ELISA PRINCIPIUL METODEI Aceast metod este indicat pentru detecia anticorpilor din probe de ser individuale sau

n pool-uri.Ea se bazeaz pe proprietatea antigenelor de a forma dup depunerea pe un support de polistiren transparent, complexe imune cu anticorpii specifici. Acestea se pot evidenia dup adugarea unui substrat specific, printr-un proces care se desfoar n mai multe etape : Fixarea antigenelor specifice pe suportul de polistiren transparent Adugarea serului de testat, ale crui imunoglobuline specific de antigenele fixate pe suportul solid. Adugarea de antiimunoglobuline conjugate cu o enzim Adugarea unui substrat capabil s activeze peroxidaza cu care s-a marcat antianticorpul pentru a dezvolta o reacie de culoare Stoparea reaciei Citirea reaciei de culoare la un spectofotometru automat. se vor lega

Etapele descrise sunt caracteristice tehnicii ELISA indirect.Acest metod permite testarea anticorpilor pe seruri individuale sau n amestec de 10 seruri. Amestecul se realizeaza luand aceeasi cantitate de ser din cele 10 probe, formand o proba unica. Amestecurile gsite pozitize trebuie reluate i testate pe seruri individuale. MATERIALE NECESARE Continutul kitului i modul de depozitare Este recomandabil s se lucreze cu to i reactivii adu i la temperatura de + 21 0C (50C).Pentru aceasta, este indicat ca reactivii s fie sco i din frigider cu cel pu in o or nainte de a ncepe efectuarea testului (cu excep ia conjugatului). COMPONENTUL Microplci godeuri sensibilizate cu 96 CANTITATEA 10 buci MODUL DE CONSERVARE I ALTE OBSERVAII +5 C(3 C) pn la expirarea termenului
0 0

(12x8)

de valabilitate. Dac o plac nu este folosit n totalitate,

ea se poate utiliza ulterior dac este introdus ntr-o pung de plastic nchis Martor pozitiv (n kit) Martor negativ lichid (n kit) conjugat , anticorp 1 flacon de 1,5 +50C(30C) pn la expirarea termenului monoclonal anti igG ml marcat cu de valabilitate. Soluia de conjugat diluat nu poate fi lichid 1 flacon de 1 ml 1 flacon de 1 ml etan i meninut la +50C(30C) +50C(30C) pn la expirarea termenului de valabilitate.

peroxidaz ( HRPO) conservat Soluie substrat n 1 flacon de 120 +50C(30C) pn la expirarea termenului diluie de lucru(TMB) ml de valabilitate. Soluia poate avea o tent uor bleu la +50C(30C),devenind +210C(50C) Soluia poate fi lsat la temperatura laboratorului la +210C(50C)timp de o sptmn dac este stocat n flacoane Soluie nchise etan stopare 1 flacon de 120 +50C(30C) pn la expirarea termenului ml de valabilitate. Soluia de stopare poate fi inut la 18 250C(50C) dup ce kitul a fost deschis Tampopn de diluie 1 Tampopn de diluie 2 Soluie timp de o lun. 1 flacon de 120 +50C(30C) ml 2 flacoane de +50C(30C) de +50C(30C) Soluia prezint cristale la +5 0C(30C) care vor dispare la +21 0C(50C)iar o agitare uoar din cnd n cnd va accelera dizolvarea acestora. Soluia poate fi lsat la temperatura laboratorului la +210C(50C)timp de o lun incolor la

(soluie H2SO4 0,5 M)

120 ml splare 2 flacoane 100ml

concentrat 20x

dac este stocat n flacoane nchise etan.Dup diluare poate fi conservat timp de 3 zile la +50C(30C). Serurile de cercetat, cu hemoliz puternic, contaminate cu bacterii sau fungi sau cele recoltate pe anticoagulant (heparin sau EDTA) nu se testeaz deoarece pot furniza rezultate eronate. Sunt necesari 5-7 ml snge/prob. Serurule de testat se pstreaz la frigider la 20 - 70 C pn la 5 zile iar dac este necesar o perioad mai lung de pstrare vor fi congelate la 20 0C. ECHIPAMENTE DE NCERCARE I MIJLOACE DE MSURARE Etuv electric tip BINDER, reglat la 37oC, Termostat incucell reglat la 37C Agitator vortex Agitator/incubator placi Linie ELISA TECAN (monitor, spltor, agitator ,cititor, imprimant), Cilindri gradai de 100. 250, 1000 ml Micronixuri pentru probe Pipete semiautomate, calibrate, monocanal i multicanal Cuve din plastic pentru reactivi

Virfuri pentru pipete semiautomate Frigider cu congelator Pipete de 5 ml i 10 ml

Aciuni i / sau msuri preventive Protecia personalului Obligatorie purtarea halatului, a mnuilor chirurgicale(ecipament de protecie). Materialele supuse examinarii vor fi considerate ca posibil infectate cu germeni patogeni pentru om si vor fi manipulate cu atentie. Reactivii nu se pipeteaz cu gura ; Reactivii se utilizeaza numai pentru diagnosticul de laborator.

Evitarea contactului substratului(TMB) cu pielea, mucoasele i ochii. Dup utilizare plcile i substratul pot fi distruse prin incinerare. Soluia stop conine H2SO4 0,5 M ce poate cauza arsuri grave n caz de contact cu pielea, mucoasele i ochii. Materialele folosite in reactie se strang in vasul pentru deseuri, al carui continut va fi distrus prin ardere. Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante Sterilizarea ncperii de lucru cu raze U.V.

Protecia mijloacelor de ncercare i / sau msurare Sticlria curata se pstreaz n dulapuri speciale Executarea periodic a serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii Verificarea i nregistrarea temperaturii din ncperea de lucru

Verificarea strii de funcionare i confirmarea metrologic a mijloacelor de msurare Verificarea o dat pe zi a temperaturii termostatelor

MOD DE LUCRU. Factorii care influenteaza fidelitatea metodei sunt : calitatea spalarilor (atentia acordata ultimei spalari este foarte importanta pentru buna realizare a testului). precizia pipetajului conditiile de temperatura a reactiei. Pregtirea trusei de lucru Se aduc toi reagenii le temperatura camerei (18 25 0C) nscrierea n fia de lucru a probelor de testat i a serurilor martor

Se nregistreaz pe fia de lucru poziia serurilor i martorilor n plcile cptu ite cu anticorpi Diluarea serurilor Se distribuie 190 l tampon de diluie 2 n fiecare godeu Se depun 10 l ser de referin negativ pur n godeul A1 Se depun 10 l ser de referin pozitiv pur n godeul B1 Se depun 10 l ser pentru testare n godeurile aferente Se omogenizeaz coninutul cu grij btnd placa de 10 ori. Se acoper placa i se incubeaz 60 minute(5 minute) la +37 0C.

A B C D E F G H

N P 1 2 3 4 5 6

10 11 12

Fig.1:Distribuia probelor i martorilor pe plac Unde : P = martor pozitiv N = martor negativ 1 = ser de testat nr.1 2 = ser de testat nr.2.....

Prepararea soluiei de splare i folosirea acesteia

Soluia de splare concentrat de 20 x trebuie adus la temperatura camerei i omogenizat prin agitare uoar pentru a ne asigura c srurule precipitante s-au dizolvat

Soluie de splare concentrat 20x trebuie diluat n 1900ml ap distilat Se scot probele din termostat. Se elimin coninutul godeurilor prin rsturnare sau cu ajutorul unui aparat automat ntr-un container de colectare. Se distribuie n fiecare godeu 350l soluie de splare i apoi se elimin din nou aceast soluie Procedura de splare se repet de 2 ori(deci 3 splri n total). Daca se foloseste spalatorul automat se respecta instructiunile de folosire ale acestuia. Dac se lucreaz cu un numr mare de plci n acelai timp,n scopul sincronizrii operaiunilor, plcile se pot lsa umplute cu soluia de splare pn la o or, fr ca aceasta s influeneze validarea testului.

Depunerea conjugatului Se dilueaz conjugatul 1/100 n tamponul de dili ie nr.1(de exemplu pentru 1 strips se amestec 1ml TD.1 cu 10 l conjugat) Se depun 100l conjugat diluat n fiecare godeu. Se omogenizeaz coninutul cu grij btnd placa de 10 ori. Se acoper placa i se incubeaz 30 minute(3 minute) la +37 0C (3 minute).

Splarea (pasul al 2-lea de splare) Se elimin coninutul godeurilor prin rsturnare sau cu ajutorul unui aparat automat ntr-un container de colectare . Se distribuie n fiecare godeu 350l soluie de splare i apoi se elimin din nou aceast soluie Procedura de splare se repet de 2 ori(deci 3 splri n total).

Atenia acordat ultimei splri este important pentru buna realizare a testului

Revelarea. Se depun 100 l substrat (TMB) n fiecare godeu Se omogenizeaz coninutul cu grij btnd placa de 10 ori. Se incubeaz plcile timp de 20 minute la temperatura camerei 21 0C (50C) la ntuneric. Se ncepe cronometrarea de la umplerea primului godeu Placa nu se acoper cu folie adeziv.

Stoparea. Se depun 100l soluie stopare n fiecare godeu. Se agit uor plcile pn la omogenizarea soluiei colorate. Se terge cu atenie fundul plcii si se pune placa la aparatul de citire. Soluia de stpare se adaug n aceeai ordine ca i solu ia substrat

Citirea. Citirea plcilor se face la o densitate optic(DO) de 450 nm. Criterii de validare a testului. Testul se consider valid dac: Serul de referin pozitiv d o valoare a densit ii optice de minim 0,350 Raportu dintre DO a serului de referin pozitiv i DO a serului de referin negativ d o valoare de minm 3

INTERPRETAREA REZULTATELOR Se calculeaza pentru fiecare prob procentul E/P:

% E/P = (DO prob/DO ser de referin pozitiv )x 100 Orice prob a crui % E/P100% este considerat negativ Orice prob a crui % E/P100% este considerat pozitiv

IMUNODIFUZIA IN GEL DE AGAR PRINCIPIUL METODEI Reacia de precipitare i imunodifuzie n gel de agar este reacia care se produce ntre antigen i anticorp n urma migrrii acestora n gel de agar. Antigen: agentul patogen ( suspensie microbiana vie, atenuata sau inactivata) care are capacitatea de a induce formarea de anticorpi n organism. Anticorp: element specific produs de organism n urma contactului acestuia cu diferii ageni patogeni.Are rolul de a neutraliza efectele nocive ale agentului patogen. Metoda se bazeaz pe proprietatea anticorpilor precipitani prezeni n serul animalelor bolnave sau potenial purttoare de virus i a antigenului de a migra n gelul de agar. Anticorpii precipitani apar rapid, ca urmare a infeciei cu virus , reaciile pozitive specifice fiind indicate prin linii de precipitare formate ntre antigen i serul de testat, reacii confirmate prin identitatea cu reacia dintre antigen i serul standard pozitiv .

MATERIALE NECESARE

Continutul setului i modul de depozitare

Setul de diagnostic pentru este format din urmtoarele componente : 1 flacon cu antigen 2 ml 3 flacoane cu ser pozitiv liofilizat 3 ml 1 flacon cu diluant pentru componentele setului

Pe lng componentele din setul de diagnostic, pentru desf urarea testului se mai folosesc :agar (agaroza)Noble pentru imunodifuzie, ap distilat, acid boric , clorur de sodiu, hidroxid de sodiu, vat, tifon, alcool sanitar-pentru degresarea placilor Componentele setului de diagnostic se conserv la + 2 0 / + 70 C. Serurile de cercetat, cu hemoliz puternic, contaminate cu bacterii sau fungi sau cele recoltate pe anticoagulant (heparin sau EDTA) nu se testeaz deoarece pot furniza rezultate eronate. Sunt necesari 5-7 ml snge/prob. Serurule de testat se pstreaz la frigider la 2 0 - 70 C pn la 5 zile iar dac este necesar o perioad mai lung de pstrare vor fi congelate la 200C

ECHIPAMENTE DE NCERCARE I MIJLOACE DE MSURARE Aparatur i sticlrie Termostat Friocell reglat la 20-22 C, Lupa cu putere de marire de 3x Lampa U.V. radiatii U.V. cu efect bactericid incaperilor i a suprafetelor de lucru. Aparat tip ovoscop pentru citire plci Petri. Matri metalic cu diametrul de 5,0/3,0 mm - de 5,3 / 2,4 mm pentru efectuarea godeurilor Plci Petri sterile din material plastic cu diametrul de 85 - 90 mm Pipete semiautomate, calibrate, monocanal Vrfuri pentru pipete semiautomate Baloane Erlenmeyer de la 250 la 1000 ml Eprubete de 16 x 160 mm din sticla neutra sterile cu dopuri din vata. Cristalizator sau placa Petri din sticla cu diametrul de 20 cm. Pipete gradate de 5, 10, 25 ml. Stative pentru eprubete. pentru sterilizarea aerului

Aciuni i / sau msuri preventive Protecia personalului Obligatorie purtarea halatului, a mnuilor chirurgicale i a mtii de tifon (echipament de protecie). Flacoanele cu antigen sau cu seruri de referin se vor colecta n vase speciale cu sod caustic 5%, apoi se vor steriliza la autoclav. Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante Sterilizarea ncperii de lucru cu raze U.V. Manipularea soluiilor oxidante folosite pentru decontaminarea materialelor se va face cu precuie. Protecia mijloacelor de ncercare i / sau msurare Sticlria steril se pstreaz n dulapuri speciale Executarea periodic a serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii. Verificarea i nregistrarea temperaturii din ncperea de lucru

Verificarea strii de funcionare i confirmarea metrologic a mijloacelor de msurare Verificarea zilnic a temperaturii termostatului

MOD DE LUCRU Factorii care influenteaza fidelitatea metodei sunt urmatorii : Reactivii s se ncadreze n termenul de valabilitate Serul s fie fr urme de hemoliz Reactivii s fie adusi la temperatura camerei Plcile Petri s fie curate (de unic folosin) i agarul s fie preparat corespunztor. Sa nu existe condens in interiorul godeurilor( poate dilua reagentii). Vrfurile pentru pipetele semiautomate s fie de unic folosin

Pregtirea materialului supus examinarii Probele se pregtesc conform metodei omologate pentru care se solicit examenul.Dup recepionare, se face identificarea probelor( se verifica daca nr. de pe eticheta sticlutelor corespund cu cele din tabelul insotitor).Se verifica daca probele sunt corespunzatoare( sa fie proaspete, exprimate, sa nu fie hemolizate, infectate bcterian sau fungic. Probele la care serul este exprimat se introduc la frigider, probele cu serul neexprimat se decoleaz i se menin 3-6 ore la temperatura camerei (21 C), apoi se pun la frigider pn se lucreaz. Este necesar un volum de 5-7ml singe/proba. Prepararea tamponului borat i a gelului de agar Tamponul borat (pH 7,2) se prepar dup formula : acid boric..9,0 g hidroxid de sodiu.2,0 g sau 50 ml 1n clorura de sodiu.70,0 g ap distilat ad 1000 ml

La 1l de tampon borat preparat dup formula de mai sus, se adaug0,8 g de agar Noble Difco (agaroz), se las 12 ore la temperatura camerei la macerat, dup care amestecul se fierbe la baie marin pn la dizolvarea complet a agarului. Filtrarea se face prin tifon sau vat. Gelul de agar se aduce la temperatura de 60 0 C, apoi se toarn neprubete de 16/160 cte 15 ml n fiecare. n ziua efectuarii testului, gelul din eprubete se topete n baia marin, apoi se toarn n plci Petri cu diametrul de 85 mm.

Pregtirea plcilor pentru reacie Nu se folosesc placile deformate, fisurate, mate sau zgariate. Placile vor fi degresate cu alcool sanitar inainte de a se turna agarul in ele. Plcile din plastic n care s-a turnat agarul se las la temperatura camerei cu capacul putin intredeschis, pe o suprafata perfect plana, intr-un loc ferit de curenti de aer si praf, timp de 10 minute pentru solidificarea acestuia, se introduc n

frigider la temperatura de 2-8 0 C pentru 2 ore, timp necesar pentru rcirea complet a agarului. Agarul trebuie s aib o grosime de aproximativ 2,8mm. Cu matria cu diametrul de 6,5/3,0 mm sau de 5,3/2,4 mm se taie n agarul din placa Petri un numar de 7 grupuri de godeuri ; fiecare grup este format din 7 godeuri ( 6 godeuri periferice si 1 central) asezate sub forma de rozeta. Cu un ac de seringa se scoate gelul de agar din godeuri. Plcile nefolosite pot fi depozitate la frigider la 2 7 0C n pungi nchise etan pn la o sptmn, iar nainte de utilizare agarul trebuie verificat pentru a ne asigura c nu este uscat .Godeurile trebuie sa aiba marginile regulate si peretii perfect verticali. Repartizarea reagenilor n godeuri i incubarea plcilor Componentele setului de diagnostic se dizolv n lichidul de diluie, n cantitile menionate de producator pentru fiecare flacon n parte, dup care se pun la frigider timp de 10 minute pentru stabilizare(n funcie de furnizor) iar cele neliofilizate se folosesc ca atare. Se verific dac agarul nu s-a desprins de pe fundul plcii, dac godeurile sunt corect taiate ( sa aiba marginile regulate si peretii verticali), se apreciaz distana dintre ele i se verific s nu conin ap. Dac exist ap aceasta se aspir cu pipeta Pasteur, apoi se numeroteaz grupurile de godeuri cu marker-ul pe marginea fiecrei plci. Adugarea reagenilor din setul de diagnostic n godeuri are n vedere introducerea lor uniform fr bule de aer, pn la apariia meniscurilor (se pun 40 50 l/ godeu). n cazul n care serurile martor, antigenul sau serurile de cercetat depesc nivelul superior al godeurilor, lucrarea se va reface n grupul urmtor de godeuri, pentru evitarea erorilor de diagnostic. Distribuirea n plac este urmtoarea : n godeul central se pune antigenul solubilizat in godeurile 2, 4 , 6 se pune serul pozitiv solubilizat n godeurile 1 , 3 , 5 se pun serurile de testat conform figurii nr. 1 Fig.1

SP S3 AG SP S1 SP S5

AG = antigen SP = ser pozitiv S1,3.5 = ser de testat

Plcile sunt lsate 10 minute pe masa de lucru acoperite cu capac,pentru eliminarea riscului de amestec sau scurgere, ct i pentru aezarea reagenilor, nainte de a ncepe migrarea antigenelor i anticorpilor. Plcile se incubeaz la 20220 C ntr-o cutie din plastic n care s-a asigurat o atmosfer umed. Durata operatiilor 30 minute INTERPRETAREA SI EXPRIMAREA REZULTATULUI Interpretarea rezultatului Citirea reaciei se face la lumina ovoscopului, la 24, 48, i 72 ore pentru a urmri apariia martorilor i interpretarea rezultatelor. Tipul de reacie va depinde de calitatea antigenului, concentraia anticorpilor din serurile de cercetat i va putea fi apreciat dup compararea acestora cu cea a serurilor martor pozitive. Dac ntre serul martor pozitiv i antigen linia de precipitare este bine evidentiata, situata la jumatatea distantei dintre ele si apare la 24 de ore, reacia se consider valid. Exprimarea rezultatelor Se pot ntlni urmtoarela tipuri de reacie : Reacia negativ serul de cercetat nu conine anticorpi detectabili prin acest test. ntre godeurile cu ser i cel cu antigen (A) nu apare linia de precipitare. Linia de precipitare dintre godeul cu antigen si serul martor pozitiv merge pana la marginea godeului cu serul de testat.(fig 2 S1-proba negativa). Reacia pozitiv serul de cercetat conine anticorpi. Linia de precipitare este clar, continu, situat la jumtatea distanei ntre godeul cu antigen (A)i cel cu serul de

cercetat(S2). La ambele capete linia se unete sub forma unui cot cu linia de precipitare a serului martor pozitiv alturat. .(fig 2 S2-proba pozitiva) Reacia slab pozitiv linia de precipitare este foarte slab vizibil, este mai aproape de godeul ce conine serul de cercetat (S3)si curbeaza usor linia de precipitare a serului martor pozitiv.Nu formeaza o linie completa intre antigen (A) si serul de testat (S3) (fig 2 S3-proba slab pozitiva) Deoarece reaciile slab pozitive pot fi interpretate eronat, pentru confirmare se impune repetarea testului .

Fig. 2

Fig. 3

Reacia intens pozitiv serurile puternic pozitive formeaz o band mai lat de precipitare ntre godeurile cu ser (S1) i cele cu antigen (A), adesea dizolv linia de precipitare a serului de referin din partea sa, acesta rmnnd la jumtate. Diagnosticul se stabilete dup retestarea serurilor respective n diluii seriate (1/2, 1/4, 1/8) pn se obine o linie de precipitare distinct.Linia de precipitare este foarte aproape de godeul cu antigen (A)(fig. 3 S1- proba intens pozitiv). Reacia nespecific se produce n cazul unor reacii antigen anticorp de alt natur. Se ia n considerare atunci cnd serurile de cercetat formeaz o linie slab, difuz, alte ori clar, care se suprapune sau ntretaie linia serului martor pozitiv. (fig. 3 S2 reactie nespecifica) Reacia mascat - serurile de cercetat formeaz un halou albicios n jurul godeurilor n care au fost repartizate. Poate masca liniile de precipitare care pot aprea. Testul se repet folosind seruri diluate 1/2. Dac modificrile persist serurile cu reacie mascat se vor examina din din nou dup 30 de zile. Stabilirea diagnosticului se face la 48, 72 de ore. (fig. 3 S3 reactie mascata)

Stabilirea diagnosticului se face la 72 de ore.