimente in glucoza sunt dulciurile (zaharul, produsele zaharoase, mierea), precum si alimentele care contin amidon (faina de cereale si produsele cerealifere, cartofii etc.) care in organism se transforma prin actiunea enzimelor hidrolitice in glucoza. Organismul poate fabrica zahar din orice nutriment, chiar din proteine si grasimi prin procesul de gluconeogeneza. Pentru aprecierea cantitatii de zahar din organism, in laborator se analizeaza zaharul din sangele total ori din ser sau plasma. Valori normale ale glucozei din sange: 85-110 mg la 100 ml sange. La persoanele de peste 40-50 ani, valorile medii ale glicemiei sunt mai crescute decat la tineri, deoarece la ele si consumul de glucoza in organism este mai redus. Scaderea sau cresterea glicemiei in afara acestor valori produce perturbari grave organismului. Astfel, scaderea glicemiei prea mult sub valorile normale (hipoglicemie) poate produce ca simptome slabiciune, tremuraturi, transpiratii si chiar pierderea constientei (coma hipoglicemica). Acest lucru se intampla cand organismul este subalimentat cu alimente ce contin glucoza (glucide) sau in caz de infometare (inanitie). Eforturile fizice mari, mai ales pe munte, care consuma rezervele de glucide din ficat (in special la bolnavii de ficat) pot predispune la hipoglicemie. Hipoglicemia se intalneste mai rar in bolile unor glande endocrine care secreta hormoni insuficienti (hipofiza, tiroida, suprarenale), precum si la bolavii de diabet care se trateaza cu doze prea mari de insulina sau alte medicamente antidiabetice. Cresterea glicemiei (hiperglicemie) se intalneste si la persoanele sanatoase daca analiza sangelui se face dupa un consum crescut de dulciuri. De asemenea, persoanele care au avut un traumatism fizic sau psihic (stres) sau care s-au tratat cu anumite medicamente, pot avea o glicemie crescuta, fara a fi bolnavi de diabet. In aceste situatii glicemia revine la normal dupa ce a disparut si cauza care i-a provocat cresterea. O glicemie marita se intalneste in bolile glandelor endocrine care au rolul de a regla concentratia glucozei in sange. Astfel, secretia in exces a hormonilor unor glande (hiopofiza, tiroida, suprarenalele) produce hiperglicemie. Dar cea mai mare crestere a glicemiei se intalneste in diabetul zaharat sau diabetul pancreatic. Pancreasul este o glanda mixta, cu secretie endocrina de insulina si exocrina de enzime digestive ce se elimina in duoden. Insulina este un hormon ce are rolul de a ajuta la consumul si la arderea glucozei din sange si celule (insulina ajut la transportul zahrului spre celule). In unele boli ale pancreasului acesta secreta mai putina insulina sau nu mai secreta deloc si din aceasta cauza glucoza, in loc sa se consume, sa se arda, se acumuleaza in sange, crescand glicemia. Astfel, glicemia poate ajunge la 200-300 mg% si chiar mai mult, ceea ce

duce la coma diabetica (coma hiperglicemica) mai ales la acele persoane care nu stiu ca au diabet. In afara de modificarile valorilor glucozei, in diabet sunt perturbate si alte componente ale sangelui. Astfel ca si in cazul subnutritiei, pentru a face fata cheltuielilor de energie organismul recurge la rezervele de grasime, pe care le mobilizeaza din depozite si le trece in sange spre a le utiliza in locul glucozei. De aceea, sangele diabeticilor este gras, laptos si analiza arata valori crescute ale grasimilor totale si ale colesterolului sanguin. Dar acest efort al organismului de a suplini prin grasimi lipsa glucozei este sortit esecului caci grasimile nu se ard pentru a da energia necesara decat in prezenta zaharului, a glucozei. Se spune ca grasimile ard in flacara produsa de glucoza drept urmare grasimile sunt arse incomplet rezultand substante toxice pentru organism (corpi cetonici, acetona). Prezenta acestor substante in sangele si urina unei persoane arata aproape sigur ca este vorba de un diabet grav, nedescoperit sau netratat corect. Intoxicatia organismului cu acetona si alte substante cetonice poate duce la coma diabetica. De notat ca acetona din sange creste asa de mult incat se elimina pe cale respiratorie, astfel ca aerul expirat de un bolnav de diabet in aceasta faza sau de un bolnav in coma diabetica miroase a acetona sau a mere coapte. In aceasta situatie analiza corpilor cetonici din sange si urina are o mare importanta pentru diagnosticul de diabet. In diabetul grav, pentru a face rost de glucoza organismul mobilizeaza nu numai grasimile ci si proteinele corpului. Din aceasta cauza, cu toate ca manaca mult diabeticul slabeste, caci isi consuma propriile lui proteine (diabetul cu slabire). Drept urmare, cresc si deseurile proteinice din sange: acidul uric, ureea, creatinina. Datorita iritatiei cronice a rinichiului de catre glucoza crescuta ce ajunge la acel nivel, se produce alterarea filtrului renal, care lasa sa treaca albumina din sange in urina (albuminurie). n esen, diabetul este o boal n care corpul uman nu produce suficient insulin. Exist dou tipuri majore de diabet: diabet tipul I si tipul II. Diabetul de tipul I apare atunci cnd corpul nu mai produce deloc insulin, iar diabetul de tipul II apare atunci cnd corpul nu mai produce suficient insulin, combinat cu scderea nuvelului de insulin din corp. Diabetul de tipul II afecteaz 90% din bolnavii de diabet. Cauzele apariiei diabetului sunt nc necunoscute. Se tie doar c un rol esenial n apariia lui l au: cauze de natur genetic, obezitatea, lipsa de exerciii fizice. n momentul de fa diabetul nu poate fi vindecat, singura soluie fiind administrarea de medicamente pe toat durata vieii pacientului. Tratamentul const n msurarea nivelului glicemiei n snge i administrarea unei doze de insulin combinate cu o alimentaie srac n glucide i exerciii fizice. Potrivit datelor de la Organizaia Mondial a Sntii, n jur de 1.200.000 de persoane sunt bolnave de diabet de tip 2, n Romnia Cea mai simpl i popular metod de msurare a nuvelului glicemiei n snge o reprezint glucometrele portabile. Acestea sunt de dimensiuni din ce n ce mai mici, alimentate la baterii i necesit cantiti infime de snge pentru a determina nivelul de glicemie din corp. Exist mai multe metode de determinare a concentraiei de glucoz din snge: - amperometrice - optice Metod de msurare amperometric a glicemiei. Metoda cea mai folosit pentru determinarea nivelului de glucoz din ntreg sistemul sangvin este metoda amperometric. Ea presupune recoltarea unei cantiti de snge venos de la pacient. Senzorul de glucoz este un strip (bandelet) de diagnoz electrochimic care folosete o enzim numit oxidaza glucozei i trei electrozi. Doi dintre electrozi sunt electrozii de lucru ei fiind electrozii de msur, iar cel de-al treile electrod fiind electrodul de

referin. Impedana ridicat a electrozilor i face s fie adecvai msurtorilor de tip amperometric. Msurarea se face n felul urmtor: stripul (bandeleta) se introduce n instrumentul de msur, iar instrumentul de msur aplic un curent de 1A ntre electrozii de lucru i electrodul de referin. Diferenele sunt monitorizate constant de ctre alaratul de msur. Enzima depus pe strip este plasat ntr-o arie numit zona de reacie. Atunci cnd o pictur de snge este aplicat corect pe aceast zon, enzima mpreun cu substratul mediator transfer electroni spre electrozi. Aceasta umple golul dintre electrozi i are loc o scdere rapid a tensiunii dintre electrozi. Atunci cnd tensiunea scade sub un nivel predeterminat, se iniiaz procesul de msurare. n faza a doua, o tensiune constant de 300mV este aplicat strip-ului i se msoar rspunsul electric pe o durat de timp predeterminat. Dac exist o diferen de 10% ntre cei doi electrozi de lucru se genereaz o eroare. n acest caz pictura de snge a fost prea mic i electrozii nu au fost acoperii cu cantitatea de snge necesar realizrii unei msurtori corecte. Este necesar fie adugarea unei noi picturi de snge, fie repetarea msurtorii cu un nou strip. Curentul care circul ntre electrozi (la o aplicare corect a picturii de snge) este proporional cu nivelul de glucoz din snge. Determinarea nivelului de glucoz se face comparnd curentul care circul prin electrozii de lucru cu curentul determinat n prima etap (nainte de plasarea picturii de snge pe strip). Relaia curent-concentraie de glucoz devine liniar dup 3 secunde de la iniierea msurtorii. Pentru obinerea unor valori corecte, sunt necesare cam 5 secunde.

Fig. 1. Strip conductiv pentru msurarea glicemiei Pentru a asigura corecta msurare a nivelului de glucoz din snge, glucometrele au nevoie de o calibrare (pentru a compensa erorile i offset-urile diverselor componente implicate n procesul de msurare). Calibrarea se face prin trecerea instrumentului de msur n modul calibrare i plasarea unei picturi dintr-o soluie de glucoz co o concentraie de 100mg/dl pe strip-ul de test. Instrumentul realizeaz msurtoarea ca i cum ar fi o pictur de snge e strip, doar c n loc s afieze rezultatul, l folosete pentru a realiza o calibrare intern a algoritmului de msurare.

Metode optice de msurare a glicemiei a. Metoda spectrofotometric folosind transmisia luminii (neinvaziv) Pentru determinarea optic a concentraiei de glucoz se folosete un circuit format dintr-o diod LED i mai multe fotocelule (acordate pe diferite lungimi de und). Fotocelulele sunt conectate le un circuit de amplificare i apoi la convertorul A/D ale unui microcontroller, formnd un spectrofotometru. Senzorul (ce cuprinde led-ul i fotodiodele) este plasat pe lobul urechii pacientului. LED-ul ilumineaz esutul cu lumin n spectrul infrarou (2-2.5m). Radiaia infraroie trece prin esut unde este absorbit de diversele componente ale acestuia (piele, cartilagii, snge, fluid interstiial), fiecare avnd un spectru de absorbie specific. Trei vrfuri importante se pot observa (Fig. 2) la 2.12 m, 2.27 m i 2.32 m.

Fig. 2. Spectrul de absorbie al glucozei Folosind curbe de calibrare determinate pe baza cunoaterii concentraiilor de glucoz i a altor componente se poate determina concentraia de glucoz pe baza absorbanei esutului. Spectrul de absorbie al glucozei este extras din spectrul de mai sus aplicnd o curb de calibrare ca n figura 3.

Fig. 3. Spectru de calibrare al glucozei

Pentru a realiza msurarea nivelului glicemiei dein snge se plaseaz senzorul pe lobul urechii i se msoar spectrul de absorbie. Celulele fotodetectoare au amplasate n fa nite filtre pe lungimile de und de 2.12 m, 2.27 m, i 2.32 m. Fotocelulele vor nregistra nivelurile de absorbie i vor face o medie pentru a elimina din msurtoare curgerea sngelui prin esuturi. Semnalul este apoi procesat de microcontroller, acesta indicnd concentraia de glucoz din snge.

Fig. 4. Spectrul de absorbie al pielii Exist muli factori care pot infuena msurarea glicemiei prin metoda spectroscopic, printre care se numr i componentele sngelui cu spectre de absorbie apropiate de cele ale glucozei.

Fig. 5. Spectrele de absorbie ale diverselor componente sangvine

b. Metoda reflectometric (invaziv) n esen metoda este tot una spectrofotometric, dar se bazeaz pe reflexia luminii, nu pe transmiterea ei. Schema este prezentat n figura 6. Sursa de lumin a sistemului de msurare este o diod LED de intensitate mare. Pentru a genera 2 lungimi de und diferite, se folosesc 2 diode LED. Lumina celor dou diode LED este proiectat pe un strip pe care a fost depus n prealabil un reactiv. Lumina reflectat de pe reactiv este preluat de un fotodetector a crui ieire (curent) va fi proporional cu lumina reflectat de reactiv. Timpul necesar citirii este de aproximativ 0.2 secunde. Semnalul preluat de la fotodetector este amplificat i convertit n semnal digital care va fi procesat cu ajutorul unui microcontroller.

Fig. 6. Schema bloc a unui instrument de msur a glicemiei prin reflexia luminii. Metoda de msurare este simpl: se aplic pe suprafaa strp-ului o pictur de snge. Strip-ul conine o membran hidrofil, reflectant i poroas. Pe lng acestea mai conine i un substrat format din enzima oxidaz a glucozei, peroxidaz i un colorant. Aceste componente reacioneaz cu glucoza formnd un colorant. Sistemul de msur determin n permanen reflectivitatea reactivilor pentru a detecta o cretere a acesteia. Pentru a elimina interferenele ce pot aprea (cauzate de prezena celorlalte elemente din snge (de ex. hematocritul)) se folosec dou lungimi de und diferite: 635nm i 700nm. nainte de aplicarea picturii de snge pe strip se realizeaz o prim msurtoare. Dup aplicarea picturii de snge se mai realizeaz mai multe msurtori la intervale de timp prestabilite i la lungimi de und diferite, rezultatele fiind comparate i procesate de ctre microcontroller. Indicele de reflexie al colorantului este direct proporional cu cantitatea de glucoz din snge. Pentru concentraii de glucoz sub 250mg/dl e nevoie de 20 de secunde pentru a se stabiliza reacia chimic, iar pentru concentraii de glucoz peste 450mg/dl e nevoie de 30 de secunde. Partea practic: - pentru un strip de tipul conductiv se msoar rezistena dintre electrodul de referin i electrozii de lucru n cazul n care nu s-a aplicat nici o pictur de substan pe el, n cazul n care s-a aplicat o soluie de 100mg/dl, i n cazul aplicrii unei soluii de 200mg/dl. Se msoar conductivitatea n toate cele 3 cazuri. - Pentru un strip de tipul reflectiv se urmrete procesul de formare a colorantului n cazul aplicrii unei soluii de glucoz 100mg/dl i n cazul unei soluii de glucoz cu o concentraie de 200mg/dl. Cu ajutorul unui laser cu lungimea de und de 633 nm i a unui indicator de intensitate luminoas se determin reflectivitatea stripului.