Manual Espermiograma - PDF 2

Manual de laboratorio para el analisis del semen
Manual analtico y te cnico de ayuda al diagnostico de la esterilidad y subfertilidad de origen masculino y preparacio n del semen para las te cnicas de reproduccio n asistida
M Jos Lpez Garca, Aurora Urbano Felices, Marta Crdenas Povedano Revisado por: Javier M Gutirrez Romero, Iratxe Lpez Pelayo
1 edicin 2012 OmniaScience (Omnia Publisher SL) www.omniascience.com
DOI: http://dx.doi.org/10.3926/oss.5 ISBN versin on-line: 978-84-695-4746-5 ISBN versin impresa: 978-84-940234-8-4 DL: B-26402-2012 Diseo portada y contraportada: OmniaScience Fotografa portada: Joshua Resnick - Fotolia.com
ndice
NDICE NDICE DE TABLAS NDICE DE ILUSTRACIONES PRESENTACIN CAPTULO 1 BIOLOGA DEL SEMEN 1.1 Anatoma 1.2 Citologa
1.2.1. El espermatozoide
1.3
Fisiologa
La eyaculacin Movilidad del espermatozoide Capacitacin del espermatozoide Espermatogenesis Regulacin de la funcin gonadal testicular Esterilidad de la pareja
1.3.1. 1.3.2. 1.3.3. 1.3.4. 1.3.5.
1.4
CAPTULO 2
Patologa
1.4.1.
PREANALTICA 2.1 Factores que afectan a la calidad de la muestra 2.2 Recogida de las muestras 2.3 Recogidas especiales 2.4 Transporte 2.5 Recepcin 2.6 Conservacin: Criopreservacin CAPTULO 3 EVALUACIN INICIAL DEL SEMEN 3.1 Evaluacin inicial macroscpica 3.2 Evaluacin inicial microscpica
CAPTULO 4 ESTUDIO BSICO DEL ESPERMIOGRAMA Recuento 4.1

4.1.1. Criptozoospermias y azoospermias
4.2 4.3
Morfologa Vitalidad
Test de los colorantes supravitales Test hipoosmticos
4.3.1. 4.3.2.
4.4 4.5
Anticuerpos antiespermatozoides Otras clulas

Leucocitos Clulas de la espermatognesis inmaduras
4.5.1. 4.5.2.
CAPTULO 5 PRUEBAS ANALTICO-CLNICAS DE SEGUNDA INTENCIN 5.1 Caracteres funcionales de los espermatozoides
5.1.1. 5.1.2. 5.1.3. 5.1.4. 5.1.5. 5.1.6. Prueba de interaccin moco cervical-esperma Anlisis del movimiento de los espermatozoides asistido por ordenador (C.A.S.A.) Estudio de la reaccin acrosmica Prueba de fecundidad heteroespecfica Pruebas para explorar la calidad del ncleo espermtico Estudio por microcopia electrnica de los espermatozoides Eleccin de los marcadores bioqumicos Determinacin de marcadores bioqumicos Expresin de los resultados Cariotipo y anomalas cromosmicas Determinaciones hormonales
5.2
Bioqumica seminal
5.2.1. 5.2.2. 5.2.3.
5.3
Estudios complementarios en sangre
5.3.1. 5.3.2.
CAPTULO 6 ESTUDIO DEL SEMEN EN VASECTOMAS Y VASOVASOSTOMAS 6.1 Semen de postvasectoma

6.1.1. 6.1.2. 6.1.3. Anlisis en fresco Anlisis sedimento Expresin de los resultados
6.2 6.3
Semen de prevasovasostoma Semen posvasovasostoma

Resultados del semen pre y posvasovasostoma
6.3.1.
CAPTULO 7 CAPACITACIN DEL SEMEN Campo de aplicacin 7.1 7.2 Objetivos de las tcnicas de preparacin de semen 7.3 Tipo de muestra
7.3.1. 7.3.2. Semen fresco Semen congelado
7.4 7.5
Materiales y medios necesarios Mtodos de preparacin del semen

Mtodo de lavado Migracin Gradientes de densidad Mtodo de filtrado
7.5.1. 7.5.2. 7.5.3. 7.5.4.
7.6 7.7 CAPTULO 8
Valoracin de los resultados Conclusiones
INFORME DEL LABORATORIO 8.1 Resultados 8.2 Valores de referencia 8.3 Comentarios CAPTULO 9 BIBLIOGRAFA SOBRE LOS AUTORES DEL LIBRO SOBRE LOS REVISORES DEL LIBRO
ndice de tablas
Tabla 1. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen Tabla 2. Clculo de la profundidad de campo para el estudio microscpico Tabla 3. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de 200 spz (400 spz) Tabla 4. Clculo de la dilucin necesaria segn el recuento estimado Tabla 5. Clculo del volumen de cada unidad de rejilla Tabla 6. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de 200 spz (400 spz) Tabla 7. Origen glandular de los parmetros bioqumicos del plasma seminal Tabla 8. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudio de fertilidad. Espermiograma Tabla 9. Procedimiento de laboratorio para el anlisis del semen en intervenciones quirrgicas Tabla 10. Ventajas de los mtodos de capacitacin ms empleados Tabla 11. Procedimiento de laboratorio para la capacitacin del semen Tabla 12. Valores y lmites de referencia Tabla 13. Nomenclatura de la calidad del esperma
ndice de ilustraciones
Ilustracin 1. Diferentes partes y grados de aglutinacin entre los espermatozoides Ilustracin 2. Tipos de movilidad de los espermatozoides Ilustracin 3. Procedimiento para facilitar el contaje de la movilidad Ilustracin 4. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos porcentajes Ilustracin 5. Detalles de la cmara Neubauer improved Ilustracin 6. Ejemplo de recuento en cmara Neubauer improved Ilustracin 7. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos recuentos Ilustracin 8. Tcnica para realizar una extensin de semen Ilustracin 9. Clasificacin de los defectos morfolgicos de los espermatozoides Ilustracin 10. Ejemplo del test de vitalidad con Eosina/Nigrosina Ilustracin 11. Ejemplo del test de vitalidad con Sol. hiposmtica Ilustracin 12. Parmetros de la trayectoria del espermatozoide, medidos por ordenador Ilustracin 13. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la L-carnitina en plasma seminal Ilustracin 14. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la fructosa en plasma seminal Ilustracin 15. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin del citrato en plasma seminal Ilustracin 16. Esquemas grficos de los principales mtodos de capacitacin para recuperacin de espermatozoides mviles Ilustracin 17. Algoritmo diagnstico de la azoospermia
Presentacin
Presentacin
El problema de la esterilidad e infertilidad en las parejas hoy da est poniendo en riesgo la capacidad de reemplazo generacional en Europa. Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), alrededor del 10 al 15% de las parejas en edad de procrear consultan al mdico por problemas de esterilidad, habitualmente despus de unos dos aos de no lograr concebir; de hecho, se calcula que hay alrededor de 60-80 millones de parejas estriles en el mundo. Es por ello que la demanda de evaluacin y tratamiento por esterilidad e infertilidad ha aumentado drsticamente. Por otra parte, ante la dificultad de comparar resultados entre distintos laboratorios y los resultados dispares de diferentes estudios, la OMS ha editado en 2010 el 5 Manual de laboratorio para el examen y procesamiento del semen humano, para unificar criterios y establecer los lmites inferiores de referencia de nuestra era. El objetivo de este manual es actualizar los conocimientos y adiestrar en los procedimientos para evaluar la calidad del semen y capacitarlo, con el fin ltimo de ayudar al diagnstico de la subfertilidad y esterilidad de origen masculino (casual o provocada por vasectoma) y al tratamiento de la pareja mediante la preparacin del semen para las tcnicas de reproduccin asistida. Va dirigido al personal en formacin y a profesionales del mbito sanitario, principalmente del laboratorio (tcnicos y analistas) pero tambin a los clnicos prescriptores (urlogos y gineclogos). Para la elaboracin del manual nuestro grupo de trabajo ha realizado una revisin completa y actualizada del anlisis y preparacin del semen sobre la que se han desarrollado unos Procedimientos de Laboratorio de forma detallada y esquematizada, de cada uno de los pasos del proceso analtico: recepcin de muestras, anlisis del semen, capacitacin e informe de laboratorio.
Julio 2012
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Captulo 1
Biologa del semen

1.1
Anatoma
El aparato reproductor masculino est formado por varios rganos que segn su funcin se podran clasificar en cuatro grupos: o Dos testculos: tienen una doble funcin, por una parte producen los espermatozoides mediante un proceso llamado espermatognesis y por otra ejercen una importante regulacin endocrina, tanto a nivel reproductor como sobre otros rganos y funciones de nuestro cuerpo. Las vas seminales, que tambin son dobles hasta su conexin con la prstata: transportan los espermatozoides a lo largo del sistema reproductor. Las glndulas accesorias: aportan una serie de sustancias vitales para la funcin reproductora porque forman el lquido seminal, y adems tienen una funcin nutritiva o reguladora. El pene: deposita el semen en la vagina.
o o
Biologa del Semen
Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustracin 20) http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#sistema_masculino http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_01a.jpg
A) Testculos Los testculos se hallan en la regin perineal, tras la base del pene, en el interior de la bolsa escrotal. El escroto no tiene grasa y sus msculos reaccionan al calor extendiendo o contrayendo la piel. Las dos gnadas (testculos) no ocupan el mismo nivel, ya que en la mayora de los hombres el testculo izquierdo baja un poco ms que el derecho. o Estn suspendidos de su extremo inferior por el cordn espermtico y estn desprovistos de adherencias en la mayor parte de su superficie exterior, por lo que resultan mviles en todos los sentidos, pudiendo contraerse y ascender hacia el anillo inguinal. El escroto y el hecho de que estn alojados fuera del abdomen, hacen que se mantenga la temperatura unos dos grados centgrados por debajo de la temperatura corporal. Esto ser de vital importancia para el mantenimiento de la espermatognesis.
El testculo y el epiddimo estn envueltos por la tnica albugnea, que es una capa fibrosa de tejido conjuntivo blanco, denso y elstico. Los conductos o tbulos seminferos son los conductos productores de los espermatozoides. Se encuentran dentro de los lobulillos testiculares (hay entre 200 y 300 por testculo) formados por los septos testiculares, que parten desde la tnica albugnea y se unen en el mediastinum testis. Cada lobulillo contiene de 1-4 tbulos seminferos productores de espermatozoides. Los tbulos seminferos desembocan a travs de los tbulos rectos en las cavidades denominadas rete testis en el mediastinum testis. En cuanto a la vascularizacin, los testculos estn irrigados por las arterias espermticas (la arteria deferencial y la arteria funicular). Del drenaje sanguneo estn encargadas las venas espermticas y cuando se obstruyen producen el varicocele. A partir de la pubertad, los tbulos seminferos, desarrollan una pared gruesa y compleja llamada epitelio germinal, compuesta por dos tipos de clulas: o Las clulas germinales, que proliferan y se diferencian en espermatozoides.
Las clulas de Sertoli, que sostienen a las clulas germinales e intervienen en su nutricin.
Una lmina basal separa el epitelio seminfero del intersticio gonadal. El intersticio gonadal est formado por tejido conjuntivo, tejido linftico, por capilares sanguneos y por clulas de Leydig productoras de testosterona. Las clulas de Sertoli se caracterizan por: o o o o o o Se extienden radialmente hacia la luz tubular; su citoplasma emite prolongaciones que rodean las clulas germinales. Forman la barrera hematotesticular. Protegen las clulas germinales y las nutren. Proporcionan apoyo mecnico para las clulas germinales. Eliminan clulas espermticas degeneradas. Sintetizan protenas relacionadas con la funcin reproductora.
Las clulas germinales tienen distinto grado de diferenciacin dependiendo de la zona del epitelio germinal en donde se localicen: o o En la zona basal, estn las espermatogonias y espermatocitos primarios. En la zona adluminal se diferencian hacia espermatocitos secundarios y espermtides.
La barrera hematotesticular: o o Est formada por las clulas de Sertoli a travs de complejos de unin. Acta de barrera entre la luz del tubo y el espacio intersticial. Esta barrera es dinmica, permite la migracin de espermatocitos de la zona basal a la adluminal, y es infranqueable por clulas perteneciente al sistema inmunitario como son los linfocitos. Las espermatogonias y espermatocitos primarios se encuentran en la zona basal, por fuera de la barrera. Los espermatocitos secundarios y espermtides se encuentran en el compartimento adluminal, dentro de la barrera. La barrera asla el espermatozoide, para que no sea reconocido como propio por el sistema inmune.
o o o
La termorregulacin se consigue mediante los siguientes mecanismos: o o La presencia de receptores de la temperatura en la piel del escroto activan grandes glndulas sudorparas adrenrgicas. Hay una actuacin muscular que regula la cercana de los testculos al cuerpo.
Biologa del Semen
Por ltimo hay una regulacin sangunea, de forma que la sangre arterial que entra en los testculos se enfra por la sangre venosa que sale de ellos.
Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustraciones de la 1 a la 10) http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_02.jpg http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_04.jpg
B) Vas seminales Las vas seminales estn constituidas por: tubos rectos, rete testis, conductos eferentes, epiddimo, conductos deferentes, ampolla deferencial y el conducto eyaculador. Los extremos terminales de los tbulos seminferos, revestidos slo por clulas de Sertoli, se estrechan y forman los tubos rectos, los cuales unen el tbulo seminfero con la rete testis. La rete testis es una red de delicados tbulos, situado en el hilio del testculo, mediastino testicular, que lleva los espermatozoides desde los tbulos seminferos a los vasos eferentes. En la rete testis el lquido seminal se reabsorbe, concentrando los espermatozoides. Los conductos eferentes unen la rete testis con la cabeza del epiddimo. La luz de los tubos se reviste de dos tipos celulares: o o Clulas ciliadas, altas: arrastran el contenido celular en direccin al epiddimo. Clulas no ciliadas, bajas: realizan procesos de endocitosis.
El epiddimo es un conducto altamente contorneado, entre el testculo y vaso deferente. Tiene forma de media luna, y se divide en cabeza, cuerpo y cola. El epiddimo est tapizado por: o o Un epitelio pseudoestratificado que produce la absorcin de casi el 90% de lquido testicular. Por la musculatura lisa que produce movimientos peristlticos para transportar los espermatozoides.
Aparte de las funciones de transporte y servir de va, el epiddimo: o o Produce la maduracin de los espermatozoides y la concentracin de estos al reabsorber lquido. Esta absorcin se produce a nivel de la cabeza del epiddimo. Aumenta la movilidad de los espermatozoides a travs de la Protena de avance de movilidad.
o o
Acta almacenando los espermatozoides (unos 42 das). Destruye los espermatozoides tras larga abstinencia sexual. Por ejemplo en vasectomas.
La va seminal contina con los conductos deferentes. Estos ltimos transportarn el semen durante el coito desde la cola del epiddimo hasta la ampolla deferencial. La ampolla deferencial es una dilatacin del conducto deferente, que almacena espermatozoides durante el coito. Est situada antes del conducto eyaculador. El conducto eyaculador: o o o Perfora la prstata a nivel del veru montanum. La ltima porcin desemboca en la uretra. La normalidad es fundamental para una buena eyaculacin.
Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustraciones de la 22 a la 24) http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_03a.jpg C) Glndulas accesorias Las glndulas accesorias se refieren a: las vesculas seminales, la prstata, las glndulas bulbouretrales de Cowper y las glndulas uretrales de Littr. Vierten a las vas seminales el 80% del volumen del eyaculado. Contribuyen de esta forma muy decisivamente a la formacin del plasma seminal, cuya funcin es ser: medio nutritivo, vehculo de transporte y proteccin del tracto urinario. Las vesculas seminales estn situadas en la base de la prstata y unidas a ella por su extremo inferior. Cada una est asociada al deferente y al conducto eyaculador. El eyaculado que segregan se caracteriza por: o o o o Constituye entre el 50-70% del lquido seminal de un eyaculado. Forma parte de la segunda porcin del eyaculado. Es un lquido mucoide, viscoso y amarillento, de pH alcalino. Es rico en fructosa y otras sustancias nutritivas. Contiene otras sustancias como prostanglandinas y fibringeno.
La prstata est situada en la base de la vejiga, rodeando la primera porcin de la uretra. Su parnquima glandular constituye una glndula tubuloalveolar. El lquido prosttico nutre y protege al espermatozoide y se caracteriza por:
Biologa del Semen
o o o o
Constituye entre un 15 y un 30% del volumen final de ste. Forma parte de la primera porcin del eyaculado. Es un lquido opalescente, de pH 6.5. Es rico en cido ctrico, fosfatasas cidas, zinc, manganeso y calcio.
Las glndulas bulbouretrales o glndulas de Cowper: son glndulas del tamao de un guisante y situadas a ambos lados del bulbo uretral. Vierten de manera gradual a la uretra, ante la estimulacin ertica, actuando como lubricante de sta ante el paso del semen a gran velocidad. El lquido seminal que segregan es: o o Un lquido claro, viscoso y mucoide. Rico en galactosaminas, galactosa, cido oxlico y mucoprotenas.
Las glndulas uretrales de Littre estn situadas a lo largo de la uretra, vierten un fluido viscoso, que acta limpiando y lubricando la uretra, favoreciendo el paso de los espermatozoides. Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustraciones 21 y de la 25 a la 28) http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_09.jpg D) Pene El pene est formado por tres grandes cilindros de tejido erctil, rodeados por una vaina elstica. Cada cilindro se rellena de sangre durante la excitacin sexual. o o Los dos cilindros superiores, llamados cuerpos cavernosos, son los responsables de la rigidez e incremento de volumen y longitud durante la ereccin. El cilindro inferior, llamado cuerpo esponjoso, acaba en el glande. La uretra atraviesa el cuerpo esponjoso. Durante la ereccin se mantiene ms blando que los cuerpos cavernosos.
Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustraciones 29 y 30) http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_10.jpg
1.2
Citologa
1.2.1. El espermatozoide El espermatozoide maduro es una clula altamente diferenciada. Est formado por: o o o Cabeza, que contiene el ncleo y aporta la informacin gentica. Pieza intermedia, que contiene las mitocondrias, fuente de energa. Flagelo, que proporciona la movilidad necesaria para el traslado al lugar de fecundacin y asegura la adecuada orientacin de la cabeza para penetrar las cubiertas del ovocito.
Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustracin 17) http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#sistema_masculino A) Cabeza La cabeza del espermatozoide es de forma oval al observarla frontalmente, y piriforme cuando la observacin es lateral, siendo ms gruesa en la base y adelgazando hacia la punta. Su tamao aproximado oscila entre 3,7 y 4,7 micras de longitud y 2,5 a 3,2 micras de anchura, por 1 a 1,5 micras de espesor. La razn longitud/anchura vara entre 1,3 y 1,8. En la cabeza del espermatozoide se sitan el ncleo y el acrosoma, recubiertos ambos por la membrana plasmtica. El ncleo ocupa la mayor parte de la cabeza. Es una masa de DNA haploide que se fusionar con el ncleo del ovocito en el momento de la fecundacin. Su cromatina se ha condensado intensamente a fin de disminuir el volumen de la cabeza, lo que facilita la movilidad del espermatozoide a travs de los diferentes fluidos y estructuras que debe atravesar. Adems protege al genoma de daos durante el trayecto. o o El ncleo est delimitado por una membrana doble, la membrana nuclear. A nivel de insercin del flagelo, el ncleo est ligeramente deprimido formando la foseta de implantacin.
El acrosoma es una estructura membranosa, situada entre el ncleo y la membrana plasmtica, adopta la forma de capuchn. Est envuelto por la membrana acrosmica: o o La porcin adherida a la envoltura nuclear por su parte interna es la membrana acrosmica interna. La membrana plasmtica por su parte externa, membrana acrosmica externa.
El acrosoma se forma a partir del aparato de Golgi y contiene una gran concentracin de hidratos de carbono y enzimas lisosmicas como la hialuronidasa. Hay tambin una enzima
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Biologa del Semen
proteoltica llamada acrosina. El papel de estas enzimas en la fecundacin es el facilitar el reconocimiento y penetracin del espermatozoide a travs de las envolturas del ovocito. Para ello es necesario que se produzcan una serie de cambios en el espermatozoide, conocidos como capacitacin, y que culminan en un proceso de modificacin del acrosoma en la llamada reaccin acrosmica. El lquido seminal impide la capacitacin por su accin decapacitante. Es por ello que dicho proceso, indispensable para una correcta fecundacin del ovocito, se produce en el tracto genital femenino donde el espermatozoide se libera del lquido seminal. La membrana plasmtica recubre estrechamente el acrosoma y la regin postacrosmica. Delimita una escasa cantidad de citoplasma. En la zona donde parece unirse con la membrana nuclear se define una depresin, el anillo posterior. Este anillo parece dividir la cabeza en dos partes. o o B) Cuello El cuello es la unin entre la cabeza y el flagelo y es una zona compleja y de gran importancia, que soporta algunas estructuras esenciales: o o La pieza conectiva que tiene un denso capitel. La placa basal, adaptada en su forma a la fosa de implantacin. Hacia delante se encuentra la membrana temporal, que participa activamente en la reaccin acrosmica al fusionarse con la membrana acrosmica externa. Hacia atrs se extiende la zona de membrana estable.
A partir del capitel se extienden hacia atrs 9 densas columnas segmentadas de 1 a 1,5 micras de largo, que forman una especie de embudo, y se continan en sus extremos con las nueve fibras externas densas del flagelo. El centriolo proximal est situado bajo la placa basal y a la entrada de ese embudo, pero formando un ngulo de 70-80 grados con el eje del flagelo. Posee la estructura tpica de nueve tradas tubulares. El par central de microtbulos del axonema flagelar puede llegar por delante hasta el interior de la pieza de conexin, incluso hasta el centriolo proximal. Generalmente en los espermatozoides maduros falta el centriolo distal, el orientado segn el eje del flagelo, pero residuos de sus nueve tripletes pueden estar unidos a la cara interna de las columnas segmentadas. En la regin del cuello, y por fuera de la pieza de conexin pueden encontrarse algunas mitocondrias orientadas longitudinalmente, que a veces emiten prolongaciones que se extienden entre las columnas segmentadas. C) Flagelo El flagelo es una larga estructura filiforme de aproximadamente 50 m de longitud. Est recubierto por una vaina fibrosa en su primera fraccin y luego solo por la membrana flagelar.
Posee una constitucin interna comn a la mayora de los flagelos del reino animal. En el eje est el axonema formado por dos microtbulos centrales nicos, rodeados por nueve pares de microtbulos regularmente distribuidos. Son los microtbulos A y B. Esta estructura se conoce como axonema 9+2. Cada microtbulo A posee dos brazos en gancho formados por la protena dineina, la cual puede hidrolizar las molculas de ATP, produciendo la energa necesaria para impulsar el espermatozoide. Pero el flagelo de los espermatozoides humanos se diferencia de otros en que el axonema est rodeado por nueve fibras densas externas, lo que lo convierte en un modelo 9+9+2. Se considera que el axonema es el componente motor y que las fibras densas externas son estructuras que dan firmeza al flagelo. El flagelo se diferencia en tres regiones: o La pieza intermedia mide de 5 a 7 m. El axonema est en esta regin rodeado por las fibras densas. Se caracteriza por una vaina de mitocondrias orientadas circularmente y dispuestas extremo con extremo para formar una espiral cerrada. Las mitocondrias producen la energa necesaria para el movimiento en forma de ATP. La pieza principal mide unas 45 m de longitud. El axonema conserva el mismo aspecto en todo el trayecto pero las fibras densas se modifican, disminuyendo progresivamente de dimetro y desapareciendo en un orden bien establecido, as por ejemplo las fibras 3 y 8 se incorporan a las columnas longitudinales de la vaina fibrosa. La pieza terminal est formada slo por el axonema, recubierto por la membrana flagelar. Adems el axonema pierde su disposicin circular para hacerse desordenada.
1.3
1.3.1.
Fisiologa
La eyaculacin
En la fase de excitacin sexual los cilindros se llenan de sangre y se produce la ereccin. El glande, que aumenta su tamao casi al doble, est provisto de abundantes terminaciones nerviosas sensitivas. El meato urinario se dilata y hay una elevacin parcial de los testculos y un engrosamiento de la tnica y piel testicular. Cuando la excitacin sexual alcanza la fase de meseta vierten las glndulas de Cowper, los testculos aumentan de tamao, rotan anteriormente y el escroto se engruesa. En el momento del orgasmo el esfnter interno de la vejiga se contrae, las vesculas seminales se contraen tambin, lo mismo que los conductos deferentes, el esfnter erctil y la glndula prosttica. Estas contracciones fuerzan al lquido seminal a fluir a travs de la uretra al contraerse tambin el propio pene. La actividad contrctil est bajo control de las fibras adrenrgicas. La ereccin depende sin embargo de impulsos parasimpticos. En el epiddimo slo la regin distal de la cola experimenta una marcada contraccin bajo el estmulo de las fibras adrenrgicas de los nervios hipogstricos. Esto evita el paso significativo de espermatozoides inmaduros durante la eyaculacin.
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Biologa del Semen
En resumen, se distinguen distintas fases del eyaculado: o El preeyaculado, en la cual vierten las secreciones de las glndulas bulbouretrales y glndulas de Littre. Su funcin ser la de lubricar la uretra como preparacin de la eyaculacin. Primera fraccin del eyaculado, donde vierten las secreciones de la prstata que contribuye al eyaculado con un porcentaje entre el 15 y el 30% del volumen final y las procedentes del testculo y epiddimo que aportan entre un 5 y un 10%. Por ltimo, la segunda fraccin la constituyen las secreciones procedentes de las vesculas seminales que aportan entre un 50 y un 70% del volumen final.
A continuacin se detallan los componentes bioqumicos de cada fraccin: a) Marcador de la prstata. (1 Fraccin del eyaculado) o o Citrato: es el anin principal y acta como quelante de cationes. Existe una estrecha correlacin entre las concentraciones de zinc y citrato. Zinc: es un catin especfico del plasma seminal dotado de poder bactericida. Su papel sera estabilizar la condensacin de la cromatina. Es transportado por el citrato y las protenas. Fosfatasa cida: es una enzima activa en la desfosforilacin de los steres ortofosfricos. La isoenzima hallada en el esperma es especfica de la prstata.
b) Marcadores del epiddimo (1 Fraccin del eyaculado) o L-carnitina o o o Est en dos formas en el esperma: L-carnitina y acetilcarnitina. Desempea un papel en la adquisicin de la movilidad progresiva, es un transportador de cidos grasos. Es el marcador del cuerpo y la cola del epiddimo, pero no es secretada por las clulas de la cabeza. Existe una pequea secrecin extraepididimaria del orden del 15 al 20%.
1,4 glucosidasa neutra o o o Es una hidrolasa que est en dos formas en el esperma: una forma cida de origen prosttico y una neutro epididimaria. En el epiddimo desempeara un papel en la maduracin de los espermatozoides. Slo es segregada en el cuerpo del epiddimo. Existe una dbil secrecin extraepididimaria, inferior al 10%.
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c)
Marcador de las vesculas seminales. (2 Fraccin del eyaculado)
La fructosa es el marcador ms especfico segregado en ellas. Es sintetizada por las clulas epiteliales a partir de la glucosa sangunea. Es la fuente de energa de los espermatozoides. Su secrecin es andrgeno-dependiente. 1.3.2. Movilidad del espermatozoide
La movilidad es uno de los parmetros ms importantes en la evaluacin de una muestra de semen. Un espermatozoide inmvil es incapaz de atravesar el moco cervical femenino y mucho menos las envolturas del ovocito. El proceso evolutivo en la adquisicin de la movilidad de los espermatozoides, es el que sigue: o o Los espermatozoides en el testculo son inmviles o con poca movilidad, debido probablemente a la inmadurez de la membrana plasmtica. En la cabeza y porcin proximal del cuerpo del epiddimo siguen siendo inmviles o tienen movimientos vibratorios muy dbiles. Algunos tienen un batido flagelar vigoroso, pero sin efecto progresivo. En la parte media del cuerpo predomina este movimiento flagelar vigoroso, pero son pocos los espermatozoides con movimiento progresivo. La madurez en el movimiento se alcanza en la parte distal del cuerpo del epiddimo, donde los espermatozoides adquieren la capacidad de progresar eficazmente.
o o
El camino que debe recorrer el espermatozoide desde la eyaculacin es largo, atravesando el canal cervical y ascendiendo hasta las trompas. Cuando llega al ovocito todava debe atravesar las diferentes barreras celulares que lo rodean antes del contacto clula-clula. Esto se consigue gracias al flagelo, que dota al espermatozoide de movimiento. En el plasma seminal se mueve a una velocidad que flucta entre 10 y 60 micras/segundo. El flagelo produce un movimiento ondulatorio, batiendo aproximadamente 10 veces por segundo. Esta batida se propaga desde la base del flagelo en direccin a la cabeza, lo que lo conduce hacia delante. Pero si analizamos el movimiento podemos apreciar un avance tipo sacacorchos, por lo que la cabeza va girando durante el avance. Esto ser fundamental para poder atravesar las diferentes estructuras del ovocito. La importancia de la protena dinena se pone de manifiesto en personas que presentan el sndrome de Kartagener. Sus espermatozoides carecen de esta protena y padecen una esterilidad por ausencia total de movimiento de los espermatozoides. El movimiento del flagelo se produce cuando los brazos de dinena de un par de microtbulos se deslizan sobre el par contiguo, pareciendo que caminasen. Esto producira torsiones y angulaciones que al irse propagando por toda la longitud y al resto de tubos explicara el movimiento ondulatorio. Es lo que se conoce como Hiptesis de deslizamiento de microtbulos.
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1.3.3.
Capacitacin del espermatozoide
Los espermatozoides de todos los mamferos placentarios son incapaces de fecundar el ovocito directamente desde el eyaculado, y deben experimentar un proceso en el que se producen cambios moleculares denominados capacitacin. Los espermatozoides adquieren la capacidad de fecundar el ovocito despus de haber permanecido durante un tiempo en el tracto genital femenino. Una definicin ms exacta seria aquella que describe la capacitacin como la serie de cambios bioqumicos y fisiolgicos requeridos por el espermatozoide para liberar el contenido acrosomal. Dichos cambios son tales como: o o o o Prdida de protenas o sustitucin por otras de menor peso molecular. Transformacin de los fosfolpidos, disminucin de la relacin colesterol/ fosfolpidos. Cambios en la fraccin glucdica de las glucoproteinas. Movilidad de lpidos y protenas.
Actualmente no se conocen todos los sucesos implicados en el complejo proceso de la capacitacin. Se diferencian las siguientes etapas: o o o o Fluidificacin de la membrana celular debido a modificaciones de la estructura lipdica. Flujo de Ca++ hacia la cabeza y flagelo del espermatozoide. Generacin de cantidades controladas de especies reactivas de oxgeno. Fosforilacin de protenas en los residuos de serina, treonina y tirosina.
En condiciones in vivo los espermatozoides mviles se separan del resto del eyaculado por migracin activa a travs del moco cervical. La capacitacin de los espermatozoides se puede conseguir in vitro, si son sometidos durante el tiempo necesario, a unas condiciones de cultivo que faciliten y aporten los cambios y las seales de transduccin de forma semejante a las condiciones in vivo. En la capacitacin, el espermatozoide adquiere tres caractersticas: o o o Reaccin acrosmica. Unin a la zona pelucida del ovocito. Hipermovilidad.
Ilustraciones recomendadas: http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#fecundacion a) Reaccin acrosmica El acrosoma es una organela tipo lisosoma localizada en la regin anterior de la cabeza del espermatozoide por debajo de la membrana plasmtica, como un casquete sobre el ncleo. El
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acrosoma contiene muchas enzimas que quedan al descubierto con la reaccin acrosmica, que consiste en la liberacin del contenido acrosomal imediatamente antes de la fecundacin. Esta reaccin es de exocitosis, la fusin de una vescula intracelular de almacenamiento con la superficie interna de la membrana celular, seguida de la liberacin del contenido de la vescula. Esta reaccin requiere la entrada de iones calcio, la salida de iones hidrogeno, un aumento del pH y la fusin de la membrana plasmtica con la membrana del acrosoma, lo que permite el contacto con las enzimas y favorece la salida de las retenidas por la membrana interna del acrosoma. Para que un componente de la zona pelucida del ovocito provoque la reaccin acrosmica es necesario el contacto del espermatozoide con dicha estructura ovocitaria. Se cree que este componente es un receptor de glicoproteinas espermticas que tendra una doble funcin: unirse al espermatozoide e inducir la reaccin acrosmica. b) Unin espermatozoide-vulo La capacidad de unin de la membrana plasmtica del espermatozoide con la del ovocito se desarrolla durante o tras la reaccin acrosmica. El contacto inicial entre espermatozoide y ovocito es un proceso mediado por receptores. La zona pelucida est compuesta por glucoproteinas secretadas por el ovocito llamadas ZP1, ZP2 y ZP3 de las cuales la ms abundante es ZP3 y el principal fijador para el espermatozoide. Para que el espermatozoide se una es necesario que reconozca el componente carbohidrato de la molcula fijadora de las glucoproteinas especificas para la especie. Despus de la unin, el componente peptdico de la glucoproteina receptora desencadena la reaccin acrosmica. Al menos uno de los receptores de la cabeza del espermatozoide es una tirosinquinasa activada por la unin a la glicoproteina ZP3 y que inicia la reaccin acrosmica. Esta interaccin sigue los principios generales de la unin y actividad hormona-receptor. En el caso del espermatozoide y el ovocito, en el reconocimiento interviene una enzima de la superficie del espermatozoide que queda expuesta en el proceso de capacitacin. c) Hiperactivacin espermtica
En cierto momento de la preparacin del espermatozoide para la fecundacin, este desarrolla un movimiento peculiar, llamado hiperactivo, que se caracteriza por una pequea velocidad de progresin y un rpido movimiento in situ con un gran desplazamiento lateral de la cabeza. El aumento de la movilidad, debido al estado de hiperactividad, contribuye al ltimo avance hacia el ovocito. Es posible que esta movilidad sea en parte el resultado de una interaccin con el epitelio de la trompa, que le aporta mayor velocidad y mejor orientacin, y tambin impide que los espermatozoides se adhieran y queden atrapados en el epitelio de la trompa. 1.3.4. Espermatogenesis
Se trata de un proceso complejo de maduracin y diferenciacin celular, mediante el cual las clulas germinales indiferenciadas se transforman en espermatozoides. La espermatognesis se produce en el testculo, a nivel de tbulos seminferos. Pero el testculo no slo tiene esa funcin. En el testculo ocurre la produccin de hormonas sexuales
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(esteroidognesis), que se produce a nivel de tejido intersticial. Ambos procesos estn interrelacionados, con el objetivo de conseguir la correcta produccin de espermatozoides. La espermatognesis se inicia con la divisin de las clulas madre y finaliza con la formacin de los espermatozoides maduros. En esta progresin se diferencian tres fases: a) Fase proliferativa, donde se produce la multiplicacin y crecimiento de clulas madre. b) Fase de maduracin, donde se producen los fenmenos de Meiosis. c) Fase de diferenciacin, donde se produce la espermiognesis. a) Fase proliferativa En la fase proliferativa se produce la continua repoblacin de espermatogonias. Las espermatogonias son clulas diploides situadas en la base del tejido germinal. En el hombre se han descrito tres tipos: a) espermatogonias del tipo A oscuras; b) espermatogonias del tipo A plidas o claras; y c) espermatogonias del tipo B. o Las espermatogonias oscuras son clulas diploides. Se denominan as por tener la cromatina nuclear fina y oscura. Se consideran las clulas madre de la espermatognesis. Son clulas diploides quiescentes que slo entran en mitosis cuando se reduce drsticamente la poblacin de espermatogonias. La divisin produce ms espermatogonias oscuras y algunas claras. Las espermatogonias claras son igualmente diploides. La cromatina nuclear es fina y plida. Se dividen a intervalos regulares y dan lugar a ms espermatogonias plidas o espermatogonias del tipo B. Las primeras se unen por el citoplasma pudiendo derivar a tipo B por maduracin. Por ltimo las espermatogonias del tipo B siguen siendo clulas diploides, la cromatina nuclear es granulosa y oscura y se dividen produciendo ms espermatogonias B. Por maduracin producen espermatocitos primarios o espermatocitos preleptotene (fase de preparacin de la meiosis).
b) Fase de maduracin En la fase de maduracin se produce el fenmeno de la Meiosis. Es un proceso de divisin celular en el cual una clula diploide (2n) experimenta dos divisiones nucleares y citoplasmticas sucesivas. La primera conocida como Meiosis I y la segunda como Meiosis II, generando al final cuatro clulas haploides. Previo a la meiosis ocurre un proceso preparatorio similar a la mitosis. Tanto la Meiosis I como la II estn a su vez divididas en cuatro fases: Profase, Metafase, Anafase y Telofase. o Durante el proceso preparatorio se produce el paso de espermatogonia a espermatocito primario. Como consecuencia se produce un aumento de tamao de la clula debido a la fabricacin acelerada de orgnulos, protenas y otras materias celulares. Pero lo ms importante es que el material gentico se replica. Como
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consecuencia, los cromosomas, que hasta el momento tenan una sla cromtida, eran 2n de dotacin gentica, ahora tiene dos, lo que podramos llamar 2nx2. o Tras el proceso preparatorio se produce la primera meiosis, Meiosis I tambin llamada reduccional. Como consecuencia un espermatocito primario da lugar a dos espermatocitos secundarios. Con la Meiosis I pasamos de una clula con dotacin gentica 2nx2, o sea con 46 cromosomas con dos cromtidas por cromosoma a una con dotacin nx2, clulas haploides en cuanto al n de cromosomas, pero su contenido de DNA es diploide ya que tienen dos cromtidas (nx2). La Meiosis I se divide en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase. La profase se divide a su vez en cinco: leptotene, zigotene, paquitene, diplotene y diacinesis. Durante la profase se produce el fenmeno de apareamiento de cromosomas homlogos (sinapsis) y el intercambio de material gentico entre ellos (crossing over). Este fenmeno es muy importante al aumentar la diversidad gentica. Tras la Meiosis I o Meiosis reduccional se contina con la Meiosis II o Meiosis ecuacional. Como resultado final un espermatocito secundario da lugar a dos espermtides. La dotacin gentica pasa de nx2 del espermatocito a una dotacin haploide (23 cromosomas) y adems cada cromosoma tiene ya solamente una cromtida. La meiosis II es un proceso similar a una mitosis, con cuatro fases: profase, metafase, anafase y telefase.
c)
Fase de diferenciacin
El proceso de transformacin sin divisin celular es conocido como espermiognesis, en la que las espermtides se transforman en espermatozoides. Durante la espermiognesis se producen una serie de cambios: desarrollo del acrosoma, desarrollo del flagelo, reorganizacin del ncleo y reorganizacin del citoplasma. o Desarrollo del acrosoma. El aparato de Golgi, del cual deriva el acrosoma, forma vesculas proacrosmicas que se unen y desplazan junto al ncleo hacia el extremo apical de la cabeza. El desarrollo del flagelo se inicia cuando los centriolos emigran hacia la periferia. Del centriolo distal se origina el axonema. Conforme se alarga, los centriolos se invaginan y las mitocondrias se disponen helicoidalmente alrededor del flagelo, formando la pieza intermedia. En cuanto a la reorganizacin del ncleo, este se vuelve elptico, adopta posicin excntrica, se produce la condensacin de la cromatina y la sustitucin de histonas por protaminas. En la reorganizacin del citoplasma, ste es reducido en su mayor parte, bien porque es fagocitado por las clulas de Sertoli o bien porque es liberado en el interior de los tbulos. Puede permanecer unido al espermatozoide durante un tiempo.
La barrera hematotesticular est formada por las clulas de Sertoli, que se extienden desde la membrana basal hasta la luz de los tbulos seminferos. Estas clulas conectan entre ellas mediante fuertes complejos de unin, formando un anillo sin solucin de continuidad dentro de
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cada tbulo seminfero. Estos complejos de unin aparecen durante la pubertad, coincidiendo con el comienzo de la espermatognesis. Durante la espermatognesis las clulas germinales se van desplazando desde el compartimento basal hasta el adluminal. Esto es posible gracias al carcter dinmico de la barrera, con aparicin y desaparicin de los complejos de unin. De esta manera se crea un ambiente nico para el desarrollo de la meiosis y espermatognesis. Por otra parte las clulas de Sertoli retienen parte del citoplasma de las espermtides que salen a la luz tubular, formando los cuerpos residuales, que son fagocitados posteriormente. En la cintica de la espermatognesis hay que destacar varios aspectos peculiares. o La espermatognesis es un proceso que dura 72 das. Cuando se estudia una seccin determinada de un ttulo se encuentra que no contiene todos los tipos de clulas germinales, sino slo algunos, que forman asociaciones. Hay 6 tipos de asociaciones diferentes, conocidas como Estados. Los estados se van sucediendo. Una seccin del tbulo ir pasando por los diferentes estados, del I al VI. Cada estado dura 16 das, por lo que la duracin total de la espermatognesis ser de 4,5 estados. En el tubo semenfero cada ciclo de la espermatognesis se desarrolla siguiendo una distribucin helicoidal. Empieza con las espermatogonias desde la membrana basal hasta acabar con los espermatozoides formados en el interior del tubo.
Adems en una seccin determinada no slo encontramos un estado, sino varios, que se superponen. Esto se debe a que en el testculo se desarrollan en el tiempo, tres ciclos a la vez. Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt. htm (Ilustraciones de la 11 a la 16) http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_05.jpg http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_04b.jpg 1.3.5. Regulacin de la funcin gonadal testicular
La regulacin hormonal de los testculos va a seguir un esquema comn a toda la endocrinologa, actuando una serie de hormonas secuencialmente tanto en el estmulo como en la regulacin negativa. El ncleo arcuato del hipotlamo secreta GnRh, hormona liberadora de gonadotropinas. La GnRh es un decapptido que alcanza la Adenohipfisis a travs del sistema portal hipofisario y acta liberando gonodotropinas, LH y FSH. La liberacin de GnRh es pulstil y se realiza mediante impulsos precedentes del Sistema Nervioso Central. La frecuencia y amplitud de estos impulsos marca tambin la secrecin de gonadotropinas. Segn la frecuencia se libera preferentemente LH o FSH. La LH se fija a receptores especficos de las clulas de Leydig, activando la adenil ciclasa y esta a su vez el AMP cclico intracelular, que favorece el transporte de colesterol a las mitocondrias y
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estimula su conversin en pregnenolona, el primer paso en la sntesis de Testosterona. Parte de la testosterona va a pasar a sangre y parte a los tbulos seminferos donde acta sobre el epitelio germinal y clulas de Sertoli. o La testosterona acta en la diferenciacin de los caracteres sexuales masculinos y su mantenimiento en el adulto, adems de en el inicio y mantenimiento de la espermatognesis. Por otra parte, realiza un feedback negativo sobre el hipotlamo y adenohipfisis.
La FSH acta sobre las clulas de Sertoli, unindose a receptores especficos y siguiendo la va AC-AMPc. Las clulas de Sertoli producen: protenas transportadoras, proteasas y antiproteasas, otras protenas y factores de crecimiento, entre ellos la inhibina. Las clulas de Sertoli inducen la proliferacin y divisin celular en periodos prenatal y neonatal. Aumentan el metabolismo lipdico y energtico, incorporando glucosa y produciendo lactato y piruvato para las clulas germinales. Promueven la sntesis y secrecin de numerosos productos. o Entre las protenas transportadoras encontramos: o ABP, protenas transportadoras de andrgenos. Es secretada en su mayor parte a los tbulos seminferos y transporta testosterona en la propia clula de Sertoli, en el interior de los tbulos y de los tbulos al epiddimo. Slo el 20% pasa a la sangre. Transferrina, que transporta el hierro a las clulas germinales, necesario para su desarrollo y diferenciacin. Ceruloplasmina, que transporta Cobre. SPARC, necesaria para el transporte de Calcio. Protena transportadora de Retinol, que transporta Vitamina A. Protena transportadora del factor de crecimiento insulnico.
o o o o o o
Las proteasas y antiproteasas actan en la remodelacin del epitelio germinal, favoreciendo la migracin de clulas germinales al compartimento adluminal o la liberacin de espermtides durante la espermiognesis. Entre ellas encontramos: o o o o Activador de plasmingeno. Catepsina L. Metalproteasas. Alfa2 macroglobulina.
Las clulas de Sertoli producen tambin otras protenas. o La Clusterina que acta en interacciones celulares, en la apoptosis, en la proteccin de clulas germinales frente al complemento e inmunoglobulinas, y en la proteccin de las clulas de Sertoli. Otra protena es la Testibumina, una protena homloga a la albmina que se encuentra en el compartimento adluminal.
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Biologa del Semen
Los factores de crecimiento actan sobre las clulas de Sertoli, clulas de Leydig, clulas mioides peritubulares y clulas germinales. Intervienen en el crecimiento, funcin y diferenciacin celulares. Entre ellos encontramos: o o o o o o o o o El Factor de crecimiento fibroblstico. El Factor transformador de crecimiento. La Sustancia inhibidora Mulleriana. El Factor de crecimiento nervioso beta. Los factores de crecimiento plaquetarios. El factor de crecimiento secretado por clulas de Sertoli. Las Citocinas. La Activina. Y la Inhibina que merece especial atencin. Se trata de un pptido no esteroideo. La mayor parte pasa a tbulos, se reabsorbe en Rete Testi y pasa a sangre. Acta frenando la secrecin de FSH por la hipfisis y la hormona liberadora de gonadotropinas en el Hipotlamo. A nivel local restringe la accin de la FSH en el testculo.
Haciendo un compendio de la regulacin hormonal: o La FSH, LH y Testosterona son necesarias para el desarrollo de la espermatognesis a partir de la pubertad. As mientras en ausencia de Testosterona las clulas germinales degeneran, pero slo en algunos estados, en ausencia de FSH la espermatognesis contina por accin de la Testosterona. Por otra parte, tanto Testosterona como inhibina actan como feedback negativo, actuando sobre el hipotlamo y adenohipfisis y regulando de esta forma la produccin de FSH y LH. Existe adems una regulacin local de tal forma que la esteroidognesis y la espermatognesis testicular estn controladas por multitud de potentes mecanismos locales. El mejor documentado es la accin reguladora autocrina de la Testosterona que tradicionalmente fue considerado slo por su accin puramente endocrina: o La Testosterona intratesticular acta localmente sobre la espermatognesis. De hecho es la testosterona la que regula realmente la espermatognesis. Para ello se requieren concentraciones 200 veces superiores a las sanguneas. Las clulas germinales no poseen receptores andrognicos, pero s estn presentes en las clulas de Sertoli, clulas de Leydig, arteriolas y clulas mioides peritubulares. Por tanto, la testosterona ejerce su funcin sobre clulas germinales indirectamente actuando sobre clulas de Sertoli, clulas peritubulares o a travs de receptores de la protena transportadora de andrgenos.
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Ilustraciones recomendadas: http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_07.jpg
1.4
1.4.1.
Patologa
Esterilidad de la pareja
Segn el 5 manual de OMS, la esterilidad no debe tratarse como un problema individual, sino que es un problema de pareja. o o Se entiende por estril la pareja que tras 12 meses de relaciones sexuales sin mtodos anticonceptivos, no queda gestante. Infrtil es aquella pareja que presenta incapacidad para llevar a trmino las gestaciones. Se embarazan, pero abortan.
Hoy da la situacin ms frecuente entre las parejas que acuden a la consulta es de subfertilidad, y se entiende como una probabilidad disminuida de conseguir un hijo vivo. Cuando se estudian las causas se pueden encuadrar en cuatro tipos: factor femenino, factor masculino, factor mixto y la esterilidad de causa desconocida. El factor masculino oscila en estos aos en unas cifras en torno al 35%. En consecuencia, la exploracin de la pareja y la bsqueda de las causas de subfertilidad masculina son imperativas. Es imposible concebir el abordaje de la pareja estril sin este estudio, lo que ocurra hasta muy recientemente. El estudio del espermiograma permite orientar hacia una subfertilidad de origen masculino. Muchos otros exmenes como las concentraciones hormonales, la bioqumica seminal, el cariotipo sanguneo, las pruebas de interaccin mocoesperma (prueba de Hhner, prueba de penetracin cruzada in vitro), la leucospermia o incluso exmenes an ms especializados, como el examen por microscopia electrnica de los espermatozoides, la prueba hmster, el estudio del movimiento, confirman eventualmente un etiologa sospechosa en el espermiograma. Cualquiera que fuere su grado de especializacin, la buena ejecucin de todos estos exmenes ser esencial para lograr una actuacin teraputica adaptada y eficaz. En efecto, las tcnicas de asistencia mdica a la procreacin (IIC: inseminaciones intracervicales, IIU: inseminaciones intrauterinas, FIV: fecundacin in vitro, ICSI: Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides) permiten ahora ampliar los lmites de la teraputica. A) Azoospermia Es la ausencia de espermatozoides en 2 espermiogramas practicados con 2 meses de intervalo, segn las recomendaciones de la OMS.
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Biologa del Semen
Las azoospermias pueden tener un origen: o o Secretor, no obstructivo. No hay espermatozoides por falta de funcionalidad de la espermatognesis, o sea, porque no hay fabricacin de espermatozoides. Excretor, obstructivo. con funcin secretora conservada. Hay produccin de espermatozoides, pero existe una imposibilidad de salida debido a una obstruccin bilateral en las vas seminales. Las azoospermias excretoras pueden ser congnitas o adquiridas.
La importancia de un diagnstico correcto es fundamental para poder abordar el tratamiento exclusivamente en el hombre (hormonal, quirrgico) o en la pareja (biopsia testicular para ICSI). Estrategia de la exploracin de la esterilidad masculina Los trastornos de la espermatognesis son de origen gentico o ligado a factores extrnsecos: o Las causas genticas se manifiestan, bien de modo evidente en caso de anomalas cromosmicas por ejemplo, o bien en el estudio de subfertilidad de la pareja o en la fecundacin. Los pacientes afectados producen pocos o ningn espermatozoide o espermatozoides en nmero normal pero no fecundadores. Los factores extrnsecos afectan a la espermatognesis durante la vida pre y pospubescente, resultando en una produccin reducida de espermatozoides y en infertilidad.
Globalmente, la estrategia de exploracin de la infertilidad masculina tiene 4 pasos: un cuestionario, un examen clnico, los exmenes diagnsticos de primera intencin y los exmenes de segunda intencin. 1. Cuestionario
El cuestionario permite la investigacin de los factores de riesgo de la infertilidad. Tiene que ser tan completo como sea posible, ya que, excepto causas especficas, no olvidar que una patologa general puede repercutir en la espermatognesis. Hay que considerar: o o o o o o o o la duracin de la infertilidad de la pareja los antecedentes de embarazo o hijos con la pareja actual o con otras parejas la profesin y la exposicin a diferentes txicos (disolventes, insecticidas, etc.) las medicaciones actuales o pasadas los antecedentes quirrgicos, sobre todo los de la esfera urogenital los antecedentes de infecciones genitourinarias los antecedentes de infecciones de la esfera ORL o pulmonar los antecedentes de traumas testiculares
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o o o o o o o 2.
las costumbres (sauna, prendas ntimas, cigarrillo, alcohol, frecuencia de las relaciones sexuales...) los antecedentes de enfermedades infantiles (parotiditis...) los antecedentes familiares (sufertilidad, patologas genticas...) los antecedentes de patologas graves la presencia de una patologa crnica (diabetes, HTA...) la presencia de enfermedad gentica cualquier otro sntoma como cefaleas
Examen clnico
En la biologa de la reproduccin, el examen de las bolsas testiculares es esencial en el estudio de las azoospermias. A menudo, permite orientar hacia una azoospermia secretoria o una azoospermia excretoria. Cuanto ms pequeo es el volumen testicular, ms sugestivo es el origen secretorio de la azoospermia. Igualmente ocurre cuando los testculos son blandos. En cambio, la ausencia de los conductos deferentes orienta hacia una azoospermia excretoria por agenesia de los conductos deferentes. El examen puede poner de manifiesto quistes testiculares o del epiddimo. El examen investiga la presencia de un eventual varicocele. Ante la menor duda o la menor anomala, es importante orientar al paciente hacia un urlogo. 3. Pruebas analtico-clnicas de primera intencin:
Espermiograma y cultivo de semen. El espermiograma es la primera etapa diagnstica de la exploracin de la fertilidad masculina. Slo este examen permite orientar hacia una participacin masculina en la subfertilidad de pareja o confirmarla. Tambin es el punto de partida de un proceso etiolgico. 4. Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin o Exmenes de exploracin de los caracteres funcionales de los espermatozoides. o o o o o Marcadores Prueba de interaccin moco cervical-esperma. Anlisis del movimiento de los espermatozoides asistido por ordenador (C.A.S.A.) Estudio de la reaccin acrosmica. Prueba de interaccin del espermatozoide con la membrana del ovocito, etc.
Bioqumicos o o Estudios complementarios en sangre: Cariotipo y anomalas; hormonas. Bioqumica seminal.
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Biologa del Semen
B) Vasectoma y vasovasostoma La vasectoma est considerada como uno de los mtodos ms efectivos y populares de control de la natalidad. Esta tcnica es de eleccin, sobre todo para parejas estables que ya tienen hijos y no desean tener ms. La incorporacin de nuevas tcnicas quirrgicas que han sustituido la mera ligadura y sutura del conducto deferente, ha aumentado la eficiencia de la vasectoma, que se considera el mejor mtodo anticonceptivo. La evidencia cientfica actual considera el anlisis de semen como la mejor metodologa de valoracin de la efectividad de la tcnica quirrgica, ya que hay que considerar que existe un riesgo bajo, pero no nulo, de complicaciones o de que se recanalice el conducto seccionado. La vasectoma es una operacin simple que tiene una duracin media de 30 minutos y que se realiza en el mbito ambulatorio, con la utilizacin de anestesia local. Tiene como fundamento la oclusin quirrgica de los conductos deferentes. Inmediatamente despus de la vasectoma, todas las eyaculaciones pueden contener en teora espermatozoides potencialmente frtiles, por lo que se debe aconsejar continuar con otros mtodos anticonceptivos hasta que se demuestre la eficacia de la intervencin. La experiencia del cirujano, junto con el nmero de vasectomas/ao que realice, ha demostrado ser el factor ms importante en el xito de la operacin y la posible aparicin de complicaciones. La recanalizacin espontnea puede ser precoz (antes de los 4 meses) o tarda. La recanalizacin precoz presenta una incidencia entre 0,36-0,75% segn los diferentes estudios y una posterior paternidad de 0-0,08% y la tarda presenta una incidencia aun menor del 0,1%. Todo paciente que vaya a ser sometido a una vasectoma debe ser informado por el clnico de estos datos. Debe existir un equilibrio entre la realizacin del anlisis de los controles que demuestren la eficacia de la tcnica y el tiempo de espera para realizar el primer control, ya que si ste se realiza demasiado pronto, se puede tener un elevado nmero de falsos positivos (varones con la vasectoma bien realizada que presentan espermatozoides mviles en el eyaculado). Los espermatozoides residuales pierden capacidad de fecundacin entre los 3-8 das despus de la intervencin y se encuentran inmviles transcurridos 15 das. El 97% de los pacientes presentan una azooospermia a los 4 meses de la intervencin, el 3% restante puede presentar espermatozoides residuales hasta 12 meses despus, asociado probablemente a un mayor reservorio del tracto urogenital; aunque numerosos estudios aseguran que en estos pacientes esto no implica un mayor riesgo de gestacin que la azoospermia. Se estima que existe un 16% de pacientes operados que no realizan ningn tipo de control tras la vasectoma. La vasovasostoma es una intervencin que recanaliza el conducto deferente y que requiere microciruga con anestesia general. La incidencia de las vasovasostomas se ha descrito entre el 1-30/00 de las vasectomas y el aumento de su frecuencia en el nuevo contexto social, hace aconsejable su incorporacin al presente documento. La operacin puede exceder de las dos horas y si se realiza una epiddimo-vasostoma 4 o 5 horas. Respecto a la tcnica quirrgica, se recomienda el empleo de microciruga. El conducto deferente es seccionado a ambos lados de la sutura y la aparicin intraoperatoria de espermatozoides al final del deferente seccionado es un ndice de buen pronstico. Posteriormente se procede a la anastomosis del vaso. Cuando existe una obstruccin patolgica del epiddimo es necesario realizar una epiddimo-vasostoma, que
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comporta una mayor complejidad y unos resultados ms pobres. La experiencia del cirujano y la tcnica de microciruga empleada es un factor importante. Se han descrito una tasa de recuperacin testicular y posterior paternidad entre el 30-65% de los intervenidos, en funcin de los aos transcurridos desde la vasectoma. La realizacin de una epiddimo-vasostoma est indicada cuando han transcurrido ms de 10 aos de la vasectoma. Una alternativa actual que se debe plantear despus del fracaso de la vasovasostoma, es la utilizacin de tcnicas de reproduccin asistida (ICSI) a partir de espermatozoides obtenidos por aspiracin de espiddimo o biopsia testicular.
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Preanaltica
Captulo 2
Preanaltica
2.1
Factores que afectan a la calidad de la muestra
A) Recogida de la muestra completa Un anlisis de semen correcto se debe realizar sobre una muestra de semen completa: o o La primera parte del eyaculado aporta las secreciones del testculo-epididimo (en esta fraccin estn los espermatozoides) y las secreciones de la prstata. La segunda parte corresponde a las secreciones de vesculas seminales.
Por tanto, si se derrama una fraccin de la primera parte, al faltar parte de los espermatozoides obtendremos una concentracin irreal, ms baja; y si se derrama una fraccin de la segunda, la fraccin que aporta ms volumen, lo que ocurrir es que obtendremos un volumen ms bajo y una concentracin espermtica ms alta. En consecuencia, una muestra incompleta debe ser desechada. B) Proporcin de las diferentes secreciones Un aumento de secrecin prosttica por infiltracin producir aumento de volumen, diluyendo los espermatozoides y disminuyendo la concentracin.
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C) Abstinencia sexual En un estudio de 11 individuos que recogieron 4 muestras en 8 das (De Jonge et al., 2004; Carlsen, Jorgen, Andersson & Niels, 2004), se observ que la abstinencia entre 1 y 8 das no influye en la movilidad, en la morfologa, en la vitalidad ni en el pH, pero s en las determinaciones de volumen y concentracin, que van aumentando a lo largo de los ocho das. Por otra parte, parece que el periodo de abstinencia de la penltima eyaculacin podra condicionar los valores de la ltima, siempre que una eyaculacin no consiga vaciar los depsitos del epiddimo. Sin embargo, cuantificar en qu medida influye es difcil, por lo que la OMS no lo incluye dentro de las normas a seguir en su ltimo manual. D) Variabilidad biolgica En otro estudio en el que participan 52 individuos a lo largo de 540 das, se puede apreciar que hay unos considerables saltos en la concentracin espermtica, as como en el nmero total de espermatozoides por eyaculacin, en algunos individuos se observan valores por debajo de la normalidad. En el trabajo de Alvarez et al., (2003), se estudian los coeficientes de variacin intraindividuales y entre individuos de los diferentes valores seminales. Se pudo ver que el coeficiente de variacin intraindividual oscila entre el 15-20% para la mayora de valores, y un 26.8% para la concentracin espermtica. Carlsen et al. (2004), tambin estudiaron el coeficiente de variacin intraindividual segn el nmero de muestras estudiadas. Como era de esperar, la variacin disminuye drsticamente tras 10 determinaciones en la contraccin, en cuanto a la movilidad y morfologa el coeficiente se reduce a la tercera y cuarta muestra analizada. Se puede concluir que es imposible caracterizar a un individuo con un solo anlisis de semen y que es necesario realizar 2-3 anlisis para estudiar el estado basal de un individuo. E) Frmacos Podemos encontrar gran cantidad de principios activos que van a afectar la calidad seminal, actuando a diferentes niveles. o o o o o o o o o o Antipsicticos (fenotiazidas) Antidepresivos Antihipertensivos (alfametildopa) Antihistamnicos Andrgenos, esteroides anabolizantes Antiulcerosos (ranitidina, cimetidina) Espironolactona Nitrofurantona Colchicina Quimioterapia
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Preanaltica
Sulpiride
En el caso de que el tratamiento se prolongue en el tiempo y/o que los efectos sean irreversibles, como en la quimioterapia, es recomendable que se conserven los espermatozoides en un banco de semen. F) Txicos o o o o o Marihuana: inhibe GnRH y la espermatognesis. Herona y metadona: disminuyen la gonadotrofinas, la lbido y retrasan e incapacitan la eyaculacin. Cocana: estimula el deseo y la ereccin. Hay estudios que apoyan que afecta a la espermatognesis. Tabaco: afecta a la movilidad espermtica. Acta sobre las enzimas antioxidantes intracelulares. Alcohol crnico: deprime el SNc e interfiere mecanismos que actan sobre la excitacin sexual. Algunos autores destacan que el vino tomado a dosis moderadas aumenta la calidad seminal debido al efecto antioxidante que aportan los componentes de la piel de la uva.
G) Factores ambientales ltimamente se ha descubierto que hay multitud de factores ambientales que actan como disruptores endocrinos. Son sustancias que tienen accin estrognica o antiestrognica. Actan en las primeras fases del desarrollo fetal, en los periodos pre o perinatal, pero sus efectos son de aparicin tarda, pudiendo aparecer incluso en generaciones posteriores. Algunos autores opinan que los disruptores endocrinos son los causantes del llamado Sndrome de disgenesisa testicular, que cursa con: aumento de criptorquidia e hipospadias, aumento de cncer de testculo y descenso en la calidad seminal. La lista de sustancias descritas es muy amplia, pero vamos a destacar algunas para que veamos en qu medida convivimos con ellas peligrosamente de forma ms habitual de lo que imaginamos: Bisfenoles resinas epoxi ............. estn en pegamentos escolares Policarbonato............................. forma parte de los biberones Ftalatos ...................................... en las tetinas de los biberones Benzofenonas ............................ en las cremas solares (en los filtros UV).
H) Duracin de la espermatognesis Otro de los factores que se ha de tener en cuenta cuando se estudie la calidad seminal es que cualquier intervencin sobre el testculo necesitar al menos 75 das (2 meses y medio) para ponerse en evidencia. Esto es as porque la espermatognesis del hombre dura eso, 75 das. Por
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ejemplo, si tenemos el caso de un individuo sometido a quimioterapia, que se sabe afecta la espermatognesis, se deber estudiar si se ha producido la recuperacin normal de sta despus de unos tres meses del tratamiento. I) Otros o o o o Ejercicio fsico Fiebre Estrs Exposicin a altas temperaturas.
2.2
Recogida de las muestras
A) Instrucciones Deben ser claras y si es posible por escrito. En ellas debemos detallarles: o o o o o o o o Lugar de recogida. Forma de recoger la muestra. Contenedores de recogida. Medidas higinicas. Abstinencia. Tiempo recogida-entrega laboratorio. Normas de transporte al laboratorio, si se recoge en casa. Medicacin.
B) Forma de recogida En cuanto a la forma de recoger la muestra el manual de la OMS es muy claro: o o Preferiblemente por masturbacin. Nunca por coitus interruptus, ya que se puede perder la primera fraccin de la muestra, se puede contaminar la muestra y se puede afectar la movilidad por el pH cido de la vagina. El preservativo slo se podr usar cuando haya imposibilidad de realizarlo por masturbacin. Pero no se puede usar un preservativo cualquiera sino preservativos especiales que hay en el mercado, que no llevan espermicidas. Adems, hay que dar una detallada informacin al paciente acerca de: la forma de recogida, cierre y transporte del contenedor.
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Preanaltica
C) Abstinencia sexual La OMS recomienda una abstinencia entre dos y siete das. Adems aconseja que en caso de repeticin se mantengan los tiempos de abstinencia para hacerlo de esta forma en las mismas condiciones y evitar la variabilidad. Recordemos adems que se recomiendan entre 2 y 3 anlisis para fijar el estado basal de un individuo, si bien algunos autores son de la opinin que si el primer anlisis es normal no es necesario volver a repetir. D) Contenedores de recogida Los contenedores de recogida que utilicemos deben ser de cristal o plstico. Adems deben estar testados para comprobar que el material no es txico. Antes de la recogida de la muestra hay que mantenerlos atemperados entre 20-37C. Si se quiere introducir en nuestro protocolo un nuevo contenedor, se ha de someter a un ensayo de toxicidad: o o o o Seleccionar una muestra con alta concentracin y movilidad. La mitad de la muestra se sita en un contenedor de control y la otra mitad en el contenedor problema. Se ensaya la movilidad cada hora durante cuatro horas. Aplicar el t-test y si no encontramos diferencias estadsticamente significativas se considera no txico.
E) Recogida de datos Cuando la muestra es entregada debe ser rotulada: con nombre y apellidos, y con el cdigo de laboratorio. Inmediatamente despus debe ser guardada en estufa a 37C. Adems se le han de preguntar al paciente los siguientes datos: o o o o o o o Si ha tomado alguna medicacin en fechas anteriores. El periodo de abstinencia sexual. Si ha recogido la muestra completa o por el contrario hay prdida de alguna fraccin. Asegurarnos que slo ha recogido una eyaculacin. Si es para anlisis microbiolgico corroborar que ha cumplido las normas de higiene (lavado de manos y genitales y orinar previamente). Hora en que ha recogido la muestra y por supuesto la hora de entrega al laboratorio. La forma de recogida. Debemos descartar el uso de coitus interruptus o de preservativos no homologados para este uso.
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Deberemos anotar adems cualquier incidencia, como dolencia al eyacular, sangrado, etc.
2.3
Recogidas especiales
A) Anlisis microbiolgico En el caso de que la muestra vaya a usarse para anlisis microbiolgico tenemos que tener en cuenta que: o o o Todo el material debe ser estril. No se puede exceder ms de tres horas desde la recogida hasta el inicio del cultivo. Se debe seguir unas normas higinicas para este tipo de recogidas: 1 orinar, con objeto que la orina limpie la uretra de grmenes; 2 lavar genitales y manos con jabn y agua, enjuagar detalladamente con agua y secar; y 3 recoger la muestra.
El anlisis microbiolgico est recomendado tras los siguientes hallazgos: o o o o o o o Hipospermia: volumen bajo de semen y/o pH<7. Hemospermia: sangre o hemates en semen. Leucocitospermia: >106 leucocitos / ml semen. Aglutinaciones espontneas de los espermatozoides en el eyaculado. Marcada asteno-, oligo- o terato-zoospermia. Antecedentes de infecciones urogenitales o de las glndulas accesorias con datos actuales de posible infeccin de va seminal. En casos de inclusin en programas de reproduccin asistida, ya que aqu es fundamental que la muestra de semen no contamine los medios de cultivo enriquecidos de nutrientes en los cuales se incuban normalmente ovocitos y espermatozoides.
B) Bloqueos A veces ocurren los llamados bloqueos, o la imposibilidad de recoger la muestra. o Cuando se trate de una recogida de muestra para una prueba diagnstica no tendr mayor importancia. Trataremos de tranquilizar a nuestro paciente, recomendndole dar una vuelta antes de intentarlo de nuevo. Si el bloqueo persiste se recomendar la recogida de la muestra en casa. El problema surge cuando el anlisis de semen va encaminado a evaluar una muestra que debe ser utilizada posteriormente para tcnicas de reproduccin asistida, donde la recogida no puede dilatar ms all de unas cuantas horas. Si los mtodos anteriores no dan resultado habr que recurrir a la administracin de frmacos, tales como levitra, Cialis o Viagra.
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Preanaltica
C) Eyaculacin retrgrada Otro caso de recogida especial es cuando ocurre una eyaculacin retrgrada, donde la eyaculacin de la muestra en lugar de seguir la va habitual a travs de la uretra asciende hasta la vejiga atravesando el orificio uretrovesical. Hay que sospecharlo en pacientes con un volumen de muestra bajo, menos de 1 ml, incluso con ausencia de eyaculado, lo que se conoce como aspermia. Es frecuente en diabticos, en lesiones medulares y enfermedades neurolgicas. En estos casos podemos recuperar los espermatozoides de la orina y utilizarlos para alguna tcnica de reproduccin asistida, bien inseminacin o fecundacin in vitro. Para ello es necesario alcalinizar primero la orina, cuyo pH es cido, con objeto de conseguir que los espermatozoides sean viables. El protocolo es el siguiente: o o Noche anterior: se ingieren 2 g de bicarbonato sdico para alcalinizar la orina. Da de la recogida: o o o o o o Se recoge la orina en la que medir la osmolaridad y pH. Se ingieren 4 g de bicarbonato en 500 ml de agua (en diabticos 750 ml). Se orina cada 15 minutos hasta que la osmolaridad tenga un valor entre 350-400 miliosmoles/kg, y pH = 6,5-8. Se tiene orgasmo. Se recoge orina en un frasco que tenga 10 ml de medio de cultivo estril. Se centrifugar inmediatamente a 600 g durante 8 minutos. Se resuspende el sedimento en 1 ml de medio de cultivo estril.
D) Anlisis postvasectmicos o o Se recomienda que se haga despus de unas 24 eyaculaciones tras la vasectoma. Lo ideal ser unos cuatro meses. Se deber repetir adems un segundo anlisis entre dos y cuatro semanas del primero. Se recomienda que no se dejen los mtodos anticonceptivos hasta que estos dos anlisis ratifiquen que las muestras son azoosprmicas. A veces ocurre que se encuentran espermatozoides despus de estos cuatro o cinco meses. De hecho el 30% de las muestras estn en este caso, si bien los espermatozoides suelen ser inmviles. En tal caso habr que repetir el anlisis a los 7 meses. El 10% de las muestras siguen teniendo algunos espermatozoides inmviles, menos de 10.000 espermatozoides por mililitro. Es lo que se conoce como azoospermia sui generis y el paciente puede abandonar los mtodos anticonceptivos, pero advirtindole que el riesgo de gestacin es de 1/2000.
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Hay un caso especial. Los llamados embarazos sin espermatozoides. Ocurre en 1 de cada 100.000 pacientes con vasectomas y con muestras azoosprmicas. Para el estudio de estos casos se hicieron las pertinentes pruebas de paternidad. Se debe a recanalizaciones espontneas de los conductos deferentes de forma transitoria. Esto permitir el paso de algunos espermatozoides. Pero lo curioso es que cuando se vuelven a estudiar las muestras de este paciente siguen siendo azoosprmicas, porque la recanalizacin como hemos dicho es transitoria.
En el cuestionario al paciente debe quedar registrada la fecha de la vasectoma y si es la primera muestra que se trae al laboratorio. E) Muestras para criopreservacin Previa a la criopreservacin seminal se requiere la firma de un documento de autorizacin y compromiso por parte del paciente. El consentimiento informado ms extendido en nuestro pas es el de la Sociedad Espaola de Fertilidad: http://nuevo.sefertilidad.com/consentimientos/pdf2008/04.pdf
2.4
Transporte
El manual de la OMS de la 5 edicin recomienda que la recogida de la muestra se haga cerca del laboratorio, para controlar fluctuaciones de temperatura y tiempo al comienzo del anlisis. Pero si no se puede hacer de esta forma hay que ofrecer la posibilidad de recoger la muestra en casa, siempre que se cumpla que: o o o o Hay que llevarla al laboratorio antes de una hora desde la recogida. Transportarla a una temperatura entre 20-37C. Protegerla de la luz. En un contenedor adecuado, que debe ser proporcionado preferiblemente por el laboratorio.
2.5
Recepcin
Una vez entregada la muestra en el laboratorio, antes del cuestionario, se procede a identificarla, con nombre y dos apellidos, as como un cdigo de trabajo del laboratorio y se coloca inmediatamente en estufa, a 37C. Si es posible adems es sometida a rotacin, usando para ello un agitador orbital colocado dentro de la estufa. Conseguiremos as una temperatura y homogenizacin de la muestra ptimas, lo cual deberemos de mantenerlo a lo largo de todo el anlisis. Segn nos indica el manual de la OMS, el anlisis hay que realizarlo preferiblemente antes de transcurridos 30 minutos desde la recogida de la muestra. Nunca debe retrasarse ms de una
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Preanaltica
hora. En casos de anlisis de postvasectoma, el lmite mximo es de 4 horas desde la eyaculacin.
2.6
Conservacin: Criopreservacin
Se excluye expresamente del mbito de aplicacin de este apartado la criopreservacin seminal en donantes de semen, dirigindose nicamente a los casos de uso dentro de la pareja. La criopreservacin seminal consiste en la congelacin y almacenamiento de espermatozoides con fines reproductivos. Es una herramienta fundamental en reproduccin asistida pues permite optimizar los tratamientos de esterilidad y preservar la fertilidad en pacientes que, potencialmente, pueden perderla. Los espermatozoides humanos presentan bajo contenido en agua por su pequeo tamao, matriz viscosa con alto contenido en protenas y azcares, y una estructura compartimentalizada. El dao producido en el espermatozoide por la congelacin y posterior descongelacin tiene lugar a distintos niveles estructurales y/o funcionales, por lo que todava no existe un mtodo de criopreservacin espermtica universalmente aceptado que logre mejores tasas de criosupervivencia. El proceso de congelacin afecta sobre todo a la movilidad espermtica, no existiendo parmetros espermticos en el anlisis inicial que nos permitan correlacionarlos positivamente con la supervivencia. El objetivo principal de la criopreservacin de espermatozoides es mantener su viabilidad y funcionalidad a bajas temperaturas (-196C) durante largos periodos de tiempo frenando los procesos de envejecimiento y degeneracin celular. Las dificultades de la congelacin derivan de los procesos de enfriamiento y calentamiento, y no de la permanencia a bajas temperaturas, puesto que a stas no existen fenmenos de difusin ni energa trmica suficiente para llevar a cabo reacciones qumicas. En el territorio del Estado Espaol la criopreservacin seminal est definida, en la Ley 14/2006 sobre Tcnicas de Reproduccin Humana Asistida, como una tcnica especfica de los establecimientos acreditados para Reproduccin Humana Asistida, y dentro de ellos los que lo estn como Banco de Gametos. Cualquier laboratorio que quiera criopreservar semen deber solicitar la correspondiente acreditacin como banco de gametos. Es una actividad que requiere acreditacin especfica, no siendo suficiente con la solicitada para las actividades habituales de laboratorio. A) Muestras o o Semen fresco. La muestra de semen debe recogerse siguiendo las recomendaciones de la fase preanaltica recogida de muestras. Espermatozoides recuperados. Pueden congelarse espermatozoides previamente seleccionados. No hay un acuerdo generalizado acerca de la tcnica que debe usarse para procesar este tipo de muestras o si este proceso previo a la congelacin tiene algn efecto en la tasa de criosupervivencia.
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Muestras testiculares/epididimarias. Se congelan usando los protocolos estandarizados para semen. Cuando se identifican espermatozoides maduros en la diseccin del tejido testicular o en el aspirado epididimario, estas muestras se tratan del mismo modo que el semen, con el medio de congelacin; pueden usarse, previamente a la adicin del mismo, una solucin tamponada de lisado de eritrocitos para lograr una recuperacin de espermatozoides ms eficiente.
B) Material y equipamiento necesario Todo el material fungible empleado as como los medios de cultivo y de congelacin deben ser estriles y manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar; adems deben estar testados para toxicidad espermtica y tener certificacin CE. Medios de congelacin Los medios de congelacin tienen como objetivo proteger a las clulas del choque producido por el enfriamiento a temperaturas por debajo de 0C, que es uno de los factores ms importantes que afecta a la supervivencia espermtica. Son medios formados fundamentalmente por: o Agentes crioprotectores: potencian la deshidratacin celular y reducen el agua disponible para la formacin de cristales internos; pueden ser penetrantes o no penetrantes, siendo los primeros los ms utilizados. o Penetrantes: sustancias de bajo peso molecular con permeabilidad a travs de la membrana espermtica, lo que permite el desplazamiento del agua celular; glicerol (ms utilizado), etilen-glicol (mejores tasas de criosupervivencia). No penetrantes: sustancias de alto peso molecular, no permeables que favorecen la deshidratacin gracias a la creacin de un gradiente osmtico; glucosa y sacarosa.
Tampones: los ms utilizados en los medios de congelacin son: o o o TRIS (tris-hidroximetil-amino metano) HEPES (cido N-2- hidroxietilpiperacina-N-2-etanesulfnico) TES (acido N-tris-hidroximetil-metil-2-aminoetanosulfnico).
o o
Quelantes: disminuyen el gradiente de concentracin de iones calcio a travs de la membrana plasmtica; los ms frecuentes son EDTA y citrato. Molculas estabilizantes de la membrana espermtica: albmina o lecitina son las ms empleadas actualmente, sustituyendo a la yema de huevo que tiende a dejar de utilizarse por ser de origen animal.
Los medios de congelacin se aaden a las muestras en distinta proporcin segn su composicin y deben aadirse a la muestra lentamente, a razn de 1 gota cada 5 segundos,
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Preanaltica
homogeneizando suavemente la mezcla, para conseguir un equilibrio osmtico eficiente sin provocar alteraciones abruptas en la osmolaridad celular. Material fungible y equipamiento o Sistemas de almacenamiento: el uso de pajuelas CBS (Cryo Bio System) de alta seguridad, fabricadas con resina ionomrica, es el mtodo disponible ms seguro en la actualidad ya que presentan varias ventajas sobre otros sistemas de congelacin (criotubos o pajuelas de PVC): o La estanqueidad. Al estar selladas por sus extremos, no permite el contacto entre el nitrgeno lquido y su contenido, ni que se produzcan prdidas del mismo. Rpida transferencia de temperatura y distribucin homognea en los cambios de la misma, gracias a su pequeo dimetro.
o o
Sistemas de llenado y cerrado de pajuelas: existen sistemas automticos para este fin aunque pueden utilizarse boquillas de llenado y un termosellador para cerrar las pajuelas hermticamente (SYMS, Cryo Bio System, Pars, Francia). Unidades de almacenamiento: visotubos (margaritas), gobelets, etc. Sistema de identificacin de pajuelas: impresora de etiquetas adhesivas resistentes a bajas temperaturas con el nmero de identificacin, equipos que imprimen directamente sobre la pajuela (ej. MAPI CryoBioSystem) incluso existen mtodos de identificacin por radiofrecuencia (RFID tag). Sistemas de congelacin: congelador de velocidad programable o congelador de fase vapor controlado mecnicamente. Tanques de almacenamiento criognicos: pueden utilizar nitrgeno lquido o vapor de nitrgeno. Para pajuelas de alta seguridad se recomienda el uso de contenedores de fase lquida por su capacidad de mantener la temperatura estable a -196 C a pesar de aperturas frecuentes; es conveniente que estn dotados de un sistema de alarma que detecte un aumento de la temperatura (T) o una disminucin del nivel del nitrgeno lquido (si la T aumenta por encima de -132 C, las muestras almacenadas pueden sufrir recristalizacin que produce dao en las clulas congeladas). Pinzas para manipulacin de pajuelas (Rocket Medical Watford, UK). Bombona de suministro de nitrgeno lquido. Instrumento para cortar pajuelas: tijeras de sutura esterilizables.
o o
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C) Mtodos de congelacin Dependiendo de la velocidad de congelacin pueden diferenciarse varios mtodos de congelacin: o Congelacin lenta: la velocidad oscila entre 0,5 C y 10C/min. o Congelacin rpida: la velocidad oscila entre 50-400C/min.
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o o
Congelacin ultrarrpida: la velocidad es aproximadamente 2500C/min. Vitrificacin: la velocidad oscila alrededor de 20000 C/min.
Con el objetivo de cumplir la normativa que establece el RD 1301/2006 (trazabilidad en todos los procesos que conlleva la congelacin y almacenamiento de semen), es fundamental el control exhaustivo de la velocidad y la temperatura de la muestra en cada momento, por lo que actualmente se recomienda la utilizacin de congeladores programables ms que otros mtodos clsicos como la congelacin en vapores de nitrgeno lquido o la congelacin en pldoras en molde de hielo seco. La vitrificacin de espermatozoides tiene la limitacin del pequeo volumen empleado, por lo que slo permite la criopreservacin de un nmero reducido de espermatozoides (muestras para microinyeccin intracitoplasmtica, ICSI, exclusivamente). A continuacin, se exponen dos ejemplos de protocolos de congelacin para espermatozoides, uno con congelador programable y otro manual, dado que existen muchas alternativas a estos procedimientos. Protocolo de congelacin con congelador programable 1. Mientras la muestra completa la licuefaccin (no ms de 30 minutos), atemperar el medio de congelacin a T ambiente. 2. Separar una alcuota de muestra para el anlisis. 3. Medir el volumen de la muestra de semen que se va a congelar y transferir a un tubo de poliestireno; este proceso ser el mismo con muestras de espermatozoides previamente seleccionados, procedentes de biopsia testicular o aspirado epididimario. 4. Calcular el nmero de pajuelas que sern necesarias, teniendo en cuenta la dilucin con el medio recomendada por el fabricante (ej. 1+1 o 3+1). 5. Etiquetar las pajuelas con el cdigo de identificacin correspondiente, elegir el color adecuado (visotubo, manchn, bandera, etc.) de las unidades de almacenamiento y etiquetarlas. Las pajuelas deben identificarse individualmente; de esta manera, si se retiran dos dosis del banco y se descongelan al mismo tiempo, no hay posibilidad de error. El clsico mtodo de cdigo de barras que utiliza lneas con un rotulador de punta fina no se recomienda. 6. Agregar el medio de congelacin lentamente, gota a gota, con movimientos suaves pero continuos del tubo para asegurar el mezclado completo (1 gota cada 5 segundos). 7. Llenar las pajuelas conectndolas al dispositivo de succin (por ejemplo a una jeringa de 1 ml o una bomba del vaco), dejando 1 cm de aire en el extremo final de la pajuela. Usar una boquilla de llenado para evitar que el exterior de la pajuela entre en el contacto con el semen o las paredes del tubo. 8. Sellar los extremos de cada pajuela mediante un termosellador (SYMS, Cryo Bio Sistema, Pars, Francia). 9. Desinfectar el exterior de cada pajuela mediante alcohol 70% (v/v) u otra solucin descontaminante, enjuagar seguidamente con agua estril y secar. 10. Transferir las pajuelas al sistema de bandejas del congelador programable y comenzar el ciclo de congelacin. Un ejemplo de curva genrica de congelacin sera el siguiente:
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Preanaltica
Etapa 1: Reducir la T desde la T ambiente a +4C con una velocidad moderada de enfriamiento de 5C/min. El esperma se deshidrata en un tiempo muy limitado. Etapa 2: Reducir la T de +4C a 80C a una velocidad rpida de enfriamiento de -10C/min. La solucin de espermatozoides comienza a solidificarse. Etapa 3: Reducir la T de 80C a 160C tan rpidamente como permita el sistema de congelacin. El protocolo de congelacin debe congelar a menos de -160C para minimizar el riesgo de dao por recristalizacin durante la transferencia de las pajuelas desde el congelador hasta el recipiente de almacenamiento de nitrgeno lquido. Etapa 4: Finalmente, reducir la T de 160C a 196C sumergiendo las pajuelas en nitrgeno lquido. Este paso debe hacerse muy rpidamente.
o o
11. Sumergir la unidad de almacenamiento (visotubo, gobelet, etc), previamente identificada, en el nitrgeno lquido hasta que no se formen burbujas. 12. Transferir rpidamente, con la ayuda de unas pinzas, las pajuelas de semen congelado a la unidad de almacenamiento, que debe estar llena de nitrgeno lquido. 13. Para verificar la criosupervivencia, poner una pajuela aparte para la valoracin de la movilidad post-descongelacin. Esta verificacin puede realizarse inmediatamente o ms tarde. 14. Colocar el visotubo o gobelet con las pajuelas en el lugar de almacenamiento apropiado del banco (nmero de tanque y canister, nivel del recipiente, etc). 15. Elaborar una tarjeta ndice para los cdigos de identificacin de la pajuela, cdigo de identificacin de la muestra de semen, fecha de congelacin, lugar de almacenamiento y nmero de referencia de laboratorio del anlisis de semen. 16. Anotar toda la informacin en un libro de registro o en un programa informtico especfico. Protocolo de congelacin en vapores de nitrgeno lquido Tiene la ventaja de no necesitar congelador programable, pero las condiciones del proceso estn poco estandarizadas. Realizar todo el proceso como el protocolo anterior hasta el paso 9, y una vez rellenadas y desinfectadas las pajuelas, colocarlas en un contenedor con nitrgeno lquido aproximadamente a 10 cm. de la superficie del mismo durante 30 minutos (un contenedor con una rejilla para depositar horizontalmente las pajuelas es adecuado). Una vez terminado el proceso de congelacin, seguir el protocolo anterior desde el paso 11 para introducir las pajuelas en la unidad y en el sistema de almacenamiento.
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Entrega de instrucciones y contenedor 1 semana antes
Transporte
Recepcin
Conservacin hasta su procesamiento
Fertilidad y capacitacin 1) SEMEN EN CONTENEDOR CUANDO Si espermiograma previo (fertilidad), 3 meses despus. Si vasovasostoma, 6 meses despus. Abstinencia 2-7 das. MTODO Masturbacin. Si no, con preservativo sin espermicida. CONTENEDOR Plstico o vidrio, no txico, 20-37C. LUGAR Lo ms prximo al laboratorio. A 1 hora mximo. Inmediato, mximo 1h 22-37C Protegido de la luz. IDENTIFICAR Nombre,apellidos N Laboratorio. PASAR A CONSERVACIN. 2) CUESTIONARIO CONFIRMAR Totalidad de la muestra. Masturbacin (o preservativo). Slo una eyaculacin. Abstinencia 2-7 das. Si espermiograma previo: 3 meses de diferencia. Si vasovasostoma: anotar fecha de operacin, y muestra 6 meses despus. ANOTAR Medicacin. Hora de recogida de la muestra. Hora de entrega al laboratorio. 30 minutos, mximo 1h. 37C Rotacin.
Tabla 1. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
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Preanaltica
Entrega de Instrucciones y contenedor 1 semana antes MTODO 1) Lavar y aclarar genitales y manos. 2) Orinar. 3) Lavar y aclarar genitales y manos. 4) Masturbacin. CONTENEDOR Plstico o vidrio, estril. LUGAR Lo ms prximo al laboratorio. A 1 hora mximo.
Transporte
Recepcin Cultivo 1) SEMEN EN CONTENEDOR IDENTIFICAR Nombre,apellidos N Laboratorio. PASAR A CONSERVACIN.
Inmediato, mximo 1h 2-8C.
2) CUESTIONARIO CONFIRMAR Medidas higinicas, orinado y lavado previos. Por masturbacin. ANOTAR Hora de recogida de la muestra. Hora de entrega al laboratorio. Bloqueos PARA DIAGNSTICO 1) Despejarse 2) Si persiste, recoger en casa.
Mximo 3 h 2-8C.
El que corresponda.
PARA FIV 1) Despejarse 2) Levitra, Cialis o Viagra
Tabla 1 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
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Entrega de Instrucciones Y contenedor 1 semana antes PREPARATIVOS Abstinencia 2-7 das. Noche previa: Ingerir 2 g NaHCO3 MTODO Recoger orina: 0h. En el laboratorio determinan Osmolaridad y pH. Ingerir 4 g NaHCO3 Recoger orina: cada 15 hasta que el laboratorio diga si la Osmolaridad y pH son adecuados. Orgasmo. Recoger orina. CONTENEDOR DE LTIMA ORINA Frasco con 10 ml de medio de cultivo. LUGAR Prximo al laboratorio.
Transporte
Recepcin
Eyaculacin retrgrada 1) LTIMA ORINA EN CONTENEDOR IDENTIFICAR Nombre,apellidos N Laboratorio. PASAR A CONSERVACIN 2) CUESTIONARIO Inmediato. 22C CONFIRMAR Abstinencia 2-7 das. Noche previa 2 g NaHCO3 Recogida de orina tras alcalinizacin y orgasmo. ANOTAR Medicacin. Hora de recogida de la muestra. Hora de entrega al laboratorio. Procesamiento inmediato
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Preanaltica
Entrega de Instrucciones Y contenedor 1 semana antes
Transporte Postvasectoma
Recepcin
1) SEMEN EN CONTENEDOR IDENTIFICAR Nombre,apellidos N Laboratorio. PASAR A CONSERVACIN 2) CUESTIONARIO CONFIRMAR Totalidad de la muestra. Por masturbacin. Slo una eyaculacin. Abstinencia 2-7 das. Si Control 1) 4 meses dp de vasectoma. Si Control sig) 4 semanas dp del previo. ANOTAR Fecha de vasectoma y del control previo. Medicacin. Hora de recogida de la muestra. Hora de entrega al laboratorio.
CUANDO Control 1) 4 meses despus de vasectoma. Control siguiente: 4 semanas despus del previo. Abstinencia 2-7 das. MTODO Masturbacin. CONTENEDOR Plstico o vidrio. LUGAR Lo ms prximo al laboratorio. A 1 hora mximo.
Inmediato, mximo 1h 22-37C Protegido de la luz.
30 minutos, mximo 4h 22-37C Rotacin.
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Entrega de Instrucciones Y contenedor 1 semana antes Criopreservacin
Transporte
Recepcin
Conservacin Hasta su procesamiento
1) SEMEN EN CONTENEDOR PREPARATIVOS Medicacin (3 meses desde quimioterapia) Abstinencia 2-7 das Leer y firmar Consentimiento informado. MTODO Masturbacin. CONTENEDOR Plstico o vidrio. LUGAR Lo ms prximo al laboratorio. A 1 hora mximo. IDENTIFICAR Nombre,apellidos N Laboratorio. PASAR A CONSERVACIN 2) CUESTIONARIO Inmediato 22-37C CONFIRMAR Totalidad de la muestra. Por masturbacin. Slo una eyaculacin. Abstinencia 2-7 das. Si quimioterapia, 3 meses despus. ANOTAR Medicacin. Hora de recogida de la muestra. Hora de entrega al laboratorio.
1) 30a 37C rotacin. 2) Alcuota semen. 3) Atemperar el medio de congelacin. 4) Medir volumen de semen. 5) Calcular n pajuelas, identificar 6) Aadir medio congelacin: 1 gota en 5, movimiento. 7) Llenado con 1 ml semen. 8) Sellar. 9) Desinfectar el exterior pajuela. OPCIN CONGELADOR PROGRAMABLE 10a) Ciclo congelacin:
T amb4C-80C-160C-196C
Sumergir visotubo en N2(l) y pajuelas. OPCIN MANUAL 10b) Colocar las pajuelas en contenedor de N2(l) a 30 cm de superficie, 30 11) Pajuela control. 12) Tarjeta identificativa y registro.
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Evaluacin inicial del semen
Captulo 3

3.1
Evaluacin inicial macroscpica
A) Licuefaccin La licuefaccin se realiza mediante una simple observacin visual. Una muestra normal es una muestra licuada, homognea, sin grumos ni cogulos. Sin en embargo cuando se eyacula el semen se trasforma en una masa semislida coagulada, es a los pocos minutos cuando el semen comienza a licuarse y homogeneizarse, a veces se encuentran hilos de moco y cuerpos gelatinosos. No tienen ninguna importancia clnica, pero dificultan el anlisis ya que son artefactos que pueden obturarnos una pipeta o impedir una buena colocacin de un cubreobjetos sobre el porta. Hay que intentar separarlos de la muestra a la hora de recoger alcuotas para las diferentes determinaciones. La licuefaccin ocurre normalmente a temperatura ambiente en los primeros 15 minutos tras recoger la muestra. Se considera anormal cuando no ocurre en 60 minutos. Habr que researlos en el informe. Si tenemos dudas con una simple observacin visual siempre nos queda el recurso de observar la muestra al microscopio, donde tendremos la tpica imagen de una muestra no licuada, con manchas que recuerdan a acmulos de grasa.
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Cuando la muestra no lica en 60 minutos hay que recurrir a algn mtodo que nos permita licuarla y homogenizarla porque slo de esta forma obtendremos resultados fiables. o El primer mtodo consiste en aadir una solucin de bromelina, que es una enzima proteoltica que producira la licuefaccin. Esto no se puede hacer en muestras destinadas posteriormente a reproduccin asistida, ya que estn destinadas a ponerse en contacto con gametos femeninos. Por otra parte, al aadir bromelina se puede afectar la movilidad, las determinaciones de bioqumica y de morfologa. Slo debemos usarla para calcular la concentracin espermtica. Otro sistema sera diluir la muestra con igual volumen del tampn fosfato PBS. El tercer sistema sera el ms sencillo. Consiste en pasar la muestra por una jeringa dotada de aguja roma con un calibre de 18-19. Hay que actuar con cuidado para no formar burbujas que afectaran a nuestros resultados.
o o
B) Viscosidad Podemos utilizar dos mtodos: o o El ms sencillo y que recomendable consiste en recoger la muestra con pipeta pasteur y dejar caer gota a gota. Tambin puede hacerse introduciendo una varilla de vidrio en la muestra, observando el filamento que forma.
En cualquiera de los dos mtodos se considera anormal cuando se forma un filamento de ms de 2 cm; para considerarse normal debe caer gota a gota. No hay que confundir una muestra viscosa con una muestra no licuada. El aspecto de la muestra puede ser lquido, homogneo y luego hacer un gran filamento cuando la recogemos con pipeta pasteur, en el caso de ser muy viscosa. La viscosidad elevada interfiere prcticamente con todas las determinaciones: movilidad, concentracin, anticuerpos antiespermatozoide, bioqumica. Fundamentalmente es debido a la dificultad de recoger con pipeta un volumen de muestra determinado, lo que imposibilita cualquier tipo de cuantificacin. Para eliminar la viscosidad se realizan los mismos tratamientos que en el caso anterior de falta de licuefaccin. C) Apariencia Un semen normal debera ser homogneo, gris opalescente. o A veces puede tener un aspecto traslcido; ello es debido a que posiblemente tenga una baja concentracin de espermatozoides.
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o o o
Un aspecto marrn-pardo nos indicar un sangrado en tracto genital horas o das antes. Si la coloracin es rojiza nos indicar la presencia de hemates frescos, procedentes de un sangrado en el momento de la recogida. El color amarillento es indicativo de ictericia, o presencia de ciertas vitaminas. Tambin es posible que se deba a presencia de altos niveles de flavoprotenas oxidadas, procedentes de vesculas seminales. Esto indica una elevada abstinencia. Tambin en casos de leucospermia.
D) Volumen Para la medida del volumen el manual de la OMS nos describe dos mtodos. o Mediante pesada. Para ello debemos asumir la siguiente aproximacin: que la densidad de la muestra de semen es 1. Por tanto, que la masa es igual al volumen, que un gramo de semen corresponde a un ml. Lo que haremos es pesar el recipiente vacio, etiquetas incluidas. Una vez recogida la muestra pesaremos el recipiente de nuevo. La diferencia calculada nos dar nmero de gramos, que como hemos dicho anteriormente corresponder al volumen de la muestra en mililitros. o Medida directa del volumen. Se necesitan recipiente de recogida graduados. Son difciles de conseguir y caros por lo que recomendamos el mtodo mediante pesada.
Lo que no debemos hacer nunca es medir el volumen mediante transferencia a pipetas, jeringas o probetas. Estos mtodos de transferencia darn lugar a errores superiores a los dos mtodos anteriormente descritos. El manual establece el lmite inferior de referencia en 1,5 ml. o Un volumen bajo es indicativo de algunas de las siguientes alteraciones: o o Obstrucciones de vas seminales o ausencia de conductos deferentes. Cuando se ha producido prdida de alguna fraccin de la muestra en el momento de la recogida. Por eso es importante interrogar sobre una muestra correcta as como la ausencia de incidentes durante ella. Tambin se puede producir por eyaculacin retrgrada, patologa que ocasiona que el semen no sigue su va natural de salida, que es la uretra, sino la va ascendente y a travs del orificio uretro vesical se vierta dentro de la vejiga junto con la orina.
Un volumen alto puede ser producido por el aumento de volumen de secrecin de algunas glndulas, en caso de inflamacin.
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E) pH El pH refleja el balance entre las diferentes secreciones, principalmente entre el pH alcalino de vesculas seminales y el cido de la prstata. El lmite inferior de referencia establecido es de 7,2. Un pH por debajo de 7, unido a oligo o azoospermia y a un volumen bajo, nos va a sugerir la agenesia u obstruccin de vesculas seminales y/o conductos deferentes, as como indicar infeccin. Esto impide la salida total o parcial de secreciones procedentes del testculo (espermatozoides) y de vesculas seminales, con un pH bsico. Respecto a la realizacin tcnica debemos usar tiras de papel pH graduacin 6-10. Chequear el color antes de 30 segundos. Situamos la muestra sobre el papel y antes de transcurrido ese tiempo debemos hacer la lectura. Chequear tiras reactivas con soluciones patrn de pH para asegurar la buena calidad de nuestro resultado.
3.2
Evaluacin inicial microscpica
Para su realizacin es imprescindible un microscopio. Se aconseja adems que est dotado de contraste de fases y que cuente con la pletina termostatizada a 37C. En la evaluacin microscpica realizamos en primer lugar una observacin a 100x, usando para ello un ocular 10x y objetivo 10x. En esta primera observacin vamos a estudiar las agregaciones, las aglutinaciones y por ltimo las clulas no espermticas. Pasaremos luego a colocar un objetivo 20x o 40x. La observacin a 200x o 400x nos permite hacer la estimacin de la dilucin que necesitamos para calcular la concentracin espermtica, y tambin el estudio de la movilidad espermtica. Utilizaremos un simple portaobjetos con su cubreobjetos correspondiente, pero necesitaremos que tenga una profundidad de campo de 20 micras, para que no se obstaculice el libre movimiento de los espermatozoides. Teniendo en cuenta que la profundidad de campo es igual al volumen de muestra dividido por el rea que ocupa, las 20 micras de profundidad las obtendremos de las siguientes combinaciones: (tabla 2)
VOLUMEN DE MUESTRA V (l = mm3) 10 6,5 11 AREA DEL CUBREOBJETOS A (mm2) 22x22 = 484 18z18 = 324 21x26 = 546 PROFUNDIDAD DE CAMPO P= V/A (mm) 0,020
Tabla 2. Clculo de la profundidad de campo para el estudio microscpico Se vuelve a recordar que la muestra debe estar atemperada a 37C y que adems debe estar bien homogenizada. Para ello, tal y como dijimos anteriormente lo ideal es colocar un agitador
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orbital dentro de la estufa. Otro mtodo alternativo que nos indica el manual de la OMS es por aspiracin 10 veces de la muestra con pipeta de plstico de 1,5 mm de dimetro. La falta de homogenizacin de la muestra provocar que en una muestra: o o o La mayor concentracin, as como los espermatozoides con mejor movilidad y morfologa se encuentren en la superficie. Por el contrario un menor nmero de espermatozoides, con peor movilidad y morfologa se encontrarn en el fondo de la muestra. Adems encontraremos tambin en el fondo el resto de las clulas no espermticas.
A) Observacin a 100X Colocamos por ejemplo, 10 l de la muestra de semen en el porta y sobre l un cubre 22x22. Lo ponemos en el microscopio atemperado a 37C, y observamos con el objetivo de 10x. Agregaciones Las agregaciones son la adherencia de espermatozoides (inmviles o mviles) a clulas no espermticas o detritos. No son especficas, no tienen ninguna significacin clnica. Aglutinaciones Las aglutinaciones son espermatozoides mviles adheridos a otros espermatozoides mviles. S son especficas, por lo que pueden tener significacin clnica. No son evidencia suficiente para deducir la presencia de anticuerpos antiespermatozoides, pero s nos sugieren investigar su presencia. Existen diferentes tipos, en cuanto al lugar de unin y al nmero de espermatozoides unidos. Ilustracin 1.
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PARTES 1.AISLADOS <10 spz 2.MODERADO 10-50 spz
GRADOS 3.ALTA >50 spz 4.MUY ALTA Todos aglutinados
CabezaCabeza
FlageloFlagelo
PuntaFlagelo
CabezaCabeza + FlageloFlagelo
CabezaFlagelo
Ilustracin 1. Diferentes partes y grados de aglutinacin entre los espermatozoides Clulas no espermticas El eyaculado contiene otras clulas y su identificacin puede ser clnicamente relevante. Son las llamadas clulas no espermticas, que incluyen a clulas epiteliales y clulas redondas. El nombre genrico de clulas redondas engloba a clulas germinales inmaduras y a leucocitos. Diferenciar las clulas epiteliales de las clulas redondas es relativamente fcil, ya que se trata de clulas muy diferentes en morfologa. La misma tincin que usaremos en morfologa, Diff Quick, las diferencia claramente. Sin embargo, diferenciar con este tipo de tinciones las clulas de la espermatognesis de los leucocitos no resulta fcil en la mayora de los casos, es necesario recurrir a pruebas especficas como las de actividad de peroxidasa o a anticuerpos frente al antgeno CD45; la de la peroxidasa es la ms comn, y ser la que estudiaremos ms adelante.
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B) Observacin a 200X o 400X Movilidd La clasificacin de los tipos de movilidad que introduce el quinto manual de la OMS ha supuesto un gran cambio con relacin a manuales anteriores. En estos se diferenciaba la movilidad progresiva en lenta y rpida, establecindose el punto de corte de los dos en una velocidad de 25 micras por segundo. En este nuevo manual se unifican en un solo tipo de movilidad, la movilidad progresiva, quedando por tanto slo tres tipos de movilidad (Ilustracin 2): o o o Espermatozoides inmviles (IM). Espermatozoides con movilidad no progresiva (NP). Espermatozoides con movilidad progresiva (PR): lineal o en crculos amplios, independientemente de la velocidad.
Ilustracin 2. Tipos de movilidad de los espermatozoides (spz). A (progresivo rpido) B (progresivo lento) se agrupan en movilidad progresiva spz-PR C es mvil no progresivo spz-NP D es inmvil spz-IM. La razn de este cambio es la simplificacin en la medida de un parmetro que exiga un gran adiestramiento por parte del observador. Anteriormente debamos adiestrarnos para poder distinguir entre una velocidad mayor y menor de 25 micras por segundo, haba algunas dudas visuales, como considerar el valor de 25 lo que medan aproximadamente 5 cabezas de un espermatozoide o la mitad de un flagelo. Pero salvo que se utilizara un sistema automtico tipo C.A.S.A. (anlisis del movimiento de los espermatozoides asistido por ordenador), supona dotar a la tcnica de un gran componente subjetivo. Y como es de suponer esto se traduce en la posibilidad de cometer error. Tambin ha habido cambios en los valores de referencia. El quinto manual establece el lmite inferior de referencia para la movilidad total en 40% (38%-42%), y para la movilidad progresiva 32% (31%-34%).
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Para la valoracin de la movilidad, se monta el portaobjetos con 10, 6,5 u 11 l de muestra y se cubre con el cubreobjetos, 22x22, 18x18 o 21x26. Se deja en reposo 1 minuto a 37C y se sita en microscopio de contraste de fases, atemperado a 37C. Se observa con el objetivo de 20x o 40x. o Se intentar hacer en un rea definida, para ello se imaginar un cuadrado en el centro y esa ser el rea de contaje; lo perfecto sera disponer de una retcula (Ilustracin 3A). Cuando se cuenta un campo se debe iniciar el contaje inmediatamente, como si los espermatozoides comenzaran a moverse en ese justo momento. Primero se cuentan los espermatozoides con movilidad progresiva, luego los espermatozoides con movilidad no progresiva y por ltimo los inmviles, siguiendo el sentido de las agujas del reloj (Ilustracin 3B).
o o
Se debe intentar hacer el contaje con un solo golpe visual, lo que se conseguir tras un buen adiestramiento, aunque parezca raro, esto es ideal ya que se consigue menor error que con el sistema de ir contando uno a uno.
Ilustracin 3. Procedimiento para facilitar el contaje de la movilidad. A) simulacin de una rejilla en el campo visual. B) Punto de partida y trayectoria visual del contaje.
Hay que tener ciertas precauciones: o Se debe contar siempre a una distancia de los bordes mayor de 5mm con objeto de prevenir artefactos. A partir de esa distancia y conforme nos acerquemos al borde, el movimiento ir disminuyendo hasta encontrar slo espermatozoides inmviles. (Ilustracin 3B). Se debe hacer un doble contaje, para ello habr que preparar dos portaobjetos. Al menos hay que contar 5 campos en cada uno de estos portaobjetos.
o o
50
Hay que contar al menos 200 espermatozoides por porta. Si no se consigue contando 5 campos, se deber seguir hasta alcanzar ese nmero de 200.
Ilustracin 4. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos porcentajes
MEDIA (%) 0 1 2 3-4 5-7 8-11 12-16 17-23 24-34 35-65
DIFERENCIA ACEPTABLE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MEDIA (%) 66-76 77-83 84-88 89-92 93-95 96-97 98 99 100
DIFERENCIA ACEPTABLE 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Tabla 3. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de 200 spz (400 spz) Posteriormente hay que evaluar los resultados utilizando la grfica (ilustracin 4) y la tabla 3 del intervalo de confianza del 95% para diferencias entre los dos porcentajes. Esto equivale al mximo error esperado entre dos contajes en el 95% de los casos cuando el nico error es el atribuible al contaje. Si el error es mayor habr que hacer dos nuevas preparaciones y empezar de nuevo.
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Ejemplo de la valoracin de la Movilidad:

%PR 28 35 32 7 %NP 22 29 25 7 %IM 50 36 43 14 NO VALIDO
1 PREPARACIN 2 PREPARACIN MEDIA DIFERENCIA VALORACION
La media de los espermatozoides inmviles ente 50 y 36 es de 43% y la diferencia es de 14. Se puede apreciar que la diferencia obtenida supera la diferencia mxima admisible que es 10, por tanto, el resultado no es vlido y se debe repetir todo el proceso. Estimacin del recuento Al igual que para el estudio de la movilidad, se proceder a montar el portaobjetos con 10 l de muestra (por ejemplo) y lo cubrimos con el cubreobjetos correspondiente, 22x22. Se deja en reposo 1 minuto a 37C y se sita en el microscopio. Segn el nmero de espermatozoides que se cuenten se realizar una determinada dilucin (tabla 4). A veces se puede encontrar un nmero muy alto de espermatozoides, para lo cual est aconsejado hacer una dilucin 1/50.
200x >404 64-400 <64 400x >101 16-100 <16 DILUCIN: 1/20 1/5 1/2 l semen 50 50 50 l diluyente 950 200 50
Tabla 4. Clculo de la dilucin necesaria segn el recuento estimado
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Estudio bsico del espermiograma
Captulo 4

4.1
Recuento
El protocolo de contaje en concentracin se ha diseado para contar por lo menos 400 espermatozoides, ya que cuantos ms espermatozoides se cuenten menor error se comente. Dilucin para el recuento Material necesario: o o o Pipetas de desplazamiento directo, que son las adecuadas cuando se manejan muestras de semen. Pipetas automticas normales, de aspiracin por aire. Medio de dilucin Weigman: Bicarbonato sdico Formol (35%) Agua 50g 10 ml csp 1l.
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La dilucin se hace tomando como base el diluyente Weigman. El diluyente al estar preparado con formol inmovilizar los espermatozoides y nos permitir contarlos ms fcilmente, cosa que no ocurre con otro tipo de mtodos que cuentan espermatozoides vivos. Se aade posteriormente el semen usando la pipeta de desplazamiento directo. La dilucin debe estar perfectamente homogenizada, usando si es posible un agitador tipo vortex. Todo hay que hacerlo por duplicado. Cmara de contaje La OMS recomienda cmaras que tengan al menos 100 micras de profundidad y que permitan el contaje con muestras fijadas, sin movimiento. Sin embargo no recomienda, lo cual no quiere decir que prohba: o o o Cmaras de pequeo volumen, que slo permitan contar pocos espermatozoides. Cmaras llenadas por capilaridad ya que el llenado es desigual. Cmaras que utilicen muestras no fijadas, o sea que cuente espermatozoides mviles.
Segn todo esto, la mejor opcin para la OMS es la Neubauer improved. Esta cmara cumple todos los requisitos anteriores, y es adems una cmara barata, importantsimo para la OMS ya que uno de sus propsitos es la estandarizacin de las tcnicas que propone. La cmara esta subdividida en dos subcmaras, lo que nos va a permitir el doble de contaje de forma ms rpida (ilustracin 5A).
Ilustracin 5. Detalles de la cmara Neubauer improved. A) Consta de dos subcmaras; B) cada subcmara tiene 9 rejillas; C) La rejilla 5 est formada por 25 cuadrados grandes; D) Cada cuadrado grande est enmarcado por una triple lnea, y se divide en 16 cuadrados pequeos
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Cada una de las dos subcmaras tiene 9 rejillas, cada una de las rejillas tiene 100 nl de volumen. Por tanto, el total de la cmara es de 900 nl (ilustraciones 5B). Cada rejilla est formada por cuadros que llamaremos grandes, agrupados en filas. A su vez, cada cuadro grande est dividido por una triple lnea en cuadros que llamaremos pequeos. Centrndonos en la 5, sta tiene 25 cuadros grandes y cada uno de ellos est dividido en 16 cuadros pequeos (ilustraciones 5C, 5D). Clculo del volumen total de una rejilla: o o Base = Lado x Lado ; Base = 1 mm x 1 mm = 1 mm
2 2 3
Volumen = Base x Altura; Volumen = 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm = 100 nl
N DE REJILLA 4,6 2,8 1,3,7,9 5
N CUADROS GRANDES 20 20 16 25
VOLUMEN/CUADRO 100 nl/ n cuadros g nl 5 5 6,25 4
N FILAS 5 4 4 5
VOLUMEN/FILA 100 nl/ n filas nl 20 25 25 20
Tabla 5. Clculo del volumen de cada unidad de rejilla Mtodo de recuento o o o o o o o o Se ha de llenar la cmara de Neubauer improved con cada una de las dos diluciones que hemos preparado. Se deja 5 minutos de reposo en cmara hmeda para que los espermatozoides se asienten. Contar en la rejilla 5 hasta 200 espermatozoides. (Ilustracin 6A) Si no se completan los 200 espermatozoides contar en la 4, y si tampoco se completasen, seguir en la 6. Contar siempre filas completas. Si se llega a 200 contar toda la fila. Para diluciones al seguir contando las 9 rejillas. Apuntar el nmero de espermatozoides y las filas contados. Respecto a la triple lnea que separa los cuadrados grandes, se ha de tener en cuenta lo siguiente (Ilustracin 6B): o o o La lnea media muestra el cuadrado relevante. Contar todos los espermatozoides que estn dentro del cuadro central. Contar cuando la cabeza cae dentro.
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Si la cabeza est justo en la lnea central, se cuentan los de la lnea vertical izquierda y horizontal inferior, y no se cuentan los de la vertical derecha y horizontal superior (estos se contarn en otro recuento).
Ilustracin 6. Ejemplo de recuento en cmara Neubauer improved. A) Se cuentan filas completas empezando por la rejilla 5 y siguiendo por la 4 y 6 si fuese necesario. B) Contaje de espermatozoides en uno de los cuadrados grandes: en crculo los que se cuentan en ese cuadro, y en rectngulo los que no son vlidos o se cuentan en otro cuadro Clculos para el recuento Evaluacin de los resultados Una vez contados al menos 200 espermatozoides en cada una de las dos cmaras debemos evaluar los resultados. Como chequeo se calcula la suma y diferencia de los dos contajes y se compara con la grfica (ilustracin 7) o tabla 6 que recoge el intervalo de confianza del 95% para diferencias entre dos contajes; que corresponde a la diferencia esperada en el 95% de muestras slo por error estadstico de contaje. Mayores diferencias sugieren: error de dilucin, de contaje, o una distribucin no homognea de espermatozoides en la dilucin.
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Ilustracin 7. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos recuentos
SUMA 144-156 157-169 170-182 1083-196 197-211 212-226 227-242 243-258 259-274 275-292 293-309 310-328 DIFERENCIA ACEPTABLE 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 SUMA 329-346 347-366 367-385 386-406 407-426 427-448 449-470 471-492 493-515 516-538 539-562 563-587 DIFERENCIA ACEPTABLE 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
Tabla 6. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de 200 spz (400 spz) Si hemos contado 400 espermatozoides totales, el lmite mximo de diferencia entre los dos contajes es de 39, si la diferencia superara el lmite permitido habra que empezar desde el principio, preparando dos nuevas diluciones y realizando de nuevo el doble contaje. Clculo final o Para diluciones 1/5, 1/20, 1/50, en las que se han contado las filas de los cuadros 5, 4, 6, de las dos subcmaras, se ha de tener en cuenta el volumen correspondiente de cada fila (tabla 5):
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Para una dilucin , en la que se han contado las dos subcmaras:
Expresin del resultado del recuento El resultado final se da con dos cifras significativas: si es menor de 10 se da el nmero entero con un decimal; si es igual o mayor de 10 slo se da el nmero entero. El manual de la OMS establece el valor conocido como lmite inferior de referencia para la concentracin y para el contaje total de espermatozoides como sigue. o o Nmero total: 39 millones de espermatozoides / eyaculado. (33-46). Concentracin: 15 millones de espermatozoides / ml (12-16).
Ejemplo para la valoracin del recuento: o o Supongamos que en la primera valoracin en el microscopio a 400x, entre porta y cubre 22x22, y 10 l de semen, se observan 170 espermatozoides. Tendremos que realizar una dilucin al 1/20. En la cmara de Neubauer improved contamos 205 spz en la 1 subcmara y en la 2 253 spz, la diferencia mxima permitida para la suma (458) es 42, inferior a la obtenida (48); el recuento no es vlido. Habremos de preparar otro par de diluciones al 1/20 y volver a contar en Neubauer. Ahora en la 1 subcmara tenemos 215 spz y en la 2 232 spz, la diferencia permitida para el total (447) es 41, por tanto, es vlido el recuento. Supongamos que hemos necesitado contar 2 filas de la rejilla 5 en la 1 subcmara y 3 filas de la rejilla 5 en la 2 subcmara; un total de 5 filas. Ahora tendremos que aplicar la frmula C = (N spz/n filas) x (1/20 l) x Factor dilucin.
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MUESTRA
Porta + cubre 22x22 10 l semen
MTODO 400X Neubauer improved 50 l semen + 950 l dil. Weigman 1 Dil. 2 Dil. 3 Dilucin 4 Dilucin
RECUENTO 1 1 Subcmara 2 Subcmara Suma Diferencia Valoracin 2 1 Subcmara 2 Subcmara Suma Diferencia Valoracin Clculo
170 spz/campo 205 253 458 48 No vlido 215 232 447 17 Vlido C = (447/5)x(1/20)x20 = 89 millones spz / ml
4.1.1.
Criptozoospermias y azoospermias
El nuevo manual de la OMS dedica una especial atencin al anlisis de la concentracin espermtica cuando el nmero de espermatozoides es extremadamente bajo. o o Se conoce como Criptozoospermia cuando no hay espermatozoides en el eyaculado pero s son observados tras centrifugacin. Y Azoospermia cuando hay ausencia de espermatozoides, incluso tras usar un mtodo de anlisis validado.
Hay que ser especialmente cuidadoso a la hora de discriminar entre criptozoospermia y azoospermia ya que la orientacin teraputica cambia radicalmente. o o Una muestra con criptozoospermia suele ser vlida para realizar la tcnica de reproduccin asistida ICSI. Sin embargo, la nica posibilidad de poder realizar esa tcnica en un paciente con azoospermia es recurrir a una biopsia de testculo. Tras tratamiento de la pieza biopsiada se estudia la existencia o no de espermatozoides, que tras ser aislados nos servirn para nuestra tcnica de ICSI.
En teora slo seran candidatas a biopsia de testculo y posterior ICSI las azoospermias obstructivas. Sin embargo la popularizacin de la tcnica de biopsia de testculo ha demostrado que en la mayora de azoospermias secretoras existen algunos focos de tbulos seminferos con espermatognesis funcional y por tanto estos pacientes son tratados como si fuera una azoospermia obstructiva.
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En las azoospermias con volumen seminal muy bajo hay que descartar la existencia de una eyaculacin retrgrada. En este caso los espermatozoides eyaculados en lugar de seguir la va habitual son vertidos a la vejiga a travs del orificio uretrovesical. Es importante conocerlo porque la recuperacin de esos espermatozoides posibilita la realizacin de tcnicas de reproduccin asistida. La forma de tratar la muestra va a depender de: o o o Si slo necesitamos saber si hay o no espermatozoides. Si tienen o no movilidad. Si la concentracin exacta es requerida.
Si slo necesitamos saber si hay o no espermatozoides o o Cuando el nmero de espermatozoides por campo sea menor de 4 (a 400x), desde un punto de vista clnico es suficiente informar: concentracin <2 millones / ml. Cuando no se observen espermatozoides se ha de centrifugar la muestra: o 1 ml de semen, 15 minutos a 500g de Fuerza Centrfuga Relativa (FCR). Esta ltima se calcula as: FCR = 1,118 x 10-5 x R x V2. Siendo R = Radio (en cm), V = Velocidad (en revoluciones por minuto). Decantar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 50 l. Poner 10 l en porta y poner cubre 22x22. Observar a 200x todo el porta (484 campos). Si se observan espermatozoides catalogar como criptozoospermia. Al no centrifugar toda la muestra este no es un mtodo de cuantificacin. No se excluye que pueda haber espermatozoides en el resto de la muestra.
o o o o o o
Si tienen o no movilidad A veces es importante saber si adems los espermatozoides son mviles. Por ejemplo si los necesitamos para hacer una ICSI, en la cual slo trabajamos con espermatozoides mviles. Al igual que en el caso anterior: o o Cuando el nmero de espermatozoides por campo sea menor de 4 (a 400x), desde un punto de vista clnico es suficiente informar: concentracin <2 millones / ml. Cuando no se observen espermatozoides, en este caso no se pueden centrifugar porque podra alterar la movilidad. o o Se pone 40 l en porta y se coloca un cubre 24x50. Hay que observar a 200 aumentos todo el porta (unos 1200 campos).
60
Si la concentracin exacta es requerida Podemos usar dos mtodos de trabajo: o Cmara Neubauer, mtodo ya descrito. Doble dilucin con Weigman a y contaje.
Si se cuentan <200 spz / subcmara: Se ha de expresar: Resultado + Error del n spz asociado (>5%) El error asociado se podr calcular mediante la frmula: ( )
Si se observan >0 y <25 spz / subcmara: Si suponemos un error mximo admisible del 20%, sera necesario contar al menos 25 espermatozoides, lo que supondran 27777 espermatozoides por mililitro, y esa sera la sensibilidad del mtodo.
Se ha de expresar: El nmero de espermatozoides es demasiado bajo para poder precisar la concentracin, ya que esta es menor que la sensibilidad del mtodo empleado, que es de 27777 spz/ ml. Se informa por tanto que la concentracin es menor de 27777 spz/ ml.
Si se observan 0 espermatozoides: El intervalo de confianza del 95% del valor 0 es 0 y 3,7, quiere esto decir que el 95% de las veces que contemos 0 el valor estar comprendido entre 0 y 3,7. El error asociado a un contaje de 3,7 es el 52%. La concentracin de espermatozoides cuando se cuentan 3,7 espermatozoides por el mtodo ya descrito es 4100 spz/ ml.
Y se ha de expresar: No se observa ningn esperm atozoide en la evaluacin realizada. Sin embargo el nmero de espermatozoides medidos (0) lleva asociado a un error de contaje alto, del 52% y un intervalo de confianza al 95% entre 0 y 3,7. Significa esto que si la muestra es analizada 100 veces, 95 veces
61
encontraremos valores comprendidos entre 0 y 3,7 espermatozoides. Por este motivo aunque no hayamos observado ningn espermatozoide slo podemos asegurar con una probabilidad del 95% que la concentracin es menor de 4100 spz/ ml (concentracin correspondiente a 3,7 spz). o Mtodo de fluorescencia, en cmara Leja
La cmara Leja es desechable, est dividida en dos subcmaras, cada una de las cuales tiene 100 micras de profundidad y un volumen de 25000 nl. Procedimiento o o o o o o o Mezclar bien la muestra. Preparar dos alcuotas: 1 p. semen + 1 p. dilucin del fluorocromo Hoeschst 33342 en formol. Llenar cada cmara del portaobjetos Leja con 25 l de las diluciones replicadas, una rplica por cada cmara. Guardar la cmara horizontalmente durante 10-15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, en cmara hmeda. Examinar con ptica de fluorescencia a 250x. Contar al menos 200 spz en cada rplica. Anotar el nmero de espermatozoides y campos evaluados.
Clculo:
Si se cuentan <200 spz / subcmara, se ha de expresar: Resultado + Error (>5%) ( )
Si se observan >0 y <25 spz / cmara: Si suponemos un error mximo admisible del 20%, sera necesario contar al menos 25 espermatozoides, lo que supondran 1000 espermatozoides por mililitro, y esa sera la sensibilidad del mtodo.
Se expresar: El nmero de espermatozoides es demasiado bajo para poder precisar la concentracin, ya que esta es menor que la sensibilidad del mtodo
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empleado, que es de 1000 spz/ ml. Se informa por tanto que la concentracin es menor de 1000 spz/ ml. o Si se observan 0 espermatozoides:
Y se expresar: No se observa ningn espermatozoide en la evaluacin realizada. Sin embargo el nmero de espermatozoides medidos (0) lleva asociado un error de contaje alto, del 52% y un intervalo de confianza al 95% entre 0 y 3,7. Significa esto que si la muestra es analizada 100 veces, 95 veces encontraremos valores comprendidos entre 0 y 3,7 espermatozoides. Por este motivo aunque no hayamos observado ningn espermatozoide slo podemos asegurar con una probabilidad del 95% que la concentracin es menor de 150 spz/ ml (concentracin correspondiente a 3,7 spz).
4.2
Morfologa
La clasificacin de normalidad de la OMS se basa en considerar un espermatozoide normal al integrante de una subpoblacin de espermatozoides potencialmente fertilizadores seleccionados naturalmente en el moco cervical. Procedimiento para la morfologa o o o Se ha de realizar por duplicado. Elegir dos portaobjetos y limpiarlos vigorosamente con papel por ambos lados. Identificarlos. Hacer la extensin: con otro porta hacer un ngulo de unos 45 y tocando la gota arrastrar en el sentido que marcan las flechas de la imagen. Hacerlo a una velocidad tal que se tarde aproximadamente un segundo en hacer el arrastre de la gota sobre el porta. Ilustracin 8A. Si la muestra es de baja concentracin (<2 millones / ml.): o o o o o Centrifugar a 600g durante 10 minutos. Posteriormente resuspender el pellet. Depositar de 5-10 l de muestra bien homogenizada en el extremo del portaobjetos. Se hace la extensin de igual manera que en la Ilustracin 8A. Se debe hacer constar en el informe en caso de haber centrifugado la muestra, que esta manipulacin puede afectar a los resultados de la morfologa. Es importante seguir las instrucciones precisas ya que un volumen de muestra mayor producira una extensin con los espermatozoides menos separados
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dificultando la medida, y un ngulo superior a 45 producira una extensin ms fina, al igual que si se aumenta la velocidad de la extensin. o Si la muestra es viscosa se ha de tratar la muestra segn uno de los siguientes mtodos: o o Diluir una alcuota de muestra de semen con igual volumen de solucin de bromelina, incubar a 37C durante 10 minutos. O bien diluir una alcuota de entre 0,2-0,5 ml en 10 ml de solucin salina, como PBS. Centrifugar a 800g durante 10 minutos. Obtener el pellet y resuspender en unos 20-40 l. Despus del tratamiento, hacer una extensin usando una pipeta pasteur, tal y como se aprecia en la ilustracin 8B.
Ilustracin 8. Tcnica para realizar una extensin de semen. A) En muestras de viscosidad normal, se utiliza un porta a 45 para el arrastre de una gota en un segundo ; B) En muestras viscosas, previamente tratadas, se emplea una pipeta pasteur o Secar al aire las extensiones. Se ha de ser consciente de los inconvenientes de este paso: o o o o Se produce una deshidratacin menor que si la fijacin hubiera sido en hmedo. Se produce la expansin de las cabezas de los espermatozoides inmaduros. Se produce la prdida de la gota citoplasmtica osmticamente sensible.
Proceder a alguno de los siguientes mtodos de tincin: o o o Papanicolaou. Shorr. Diff-Quik. Muy fcil de usar y muy usada hoy en da: Solucin de fijacin: 15 segundos en solucin de Triarilmetano en Metanol o 1 hora en Metanol al 95%. Solucin de tincin 1, Xanthene acidfilo: 10 segundos. Solucin de tincin 2, Thiazine basfilo: 2-5 segundos.
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o o
Agua: 10-15 veces. Dejar secar.
Observar al microscopio a 1000 aumentos. Se deben contar al menos 200 spz/porta.
Interpretacin de la morfologa Un espermatozoide debe cumplir los siguientes criterios estrictos (Kruger) en cada una de sus partes para considerarse normal. Ilustracin 9. o Cabeza: o o o o o o Forma oval. Longitud 3,7-4,7 micras. Anchura 2,5-3,2 micras. Relacin longitud/anchura 1,3-1,8. Acrosmica 40-70% de la cabeza.
Pieza intermedia: o o o o Anchura <1 micra. Longitud 1 y cabeza. Unin axial a la cabeza. Gotas de restos citoplasmticos <1/3 de la cabeza.
Flagelo: o o Recto o no presentar angulaciones bruscas que sugieran rotura. Longitud 45 micras.
Restos citoplasmticos: o El rea de los restos citoplamsticos debe ser menor a 1/3 de la cabeza.
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Ilustracin 9. Clasificacin de los defectos morfolgicos de los espermatozoides o Defectos especiales: o o o Flagelos sueltos. Cabezas sueltas. Sndrome de globozoospermia: todos los flagelos carecen de acrosoma. Los espermatozoides son incapaces de fertilizar ovocitos in vivo, debi a la imposibilidad de penetrar a travs de sus envolturas. Como alternativa se propone realizar la ICSI, microinyeccin intracitoplasmtica de espermatozides, y usando inductores de la activacin tales como ionforos del calcio.
Los flagelos y cabezas sueltas no se cuentan (ilustracin 6B), al igual que en la concentracin, sin embargo las cabezas sin acrosoma s estaran dentro de las anormalidades de la cabeza. No obstante, la OMS hace una apreciacin sobre los defectos especiales, y es que si estas anomalas son muy abundantes si se cuentan e informan, en el caso de la globozoospermia habra que destacar este hecho, de tal forma que no pase desapercibido para el clnico. http://bit.ly/ThJ9p0 Aqu se puede descargar el 5 manual de la OMS (pginas 73-95: atlas de espermatozoides) y un material didctico sobre Morfologa espermtica.
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Valoracin de la morfologa Como en tcnicas anteriores, una vez obtenidos los resultados hay que evaluarlos utilizando la tabla del intervalo de confianza del 95% para diferencias de dos porcentajes. Si el error es mayor, no ser necesario repetir las dos preparaciones como en el caso de la concentracin, pero s que se tendr que repetir el contaje de ambas. El quinto manual de la OMS establece un valor para el lmite inferior de referencia para la morfologa espermtica del 4%.
4.3
Vitalidad
El manual de la OMS sugiere que el test de vitalidad debe hacerse de forma rutinaria en todas las muestras y considera que es obligatorio cuando la movilidad progresiva es menor del 40%. Fundamento de las tcnicas para la vitalidad El estudio de vitalidad lo podemos realizar usando diferentes tcnicas: o Con colorantes supravitales: Eosina y Eosina/Nigrosina. Se basa en que los colorantes no pueden atravesar una membrana plasmtica estructuralmente intacta, de tal forma que un espermatozoide vivo ser aquel cuyo ncleo no est teido de rojo; y en el caso de que la membrana est estructuralmente daada ser atravesada por los colorantes, por lo que un espermatozoide muerto ser aquel cuyo ncleo se tia de rojo. o Test hipoosmticos. Se fundamenta en estudiar la funcionalidad de la membrana plasmtica cuando est situada en el medio hipoosmolar. Cuando la membrana est funcionalmente activa no permite la salida de sustancias osmticamente activas y compensa el desequilibrio osmtico captando agua, por lo que la membrana del espermatozoide se hincha y el flagelo se riza. Se considera pues que un espermatozoide con la membrana hinchada es un espermatozoide funcionalmente activo y por tanto vivo; sin embargo, si la membrana no est funcionalmente activa permitir la salida de sustancias osmticamente activas y no se hinchar, en este caso un espermatozoide se considera no funcional. Diversos estudios (Jeyendrn, 1984; Ramirez, 1992) han demostrado que no existe un alto grado de correlacin entre test colorantes y test hipoosmticos ya que miden efectos caractersticos diferentes de la membrana plasmtica. Por una parte los colorantes nos estaran midiendo el estado estructural de la membrana plasmtica y el test hipoosmtico el estado funcional. Es por eso que el resultado del test de colorantes siempre ha de ser superior al test hipoosmtico: un espermatozoiode vivo, no teido con el colorante, podr tener el test hipoosmtico positivo o negativo, ser funcional o no; pero un espermatozoide muerto debe tener el test hiposomtico negativo siempre.
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4.3.1.
Test de los colorantes supravitales
Tcnica de la Eosina o Solucin de Eosina: Eosina Y .......................... 0,67 g ClNa ................................ 0,9 g Agua ............................... 100 ml Disolver la Eosina y ClNa en agua purificada y calentada. o Procedimiento de la Eosina (hacer por duplicado): o o o o Mezclar 5 l de semen con 5 l de la solucin de eosina, en un portaobjetos. Cubrir con un cubreobjetos 22x22. Dejar la preparacin 30 segundos en reposo. Observar en microscopio de contraste de fases a 400 aumentos. Contar al menos 200 spz/porta.
Tcnica de la Eosina/Nigrosina o Solucin Eosina/Nigrosina: Nigrosina ........................ 10 g Solucin Eosina ............... 100 ml Mezclar la Nigrosina con la solucin Eosina, hervir, filtrar, enfriar y guardar en bote de vidrio. o Procedimiento de la Eosina/Nigrosina (hacer por duplicado): o o o o Se mezcla en un porta 50 l de semen y 50 de solucin Eosina/Nigrosina. Se mezclan las dos gotas y se esperan 30 segundos. Se toma por capilaridad la dilucin de la muestra preparada y se hace una extensin en un nuevo portaobjetos. Secar las muestras y observar las extensiones a 1000 aumentos. Contar al menos 200 spz/extensin.
El test de de la Eosina/Nigrosina tiene dos ventajas: o o Permite un mejor contraste de la imagen, por lo que facilita la visualizacin de la muestra. Al usarse una extensin fijada permite guardar y reevaluar la muestra.
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Interpretacin
Diferenciar un espermatozoide vivo de uno muerto es bastante fcil con estas tcnicas: o Los espermatozoides teidos corresponden a los muertos. o Los no teidos corresponde a los vivos. Si slo se tie la zona del cuello o la cabeza tiene una ligera coloracin rosa, se considera que el espermatozoide est vivo.
Ilustracin 10. Ejemplo del test de vitalidad con Eosina/Nigrosina. A) Espermatozoide muerto, teido; B) Espermatozoide vivo, ligeramente teido; C) Espermatozoide vivo, sin teir 4.3.2. Tcnica o o Solucin hipoosmtica: Citrato sdico y fructosa en agua. Procedimiento (por duplicado): o o o Dispensar en un tubo 1 ml de la solucin hipoosmtica y 0,1 ml de semen. Se mezclan y se dejan 30 minutos en estufa a 37C. Depositar una gota de la preparacin entre porta y cubreobjetos. Observar en microscopio de contraste de fases a 400 aumentos. Contar al menos 200 spz/preparacin. Test hipoosmticos
Interpretacin La identificacin al microscopio es relativamente fcil (ilustracin 11): o o Se considera negativo cuando no hay hinchamiento de la membrana, con lo que el flagelo queda intacto. Si el test es positivo, espermatozoides viables, hay hinchamiento de la membrana y el flagelo se altera adoptando distintas formas en funcin del grado de hinchamiento.
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Ilustracin 11. Ejemplo del test de vitalidad con Sol. Hiposmtica. El Hos(-) est intacto, muerto; los Hos (+) que tienen el flagelo encogido en distinto grado por hinchamiento, estn vivos Valoracin de los resultados de ambos test de vitalidad Al igual que en el recuento, se ha de evaluar el resultado de la vitalidad mediante la grfica o tabla del intervalo de confianza del 95% para diferencias entre dos porcentajes. Si el error es mayor se deber preparar y contar dos nuevas preparaciones. El lmite inferior de referencia que marca el nuevo manual de la OMS es del 58%. La vitalidad puede servirnos como evaluacin de los resultados de movilidad. Esto es as porque el tanto por ciento de espermatozoides viables siempre debe ser igual o superior al de espermatozoides mviles. Por ejemplo: o Si el resultado de la vitalidad es del 40%, no podemos admitir como vlida una movilidad del 50%, porque para ello habra que asumir que el 10% de los espermatozoides muertos se mueven. En cambio si por ejemplo el test de vitalidad es del 40% y el de movilidad del 35% ser correcto, ya que esto supone que un 5% de espermatozoides vivos no se mueven, algo absolutamente coherente.
La vitalidad tambin puede servir para descartar problemas en la obtencin de la muestra. Si el 100% de los espermatozoides son inmviles se han de valorar los siguientes supuestos: o o o Que haya habido problemas de obtencin de la muestra, por el uso de detergentes o espermicidas. Descartar el que se haya usado un preservativo en la recogida. Que se trate de un transporte inadecuado de la muestra, bien por la temperatura o por el tiempo. Que sea un Sndrome de Kartagener: en este caso habra un 100% de espermatozoides inmviles pero con resultados de vitalidad aceptables. La ausencia de la protena Dinena incapacitara la movilidad de los espermatozoides.
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Tambin se debe valorar clnicamente los casos de movilidad baja con resultados de vitalidad aceptables: o Podra deberse a una Polispermia. Una elevada concentracin espermtica podra provocar una baja movilidad debido a un agotamiento del sustrato fructosa, importante como fuente de energa para la movilidad. Otras causas: estructurales, dficit enzimticos, etc.
Si se obtiene una vitalidad y movilidad bajas. o Podra deberse a un dao celular por peroxidacin de lpidos de membrana, fenmeno que es potenciado por la presencia de leucocitos o por el envejecimiento de muestras.
El estudio de la vitalidad puede tener una utilidad teraputica, como es el caso de la tcnica ICSI. Esta tcnica consiste en microinyectar un espermatozoide vivo dentro de un ovocito. En el caso de que todos los espermatozoides sean inmviles, se podr realizar un test hipoosmtico y seleccionar un espermatozoide hinchado que sera viable. Con una micropipeta se aspirara y se inyectara dentro del ovocito. Todo esto utilizando microscopio invertido con el equipo de micromanipulacin adecuado.
4.4
Anticuerpos antiespermatozoides
Los anticuerpos antiespermatozoide son anticuerpos generados frente a antgenos especficos del espermatozoide. Estos antgenos no estn presentes en la vida fetal en el momento del imprinting inmunolgico ya que la espermatognesis no se activa hasta la pubertad. Esto hace al espermatozoide una estructura desde el punto de vista antignico extraa. Adems los antgenos expresados sobre los espermatozoides maduros difieren en ms de un 50% de los expresados por las espermatogonias. Los anticuerpos antiespermatozoide tendrn relevancia clnica si estn adheridos a la membrana plasmtica ya que alteran su fisiologa y su funcionalidad. Los antgenos presentes en plasma seminal actan de camisa de proteccin inmunolgica. Pero en caso de una patologa sera una posibilidad de estimulacin autoinmune de la cual el espermatozoide sera la vctima inocente. No es igual que estn unidos en el flagelo que en la cabeza. Aqu la capacidad fecundante se puede ver ms alterada. Mecanismos de defensa de la autoinmunidad: o En los tbulos seminferos, las clulas de Sertoli se unen entre ellas a travs de unas 50 a 60 uniones, formando una barrera de defensa conocida como Barrera Hematotesticular. o Esta barrera asla el comportamiento adluminal donde se encuentra el espermatozoide del compartimento basal y del contacto con clulas inmunocompetentes del torrente sanguneo, evitando as el reconocimiento inmunolgico del espermatozoide.
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Adems la barrera deja pasar pequeas cantidades de antgenos espermticos al torrente, lo que estimulara los linfocitos T supresores, induciendo un estado de tolerancia inmunolgica.
o o
En la Rete Testis ser la reducida vascularizacin la que contribuya a la inmunosupresin de los espermatozoides. La inmunosupresin a nivel epididimario estar producida por la presencia de un elevado nmero de linfocitos T supresores y por la produccin de sustancias de cubierta inmunosupresoras que actan a diferentes niveles. Por otra parte diversas sustancias producidas por la prstata y las vesculas seminales actan como inmunosupresores.
Estas barreas y mecanismos de defensa a nivel tisular y de la va seminal pueden ser alterados poniendo en contacto con el sistema inmunocompetente las estructuras del espermatozoide y las sustancias inmunognicas del plasma seminal, producindose una autovacunacin antiespermatozoide. Varias patologas androlgicas pueden causar alteraciones de la barrera: o o o o o o o o Traumas. Intervenciones quirrgicas. Necrosis, torsiones testiculares. Neoplasias. Varicoceles Criptorquidias. Infecciones recidivantes del tracto genitourinario. Obstrucciones.
Una vez rota la barrera los anticuerpos producidos pueden tomar contacto con los espermatozoides alterando su funcionalidad. El Manual sobre Anlisis de semen de la OMS sigue manteniendo en su quinta edicin la obligatoriedad de realizar el estudio de anticuerpos antiespermatozoides en todos los seminogramas. Adems, es particularmente importante cuando encontramos aglutinaciones o movilidad baja, lo cual no quiere decir que siempre que haya aglutinaciones se corresponda con la presencia de anticuerpos antiespermatozoide. Se considera que existe un factor inmunolgico cuando ms del 50% de los espermatozoides mviles de un eyaculado tienen adheridos anticuerpos antiespermatozoide. En casos positivos se estudiarn: los isotipos presentes, la intensidad de respuesta y la localizacin del anticuerpo. Hay que tener en cuenta que los niveles de respuesta inmune fluctan, por lo que es interesante el seguimiento de los niveles de anticuerpos antiespermatozoide en el factor masculino inmunolgico. Sin embargo, encontrar anticuerpos no implica necesariamente el factor
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inmunolgico. Para ello hay que demostrar que existe una alteracin funcional mediante pruebas funcionales. En un eyaculado con anticuerpos antiespermatozoide generalmente hay anticuerpos de los isotipos inmunoglobulinas G o inmunoglobulinas A. Los anticuerpos inmunoglobulinas M no suelen encontrarse debido a su gran tamao. Cuando se encuentran inmunoglobulinas A lo normal es que estn acompaadas por inmunoglobulinas G, siendo las inmunoglobulinas A las que tienen una mayor importancia clnica. Habitualmente se suelen usar tcnicas que detectan los anticuerpos inmunoglobulinas G como cribaje poblacional y en caso positivo se debe estudiar la presencia de anticuerpos inmunoglobulinas A. La importancia clnica de los anticuerpos antiespermatozoide depender tambin de su localizacin a lo largo de la membrana plasmtica. o o o La alteracin funcional ms grave se produce cuando se fijan a nivel de la cabeza o de la pieza intermedia, alterndose los procesos de capacitacin espermtica. Cuando se fijan en el flagelo se producirn alteraciones de la movilidad. Por ltimo, no tienen ninguna relevancia clnica y por tanto no deben ser considerados los anticuerpos adheridos a la punta del flagelo.
Fundamento de las tcnicas para anticuerpos antiespermatozooides Las tcnicas para la deteccin de anticuerpos antiespermatozoide se basan en una reaccin de aglutinacin de los anticuerpos con esferas recubiertas de anticuerpos antiinmunoglobulinas. Se basan en medir el % de espermatozoides mviles que tienen adheridos anticuerpos y por tanto esferas en su superficie. Permiten caracterizar los isotipos presentes as como cuantificar la respuesta inmunolgica. Sin embargo el hecho de medir solamente sobre espermatozoides mviles, hace que en casos de Astenozoospermia elevada y Necrozoospermia no tengan ninguna utilidad y por tanto sean intiles para detectar un factor inmunolgico masculino. Las tcnicas ms usadas son: o o Test Inmunobead o IB test. Reaccin mixta de antiinmunoglobulinas o MAR test.
Las dos tcnicas pueden ser utilizadas como: o o Test directos que nos permiten la deteccin de anticuerpos antiespermatozoide adheridos a espermatozoides, o Test indirectos para la deteccin de anticuerpos antiespermatozoide en fluidos como lquido seminal, suero, fluido cervical.
Vamos a desarrollar los test directos por ser los de primera eleccin, y con mayor detalle los M.A.R. test directos por ser los ms implantados.
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IB TEST DIRECTO o o o o Utiliza semen lavado. Emplea una matriz de poliacrilamida. Nos permite detectar IgG e IgA tanto de origen secretor como no secretor. Nos dar ms informacin que el Mar test al no interferir el lquido seminal.
En esta tcnica los anticuerpos antiespermatozoide se pondrn en evidencia en caso de existir porque se unirn a ellos antiinmunoglobulinas G o A fijados a las esferas de poliacrilamida y por tanto se observan los espermatozoides mviles con las esferas adheridas. o M.A.R. TEST DIRECTO o o o o Se emplea semen completo. Es un test rpido, fcil y sensible. Permite detectar los isotipos IgG e IgA de origen secretor. Nos da menos informacin que el test inmunobead al no haberse eliminado el lquido seminal.
Para identificar la presencia de anticuerpos fijados en espermatozoides se aadirn esferas de ltex a las que se une Inmunoglobulinas, del isotipo G o A. Posteriormente se aadirn anticuerpos antiinmunoglobulinas, frente a los del isotipo G o A. Si hay anticuerpos antiespermatozoide fijados, formarn un complejo de unin con stos y con las esferas de ltex unidas a inmunoglobulinas. Por lo tanto el espermatozoide fijar bolitas de ltex slo si tiene anticuerpos adheridos. Procedimiento del M.A.R. test directo En portaobjetos y por duplicado poner. o o o o o o o 3,5 l de semen completo y 3,5 l de esferas revestidas con IgG (o IgA humana). Mezclar. Aadir 3,5 l de antisuero frente a IgG (o IgA humana). Mezclar y cubrir con cubre 22x22. Mantener 3 minutos en cmara hmeda. Realizar la observacin microscpica a 400x utilizando contraste de fases. Contar al menos 200 espermatozoides en cada portaobjetos. Realizar la observacin en cmara hmeda: o 1 medida, a los 3 minutos. Si el 100% de los espermatozoides mviles presentan esferas unidas no hacer ms observaciones.
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2 medida, a los 10 minutos. Valorar el porcentaje de los espermatozoides mviles con esferas unidas. Si los espermatozoides se hubieran vuelto inmviles a los 10 minutos considerar como vlida la medida a los 3 minutos.
Interpretacin del M.A.R. test directo o o o o o Se considera un espermatozoide positivo, con anticuerpos en su superficie, si es mvil y tiene esferas adheridas. Si no hay anticuerpos en las membranas de los espermatozoides mviles, stos nadarn libremente entre las partculas. Anotar el lugar de unin: cabeza, parte intermedia o flagelo. Ignorar si las esferas estn unidas en la punta del flagelo. Calcular el porcentaje de cada preparacin.
Como en todas las tcnicas se debe realizar la evaluacin de resultados mediante el clculo del intervalo de confianza del 95% para diferencias de dos porcentajes. Si el error es mayor se debe prepara y contar dos nuevas preparaciones de la muestra. Valores normales del M.A.R. test directo El nuevo manual sigue sin dar unos valores normales, entendiendo por ellos unos realizados estudiando una poblacin de varones frtiles. Aunque se mantiene el valor de consenso del 50% como valor indicativo. Esto es as porque hay estudios que demuestran que la penetracin de espermatozoides en moco cervical y fertilizacin in vivo tiende a no correlacionar cuando los valores de anticuerpos antiespermatozoides son iguales o superiores a 50%.
4.5
Otras clulas
Adems de espermatozoides, el eyaculado contiene otras clulas: o o Clulas epiteliales. Clulas redondas, una terminologa que agrupa a leucocitos y clulas de la espermatognesis. Un nmero alto de estas clulas puede ser indicativo de procesos inflamatorios o alguna patologa o alteracin a nivel testicular.
Como procedimiento estndar se debera hacer de forma rutinaria el contaje de clulas redondas. Si el nmero supera la concentracin de un milln por mililitro debera investigarse la presencia de leucocitos por alguno de los mtodos establecidos. Para calcular la concentracin de estas clulas podramos recurrir al mtodo ya visto, doble dilucin y medida en cmara de Neubauer improved. Se hara a la par que se realiza el contaje de los espermatozoides para la medida de la concentracin espermtica. Sin embargo este mtodo no es muy apropiado, ya que salvo que haya una alta concentracin de clulas redondas
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las diluciones empleadas suelen ser demasiado altas como para poder realizar una medida fiable, que recordemos pasa por contar al menos 400 elementos para obtener un error que no supere el 5%. Por tanto, la forma ms adecuada para calcular la concentracin de clulas redondas es usando las extensiones teidas para la realizacin de la morfologa espermtica. A la vez que se hace la morfologa se anotar el nmero de clulas redondas visualizadas y se aplicar la siguiente frmula:
o o
Si se cuentan menos de 400 clulas redondas el error es superior al 5%, y aparte del resultado hay que informar el error asociado al n de espermatozoides contados. Si se cuentan menos de 25 clulas redondas, el error es superior al 20%, que recordemos se consideraba el error mximo permitido para poder dar un resultado respetable. Por lo tanto, el resultado se debera acompaar con el comentario de que el nmero de clulas redondas contadas es demasiado pequeo para poder asegurar esa concentracin.
Ejemplo o Supongamos que en una de las preparaciones Diff-Quik, a la vez que vamos contando la morfologa, contamos 16 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En la otra preparacin, contamos 19 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En total habremos contado 35 clulas redondas por 400 espermazotoides. Para un contaje de 35 clulas la diferencia mxima permitida es de unos 10, en nuestro caso es 3. Luego el resultado ser apto. Si no lo fuera tendramos que recontar de nuevo las dos preparaciones. Aplicando estos datos a la frmula ya conocida, obtendremos una cifra de 7,79 millones/ ml. El resultado no debe tener ms de dos cifras significativas, por lo tanto informaremos 7,8 millones de clulas redondas / ml. Pero no hemos contado 400 clulas redondas sino 35, con lo que el error ser mayor del 5% y deberemos informarlo, el error ser del 17%. El informe final ser millones clulas redondas / ml, con un error del 13%. Se ha de tener en cuenta que al superar el milln por mililitro debe ser investigada la presencia de leucocitos por alguno de los mtodos vlidos, como el test de la peroxidasa.
o o o
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EXTENSIN EN PORTA Y TINCIN DIFF-QUIK. 1000X RECUENTO Clulas Redondas Espermatozoides 1 preparacin 16 200 2 preparacin 19 200 Suma 35 400 Diferencia 3 Valoracin APTO Clculo C= (C spz x N Clulas Redondas)/400 C = (89 x 35)/400 C = 7,8 millones Clulas Redondas/ ml Error %SE = 100 (N/N) %SE = 100 (35/35) = 17%
4.5.1.
Leucocitos
Los leucocitos, principalmente polimorfonucleares, estn presentes en la mayora de eyaculados. Un nmero alto se asocia con posible infeccin y pobre calidad espermtica. El posible dao que producen en espermatozoides depende del nmero de leucocitos y de la relacin entre el nmero de leucocitos y espermatozoides. Los leucocitos producen un ataque oxidativo alterando la movilidad de los espermatozoides y la integridad del DNA. Procedimientos o Tincin de Papanicolaou: se pueden diferenciar los leucocitos de las clulas de la espermatognesis, espermatidas y espermatocitos. Pero la diferenciacin no siempre es fcil, adems la mayora de laboratorios no disponen de esta tcnica de tincin que es mucho ms compleja que el diff quik. Tincin con anticuerpos frente a antgenos CD 45 de los leucocitos. Test de la Peroxidasa. Es la usada mayoritariamente.
o o
Test de la Peroxidasa o Fundamento Las peroxidasas del leucocito polimorfonuclear reaccionan con el agua oxigenada de la solucin de trabajo desprendiendo oxgeno que reacciona a su vez con la ortotoluidina, oxidndola y haciendo que adquiera el tono marrn. o Limitaciones o o No se tien leucocitos polimorfonucleares que estn activados y hayan liberado sus grndulos de peroxidasa. No se tien linfocitos, macrfagos o monocitos ya que no contienen grnulos de peroxidasa.
77
Tcnica o Hay que preparar cuatro soluciones: 1 NH4Cl................................ 250 g/ L 2 Na2EDTA ........................... 50 g/ L en PBS 3 Orto-toluidina................... 0,25 mg/ ml 4 H2O2 ................................. 30% o Con estas cuatro soluciones se prepara la Solucin de trabajo: 1 ml de la Solucin 1 1 ml de la Solucin 2 9 ml de la Solucin 3 1 gota de la Solucin 4 o o o o A 0,9 ml de la Solucin de trabajo se aade 0,1 ml de semen. Realizar por duplicado. Agitar 2 minutos. Dejar 20-30 minutos a temperatura ambiente. Agitar y proceder al recuento.
El recuento se hace en cmara de Neubauer, de forma similar a la concentracin espermtica. Al menos hay que contar 200 clulas peroxidasa positivas en cada subcmara, para lo cual se contarn el nmero de rejillas completas necesarias. Despus se evaluarn los resultados mediante grfica del intervalo de confianza al 95% para diferencia entre dos contajes. Por ltimo se calcular la concentracin segn la frmula:
El resultado se dar con dos cifras significativas, por ejemplo si obtenemos 2,74 lo redondearemos a 2,8.Si se cuentan menos de 400 clulas el error ser superior al 5% y junto al resultado habr que informar el error asociado al nmero de clulas contadas. Para calcular la sensibilidad del mtodo, suponiendo un error mximo admisible del 20%, la sensibilidad sera 138888 PMN / ml
Si se observa algn leucocito pero menos de 25, se expresar: El nmero de leucoc itos es demasiado bajo para poder precisar la concentracin, ya que sta es menor que la sensibilidad del mtodo, que es de 138888 PMN/ ml. Se informa por tanto que la concentracin es menor de 138888 PMN/ ml.
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Ejemplo o Supongamos que al realizar por duplicado el contaje obtenemos en una subcmara completa 102 leucocitos en las 9 rejillas, y en la segunda 119 leucocitos tambin en las 9 rejillas. Al haber contado 221 leucocitos deberamos obtener una diferencia mxima de unos 29, en nuestro caso la diferencia es de 17, por lo tanto nuestros resultados sern vlidos. Al aplicar la frmula obtenemos 1,23, e informaremos slo dos cifras significativas: 1,2 millones leucocitos/ ml. Puesto que hemos contado <400 leucocitos se ha de informar el error, que sera 7%, as el informe sera: C (leucocitos) = 1,7 millones / ml (error 7%).
MUESTRA RECUENTO LEUCOCITOS 1 Subcmara 2 Subcmara Suma Diferencia Valoracin Clculo NEUBAUER IMPROVED 400X 0,1 ml semen + 0,9 ml Sol Peroxidasa 1 PREPARACIN 102 119 221 17 Apto C = (N PMN/ N rejillas) x (1/100) x Factor Dil C = (221/18) x (1/100) x 10 C = 1,2 millones PMN / ml %SE = 100 (N/N) %SE = 100 (221/221) = 7% 0,1 ml semen + 0,9 ml Sol Peroxidasa 2 PREPARACIN
o o
Error
Valores de referencia El manual no establece unos valores de referencia con la poblacin de estudio de este manual, es decir, en parejas que han quedado gestantes en el plazo de un ao o menos. Mientras no existan estudios, se mantiene el valor de referencia de 1 milln de leucocitos por mililitro.
4.5.2.
Clulas de la espermatognesis inmaduras
Generalmente en semen se encuentran: espermtides redondas, espermatocitos, y raramente espermatogonias. Un recuento alto de este tipo de clulas indicara desrdenes en la espermatognesis.
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Procedimientos o Tincin de Papanicolau. Las espermtides y espermatocitos se pueden diferenciar de los leucocitos mediante la tincin de Papanicolau en funcin de la coloracin adquirida, forma y tamao del ncleo. Sin embargo, cuando los leucocitos degeneran en procesos inflamatorios resulta difcil diferenciarlos mediante esta tcnica. Imagen, Test de la peroxidasa. Test de anticuerpos frente a antgenos CD 45 de los leucocitos. Estas dos ltimas tcnicas son una aproximacin, ya que habra que asumir que las clulas que no son leucocitos polimormonucleares son clulas germinales. o Tinciones especficas del acrosoma (con lectinas o anticuerpos especficos). Tien el acrosoma que comienza a desarrollarse en las espermtides.
o o
El tamao nuclear tambin ayuda a la identificacin: o o o Espermatogonia-8 micras Espermatocito-10 micras Espermtida-5 micras.
Sin embargo, esto slo sirve de referencia porque la degeneracin o los periodos de divisin afectan estos tamaos. http://bit.ly/ThJ9p0 Aqu se puede descargar el 5 manual de la OMS (pginas 97-99: atlas de clulas).
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Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
Captulo 5

5.1
5.1.1.
Caracteres funcionales de los espermatozoides

Prueba de interaccin moco cervical-esperma
Estas pruebas permiten apreciar la aptitud de los espermatozoides para migrar en el moco y adems, son esenciales en la evaluacin de la calidad funcional de los espermatozoides. La prueba de Hhner es un examen solicitado sistemtica y precozmente en el estudio de la subfertilidad de la pareja. A) Prueba de Hhner o prueba poscoital Se trata de una prueba simple, no invasiva y barata. Aporta informacin sobre la calidad del moco cervical consecuencia de la secrecin de estrgenos y de la calidad del movimiento flagelar de los espermatozoides. Las anomalas en la interaccin moco-esperma son responsables del 5 al 15% de los casos de infertilidad. Se hace en el perodo preovulatorio. Para un ciclo de 28 das, se recomienda practicarla al decimotercer da. Los pacientes tienen que tener una relacin sexual de 2 a 18 horas antes del examen. La paciente no tiene que hacer la limpieza ntima antes de ir al laboratorio. La primera etapa de este examen consiste en apreciar la calidad del moco cervical por el estudio de su volumen, su viscosidad, su filancia, su cristalizacin y su celularidad.
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Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
El estudio de estos parmetros permite establecer un ndice, el ndice de Insler (Insler score). o o Si el ndice de Insler es superior a 10, el moco es de buena calidad, de tipo ovular. Si es inferior a 10, el moco no es de tipo ovular.
La prueba es considerada como: o o Positiva si existen ms de 10 espermatozoides mviles por campo con un aumento de 400. Si la prueba es negativa (<10 spz/campo), puede tratarse o de un moco inadecuado o de una patologa espermtica (disquinesia flagelar). o En caso de negatividad de la prueba por problema del moco, debe repetirse cuando mejore, o despus de tratamiento antibitico si haba infeccin o, lo ms frecuentemente, despus de tratamiento estrognico. Si la prueba es negativa y el moco es de buena calidad, se solicita una prueba de penetracin cruzada in vitro.
B) Prueba de penetracin cruzada in vitro Exige diferentes materiales biolgicos: moco cervical de la mujer, esperma del marido, esperma testigo y moco testigo. Consiste en poner en contacto el moco de la mujer con el esperma de su pareja, los espermatozoides del paciente con un moco testigo y el moco de la paciente con el esperma testigo. Esta prueba tambin se realiza lo ms prximo posible a la ovulacin. Evala la calidad y la cantidad de espermatozoides que ha penetrado en los diferentes mocos. La interpretacin de esta prueba es a veces difcil cuando existe participacin del moco y de los espermatozoides, en los defectos de migracin. Permite ver si se trata de un problema de moco o un problema de espermatozoides. o Si los espermatozoides probados no penetran ni en el moco de su pareja, ni en el moco testigo, mientras que el esperma testigo s penetra en el moco testigo, se trata de un problema espermtico. Si al contrario, el esperma probado penetra en el moco testigo y no en el moco probado y el esperma testigo no penetra tampoco en el moco probado, se trata de un problema de moco. Anlisis del movimiento de los espermatozoides asistido por ordenador (C.A.S.A.)
5.1.2.
El objetivo es poner de manifiesto las anomalas del movimiento difcilmente visibles en la observacin microscpica simple. Se puede solicitar el caso de prueba de Hhner y prueba de penetracin cruzada negativas por causa espermtica, en caso de sospecha de anomala del movimiento en el espermiograma (como por ejemplo presencia de espermatozoides de migracin deslizante).
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Un espermatozoide presenta habitualmente un movimiento sinusoidal y su trayecto se caracterizada por bastantes parmetros (Ilustracin 12): o o Amplitud del giro lateral de la cabeza respeto a la pieza intermedia (ALH); Velocidad de progresin lineal en m/s (VSL): velocidad media del desplazamiento segn una lnea recta trazada entre la primera y la ltima posicin detectada de la cabeza; Velocidad curvilnea en m/s (VCL): velocidad media del desplazamiento de la cabeza a lo largo de su trayectoria real, tal como se ve en dos dimensiones en el microscopio; Velocidad segn el trayecto medio en m/s (VAP): velocidad media de desplazamiento de la cabeza siguiendo el trayecto medio; Linealidad del trayecto igual a la relacin VSL/VCL. Media del desplazamiento angular (grados), MAD. La media de los valores del ngulo de giro instantneo de la cabeza de los espermatozoides a lo largo de su trayectoria curvilnea.
o o o o
Ilustracin 12. Parmetros de la trayectoria del espermatozoide, medidos por ordenador. ALH: amplitud del giro lateral de la cabeza respeto a la pieza intermedia. MAD: media del desplazamiento angular. VAP: velocidad segn el trayecto medio. VCL: velocidad curvilnea. VSL: velocidad de progresin lineal. Aqu se puede ver un vdeo demostrativo del anlisis del movimiento asistido por ordenador: http://www.micropticsl.com/esp/productos/analisis_esperma_sca_video03.html 5.1.3. Estudio de la reaccin acrosmica
Este examen se practica en muy pocos laboratorios. Los espermatozoides capacitados tienen que ser capaces de efectuar la reaccin acrosmica con el fin de penetrar en los ovocitos. Parece bien demostrado que el resultado de la fecundacin in vitro (FIV) est correlacionado con la tasa de reaccin acrosmica y que un fracaso de FIV puede ser debido a la ausencia de reaccin
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acrosmica. As, una tasa de reaccin acrosmica inducida inferior o igual al 5% sera predictiva de una tasa dbil de fecundacin. Este examen se solicita en el caso de presencia en el espermiocitograma de un porcentaje importante de anomalas del acrosoma o despus de un fracaso de la FIV. 5.1.4. Prueba de fecundidad heteroespecfica
Permite estudiar, por una parte, la interaccin entre las membranas ovocitarias y la membrana del espermatozoide y por otra parte, la aptitud de los espermatozoides para desarticular su ncleo despus de su penetracin en un citoplasma ovocitario. Se hace con ovocitos de hmster depelucidados, ya que la pelcida es una barrera interespecies. Es de realizacin delicada y slo se hace en algunos laboratorios de Biologa de la Reproduccin. Se valoran las cabezas expandidas por ser indicativas de que el ncleo del espermatozide, que estaba muy contrado en el momento de entrar en el ovocito, ha conseguido entrar en l, ha desaparecido la membrana nuclear del espermatozoide, se ha descondensado la cromatina y expandido el ncleo dentro del ovocito. La prueba es positiva si se observa la presencia de una o ms cabezas expandidas en ms del 10% de los ovocitos. Cuando el porcentaje es nulo, las probabilidades de conseguir embriones en FIV convencional son muy dbiles; en estos casos est indicada la inyeccin intracitoplsmica de espermatozoides. Concretamente cuando se quiere realizar una inseminacin artificial y en el espermiograma se han hallado numerosas anomalas de la cabeza de los espermatozoides (anomalas del acrosoma, base disminuida) y la prueba de fecundidad heteroespecfica ha sido negativa, se evita un fracaso de fijacin en la FIV convencional y se realiza en su lugar la prueba ICSI. 5.1.5. Pruebas para explorar la calidad del ncleo espermtico
El fenmeno de condensacin o compactacin del ncleo se desarrolla en la maduracin del espermatozoide, al final de la espermiognesis y durante el trnsito epididimario. El estado de condensacin y estabilidad del ncleo puede ser apreciado por diferentes mtodos. En el eyaculado humano, los espermatozoides forman una poblacin muy heterognea que presenta niveles diferentes de madurez nuclear. La coloracin por el azul de anilina permite evaluar el grado de condensacin de la cromatina. Desde hace poco tiempo, hay pruebas que estudian el grado de fragmentacin del ADN de los espermatozoides. Ciertos equipos consideran que estas pruebas tienen un valor pronstico con respecto a los resultados de la asistencia mdica a la procreacin. 5.1.6. Estudio por microcopia electrnica de los espermatozoides
Permite confirmar las anomalas constitucionales de los espermatozoides, como es el caso de las disquinesias flagelares. Confirma, por ejemplo, las anomalas del axomena de los espermatozoides (ausencia de brazos de dineina, ausencia de los tbulos centrales, anomalas
84
de la vaina fibrosa...) o las ausencias de capa posacrosmica. Este examen se efecta en laboratorios especializados equipados con un microscopio electrnico.
5.2
5.2.1.
Bioqumica seminal
Eleccin de los marcadores bioqumicos
La eleccin de los marcadores bioqumicos se basa, no en su papel o inters fisiolgico, sino nicamente en que sea producido especficamente mediante una de las glndulas anexas o una zona muy determinada del tracto genital masculino. Permiten realizar una verdadera cartografa anatmica del aparato genital. Es posible, en efecto, localizar una afeccin del tracto genital en funcin de la disminucin de un determinado marcador, teniendo en cuenta que: o o o o Cada glndula posee su marcador especfico. Tabla 7. Si una glndula est afectada, hay disminucin de la concentracin de su marcador. Esta disminucin no es compensada porque no hay mecanismos de regulacin homeostsica, como para la glucemia. Si hay obstruccin al nivel del tracto, las secreciones de las glndulas situadas ms arriba no se pueden evacuar y se observar una disminucin del marcador correspondiente.
Las indicaciones ms frecuentes de la bioqumica seminal son: o o o o o o Una azoospermia; Una oligozoospermia; Un volumen pequeo; Una infeccin genital; Una disminucin de la movilidad (< al 20%); Otros: viscosidad anormal, preparacin de esperma para FIV o ICS.
VESCULAS SEMINALES o Fructosa
PRSTATA o Citrato o Zinc
EPIDDIMO o -1,4 Glucosidasa neutra
o L-Carnitina
o Fosfatasa cida Tabla 7. Origen glandular de los parmetros bioqumicos del plasma seminal
85
5.2.2.
Determinacin de marcadores bioqumicos
A) Obtencin del plasma seminal Despus de analizar el semen se toma una alcuota de la muestra que nos quede y se procede a la centrifugacin: durante 10 minutos a 1000g de Fuerza Centrfuga Relativa (FCR = 1,118 x 10-5 x R [cm] x V2 [rpm]). Posteriormente se decanta el plasma seminal del sobrenadante y se conserva congelado a -20C hasta su procesamiento. B) Pretratamiento del plasma seminal Es largo y meticuloso. o Para la determinacin de la L-carnitina hay dos posibilidades: o se realiza previamente la desproteinizacin con cido perclrico, seguida de una neutralizacin, o bien se realiza una desproteinizacin por paso a travs de membrana de filtracin MilliporeTM, que elimina las protenas del plasma seminal. Para la determinacin de la fructosa y el citrato se realiza una desproteinizacin seguida de una neutralizacin. La determinacin del zinc, de las fosfatasas cidas, de la -1,4 glucosidasa se realiza directamente en el plasma seminal o despus de simple dilucin en NaCl 0,15 M.
o o
C) Tcnica UV a 340nm La cuantificacin de los tres sustratos, carnitina, fructosa y citrato, se basa en el mismo principio cuando se realiza a 340 nm. El parmetro a determinar es el primer sustrato de una cascada de reacciones enzimticas a 37 C, es pues el parmetro limitante. La ltima reaccin es la reaccin indicadora, que acaba en la formacin o el consumo de NADH2 o a NADPH2, que se mide por la variacin a punto final de la absorbancia por espectrofotometra UV a 340 nm. La deteccin se desarrolla en 2 tiempos: o Se incuba en primer lugar el plasma seminal con el reactivo 1 que contiene el tampn de reaccin, los sustratos anexos necesarios y las diferentes enzimas de la cascada, excepto la primera enzima. Luego se aade el reactivo 2, reactivo desencadenante, conteniendo la primera enzima que inicia la cascada de reacciones. Se efecta la medida al final de la reaccin, cuando se agota el sustrato inicial. o o L-Carnitina. El reactivo desencadenante es la carnitina acetil transferasa. Ilustracin 13. Fructosa. El estuche comercial utilizado est concebido para analizar al mismo tiempo la fructosa y la glucosa. El esperma contiene poca glucosa, pero sin embargo hay que eliminar esta interferencia. Ilustracin 14.
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Con ese fin, el primer reactivo contiene la hexocinasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que realiza la totalidad de la cascada enzimtica de la glucosa, mientras slo la fructosa es transformada en fructosa-6-fosfato. La primera medida efectuada tiene en cuenta la formacin de NADH2 debida especficamente a la presencia de glucosa. Luego la fosfoglucosa isomerasa, contenida en el segundo reactivo, da lugar a la continuacin de la determinacin especfica de la fructosa. As, por diferencia entre las dos medidas de absorbancia, se consigue la cuantificacin de la fructosa.
Citrato. La tcnica es parecida a la de la carnitina, con un reactivo que activa la citrato liasa. Ilustracin 15.
Ilustracin13. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la L-carnitina en plasma seminal
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Ilustracin14. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin de la fructosa en el plasma seminal
Ilustracin15. Tcnica de cintica enzimtica para la determinacin del citrato en el plasma seminal D) Tcnicas colorimtricas o L-Carnitina. Se mide la formacin de CoASH despus de la accin de la carnitina acetil transferasa sobre el acetil CoA y sobre la L-carnitina de la muestra. El CoASH formado reacciona con el DTNB para formar el anin 5-tio-2-nitrobenzoato amarillo que absorbe a 405 nm. Fructosa: en condiciones de calor y acidez la fructosa reacciona con el indolo formando un complejo coloreado que absorbe a 470 nm. Zinc. El zinc forma con el 5-Br-PAPS un complejo coloreado el cual se mide a punto final a 560 nm.
88
Fosfatasa cida. Un sustrato especfico, el -naftilfosfato, es hidrolizado a 37C, acabando en la formacin de un compuesto azico coloreado. Es un mtodo cintico colorimtrico: se mide el aumento medio de densidad ptica por minuto a 405 nm durante 3 minutos (mtodo de Hillmann modificado). -1,4 Glucosidasa neutra. La actividad enzimtica es medida por hidrlisis a pH 6,8 y a 37C del p-nitrofenilglucopiransido en p-nitrofenol, que al aadirle carbonato sdico se trasforma en un producto amarillo medible por su absorbancia a 405 nm. Para que la medida de esta isoenzima sea especfica, se utilizan dos inhibidores: o o El dodecilsulfato de sodio, SDS, que inhibe la actividad de la isoenzima -glucosidasa cida prosttica. La castanospermina, alcaloide que inhibe todas las actividades hidrolsicas del esperma y permite realizar un blanco de muestra.
La actividad de la-1,4-glucosidasa neutra es fcil de medir, rpida, sensible y especfica. Las determinaciones de L-carnitina, fructosa, citrato y fosfatasa cida estn comercializadas y son automatizables. 5.2.3. Expresin de los resultados
Los valores normales de los marcadores seminales varan de un laboratorio a otro, en funcin de las tcnicas utilizadas. Cada laboratorio tiene que establecer sus propios valores usuales. Tienen que ser establecidos a partir de esperma procedente de sujetos que ya hayan procreado. Los resultados se expresan en concentracin o en cantidad por eyaculado.
5.3
5.3.1.
Estudios complementarios en sangre

Cariotipo y anomalas cromosmicas
En el estudio del genotipo se pueden encontrar anomalas causantes de la infertilidad masculina, por ejemplo: o o o o 5.3.2. El sndrome de Klinefelter (47,XXY) El doble Y(47,XYY) Sndrome de los hombres XXES Anomala en la estructura de los cromosomas Determinaciones hormonales
Un estudio hormonal es indispensable ante una azoospermia, una oligospermia o ante una degradacin de los parmetros del esperma. Se ha de investigar un origen secretorio de los trastornos de la espermatognesis cuando se ha observado un hipogonadismo o una hiperprolactinemia reveladora de un adenoma hipofisario.
89
En consecuencia, el estudio hormonal comprende las determinaciones de FSH, LH, testosterona y prolactina. En caso de ginecomastia, se aade la cuantificacin de los estrgenos. El recurso a una consulta de endocrinologa es necesario en caso de alteracin compleja del balance hormonal.
MUESTRA
MTODO EVALUACIN INICIAL MACROSCPICA o Visual o Si no lica: Licuefaccin o Bromelina o PBS o Jeringa o Pipeta Viscosidad o Varilla Apariencia o Visual o Pesada Volumen o Recipiente graduado pH o Tiras reactivas pH (6-10) EVALUACIN INICIAL MICROSCPICA o Microscopio contraste de fases, pletina 37C o Porta y cubreobjetos: l muestra Cubreobjetos 10 22x22 6,5 18z18 11 21x26 Agregacin 100X Aglutinacin 100X Cel no espermticas 100X o Montar porta-cubre y esperar 1 o Visualizar a 5 mm del borde o Contaje: 200X o 400X 1 Porta: 2 Porta: Movilidad 5 campos 5 campos 200 spz 200 spz Suma con IC = 95% % Progresivos, % No Progresivos, % Inmviles 200x: 400x: DILUCIN Weigman Estimacin del >404 >101 1/20 Recuento 64-400 16-100 1/5 <64 <16 1/2
PARMETRO
Tabla 8. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudios de fertilidad: Espermiograma
Semen reciente (1 h mximo) en contenedor de plstico o vidrio.
90
MUESTRA
PARMETRO
Recuento
MTODO ESTUDIO BSICO o Neubauer improved o 400x o Contar rejilla/s: 5, 4, 6 o Filas completas 1 Subcmara: 2 Subcmara: 200 spz 200 spz N = Suma spz con IC = 95% C = (N/n filas) x (1/20) x Dil Cripto y azoospermias RECUENTO APROXIMADO: Porta y cubre < 4 spz/campo <2 mill/ ml 0 spz/campo: contar todo el porta - 10 l sedimento (1 ml, 15, 500g) - 40 l si movilidad. Criptozoospermia RECUENTO EXACTO: o Micr. Contraste Fases o Micr. Fluorescencia o 400x o 250x o Neubauer improved o Cmara Leja o Dilucin Weigman o Dilucin Hoeschst o Contar cmara total o Contar cmara total o C= N x (1/1800) x2=spz/ ml o C= N x (1/50000)x2=spz/ ml o %SE= 100 (N/N) o %SE= 100 (N/N)
N <400 25-0 0 C Frmula 27777=S 4100 %SE Frmula (>5) 20 52 N <400 25-0 0 C Frmula 1000=S 150 %SE Frmula (>5) 20 52
Tabla 8 continuacin. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudios de fertilidad: Espermiograma
91
MUESTRA
PARMETRO
o o o o o o o
Morfologa
MTODO ESTUDIO BSICO 2 portas Arrastre de 1 gota con porta 45 / 1 Si <2mill/ ml: 5-10 l sedimento (10600g) Si viscoso: Dil Bromelina (1/2) o PBS (1/20). Extender con pipeta Secado al aire Tincin: Papanicolaou, Shorr o Diff-Quik Microscopio 1000x 1 Porta: 2 Porta: 200 spz 200 spz Suma con IC = 95% Segn criterio Kruger % Normales, % Anormales Obligatorio si PR<40% COLORANTE SUPRAVITAL T.HIPOOSMTICO
Vitalidad
Sol. Eosina Porta-cubre : semen+Eosina 400x M Contr Fas Vivos: blancos Muertos: rosas
Sol.Eosina/Nigrosina
IB TEST DIRECTO
Porta: extensin : semen+Eo/Nig 1000x Vivos: blancos Muertos: rosas (200spz/porta) x 2 Suma IC=95% % Vivos, % Muertos MAR TEST DIRECTO
Sol. Hiposmtica Porta-cubre 1/10: semen+Sol 400x M Contr Fas Vivo: flag hinch Muerto: intacto
Ab Antiespermatozoide
Semen lavado Semen completo Esferas de poliacrilamida Esferas de ltex Anti-IgG o Anti-IgA Anti-IgG o Anti-IgA Porta-cubre 400x Micros Contraste Fases (200spz/porta) x 2 Suma IC=95% 3 y 10: % spz mviles + esferas
92
MUESTRA
PARMETRO
MTODO ESTUDIO BSICO

CLULAS REDONDAS cr LEUCOCITOS CLULAS ESPERMATOG
o Tinc. Eosina/Nigr Otras Clulas Porta: extensin : semen+Eo/Nig 1000x (200spz/porta).2 C cr Suma IC=95% C=C spz x C cr/400
o Test Peroxidasa Neubauer imprvd 1/10: semen+D Perox 400x M Contr Fases Rejillas completas C=(N/rejilla).(1/100).10 N<400, %SE>5% N=25-0, C=S=138888
Semen reciente en contenedor de plstico o vidrio.
o Tincin Papanicolau o Test Peroxidasa o Test Ab frente CD45 o Tincin acrosoma
SEGUNDA INTENCIN Moco cervical y esperma: o Prueba de Hhner o Penetracin cruzada in vitro FUNCIONAAnlisis del movimiento asistido por ordenador C.A.S.A. LIDAD DEL Reaccin acrosmica ESPERMAPrueba de fecundidad heteroespecfica TOZOIDE Exploracin de la calidad del ncleo espermtico Microscopia electrnica de los espermatozoides
BIOQUMICA:
o Centrifugar (10, 1000g)Separar plasma seminal o Si Congelacin (<-20C)Descongelacin o Desproteinizacin y Neutralizacin Cintica Enzimtica 340 nm Colorimetra 470 nm o Desproteinizacin (HCl) y Neutralizacin o o Desproteinizacin con Millipore TM Cintica Enzimtica 340 nm Colorimetra 405 nm
Fructosa L-Carnitina -1,4Glucosidasa Zinc Fosfatasa cida Citrato
Cintica colorimtrica 405 nm Colorimetra 560 nm Cintica colorimtrica 405 nm Desproteinizacin y Neutralizacin Cintica Enzimtica 340 nm
Sangre
OTROS:
o Gentica o Hormonas
93
Captulo 6
Estudio del semen en vasectomas y vasovasostomas

6.1
6.1.1.
Semen de postvasectoma
Anlisis en fresco
Se recomienda que el laboratorio analice las muestras de semen lo antes posible con un lmite mximo de 4 horas desde la eyaculacin. La muestra se homogeneizar mediante agitacin suave y se situar una alcuota de 10 l entre portaobjetos y cubreobjetos de 22 x 22 mm y se examinarn no menos de 20-30 campos con un microscopio en contraste de fases. Si se detecta la presencia de espermatozoides mviles, se especificar la concentracin y el grado de movilidad siguiendo las recomendaciones del Manual de Anlisis Bsico de Semen de la ESHRE o de la OMS. Si se detecta exclusivamente la presencia de espermatozoides inmviles, bastar con mencionarlo en el informe.
94
6.1.2.
Anlisis sedimento
Si en el anlisis en fresco no se observan espermatozoides se transferir toda la muestra de semen a un tubo de base cnica y se centrifugar a 1000 g de FCR durante 10-15 minutos. FCR = 1,118 x 10-5 x R [cm] x V2 [rpm] Se separar el sobrenadante y se homogeneizar mecnicamente el sedimento en 100 l del mismo plasma seminal y se estudia de igual manera a la descrita cuando se analiza el semen fresco, sealando la presencia o ausencia de espermatozoides y su movilidad. Los distintos grados de movilidad no se podrn evaluar despus del centrifugado, slo si son mviles o inmviles. Recomendaciones: En el caso de observar abundantes clulas o leucocitos en el sedimento, se debe sealar su presencia, indicando que pueden enmascarar la visualizacin de los espermatozoides y solicitar una nueva muestra para confirmar el resultado. Cuando una muestra de semen contiene espermatozoides siempre existe un riesgo de no observarlos. Cada vez que se analiza al microscopio un cubreobjetos de arriba a abajo, se observan aproximadamente unos 40 campos. Realizando esta operacin 10 veces (10 l en cada porta, hasta los 100 l de todo el sedimento), se analizan 400 campos. Cuando se examinan 400 campos, se valora un volumen total de unos 1.600 nl (4 x 400, puesto que un campo microscpico corresponde a 4 nl), por ejemplo 1/62 del volumen total del sedimento de 100 ml (100.000 nl). Si hay >188 espermatozoides en el sedimento obtenido tras la centrifugacin, el riesgo de no encontrar espermatozoides es <5%. Sin embargo, con concentraciones ms bajas, la probabilidad de no encontrar espermatozoides es >5%. Por esto, si no se encuentra ningn espermatozoide despus de examinar un volumen total de 1.600 nl, se puede afirmar que los 100 L de sedimento, y por tanto la muestra completa, contienen < 188 espermatozoides. 6.1.3. o Expresin de los resultados Anlisis en fresco: Presencia o ausencia de espermatozoides. Si se observan: concentracin, porcentaje de espermatozoides mviles y porcentaje de espermatozoides inmviles. Anlisis muestra centrifugada: Presencia o ausencia de espermatozoides. Si se observan especificar porcentaje de espermatozoides mviles y porcentaje de espermatozoides inmviles.
Recomendaciones: en el caso de detectar abundantes espermatozoides inmviles y sobre todo mviles y una vez verificada la fecha de la vasectoma, es aconsejable contactar con el clnico para informarle del hecho.
95
6.2
Semen de prevasovasostoma
Un anlisis de semen preintervencin es recomendable, ya sea para comprobar la ausencia de espermatozoides, como para obtener el volumen de semen de muestra inicial preoperatorio, ya que un bajo volumen del semen, indicara adems la necesidad de la realizacin de una ecografa antes de la intervencin para localizar obstrucciones adicionales del tracto urogenital. La recomendacin de obtencin de muestra y posterior anlisis es igual que el anlisis de semen posvasectoma junto con la medicin del volumen del eyaculado.
6.3
Semen posvasovasostoma
A los seis meses de la intervencin se determinarn los parmetros bsicos seminales. En funcin de los resultados, puede ser conveniente realizar determinaciones de fructosa, cido ctrico y maltasa (glucosidasa neutra) para valorar las secreciones de la vescula seminal, prstata y epiddimo. 6.3.1. Resultados del semen pre y posvasovasostoma
En el anlisis prevasovasostoma, se adopta el formato de resultados del anlisis de semen posvasectomas ya descrito y en cuanto al anlisis de semen posvasovasostoma el informe que el laboratorio tenga establecido.
96
MUESTRA
PARMETRO MTODO POSTVASECTOMA o Pesada Volumen o Recipiente graduado En Fresco: o Semen 10 l o Porta y cubre 22 x 22 mm o Microscopio contraste de fases 400x o 20-30 campos Si 0 spz: o Todo el semen en tubo cnico o 1000g, 15 Recuento o Sedimento en 100 l o (10 l + porta-cubre (22x22))x10 veces o Micr. contraste de fases 400x o 40 campos Si 0 spz: Si se observan spz: o No se observan spz o Movilidad o C<188 spz/E, %SE>5 o Se observan spz
Si se observan spz: o Movilidad o Recuento como Criptozoospermia
PREVASOVASOSTOMA o Pesada Volumen o Recipiente graduado o o o o o o o Todo el semen en tubo cnico 1000g, 15 Sedimento en 100 l (10 l + porta-cubre (22x22))x10 veces Micr. contraste de fases 400x 40 campos Si 0 spz: No se observan spz, C <188 spz/Eyaculado, %SE>5
Recuento
POSVASOVASOSTOMA o Evaluacin inicial macroscpica o Evaluacin inicial microscpica o Estudio bsico o (Estudios de segunda intencin: Bioqumica seminal)
Semen reciente
Tabla 9. Procedimiento de laboratorio para el anlisis del semen en intervenciones quirrgicas
97
Captulo 7
Capacitacin del semen

7.1
Campo de aplicacin
Los laboratorios clnicos, en respuesta a la creciente necesidad, deben ofrecer en su cartera de servicios tcnicas de preparacin de semen para reproduccin asistida. El campo de aplicacin de esta tcnica es, segn la Ley 14/2006, de 26 de mayo, sobre tcnicas de reproduccin humana asistida: o o o Diagnstico, en el estudio bsico de la pareja estril. Tratamiento, preparacin del semen para la tcnica de reproduccin asistida de eleccin. Seleccin de espermatozoides para pruebas funcionales.
Es muy importante tener en cuenta que las tcnicas de capacitacin espermtica no son en s mismas pruebas diagnsticas, sino que forman parte de los mtodos de tratamiento del semen. Cuando los parmetros seminales son normales el recuento de espermatozoides mviles tras la preparacin seminal (REM) no aporta informacin adicional al estudio de la pareja estril (recomendacin de la Sociedad Espaola de Reproduccin, Sociedad Espaola de Androloga y Asociacin para el Estudio de la Biologa de la Reproduccin). Sin embargo el REM se ha convertido en un referente de gran utilidad para sentar la indicacin de IIU, de FIV o ICSI, ya que el valor pronstico que aporta un seminograma anormal es insuficiente.
98
Es difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar inseminaciones intrautero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Algunos autores proponen que cada centro establezca su punto de corte en funcin de los datos clnicos y de laboratorio de cada centro. En general se considera de buen pronstico un REM por encima de 5 millones de espermatozoides mviles recuperados por mililitro.
7.2
Objetivos de las tcnicas de preparacin de semen
Es conocido que durante la maduracin en el epiddimo los espermatozoides incorporan diferentes glicoproteinas y pptidos que inhiben la capacitacin (actuaran como factores descapacitantes). Este estado de descapacitacion se mantiene tras la eyaculacin debido a estas incorporaciones y a la presencia de otros factores decapacitantes en el plasma seminal. Adems, el plasma seminal puede contener agentes infecciosos que deben eliminarse antes de cualquier tcnica de reproduccin asistida, ya que son susceptibles de provocar infecciones en la mujer y contaminar los cultivos de ovocitos y embriones. Exposiciones prolongadas (ms de 2 horas) de los espermatozoides al plasma seminal pueden provocar una prdida de la capacidad fecundante y ejercer un efecto negativo sobre su movilidad. As la separacin de los espermatozoides del plasma seminal debe realizarse lo ms rpido y eficazmente posible. Por lo tanto los objetivos de las tcnicas de preparacin de semen sern: o o o Separar los espermatozoides del plasma seminal que contiene sustancias decapacitantes, prostaglandinas y linfoquinas. Retirar los espermatozoides muertos, leucocitos, clulas redondas y agentes infecciosos. Aportar un medio de cultivo que contenga molculas captadoras de esteroles (albmina) y una composicin inica que apoye la homeostasis del espermatozoide y facilite las seales de transduccin (calcio, bicarbonato).
La finalidad ltima de este proceso es seleccionar los espermatozoides mviles y mejorar la calidad de los mismos (porque disminuye la liberacin de linfoquinas y reduce la formacin de radicales libres), y ser un requisito previo para cualquier tcnica de reproduccin asistida. El adecuado procesamiento de la muestra va a influir en la capacidad fecundante del espermatozoide, tanto in vivo como in vitro y ser fundamental para el xito de la reproduccin asistida.
7.3
7.3.1.
Tipo de muestra
Semen fresco
La muestra de semen debe recogerse siguiendo las indicaciones del captulo de Preanaltica. Pasados 30 minutos de la eyaculacin separar una alcuota de semen para su valoracin siguiendo las recomendaciones de la ESHRE y la OMS.
99
7.3.2.
Semen congelado
En aquellas situaciones en las que no se puede emplear semen fresco se puede recurrir a semen congelado. Existen dos tipos de muestras de semen criopreservadas: o Semen criopreservado antes de iniciar terapias que pueden comprometer la capacidad reproductora del paciente, cuando exista dificultad para conseguir coordinar el momento de la inseminacin con la recogida del semen, parejas serodiscordantes, etc. Semen de donante. En determinadas circunstancias como son oligozoospermias severas, ausencia de espermatozoides en testculo, enfermedades hereditarias en las que el varn es el portador y mujeres sin pareja masculina.
Los mtodos de descongelacin ms utilizados son: la descongelacin lenta (a T ambiente: 10-20C/min) y la rpida (a 37C-400 C/ min.); actualmente est demostrado que el mtodo de descongelacin ms efectivo es mantener la muestra durante 2-3 minutos en un bao de agua a 37C y posteriormente incubarla durante 5a T ambiente. La muestra de semen criopreservada contiene un agente crioprotector que debe ser retirado antes de utilizarla para cualquier tcnica de reproduccin asistida. o o Decantar el contenido de las pajuelas en un tubo estril. Diluir (aproximadamente a 1/5) en medio de lavado. La dilucin debe ser un proceso lento para evitar el choque osmtico. Se aaden lentamente, homogeneizando, durante al menos 10 minutos (gota a gota) 4,5 ml de medio de lavado, para que se produzca el equilibrio osmtico sin dao para el espermatozoide. Procesar igual que el semen fresco, preferiblemente por gradientes de densidad.
Una vez descongelado el semen y antes de procesarlo debe evaluarse la concentracin y el grado de movilidad de los espermatozoides. Evaluacin de la criopreservacin o o Descongelar la pajuela transfirindola a un bao de agua a 37C durante 2-3 minutos y dejar a T ambiente durante 5 minutos. Desinfectar el exterior de la pajuela de modo que pueda abrirse sin riesgo de contaminacin. Limpiar el extremo de la pajuela donde est la zona de aire con una solucin estril de hipoclorito, aclarar con agua destilada y secar con una gasa estril. Cortar este extremo, insertar la pajuela en un tubo, y, entonces, cortar el otro extremo (justo por debajo del filtro) para que el contenido de la pajuela se vierta en el tubo. Los extremos de la pajuela deben cortarse con un instrumento estril, por ejemplo, tijeras de sutura. Evaluar cuantitativa y cualitativamente la movilidad espermtica y determinar la concentracin total de espermatozoides, siguiendo las recomendaciones de la OMS.
100
La eficiencia de la criopreservacin de semen puede evaluarse de diferentes maneras: o Calculando el factor de criosupervivencia (CSF):
Calculando el nmero total de espermatozoides con movilidad progresiva en la pajuela post-descongelacin: mediante la evaluacin de la concentracin espermtica y la movilidad progresiva por pajuela (teniendo en cuenta el volumen de la pajuela).
Se considera una eficiencia de criopreservacin ptima un valor de CSF50% junto con una movilidad total de 30% con 25% de movilidad progresiva. El nmero de espermatozoides mviles requerido por pajuela depende de la intencin de uso que quiera darse a la misma, desde inseminacin artificial (IA) a fecundacin in vitro con inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides (FIV-ICSI). o Criopreservacin en pacientes oncolgicos: como la calidad de las muestras de semen de pacientes que van a seguir tratamientos oncolgicos suele ser baja, la mejor opcin teraputica es la FIV-ICSI. En este caso, pajuelas que contengan pocos espermatozoides mviles son a menudo suficientes para dar lugar a tasas adecuadas de fecundacin mediante esta tcnica; en estos casos, es conveniente congelar slo un pequeo nmero de espermatozoides por pajuela (ej. 40.000) para as maximizar el nmero de intentos de ciclos por muestra criopreservada. Donantes de semen: Aunque es una situacin que queda fuera del alcance de este documento queremos resear que, respecto a los donantes, debe conseguirse un nmero mnimo de espermatozoides con movilidad progresiva post-descongelacin para cada donante para decidir si la congelacin es factible. Para inseminacin intrauterina (IUI): Pajuelas que contengan menos de 4 millones de espermatozoides mviles (mnimo generalmente aceptado) pueden ser usadas para IUI pues este proceso implica la eliminacin de plasma seminal y medio de congelacin y la concentracin de los espermatozoides antes de la inseminacin. Sin embargo, se ha demostrado que el nmero mnimo de espermatozoides necesario para la realizacin de IUI con semen de donante es de 1,5 millones. Para fecundacin in vitro (FIV-ICSI): El nmero de espermatozoides mviles por pajuela de semen de donante no se correlaciona ni con la tasa de fecundacin ni con la de embarazos en FIV, lo que refleja la ptima seleccin de los espermatozoides criopreservados.
7.4
o o o
Materiales y medios necesarios

Los medios de cultivo han de atemperarse antes de su uso y tener la certificacin CE. Todos los materiales empleados as como los medios de cultivo deben ser estriles y manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar. Los medios de cultivo deben tener una osmolalidad entre 280-300 mOsm/kg.
101
El pH debe mantenerse en un rango entre 7.2-7.4, para ello es necesario utilizar medios tamponados. Los tampones ms utilizados son: HEPES, fosfato o bicarbonato. Los medios tamponados con bicarbonato necesitan una atmsfera rica en CO2 y una temperatura de 37C para que se mantenga el equilibrio inico, por lo que tienen que usarse en estufa con temperatura y CO2 controlados. Adems, los medios deben tener una concentracin de calcio, bicarbonato y protenas especfica para que los espermatozoides adquieran la capacidad de fecundar.
Los medios para la preparacin de semen son de dos tipos: o Medios para preparacin de gradientes. Los ms usados contienen una suspensin coloidal de partculas de slice unidas de forma covalente a molculas de silano y se preparan en solucin isotnica. o Medios de lavado y cultivo. Se recomienda utilizar medios que no requieran CO2, porque la mayor parte del proceso se realiza en atmsfera aire. Los medios especficos para semen suelen estar tamponados con HEPES y pueden usarse en atmsfera area. Contienen protenas, mayoritariamente albmina que acta como captadora y transportadora de molculas, as como la concentracin de sales necesaria para la homeostasis del espermatozoide y en la mayora de los casos gentamicina como agente bacteriosttico. Finalmente sealar que han sido mltiples los intentos de realizar una mejora in vitro de los espermatozoides mediante la adicin de distintos compuestos al medio de cultivo. De ellos destacar el uso de inhibidores de la fosfodiesterasa (pentoxifilina, teofilina, cafena, etc.) para estimular la motilidad espermtica. La inhibicin de la fosfodiesterasa provoca un aumento de la concentracin de adenosin monofosfato cclico (cAMP). El aumento de cAMP, mediador intracelular, regula reacciones intracelulares que activan el metabolismo del espermatozoide mejorando parmetros de movilidad. Muchas son las publicaciones sobre el efecto de la pentoxifilina mientras unos autores encuentran una mejora de la motilidad al incubar la muestra seminal con pentoxifilina otros no observan diferencia alguna de ah que no se haya implantado como rutina en la prctica clnica del laboratorio.
7.5
Mtodos de preparacin del semen
Los mtodos incluyen desde la simple dilucin y centrifugacin hasta tcnicas ms complicadas. o o o o Dilucin y lavado del semen. Los mtodos que utilizan solo lavado, deberan abandonarse y emplear tcnicas ms seguras de preparacin de espermatozoides Migracin: el movimiento del espermatozoide es un requisito esencial Gradientes de densidad: separan los espermatozoides en funcin de su punto isopcnico. Adherencia-Filtracin: combinan la movilidad de los espermatozoides con la adherencia a las matrices de filtracin (lana de vidrio, sefadex).
102
Mtodos avanzados: anticuerpos monoclonales, tecnologa de microesferas (anexina V magnetic-activated cell sorting), electroforesis, cido hialurnico, dextrano Estos mtodos en realidad slo se desarrollan para investigacin.
De todos los mtodos, los que realmente tienen utilidad clnica son los de migracin y gradientes de densidad. 7.5.1. Mtodo de lavado
Es el ms sencillo. No conlleva una mejora de la calidad seminal simplemente una capacitacin y concentracin. Procedimiento o o o o 7.5.2. Depositar la muestra seminal en un tubo y aadir medio de cultivo en proporcin 1:5 o 1:10 para retirar la mayor parte del plasma seminal. Homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 minutos. Retirar el sobrenadante y aadir 0,5 ml de medio de cultivo. Incubar 20-30 minutos. Migracin
Est basado en la capacidad de desplazamiento de los espermatozoides mviles. Es el ms fisiolgico de todos los procedimientos. Requiere muestra con buenos parmetros seminales y la muestra se recupera muy limpia. Swim-up El semen licuado se deposita sobre un medio de cultivo y los espermatozoides con buena movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo a travs del moco cervical. Dentro de esta categora existen dos formas principales Swim Up directo y Swim Up convencional. Swim Up directo El proceso consta de varias fases (Ilustracin 16A): o Colocar aproximadamente 250 l de semen licuado en el fondo de un tubo no cnico (para aumentar la superficie de contacto). Utilizar tantos tubos como sea necesario para mejorar la recuperacin de los espermatozoides. Depositar sobre el semen 500 l de medio de cultivo resbalando por las paredes del tubo, con cuidado de que no se mezcle con el semen. Dejar en un incubador a 37C formando un ngulo de 45, para aumentar la interfase, durante un tiempo entre 30-60 minutos dependiendo de la calidad del semen. No ms tiempo para evitar la contaminacin con plasma seminal.
103
o o
Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300l de medio de cultivo, con cuidado de no aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el ngulo del tubo). Si hay ms de un tubo de una misma muestra se unifica todo el aspirado en un nico tubo. Si el volumen obtenido es mayor de 500l, valorar el grado de movilidad y la concentracin de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de 300-500l para inseminar.
Swim Up convencional Se basa en el mismo principio pero requiere un primer paso de lavado. o o Aadir medio de lavado en una proporcin v/v, homogeneizar. Centrifugar durante 10 minutos a 500g. Se recomienda una centrfuga de cabezal fijo para que el botn celular tenga una amplia superficie de contacto con el medio de cultivo. Retirar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el botn celular. Aadir resbalando lentamente por las paredes del tubo 500 l de medio de lavado.
o o
Continuar el proceso desde el punto 3 del mtodo anterior. El inconveniente de estos mtodos es que los espermatozoides inmaduros y el resto de las clulas permanecen en contacto durante todo el proceso con los espermatozoides maduros y pueden producir efectos adversos sobre estos. Adems muchos de los espermatozoides mviles pueden quedar atrapados en el fondo del sedimento y no alcanzar nunca el medio de cultivo. La ventaja respecto del mtodo anterior es que disminuye la contaminacin con el plasma seminal. Para mejorar la tasa de recuperacin de espermatozoides mviles se puede fraccionar la muestra en varios tubos, procesarlos siguiendo el protocolo y unificar el aspirado de cada tubo en un nico tubo. Se debe valorar y si es necesario, se centrifugar y resuspender en un volumen entre 300-500 l de medio de cultivo para inseminar. Swim-down Este procedimiento es similar al Swim-up, pero en este caso se coloca primero el medio de cultivo y despus se deja resbalar el semen por la pared del tubo para que quede arriba. Se incuba a 37C / 5% CO2 y se descarta el sobrenadante, ya que en este caso los espermatozoides ms aptos van a nadar hacia la parte de abajo, donde est el medio de cultivo. Ilustracin 16B. 7.5.3. Gradientes de densidad
Su fundamento se halla en la seleccin de los espermatozoides que pueden vencer la dificultad que presentan los gradientes de densidad y llegar hasta el fondo del tubo, adems de actuar como filtro para plasma seminal, clulas redondas, detritus y aquellos espermatozoides con
104
movilidad no progresiva. Los gradientes de densidad disgregan las partculas en funcin de su densidad de flotacin. Los diferentes componentes se separan hasta alcanzar una posicin en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situacin de flotabilidad neutra), donde ya no se desplaza ms. o o o Los espermatozoides maduros son clulas compactadas y alcanzan el gradiente de mayor densidad (el fondo del tubo). El plasma seminal permanece flotando sobre el gradiente de menor densidad y las clulas. Los espermatozoides inmaduros y muertos se sitan en la interfase entre los dos gradientes.
Es menos fisiolgico que el mtodo de Swim-up y se utiliza fundamentalmente para smenes con parmetros bajos y smenes criopreservados. Los gradientes de densidad utilizados actualmente parten de una suspensin coloidal de partculas de slice unidas de forma covalente a molculas de silano, se utilizan de forma discontinua en soluciones isotnicas a una concentracin de 90% y 45% o tambin de 80% y 40% y pueden adquirirse ya preparados. Se recomienda utilizar volmenes de 0,5-1ml de cada gradiente de concentracin. Procedimiento (Ilustracin 16C) o o Se preparan los tubos que sean necesarios por muestra teniendo en cuenta que no se debe depositar ms de 1,5 ml de semen por tubo. Dispensar 0,5 ml del gradiente de 40% en un tubo cnico, a continuacin con una jeringa de 1 ml conectada a una aguja larga de carga, depositar 0,5 ml del gradiente de 80% en el fondo del tubo (cono), muy despacio para que el gradiente de 40% suba y queden bien definidas las dos capas. Decantar el semen licuado, resbalando por las paredes de los tubos, con cuidado de no romper la interfase. El semen debe quedar encima del gradiente de 40%. Centrifugar a 300g durante 20 minutos. Aspirar las distintas capas con una pipeta pasteur en la zona del menisco para evitar alterar las interfases y las posibles contaminaciones, hasta alcanzar claramente el gradiente de 80%, donde se encuentra el sedimento con los espermatozoides maduros. Repetir el proceso con todos los tubos de la misma muestra. Cambiar de pipeta, al aspirar el/los sedimentos. Transferir a un nico tubo nuevo (para evitar contaminaciones) con 1-2ml de medio de lavado, homogeneizar y centrifugar a 500g durante 10 min. Retirar todo el sobrenadante, con cuidado de no aspirar el botn celular. Resuspender en 300-500l de medio de cultivo.
o o o
o o
105
Evaluar la muestra capacitada (nmero de espermatozoides mviles por mililitro) y dejar en el incubador a 37C hasta el momento de su utilizacin.
Ilustracin16. Esquemas grficos de los principales mtodos de capacitacin para recuperacin de espermatozoides mviles. A) Migracin por Swim-up directo: semen (en blanco), medio (en gris oscuro). B) Migracin por Swim-down: semen (en blanco), medio (en gris oscuro). C) Centrifugacin en gradientes de densidad: semen (en blanco), medio ms denso (en gris oscuro), medio menos denso (en gris claro) 7.5.4. Mtodo de filtrado
Esta tcnica se basa en el hecho de que los espermatozoides muertos o con importantes disrupciones de membrana presentan una clara tendencia a la absorcin a determinados materiales (fibra de vidrio, partculas de vidrio, etc.). Aprovechando esto pueden construirse columnas de lana de vidrio que permitan filtrar a los espermatozoides obtenindose la fraccin de clulas viables. Se realiza mediante una malla de fibra de vidrio en porciones de 15-20mg que situamos en el interior de una jeringa de insulina hasta la divisin 0,06ml. A continuacin lavamos el filtro con 2-3ml de medio para eliminar las partculas de fibra de vidrio que pudieran estar libres y procedemos a filtrar aproximadamente 500l del semen en fresco o previamente lavado. Despus del filtrado lavaremos el filtro de nuevo con 200-300l de medio de cultivo para liberar los espermatozoides de buena calidad que pudieran quedar en el. Sin embargo se ha indicado que las columnas de lana de vidrio podran daar las membranas de la cabeza de los espermatozoides y de pequeas contaminaciones de fragmentos de fibra de vidrio.
106
7.6
Valoracin de los resultados
Una vez terminada la tcnica hay que calcular el porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva y realizar el recuento de los mismos. Los resultados se obtienen multiplicando el tanto por ciento de espermatozoides con movilidad progresiva, por los millones de espermatozoides recuperados y por el volumen final. Se expresar como millones de espermatozoides recuperados con movilidad progresiva. Si el semen se va a utilizar para inseminacin artificial se informar como millones inseminados y se calcularn multiplicando por el volumen inseminado. En caso de utilizar parte del volumen eyaculado, los resultados deben expresarse en funcin del volumen utilizado, y multiplicarse por el factor de correccin. La relacin del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el nmero de espermatozoides mviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperacin y se calcula con la siguiente frmula: Porcentaje de recuperacin = [(VF x CF x REM) / (VU x CI x IEM)] x 100 VF= volumen final CF= concentracin final de espermatozoides REM= tasa de espermatozoides con movilidad progresiva recuperados VU= volumen semen utilizado CI= concentracin inicial de espermatozoides IEM=tasa de espermatozoides con movilidad progresiva en el eyaculado Para el correcto desarrollo de este proceso se debe tener en cuenta las siguientes recomendaciones: o o o o Utilizar siempre material estril. Deben utilizarse pipetas Pasteur en lugar de agujas para aspirar espermatozoides. La preparacin del semen debe comenzar no ms tarde de 30 minutos de la eyaculacin, ya que la capacidad de fecundar el ovocito puede verse afectada. Aspirar siempre las diferentes fases en la zona de contacto con el tubo, donde se forma el menisco, para no alterarlas. No mezclar plasma seminal con los espermatozoides recuperados, puede impedir la capacitacin. Si el semen preparado va ser utilizado para inseminacin artificial, deber usarse lo antes posible. Diluir muy lentamente el semen descongelado. Centrifugar siempre a los g recomendados. FCR = 1,118 x 10 x R [cm] x V [rpm]
-5 2
o o o o
107
7.7
Conclusiones
El papel de los parmetros seminales como factor pronstico en la fertilidad masculina est actualmente sometido a debate. Se ha propuesto el test de recuperacin de espermatozoides mviles (REM) en el estudio de la pareja estril como prueba para distinguir qu parejas se beneficiarn de la inseminacin artificial y cules no, porque incluye la concentracin, la movilidad as como los efectos del procesamiento de los espermatozoides. Es difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar inseminaciones intratero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Los niveles umbral en los distintos trabajos oscilan desde 0,8 a 5 millones. No se ha podido identificar un umbral ptimo de REM que permita aconsejar a las parejas. Se requieren estudios adicionales para evaluar la capacidad predictiva del REM en los estudios de fertilidad. Algunos autores proponen que cada centro establezca su punto de corte en funcin de datos clnicos y de laboratorio de cada centro. De las tcnicas de capacitacin anteriormente descritas las ms utilizadas en los laboratorios por su simplicidad y eficacia son el Swim-up y los gradientes de densidad. Aunque no existe evidencia cientfica para recomendar una tcnica de preparacin de semen, las ventajas de cada uno de estos mtodos se recogen en la tabla 10.
MTODOS DE MIGRACIN (SWIM-UP) o Proceso fisiolgico. o La muestra capacitada queda ms limpia. o Es independiente del volumen del eyaculado. MTODO DE CENTRIFUGACIN (GRADIENTES) o Mayor capacidad de recuperacin. o Buenos resultados con muestras pobres o congeladas. o Menor tiempo para su realizacin.
Tabla 10. Ventajas de los mtodos de capacitacin ms empleados Una revisin Cochrane (Boomsma, Heineman, Cohlen & Farquhar, 2007) sobre las diferentes tcnicas de preparacin de semen concluye: o En cuanto a resultados clnicos (tasa de embarazo/tasa de recin nacidos vivos), no hay evidencia cientfica suficiente para recomendar una tcnica de preparacin de semen, al considerar resultados de los ensayos cuasialeatorios, la tcnica de gradientes de densidad puede parecer mejor, pero necesita confirmarse con ensayos clnicos aleatorios. Respecto a los parmetros seminales tras la preparacin de semen, la tcnica de gradientes parece mejor en cuanto a concentracin de espermatozoides y a tasa de recuperacin de espermatozoides mviles, mientras que la tcnica de Swim up recupera los espermatozoides con mejor movilidad, y en cuanto a la morfologa no se encontraron preferencias. En trminos generales la tcnica de gradientes puede parecer superior, aunque debe confirmarse con ensayos clnicos de calidad.
108
MUESTRA
PARMETRO
Semen criopreservado (-196C) en pajuela
Pretratamiento
MTODO o Descongelacin 2-3, 37C 5, 10C-20C o Retirada del agente crioprotector Desinfeccin de pajuela y trasvase a tubo 1/5: semen/medio lavado, 10! o Evaluacin de Eficiencia
Semen reciente (30 mximo) en contenedor de plstico o vidrio.
Lavado
o o o o
Migracin
CPR = (%PR x C) / 100 1/5 o 1/10: semen/medio cultivo Homogenizar, centrifugar: 500g, 10 Sedimento + 0,5 ml medio cultivo 37C 20-30 Swim-up Directo Convencional Reparto en n tubos: Lavado: (250l semen)abajo 1/1: semen/medio (500l medio)arriba Centrifg: 500g, 10 Sed+500l medio Incubacin: Incubacin: 37C, 45 inclinado 37C, 45 inclinado 30-60 30-60 Recuperacin: Recuperacin: Vn: (capa d arriba)x n Coger capa d arriba Si Vn>500l Si Vn>500l Morfolg, Recuento Morfolg, Recuento Centrifugacin: Centrifugacin: 500g, 10 500g, 10 Sed+300-500l medio Sed+300-500l med 37C 37C
Swim-down Reparto en n tubos: (500l medio)abajo (250l semen)arriba Incubacin: 37C, 45 inclinado 30-60 Recuperacin: Vn: (capa d abajo)x n Si Vn>500l Morfolg, Recuento Centrifugacin: 500g, 10 Sed+300-500l med 37C
Tabla 11. Procedimiento de laboratorio para la capacitacin del semen
109
MUESTRA
PARMETRO
Gradientes de densidad
Filtracin Eficiencia de la capacitacin
MTODO o Reparto en n tubos: 1. 0,5-1 ml medio 40%-45% (intermedio) 2. 0,5-1 ml medio 80%-90% (abajo) 3. 1,5 ml semen (arriba) o Centrifugacin en gradientes: 300g, 20 o Recuperacin: (sedimento) x n + 1,2 ml medio o Centrifugacin: 500g, 10 o Sedimento + 300-500 l medio o Movilidad y recuento o 37C o Lavado: jeringa con filtro + 2-3 ml medio o Filtrado: jeringa con filtro + 500 l semen o Recuperacin: jeringa con filtro + 2-3 ml medio Porcentaje de recuperacin = [(VF x CF x REM)/(VU x CI x IEM) ]x 100
Tabla 11 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la capacitacin del semen Spz: espermatozoides. CSF: factor de criosupervivencia. PR: mviles progresivos. Vn: volumen total de los n tubos. VF=volumen final. CF=concentracin final de espermatozoides. REM= tasa de espermatozoides con movilidad progresiva recuperados. VU=volumen semen utilizado. CI=concentracin inicial de espermatozoides. IEM=tasa de espermatozoides con movilidad progresiva en el eyaculado
Semen reciete
Semen descongelado en tubo
110
Informe del laboratorio
Captulo 8

Digirido a: es responsabilidad del clnico y no del laboratorio el comunicar los resultados del anlisis del semen a sus pacientes. El informe del laboratorio ha de ir dirigido al clnico solicitante. Datos que ha de incluir El informe de laboratorio debe de incluir los siguientes apartados: o o o o o o o o o Nombre Identificacin laboratorio Nmero Historia clnica Fecha de obtencin de la muestra Periodo de abstinencia Volumen Resultados Valores de referencia Comentarios
111
8.1
Resultados
Tal y como hemos visto en cada parmetro, se ha de tener en cuenta lo siguiente: o o Los resultados se han de expresar con sus unidades correspondientes. Siempre que sean recuentos (de espermatozoides o clulas no espermticas) se expresarn con el ndice de Confianza del 95% entre los dos contajes y el error asociado si fuese mayor del 5%: o o o <200 /subcmara ES>5% <25,>0 /subcmara %ES=Sensibilidad del mtodo 0 ES=95%
Se procurarn emplear las frases de expresin recomendadas por la OMS. o Coherencia entre los resultados: o o El porcentaje de vitalidad no puede ser inferior al porcentaje de espermatozoides mviles. Ante porcentajes de vitalidad prximos a cero con recuentos de espermatozoides altos, lo primero que se ha de descartar es que no haya habido un error en la fase preanaltica. Un alto porcentaje de anticuerpos antiespermatozoides se ha de acompaar de un movimiento progresivo bajo y/o alto grado de aglutinacin.
8.2
Valores de referencia
En la ltima edicin del Manual de la OMS en lugar de hablar de valores de referencia, se habla de Lmites inferiores de Referencia (tabla 12): o Que incluye al 95% de los individuos de referencia con valores superiores al percentil 5, y no en torno al percentil 50 como hasta ahora se haba considerado en los valores de referencia del espermiograma. En una poblacin compuesta por hombres con fertilidad reciente, pertenecientes a parejas que han obtenido el embarazo en un tiempo inferior o igual a 12 meses.
Es conveniente aclarar que los lmites inferiores de referencia no son valores de referencia de esterilidad o fertilidad: o Ya que ni son los valores mnimos que se necesitan para lograr un embarazo, pues habr muchos varones con valores superiores que no puedan conseguir un embarazo por causas estrictamente femeninas o por factores que no se ponen en evidencia en los parmetros del seminograma.
112
Ni valores inferiores suponen necesariamente padecer esterilidad o subfertilidad, de hecho el percentil 5 de los valores frtiles estudiados tiene valores seminales inferiores a dichos lmites.
Los valores de referencia deben interpretarse conjuntamente con la informacin clnica para poder sacar algunas conclusiones. Adems, puede haber diferencias regionales en la calidad del semen, y entre laboratorios. Estos laboratorios debern considerar la preparacin de sus propios valores de referencia.
VALORES DE REFERENCIA DE LOS PARMETROS MACROSCPICOS DEL SEMEN PARMETRO Licuefaccin Viscosidad Apariencia pH Agregacin Aglutinacin VALOR < 60 2 cm homogneo, gris opalescente 7,2 Sin inters No concluyente
LMITES INFERIORES DE REFERENCIA DEL ESPERMIOCITOGRAMA PARMETRO Volumen (ml) Concentracin spz (106/ml) Espermatozoides totales (106/E) Movilidad total (%) Movilidad progresiva (%) Vitalidad (%) Morfologa normal (%) 6 Concentracin leucocitos 10 /ml) Anticuerpos antiespermatozoides (%) VALOR 1,5 15 39 40 32 58 4 <1 < 50% IC 95% 1,4-1,7 12-16 33-46 38-42 31-34 55-63 3-4 -
VALORES DE REFERENCIA DE LOS PARMETROS BIOQUMICOS DEL PLASMA SEMINAL PARMETRO PERCENTIL 10 PERCENTIL 5 Citrato (mol/E) >60 Zinc (mol/E) >3 2,4 Fosfatasa cida (UI/E) >1234 -1,4 Glucosidasa neutra (mUI/E) >59 20 L-Carnitina (nmol/E) >654(a) o >390(b) Fructosa (mol/E) > 59 13 IC: Intervalo de confianza .E: Eyaculado (a): cintica enzimtica (b): colorimetra
Tabla 12. Valores y lmites de referencia o o Se considera una eficiencia de criopreservacin ptima un valor de CSF50% junto con una movilidad total de 30% con 25% de movilidad progresiva. La eficiencia de recuperacin de espermatozoides mviles del Swim up suele ser <20%, mientras que la de la centrifugacin en gradiente de densidad > 20%.
113
8.3
Comentarios
Conclusin
PARMETRO VOLUMEN RESULTADO NORMAL ALTO BAJO AUSENCIA NORMAL ALTO BAJO AUSENCIA AUSENCIA en fresco y PRESENCIA en el sedimento BAJO BAJO BAJO BAJOS INFORME Normospermia Hiperespermia Hipoespermia Aspermia Normozoospermia Polizoospermia Oligozoospermia Azoospermia Criptozoospermia Astenozoospermia Teratozoospermia Necrozoospermia Oligoastenoteratozoospermia Hemos o Hematospermia Leucos, Leucocito o Piospermia
RECUENTO
MOVILIDAD MORFOLOGA VITALIDAD COMBINACIONES: Recuento Movilidad Morfologa OTROS ELEMENTOS FORMES
HEMATES LEUCOCITOS
Tabla 13. Nomenclatura de la calidad del esperma A modo de resumen, el analista puede incluir un comentario sobre la calidad del esperma en funcin de los resultados cuantitativos del espermiograma, para lo cual se ha de emplear la terminologa adecuada: permia se refiere al eyaculado; y zoospermia se emplea para referirse a los espermatozoides. Tabla 13. Orientacin diagnstica Azoospermia Las determinaciones hormonales, en particular la de FSH plasmtica y los marcadores bioqumicos, la medida del volumen y el pH del plasma seminal, son esenciales para orientar el diagnstico hacia una azoospermia secretora de origen testicular o antehipofisaria o hacia un azoospermia excretora debido a una obstruccin o un agenesia de los conductos genitales. o o La FSH plasmtica permite explorar el eje gonadotropo y orientar hacia una etiologa pretesticular y testicular. La L-carnitina y la -1,4glucosidasa seminales permiten explorar todo el tracto a partir de los cuerpos del epiddimo porque son los marcadores ms significativos.
114
Ilustracin17. Algoritmo diagnstico de la azoospermia o Si la FSH est disminuida, puede tratarse de un hipogonadismo hipogonadotrfico. La anomala es pues de origen endrocrinopretesticular, la testosterona estara tambin disminuida y los marcadores bioqumicos seran normales o bajos. Es una anomala rara, curable con tratamiento hormonal. Si la FSH est aumentada con una L-carnitina y una 1,4 glucosidasa normales, el origen es testicular y es una azoospermia secretoria. Esto representa cerca del 70% de las azoospermias. La elevacin de la concentracin de FSH es proporcional al grado de afeccin testicular. Las etiologas son numerosas: el sndrome de Klinefelter, los defectos de maduracin de la lnea germinal, la criptorquidia, las secuelas infecciosas, las lesiones traumticas o trmicas. Ciertas azoospermias secretoras tienen, sin embargo, una tasa de FSH normal que complica as su diagnstico. Si el FSH es normal con un L-carnitina y una 1,4 glucosidasa baja, se denomina azoospermia excretoria. Es debida a una obstruccin o una agenesia del tracto genital.
115
La cuantificacin de otros marcadores (fructosa) permitir situar el nivel de esta obstruccin. o o Si la fructosa es normal, se puede sospechar una oclusin del epiddimo o deferencial. Si la fructosa es baja con un volumen dbil de esperma y un pH cido, se puede sugerir una oclusin de los conductos eyaculadores o una agenesia vesculodeferencial. Hay un caso difcil de diagnosticar, es la afeccin de la cabeza del epiddimo, ya que la L-carnitina y el resto de marcadores no estn alterados.
En estas azoospermias excretorias, la ciruga se utiliza frecuentemente para confirmar la topografa de la obstruccin y eventualmente quitarla. Oligozoospermias En las oligozoospermias, las determinaciones de los marcadores bioqumicos pueden orientar hacia ciertas etiologas: o o Obstruccin unilateral: ciertos marcadores estn bajos; Prostatitis: la inflamacin provoca la compresin de los conductos excretorios, el volumen est disminuido, el pH aumentado y todos los marcadores estn bajos. Hay con frecuencia una leucospermia e incluso una alternancia oligo/azoospermia (espermasfluctuantes).
Astenozoospermias En ciertas astenozoospermias es interesante determinar la L-carnitina y la fructosa, porque su disminucin puede estar en relacin con una disminucin de la movilidad del espermatozoide. La fructosa es sintetizada en las clulas epiteliales de las vesculas seminales, por conversin a partir de la glucosa sangunea. La diabetes conlleva un falso aumento de la fructosa seminal y puede, por ejemplo, disfrazar una bajada de este parmetro. Otras anomalas Los marcadores bioqumicos pueden estar alterados en los varicoceles, en los sujetos VIH... En resumen, la exploracin completa y escrupulosa de la esterilidad y subfertilidad masculinas es esencial. El espermiograma es un examen primordial, la bioqumica del plasma seminal lo completa: permite explicar ciertas anomalas, en particular las azoospermias obstructivas. El diagnstico exacto de la causa de esterilidad y subfertilidad masculinas es el resultado de un proceso pluridisciplinar, pudiendo recurrir a numerosos exmenes complementarios ms o menos complejos. Es muy importante, ya que condiciona la eleccin de un tratamiento o de una tcnica de procreacin mdicamente asistida.
116
Bibliografa
Captulo 9
Bibliografa
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Pginas webs recomendadas

http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/ch28_VldzD.htm http://nuevo.sefertilidad.com/socios-profesionales.php http://www.ceiferformacion.com/ http://www.micropticsl.com/esp/productos/analisis_esperma_sca.html
119
Sobre los autores
Sobre los autores del libro

M Jos Lpez Garca
Doctora en Farmacia Facultativa especialista en Anlisis Clnicos Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir lopezmjose.68@gmail.com
Aurora Urbano Felices

Tcnico Especialista de Laboratorio Hospital Infanta Margarita. Cabra Servicio Andaluz de Salud felices70@hotmail.com
Marta Crdenas Povedano

Tcnico Especialista de Laboratorio Hospital de Montilla Agencia Sanitaria Alto Guadalquivir martacar22@gmail.com
120
Sobre los revisores
Sobre los revisores del libro

Javier M Gutirrez Romero
Licenciado en Farmacia. Facultativo especialista en Anlisis Clnicos. Responsable de reproduccin asistida de la UGC Laboratorios Clnicos. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz. javier.gutierrez.sspa@juntadeandalucia.es
Iratxe Lpez Pelayo

Licenciado en Farmacia. Facultativo especialista en Anlisis Clnicos. UGC Laboratorios. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz. iratxelp@yahoo.es
121

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Manual de laboratorio para el analisis del semen

1 edicin 2012 OmniaScience (Omnia Publisher SL) www.omniascience.com

1.3.1. 1.3.2. 1.3.3. 1.3.4. 1.3.5.

CAPTULO 4 ESTUDIO BSICO DEL ESPERMIOGRAMA Recuento 4.1

Anticuerpos antiespermatozoides Otras clulas

5.2.1. 5.2.2. 5.2.3.

Estudios complementarios en sangre

CAPTULO 6 ESTUDIO DEL SEMEN EN VASECTOMAS Y VASOVASOSTOMAS 6.1 Semen de postvasectoma

Semen de prevasovasostoma Semen posvasovasostoma

Materiales y medios necesarios Mtodos de preparacin del semen

7.5.1. 7.5.2. 7.5.3. 7.5.4.

7.6 7.7 CAPTULO 8

Valoracin de los resultados Conclusiones

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Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustracin 20) http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#sistema_masculino http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_01a.jpg

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Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustraciones de la 1 a la 10) http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_02.jpg http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_04.jpg

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Ilustraciones recomendadas: http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm (Ilustraciones 29 y 30) http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_10.jpg

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Marcador de las vesculas seminales. (2 Fraccin del eyaculado)

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Capacitacin del espermatozoide

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Ilustraciones recomendadas: http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_07.jpg

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Bioqumicos o o Estudios complementarios en sangre: Cariotipo y anomalas; hormonas. Bioqumica seminal.

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Recogida de las muestras

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hora. En casos de anlisis de postvasectoma, el lmite mximo es de 4 horas desde la eyaculacin.

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Entrega de instrucciones y contenedor 1 semana antes

Conservacin hasta su procesamiento

Tabla 1. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen

Recepcin Cultivo 1) SEMEN EN CONTENEDOR IDENTIFICAR Nombre,apellidos N Laboratorio. PASAR A CONSERVACIN.

Conservacin hasta su procesamiento

Inmediato, mximo 1h 2-8C.

PARA FIV 1) Despejarse 2) Levitra, Cialis o Viagra

Tabla 1 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen

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Conservacin hasta su procesamiento