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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 4. établissement des procédures de vérification : La vérification de la

4. établissement des procédures de vérification :

La vérification de la méthode HACCP est une activité mise en œuvre pour s’assurer que ce système fonctionne efficacement.

4.1. Les analyses microbiologiques :

Les produits alimentaires peuvent contenir une flore microbienne plus au moins abondante qui peut être nuisible pour leur qualité, et pour la santé du consommateur. Des micro-organismes sont utilisés comme des agents technologiques et leur présence est parfois indispensable pour certaines industries alimentaires.

L’analyse bactériologique des produits alimentaires est indispensable pour :

Assurer au produit une bonne qualité et une longue conservation.

Garantir la qualité hygiénique du produit.

4.1.1. La matière première :

a) L’eau de reconstitution :

1)

Technique de prélèvement et d’échantillonnage :

Le prélèvement s’effectue directement par le robinet de tank de lancement, ceci après avoir flambé l’orifice du robinet probablement désinfecté, on laisse couler un moment et à l’aide d’un flacon stérile, on prélève 250 ml.

2)

Dilution :

On travail avec la solution mère qui représente le prélèvement de 250 ml de l’eau de reconstitution.

3)

Recherche microbiologique :

L’eau constitue un élément essentiel dans l’industrie laitière les micro-organismes rencontré dans l’eau sont très variés, leur nature dépend de celle de l’eau à analysée.

Les germes recherchés dans l’eau de reconstitution sont :

Recherche et dénombrement des Germes Totaux.

Recherche et dénombrement des germes de contamination fécale (Coliforme Totaux et Fécaux)

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30

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation  Recherche et dénombrement des Entérocoques (Streptocoques Fécaux). 

Recherche et dénombrement des Entérocoques (Streptocoques Fécaux).

Recherche et dénombrement des Clostridies Sulfito-Reducteurs.

3.1) Recherche et dénombrement des Germes Totaux : schéma n° 01

Leur dénombrement nous renseigne sur la charge microbienne du produit, et il chiffre le degré de contamination.

La technique utilisée est celle de numération en milieu solide (P.C.A ou T.G.E.A) en petries avec ensemencement dans la masse.

boites

de

Méthodologie :

La technique consiste à introduire aseptiquement 1 ml de la solution mère dans chaque boites de petries (02 boites), couler par la suite environ 20 ml de la gélose P.C.A. Faire des mouvements circulaires pour bien mélanger et laisser les boites solidifier sur la paillasse.

Incubation :

- La 1 ère boite sera incubée à 37°C pendant 24 heures.

- La 2 eme boite sera incubée à 22°C pendant 72 heures.

Lecture :

Les colonies de germes totaux se présentent sous forme lenticulaire en masse.

Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte du facteur suivant :

- Ne dénombrer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation Eau à analysée 1 ml 1 ml - Ajouter 20 ml
Eau à analysée
Eau à
analysée
1 ml
1 ml
Eau à analysée 1 ml 1 ml - Ajouter 20 ml de gélose PCA ou TGEA
1 ml
1 ml
Eau à analysée 1 ml 1 ml - Ajouter 20 ml de gélose PCA ou TGEA

- Ajouter 20 ml de gélose PCA ou TGEA

- Laisser solidifier sur paillasse

- Incuber pendant :

22°C (72 heures)

37°C (24 heures)

- Dénombrer les colonies lenticulaires en masse.

Chapitre III

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Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.2) Recherche et dénombrement des contaminations fécales (Coliformes Totaux

3.2) Recherche et dénombrement des contaminations fécales (Coliformes Totaux et Fécaux) : schéma n° 02

La méthode adapter pour cette analyse est la technique du dénombrement en tube multiple (NPP). (Annexe Le milieu utilise est le BCPL (Bouillon Lactose au Pourpre Bromocréol). La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :

Le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes.

Le test de confirmation : (test Mac Kenzie) réservé à la recherche des Coliformes Fécaux (à partir des tubes positifs du test de présomption).

Test de présomption :

Porter aseptiquement de l’échantillon d’eau à analysée :

- 50 ml dans un flacon contenant 50 ml du milieu BCPL (D/C) muni d’une cloche de durham.

- 5 fois 10 ml dans 05 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL (D/C) muni d’une cloche de durham.

- 5 fois 1 ml dans 05 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL (S/C) muni d’une cloche de durham.

Incubation :

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les tubes et flacon positifs présentent à la fois :

Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche.

Un trouble microbien accompagné d’un virage de couleur du milieu au jaune (ce qui constitue le témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu).

Les résultats sont négatifs si les tubes et flacon ne présentent aucun trouble et aucun dégagement gazeux.

La lecture se fait selon la prescription de la table de Mac Grady (Annexe

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Chapitre III Diagnostic et évaluation Test de confirmation au test de Mac Kenzie : Les tubes

Test de confirmation au test de Mac Kenzie :

Les tubes de BCPL trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes Totaux, ferrant l’objet d’un repiquage dans le milieu de BCPL muni d’une cloche de durham et EPEI (Eau Peptone exemple d’Indol).

Incubation :

L’incubation se fait à 44°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les tubes et flacon positifs présentent à la fois :

Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche).

Un anneau rouge en surface témoin de la production d’indol par l’Echérichiacoli après adjonction de 02 à 03 gouttes de réactif de Kowacs.

La lecture finale se fait selon la prescription de la table de (NPP) en tenant compte du fait qu’Echérichiacoli est à la fois producteur de gaz et d’indol à 44°C.

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Chapitre III Diagnostic et évaluation 250ml Eau a analysée 10 ml 10 10 10 10 10
250ml
250ml

Eau a analysée

10 ml 10 10 10 10 10 ml ml ml ml ml
10 ml
10
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10
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ml
ml
ml
ml
ml
a analysée 10 ml 10 10 10 10 10 ml ml ml ml ml BCPL (D/C)

BCPL (D/C)

1 ml 10 10 10 10 10 ml ml ml ml ml
1 ml
10
10
10
10
10
ml
ml
ml
ml
ml
ml BCPL (D/C) 1 ml 10 10 10 10 10 ml ml ml ml ml BCPL

BCPL (S/C)

Test de présomption

50 ml BCPL (D/C) +
50 ml
BCPL (D/C) +

Cloche durham

Incubation à 37°C pendant 24 H 1O Trouble microbien + Gaz dans la cloche ml
Incubation à 37°C pendant 24 H
1O
Trouble microbien +
Gaz dans la cloche
ml

Réaction positive

BCPL
BCPL
Test de confirmation EPEI Incubation à 44°C pendant 24 H
Test de confirmation
EPEI
Incubation à 44°C pendant 24 H
Réaction négative +2 gouttes du kowacs Anneau rouge
Réaction négative
+2 gouttes
du kowacs
Anneau rouge
Schéma n°02 : Recherche des Coliformes (Totaux et Fécaux) dans l’eau. 35
Schéma n°02 : Recherche des Coliformes (Totaux et Fécaux) dans l’eau.
35

Chapitre III

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Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.3) Recherche et dénombrement des Clostridium Sulfito-Réducteurs : schéma

3.3) Recherche et dénombrement des Clostridium Sulfito-Réducteurs : schéma

n°03

Les Clostridium sulfito-Réducteurs sont des germes anaérobies qui ont le pouvoir de réduire le sulfite en sulfure, et capables de former des spores dans les conditions défavorables.

Méthodologie :

Prendre 05 tubes vides et stériles, mettre 5ml d’eau à analysée dans chacun des 04 tubes et 1ml d’eau à analysée dans le 5 ème tube.

Puis, porter les tubes au bain marie à 80°C pendant 10mn, et après refroidir immédiatement ces tubes sous jet d’eau froide.

Ensuite, ajouter environ 20ml de gélose VF (viande foie) (après avoir ajouté à cette dernière une ampoule de 5ml de sulfite de sodium et une ampoule de 1ml de l’alun de fer) dans chaque tubes.

Incubation :

Incuber les 05 tubes à 46°C pendant 48 heures.

Lecture :

La 1 ere lecture se fait impérativement après 16 heures d’incubation.

Dans le cas où il n’y pas de colonies noires, réincuber les tubes et effectuer une 2 ème lecture après

24 heures voir 48 heures.

Dénombrement :

On compte les colonies noires directement dans les tubes positifs.

On note : - Le nombre de Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans 20 ml. (Somme des résultats des

04 tubes)

- Le nombre de Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans 1 ml.

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Chapitre III Diagnostic et évaluation Eau à analysée Chauffage à 80°C, 10 minutes Refroidissement brutal sous
Eau à analysée
Eau à
analysée

Chauffage à 80°C, 10 minutes Refroidissement brutal sous l’eau de robinet

5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
Refroidissement brutal sous l’eau de robinet 5 ml 5 ml 5 ml 5ml 1ml Ajouter environ

5 ml

5ml

1ml
1ml

Ajouter environ 20 ml de gélose VF (+02 ampoules contenant :

5 ml de sulfite de sodium, 1 ml de l’alun de fer) Puis incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures.

incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 20
incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 20
incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 20
incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 20
incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 20
incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 20

La lecture se fera sur 20 ml la somme des 04 tubes

pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 20 ml la somme

La lecture se fera sur 1 ml

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Chapitre III Diagnostic et évaluation b) La poudre de lait écrémé et entier : 1) Technique

b) La poudre de lait écrémé et entier :

1)

Technique de prélèvement et d’échantillonnage :

Le lieu de prélèvement est le laboratoire des analyses microbiologiques, 03 échantillons sont prélevés à partir de 03 sacs de 25kg de poudre de lait à 0%, et à 26% de matière grasse, cette poudre est conditionnée dans des sacs en polyéthylènes et doublés en papier hermétiquement fermé. La surface des sacs a été nettoyée et désinfectée par l’alcool et la couche supérieure a été écartée à l’aide d’une spatule stérile. On procède à un échantillonnage à l’aide d’une sonde métallique stérile à proximité de la flamme.

2)

Dilutions :

Introduire aseptiquement 25 g de poudre dans un flacon stérile contenant 225ml de TSE puis homogénéisé l’ensemble a fin d’obtenir la solution mère. A partir de cette dernière, on prélève 1ml à l’aide d’une pipette stérile et on le porte dans un tube contenant 9ml d’eau physiologique, c’est la dilution 10 -1 . On prend 1ml de la dilution 10 -1 à l’aide d’une autre pipette et on le porte dans un autre tube contenant 9 ml d’eau physiologique ce qui nous donne la dilution 10 -2 . La même technique est répète pour obtenir la dilution 10 -3 .

3)

Recherche microbiologique :

Les germes recherchés dans la poudre de lait sont :

- La Flore Mésophile Aérobie Total (F.M.A.T)

- Les Coliformes Totaux.

- Les Clostridiums Sulfito-Réducteurs.

- Les levures et moisissures.

- Les Salmonella.

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Chapitre III

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Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.1) Recherche et dénombrement de (F.M.A.T) : (schéma n°04) la Flore

3.1)

Recherche

et

dénombrement

de

(F.M.A.T) : (schéma n°04)

la

Flore

Aérobie

Mésophile

Total

Méthodologie :

A partir des dilutions décimales allant de 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , porter aseptiquement 1ml de l’échantillon dans 03 boites de petries vides et stériles préparées à cet usage.

Compléter ensuite avec environ 20 ml de gélose P.C.A fondue, puis faire des mouvements circulaires pour permettre à l’inoculum de ce mélangé à la gélose utilisée. Laisser les boites solidifier sur paillasse quelques minutes.

Incubation :

Les boites seront incubées couvercles en bas à 30°C pendant 72 heures.

Lecture :

Les colonies de F.M.A.T se présentent sous forme de lenticulaire en masse.

Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs suivants :

Ne dénombrer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies.

Multiplier le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution.

Faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation A partir des dilutions décimales 10 -1 1 ml 10 -2

A partir des dilutions décimales

10 -1 1 ml
10 -1
1 ml
A partir des dilutions décimales 10 -1 1 ml 10 -2 1 ml 10 -3 1
10 -2 1 ml
10 -2
1 ml
A partir des dilutions décimales 10 -1 1 ml 10 -2 1 ml 10 -3 1
10 -3 1 ml
10 -3
1 ml
des dilutions décimales 10 -1 1 ml 10 -2 1 ml 10 -3 1 ml -

- Ajouter 20ml de gélose PCA

- Laisser solidifier sur paillasse

- Incuber à 30°C pendant 72 heures

solidifier sur paillasse - Incuber à 30°C pendant 72 heures - Puis dénombrement les colonies lenticulaires

- Puis dénombrement les colonies lenticulaires en masse

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Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.2) Recherche et dénombrement des coliformes totaux : schéma n°05

3.2) Recherche et dénombrement des coliformes totaux : schéma n°05

Méthodologie :

Préparer 03 dilutions 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , prendre 03 boites de petries vides et stériles et mettre dans chacune 1 ml de l’échantillon.

Couler ensuite, environ 20 ml de la gélose Désoxycholate fondue dans un chaque boites puis faire des mouvements circulaires pour obtenir un mélange homogène. Laisser les boites solidifier sur paillasse quelques minutes.

Incubation :

Les boites seront incubées couvercles en bas à 37°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les Coliformes Totaux se présentent sous forme de colonies rouge foncées).

- Le dénombrement des boites se fait par le comptage des colonies (rouges foncés). Le nombre trouvé sera multiplié par l’inverse de la dilution de chaque boite de petries, puis faire la moyenne arithmétique des 03 boites.

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Chapitre III Diagnostic et évaluation A partir des dilutions décimales 10 -1 1 ml C.Totaux 10

A partir des dilutions décimales

10 -1 1 ml C.Totaux
10 -1
1 ml
C.Totaux
10 -2 1 ml C.Totaux
10 -2
1 ml
C.Totaux
10 -3 1 ml C.Totaux
10 -3
1 ml
C.Totaux

- Ajouter 20 ml de la gélose Désoxycholate.

- Laisser solidifier quelques minutes.

- Incuber à 37°C pendant 24 heures.

- Laisser solidifier quelques minutes. - Incuber à 37°C pendant 24 heures. - Dénombrer les colonies
- Laisser solidifier quelques minutes. - Incuber à 37°C pendant 24 heures. - Dénombrer les colonies
- Laisser solidifier quelques minutes. - Incuber à 37°C pendant 24 heures. - Dénombrer les colonies

- Dénombrer les colonies rouge foncées.

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Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.3) Recherche et dénombrement des Clostridiums Sulfito-Réducteurs : schéma

3.3) Recherche et dénombrement des Clostridiums Sulfito-Réducteurs : schéma

n°06

Méthodologie :

Faire subir aux tubes des dilutions 10 -1 , 10 -2 , un chauffage de 80°C pendant 1O mn et un refroidissement immédiat sous jet d’eau. Puis a partir de ces tubes portes aseptiquement 1 ml d’échantillon dans 02 tubes à essai contenant environ 20 ml du milieu VF (+ 1ampoule de l’alun de fer et une ampoule de sulfite de sodium) et bien mélanger.

Incubation :

Ces tubes seront ainsi incubés à 46°C pendant 16, 24, ou au plus tard 48 heures.

Lecture :

La première lecture doit se faire impérativement à 16 heures d’incubation, car :

D’une part, les colonies de Clostridium sont envahissantes dans ce cas on ce trouverait en face d’un tube complètement noir rendant alors l’interprétation des résultats impossible.

D’autre part, il faut absolument repérer toute colonie noir ayant poussé en masse et d’un diamètre supérieur à 0,5 mm.

Dans les cas d’absence de colonies caractéristiques, ré incuber les tubes une deuxième fois et effectuer une lecture au bout de 24 heures voir 48 heures.

Le nombre de colonies trouvées doit être multiplié par l’inverse de la dilution.

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Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 10 -1 10 -2 - Chauffage à 80°C pendant 10mn. -
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10 -2
10 -2

- Chauffage à 80°C pendant 10mn.

- Refroidissement immédiat sous jet d’eau

pendant 10mn. - Refroidissement immédiat sous jet d’eau 1 ml 1 ml - Ajouter environ 20

1 ml

1 ml
1 ml

- Ajouter environ 20 ml de gélose VF (+02 ampoules : alun de fer et sulfite de sodium). - Laisser solidifier puis incuber à 40 pendant 16-24 ou au plus tard 48 heures

- Laisser solidifier puis incuber à 40 pendant 16-24 ou au plus tard 48 heures -
- Laisser solidifier puis incuber à 40 pendant 16-24 ou au plus tard 48 heures -

- Dénombrement des colonies en masse.

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Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.4) Recherche et dénombrement des Levures et Moisissures : schéma n°07

3.4) Recherche et dénombrement des Levures et Moisissures : schéma n°07

Les levures et moisissures sont des germes aérobies, leur dénombrement se fait sur milieu de Sabouraud.

Méthodologie :

On porte aseptiquement 1 ml à partir des dilutions allant de 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , dans 03 boites de petries vides et stériles.

Verser ensuite, environ 20 ml de gélose de Sabouraud fondue, faire des mouvements circulaires afin d’homogénéiser le mélange, puis laisser les boites solidifier sur paillasse.

Incubation :

Elle se fait à 20 25°C pendant 3 à 5 jours avec couvercles en haut.

Lecture :

Après incubation, on effectue le comptage des Levures à part (grandes colonies rondes) et des Moisissures (des colonies ramifiées) d’autre part.

Multiplier ensuite le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution, puis faire la somme des 03 boites et calculer la moyenne arithmétique pour avoir le nombre exact des Levures et Moisissures.

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Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 10 -1 10 -2 10 -3 1 ml 1 ml 1
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1 ml

1 ml

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10 -1 10 -2 10 -3 1 ml 1 ml 1 ml - Ajouter 20 ml
10 -1 10 -2 10 -3 1 ml 1 ml 1 ml - Ajouter 20 ml
10 -1 10 -2 10 -3 1 ml 1 ml 1 ml - Ajouter 20 ml

- Ajouter 20 ml de gélose Sabouraud.

- Laisser solidifier sur paillasse.

- Incuber à 20 25°C. pendant 3 à 5 jours (couvercle en haut).

à 20 – 25°C. pendant 3 à 5 jours (couvercle en haut). - Dénombrement les Levures

- Dénombrement les Levures à part et des Moisissures d’autre part

Schéma n° 07 : Recherche des Levures et Moisissures dans la poudre de lait. 46
Schéma n° 07 : Recherche des Levures et Moisissures dans la poudre de lait.
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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.5) Recherche et dénombrement des Salmonella : schéma n°08 La recherche

3.5) Recherche et dénombrement des Salmonella : schéma n°08

La recherche du genre Salmonella nécessite une prise d’essai a part :

Jour 1 : pré-enrichissement :

Prélever 25g de la poudre de lait et la porter dans un flacon de 225 ml de T.S.E, incuber à 37°C pendant 12 18 heures.

Jour 2 : Enrichissement :

L’enrichissement doit s’effectuer sur un milieu sélectif : S.F.B (bouillon au sélénite cystéine) (S/C) repartie à raison de 100ml par flacon auquel on ajoute 2 ml d’additif « sélénite acide de sodium ». Prendre 10 ml à partir du milieu de pré-enrichissement et les mettre dans le flacon de S.F.B puis incuber à 37°C pendant 24 heures.

Jour 3 : Isolement :

Le flacon de sélénite positif (couleur rose) fera l’objet d’un isolement en stries sur le milieu gélose Hectoen, préalablement couler en boites de petries a raison de 15ml à 18ml et sécher en en les plaçant couvercles en bas dans un étuve de séchage entre 45 et 55°C.

Incubation :

Incuber à 37°C pendant 24 heures.

Lecture :

Les colonies de Salmonella sont présentent le plus souvent en gris bleu à centre noir.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation Pré-enrichissement T.S.E 225ml 25 g du produit à analyser

Pré-enrichissement

T.S.E 225ml
T.S.E
225ml

25 g du produit à analyser

Enrichissement

Isolement

- Homogénéisation et incubation 37°C pendant 12 – 18 heures 10ml Additif : sélénite acide
- Homogénéisation et incubation 37°C pendant 12 – 18 heures
10ml
Additif : sélénite acide de sodium (2ml)
SFB
S/C
100ml

- Incubation 37°C pendant 24 heures

Gélose Hectoen
Gélose
Hectoen

- Incubation 37°C pendant 24 heures

24 heures Gélose Hectoen - Incubation 37°C pendant 24 heures - Dénombrement les colonies grises bleues

- Dénombrement les colonies grises bleues à centre noir

Schéma n° 08 : Recherche des Salmonella dans la poudre de lait. 48
Schéma n° 08 : Recherche des Salmonella dans la poudre de lait.
48

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 4.1.2. Lait après pasteurisation 1) Technique de prélèvement et

4.1.2. Lait après pasteurisation

1)

Technique de prélèvement et d’échantillonnage :

La prise d’échantillon est réalisée au niveau de robinet du tank de repos. Après stérilisation du robinet par flambage, on laisse couler le lait quelques secondes (30 secondes) puis à l’aide d’un tube à essai, on prélève le liquide jusqu’à remplissage du tube.

2)

Dilution :

On transfère à l’aide d’une pipette pasteur stérile, 1 ml de la suspension mère dans un tube qui contient 9 ml d’eau physiologique et on agite bien, pour obtenir la dilution 10 -1 . De ce dernier on va porter 1 ml par une autre pipette graduée dans un autre tube stérile contenant 9 ml d’eau physiologique ou on obtient la dilution 10 -2 . De la même façon, on obtient la dilution 10 -3 .

3)

Recherche microbiologique :

Les germes recherches sont :

- Recherche et dénombrement des Germes Totaux.

- Recherche et dénombrement des germes de contamination fécal (Coliformes Totaux et Fécaux)

3.1) Recherche et dénombrement des Germes Totaux : schéma n°09

La numération des germes totaux se fait sur le milieu solide (P.C.A).

Méthodologie :

On porte aseptiquement 1ml de l’échantillon à partir des dilutions décimales allant de 10 -1 , 10 -2 ,

10 -3 , dans 03 boites de petries vides et stériles.

Couler ensuite environ 20 ml de la gélose P.C.A fondue, puis faire des mouvements circulaires pour permettre de bien mélanger puis laisser les boites solidifier sur paillasse.

Incubation :

Les boites seront incubées couvercles en bas à 30°C pendant 72°C.

Les colonies des Germes Totaux se présentent sous forme lenticulaire en masse.

- Premier lecture à 24 heures.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation - Deuxième lecture à 48 heures. - Troisième lecture à 72

- Deuxième lecture à 48 heures.

- Troisième lecture à 72 heures.

Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant des facteurs suivants :

Ne dénombrement que les boites contenant entre 30 et 300 colonies.

Multiplier le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution.

Faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation Schéma n°09 : Recherche des Germes Totaux dans le lait pasteurisé.

Schéma n°09 : Recherche des Germes Totaux dans le lait pasteurisé.

A partir des dilutions décimales

10 -1
10 -1

1 ml

pasteurisé. A partir des dilutions décimales 10 -1 1 ml 10 -2 1 ml 10 -3
10 -2
10 -2

1 ml

A partir des dilutions décimales 10 -1 1 ml 10 -2 1 ml 10 -3 1
10 -3
10 -3

1 ml

dilutions décimales 10 -1 1 ml 10 -2 1 ml 10 -3 1 m l -

- Ajouter 20ml de la gélose P.C.A.

- Laisser solidifier sur paillasse.

- Incuber couvercles en bas à 30°C pendant 24 48 à plus tard 72 heures

couvercles en bas à 30°C pendant 24 – 48 à plus tard 72 heures - Dénombrer
couvercles en bas à 30°C pendant 24 – 48 à plus tard 72 heures - Dénombrer
couvercles en bas à 30°C pendant 24 – 48 à plus tard 72 heures - Dénombrer

- Dénombrer les colonies lenticulaires en masse.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.2) Recherche et dénombrement des germes de contamination fécal (Coliformes

3.2) Recherche et dénombrement des germes de contamination fécal (Coliformes Totaux et Fécaux) : schéma n°10

Les Coliformes sont dénombrés sur le milieu solide Désoxycholate.

Méthodologie :

Après la préparation des dilutions décimales 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , on porte aseptiquement 1

ml d’échantillon dans 03 boites de perties vides et stériles.

Cette opération doit être effectuée en double pour chaque dilution :

Verser ensuit 20 ml de la gélose Désoxycholate fondue, puis faire des mouvements circulaires, pour bien mélanger la gélose à l’inoculum.

Laisser les boites solidifier sur paillasse.

Incubation :

Les boites seront donc incubées couvercle en bas pendant 24 à 48 heures :

37°C pour la première série (recherche des Coliformes Totaux).

44°C pour la deuxième série (recherche des Coliformes Fécaux).

Lecture :

Les Coliformes (Totaux et Fécaux) apparaissant sous forme de colonies de couleur rouge foncé fluorescentes.

Le nombre trouvé est multiplié par l’inverse de la dilution puis on fait la somme des 03

boites de petries et ensuite calculer la moyenne arithmétique cela nous donne le nombre

final des germes.

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52

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation A partir des dilutions décimales 10 -1 -2 10 10 -3

A partir des dilutions décimales

10 -1
10 -1
-2 10
-2
10
10 -3
10 -3
1 ml C.Totaux
1 ml
C.Totaux
1 ml C.Totaux
1 ml
C.Totaux

1 ml

1 ml 1 ml C.Totaux
1 ml
1 ml
C.Totaux

1 ml

- Ajouter 20 ml de gélose de Désoxycholate - Première série de boites à incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures.

C.Fécaux
C.Fécaux
C.Fécaux
C.Fécaux
C.Fécaux
C.Fécaux

- Ajouter 20 ml de gélose de Désoxycholate - Deuxième série de boites à incuber à 44°C pendant 24 à 48 heures.

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 4.1.3. Le produit fini (lait UHT) : 1) Technique de prélèvement

4.1.3. Le produit fini (lait UHT) :

1)

Technique de prélèvement et d’échantillonnage :

Le lait UHT est prélevé dés sa sortie de la conditionneuse chaque 02 heures, 1 fardeau contenant 4 briques est retiré :

1 brique analysée le jour même.

1 brique incubée à 55°C pendant 7 jours.

1 brique incubée à 30°C pendant 15 jours.

1 brique incubée à température ambiante pendant 03 mois.

Sachant qu’on a suivi dans nos prélèvements, la réglementation du journal officiel de la

2)

république Algérienne du 23 Mai 2004. Dilution :

On n’a pas besoin de dilution pour l’ensemencement du produit fini, car on travail avec la

suspension mère qui est le produit conditionné.

3)

Recherche micro biologique :

Le contrôle microbiologique du lait UHT est déterminé par les critères suivants :

1-

Recherche et dénombrement des Germes Aérobies.

2-

Test d’alcool.

3-

Test de chaleur.

4-

Test de stabilité.

3.1) Recherche et dénombrement des Germes Aérobies : schéma n°11

Le taux de présence de cette flore indique la bonne ou la mauvaise qualité microbiologique et la

stabilité du lait.

La technique utilisée est celle de la numération en milieu solide PCA en boite de petrie avec

ensemencement en masse.

Méthodologie :

A l’aide d’une pipette graduée, en introduit en aseptiquement 1ml du lait UHT conditionné dans

une boite de petrie stérile, puis couler environ 20ml de la gélose PCA en surfusion, faire des

mouvements en rotations pour bien mélangé l’inoculum et laisser la boite se solidifiée sur la

paillasse.

Incubation :

Incubée la boite couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures.

Lecture :

Réalisé le dénombrement des colonies présentent dans la boite sous forme lenticulaire en masse.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 1 ml (Lait UHT) - Ajouter 20 ml de gélose PCA
1 ml (Lait UHT)
1 ml
(Lait UHT)
1 ml (Lait UHT) - Ajouter 20 ml de gélose PCA en surfusion. - Laisser solidifier

- Ajouter 20 ml de gélose PCA en surfusion.

- Laisser solidifier sur la paillasse.

- Incubation couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures.

- Incubation couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures. - Dénombrer les colonies sous formes

- Dénombrer les colonies sous formes lenticulaires en masse.

Schéma n°11 : Recherche des Germes Aérobies dans le produit fini. 55
Schéma n°11 : Recherche des Germes Aérobies dans le produit fini.
55

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 3.2) Le test d’alcool : Méthodologie : Mélanger 2 ml d’une

3.2) Le test d’alcool :

Méthodologie :

Mélanger 2 ml d’une solution aqueuse Ethanol à 2 ml de lait UHT dans un tube à essai stérile, agiter bien le mélange pendant quelques secondes.

Lecture :

- S’il y a une floculation, les résultats sont positifs.

- S’il n’y a pas de floculation, on considère les résultats comme négatifs.

3.3) Test d’ébullition :

Méthodologie :

Introduire dans un tube à essai 2 ml de lait UHT, et porter le tube dans un bain-marie à 100°C pendant une demi-heure.

Lecture :

- Résultat positif si le lait coagule.

- Résultat négatif si le lait ne coagule pas.

3.4) Test de stabilité :

L’épreuve de stabilité comporte les opérations suivantes :

- Etuver, pendant 15 jours une unité d’échantillonnage à une température de 30°C.

- Etuver pendant 7 jours une unité d’échantillonnage à une température de 55°C. Le lait UHT doit rester stable après incubation.

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56

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 4.2. Les analyses physico-chimiques : Le contrôle physico- chimique à pour

4.2. Les analyses physico-chimiques :

Le contrôle physico-chimique à pour but d’analyse les matières premières, lait reconstitué et pasteurisé et le produit fini (lait UHT) en passant par les différents paramètres.

Il présente l’avantage de signaler toutes erreurs de fabrication, et modification des paramètres de processus de fabrication.

4.2.1. Eau de reconstitution :

a) Détermination de l’alcalimétrie de l’eau :

Cette détermination et basée sur la neutralisation d’un certain volume d’eau par un acide minéral, dilué, en présence d’un indicateur coloré.

a.1) Titre alcalimétrique simple : (T.A) :

Principe :

Addition d’une solution d’acide sulfurique titré, la transformation des carbonates et bicarbonates en sulfates, permet de connaître la qualité d’hydrate alcalin et la moitié des carbonates.

Appareillage et réactifs :

- Burette de 100 ml.

- Bêcher de 150 ml.

- Phénolphtaléine à 1 %.

- Solution d’acide sulfurique (H 2 SO 4 N/ 10 ).

Mode opératoire :

Introduire 50 ml d’eau dans un bêcher, ajouter quelque gouttes de phénolphtaléine (03 gouttes), s’il ne se produit pas de coloration rose le titre (TA) égale à zéro(0). S’il y apparition du rose, cette coloration fait appel au titrage par la solution sulfurique jusqu’à décoloration complète de la solution à solution à laid d’une burette graduée.

- Noter le volume (V) lue sur la burette. Expression des résultats :

Le TA est exprimé en degré français.

TA= V × 5

Avec : V : volume lu sur la burette en ml.

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57

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation a.2) Titre alcalimétrique complet (TAC) : Principe : Le TAC correspond

a.2) Titre alcalimétrique complet (TAC) :

Principe :

Le TAC correspond à la teneur de l’eau en alcalin libre, carbonates et les bicarbonates, le titrage se fait par la solution sulfurique servant de méthyle orange comme indicateur.

Appareillage et réactifs :

- Burette graduée de 100 ml.

- Bêcher de 150 ml.

- Méthyle orange.

- Solution acide sulfurique (H 2 SO 4 N/ 10 ).

Mode opératoire :

Prendre 50 ml d’échantillon, additionner quelques gouttes de méthyle orange, après verser lentement à l’aide d’une burette graduée de l’acide sulfurique, en agitant constamment jusqu’à virage du jaune au jaune orange. Noter le volume (V) lu sur la burette.

Expression des résultats :

Le TAC est exprimé en degré français.

Avec :

TAC = (V 0.1) × 5

V= volume de solution utilisé pour le titrage en ml.

0.1= normalité de la solution sulfurique.

b) Détermination du titre hydrométrique (TH) :

Principe :

Le TH correspond à des concentrations métalliques, la dureté de l’eau est due principalement aux ions alcalino-terreux : Ca +2 et Mg +2 . Appareillages et réactifs :

- Burette graduée 100 ml.

- Bêcher de 150 ml.

- Pipette de 2 ml.

- Solution noire Eriochrome.

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58

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation - Solution tampon pH = 10. - Solution EDTA de 0,01

- Solution tampon pH = 10.

- Solution EDTA de 0,01 N (éthylène diamine tétra acétique).

Mode opératoire :

Introduire 100 ml d’eau dans un bêcher et ajouter 2 ml de solution tampon (pH=10), ensuite additionner quelques gouttes de noire Eriochrome, le virage aux bleu indique un pH = 0. Si la coloration vire vers le violet, le titrage se fait par la solution EDTA jusqu’au virage bleu.

Expression des résultats :

On lit directement le volume EDTA versé, qui est égal au titre hydrométrique (TH) exprimé en degré français.

Avec :

V : volume de l’EDTA en ml.

4.2.2. Poudre de lait :

TH = V (EDTA)

La poudre de lait est un produit très hygroscopique, les échantillons prélevés sont conservés en récipients étanches, de capacité égale à environ deux fois le volume de poudre de lait prélevé, mais avant d’effectuer l’analyse, il faut homogénéiser bien l’échantillon en agitant le flacon par mouvements de retournements répétés.

a) Détermination du taux d’humidité :

Un lait en poudre de bonne qualité doit présenter une humidité inférieure à 4%, l’intérêt de mesurer l’humidité de la poudre du lait est de connaître la conduite rationnelle des opérations de transports, stockage et de transformation industrielle.

Principe :

Elimination de l’eau contenue dans la poudre de lait par dessiccation et détermination du taux d’humidité exprimé en pourcentage.

Appareillage :

- Capsule d’aluminium.

- Dessiccateur.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation Mode opératoire : Introduire dans une capsule 1,2g de poudre et

Mode opératoire :

Introduire dans une capsule 1,2g de poudre et déposer la capsule dans le dessiccateur, ensuite mettre l’appareil en marche.

Expression des résultats :

Lire directement sur le dessiccateur le taux d’humidité en pourcentage.

b) Détermination de l’acidité titrable :

Principe :

Le lait présente une acidité qui peut être titrée par une solution d’hydroxyde de sodium en

présence de Phénolphtaléine servant d’indicateur.

Appareillage et réactifs :

- Bêcher 150 ml.

- Pipette de 10 ml.

- Acidimétrie dornic.

- Solution de soude (NaOH N/ 9 ).

- Indicateur Phénolphtaléine.

- Eau distillée.

Mode opératoire :

Peser 02g de poudre dans un bêcher et ajouter 18 ml d’eau distillée, laisser au repos pendant 5 minutes, en suite, en titre le mélange à l’aide de la soude (NaOH N/ 9 ) après avoir ajouté quelques gouttes de Phénolphtaléine jusqu’au virage rose pâle.

Expression des résultats :

L’acidité titrable est exprimée en degré dornic, elle est donner par la formule suivante :

Avec :

A = V/2

A : l’acidité de la poudre.

V : volume versé de NaOH en ml.

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60

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation c) Détermination de la teneur en matières grasse : Principe :

c) Détermination de la teneur en matières grasse :

Principe :

C’est la dissolution des éléments du lait sec, matières grasse exceptée par l’acide sulfurique sous l’influence de la force centrifuge et grâce à l’adjonction d’une petite quantité d’alcool iso amylique, la matière grasse se sépare.

Appareillages et réactifs :

- Butyromètre de Teichert avec son bouchon.

- Centrifugeuse GERBER.

- Balance analytique de précision.

- Acide sulfurique de densité 1,825.

- Alcool iso amylique.

- Eau distillée.

Mode opératoire :

Introduction dans un butyromètre 10 ml d’acide sulfurique et ajouter 8 ml d’eau distillée, en suite ajouter 2.5 g de poudre de lait après l’avoir peser sur une balance analytique, et à la fin, additionner 1 ml d’alcool iso amylique.

Boucher le butyromètre et agiter latéralement avec prudence puis centrifuger à 1020 tours par minutes pendant 6 minutes.

Expression des résultats :

Lire directement sur le butyromètre gradué, le pourcentage de la matière grasse est donné par la formule suivante :

d)

Mesure de pH :

Principe :

Il s’agit de décrire la mesure électrométrique du pH (acidité ionique), la dissolution de la poudre dans l’eau est obligatoire pour avoir une mesure correcte du pH.

Appareillages :

- pH-mètre avec électrode en verre.

- Balance analytique.

- Réfrigérateurs (T° : 2 à 5°C).

- Bêcher de 150 ml.

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61

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation Mode opératoire : Peser 03 g d’échantillon dans un bêcher et

Mode opératoire :

Peser 03 g d’échantillon dans un bêcher et ajouter 30 ml d’eau distillée, à l’aide d’une baguette en verre, en mélange jusqu’à dissolution complète, après placer le mélange dans le réfrigérateur pendant quelques minutes pour avoir une température de 10 à 15°C, puis introduire l’électrode.

Expression des résultats :

Après stabilisation des chiffres, lire directement la valeur du pH sur le pH-mètre.

4.2.3. Lait reconstitué, lait après pasteurisation et produit fini (lait UHT) :

Les analyses physico-chimiques effectuées sur le lait reconstitué, après pasteurisation et produit fini, nous permettent de contrôler et de suivre la qualité du lait UHT.

4.2.3.1. Analyse de lait reconstitué, après pasteurisation et le lait UHT avant incubation :

a) Détermination de la densité :

Principe :

C’est le rapport entre la masse d’un volume du lait et celle d’un même volume d’eau, elle est

définie comme étant la masse volumique du lait, elle est exprimer en Kg/m 3 , on détermine la densité du lait à l’aide d’un thermo lactodensimètre.

Appareillage :

- Thermo lactodensimètre.

- Eprouvette à bec de 250 ml.

Mode opératoire :

Remplir l’éprouvette de manière à ce que le lait déborde légèrement pour éliminer la trace de mousse, le lactodensimètre est plongé verticalement dans l’éprouvette, après sa stabilisation, on prend la température du lait dans l’éprouvette et noter la densité.

Expression des résultats :

Le lactodensimètre donne une valeur exacte à température 20°C, si la température est supérieure ou inférieure, il est nécessaire d’effectuer une correction par une dés deux équations suivantes :

Si la T° lue < 20°C

Si la T° lue > 20°C

Avec :

la T° lue < 20°C  Si la T° lue > 20°C Avec : D =
la T° lue < 20°C  Si la T° lue > 20°C Avec : D =

D

= D lue 0,2 (20 T° lue)

D

= D lue + 0,2 (T° lue 20)

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62

Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation D lue = densité lue sur thermo lactodensimètre T° lue =

D lue = densité lue sur thermo lactodensimètre

T° lue = température lue sur thermo lactodensimètre.

0,2 est le coefficient de correction.

b) Détermination de l’acidité titrable :

Principe :

L’acidification du lait est due à la transformation du lactose en acide lactique par les bactéries lactiques, ceci, par une réaction de neutralisation de l’acide lactique qui est titré par la soude (NaOH N/9), en présence de phénolphtaléine comme indicateur coloré.

Appareillage et réactifs :

- Burette graduée.

- Pipette de 10 ml.

- Bêcher de 150 ml.

- Solution de soude (NaOH N/9).

- Solution alcoolique de phénolphtaléine.

Mode opératoire :

Introduire dans un bêcher 10 ml de lait, et ajouter quelques gouttes de phénolphtaléine (03 gouttes) après, avec la solution de soude en titre jusqu’à début de virage au rose pâle.

Expression des résultats :

L’acidité titrable est exprimée en degré dornic.

c) Détermination de la teneur en matière grasse :

Principe :

C’est la dissolution des éléments du lait, la matière grasse excepté par l’acide sulfurique sous l’influence de la force centrifuge et grâce à l’adjonction d’une petite quantité d’iso amylique (1

ml), la matière grasse se sépare en une couche claire et transparente. Appareillage et réactifs :

- Butyromètre du lait « GERBER ».

- Pipette de 11 ml graduée.

- Bouchon pour butyromètre + poussoir.

- Centrifugeuse « GERBER ».

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation - Alcool iso amylique avec son doseur de 1 ml. -

- Alcool iso amylique avec son doseur de 1 ml.

- Acide sulfurique avec son doseur de 10 ml. (densité = 1,825)

Mode opératoire :

Introduire dans un butyromètre 10 ml de l’acide sulfurique (D = 1,825) et ajouter 11 ml de lait, et en rajouter 1 ml d’alcool iso amylique, boucher le butyromètre et on mélange bien, puis placer le butyromètre dans la centrifugeuse à 1020 tours par minutes pendant 6 minutes.

Expression des résultats :

On lit directement sur le butyromètre les graduations contenant la matière grasse visiblement séparé, est exprimé en g/l.

d) Détermination de l’extrait sec total (EST) :

Principe :

L’extrait sec est la masse restant après une dessiccation complète basée sur l’évaporation de l’eau d’un certain volume donné de lait.

Appareillages :

- Capsule en verre.

- Papier buvard.

- Pipette de 10 ml.

- Balance analytique de précision. Mode opératoire :

Poser du papier buvard dans une capsule bien sèche et la peser à l’aide de la balance analytique, puis introduire 10 ml du lait dans la capsule, mettre cette dernière dans le micro-onde à 250 W pendant 12 minutes, après peser à nouveau la capsule ressortit de micro-onde. Expression des résultats :

L’EST est calculé par la formule suivante :

Avec :

ESD = P 0 P 1 × 1000

E

P 0 = poids de la capsule vide en gr. P 1 = poids de la capsule après la dessiccation en gr.

E = prise d’échantillon.

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation e) Détermination de l’extrait sec dégraisse (ESD) : L’extrait sec

e) Détermination de l’extrait sec dégraisse (ESD) :

L’extrait sec dégraisse est calculé par la formule suivante :

Avec :

ESD = EST MG

ESD = Extrait sec dégraisse en g/l. EST = Extrait sec total en g/l. MG = Matière Grasse en gr.

f) Mesure de pH :

Versé une quantité de lait dans un bêcher, et à l’aide du pH-mètre déterminer la valeur du pH.

Expression des résultats :

Lire directement la valeur du pH inscrite automatiquement par le pH-mètre.

4.2.3.2. Analyse du lait UHT après incubation :

Dés que la durée d’incubation c’est achevée, on fait sortir les boites du lait UHT et on établie deux analyses physico-chimique :

A) Détermination de l’acidité titrable.

B) Mesure de pH.

A) Détermination de l’acidité titrable :

Voir 2.3.1 - b)

B) Mesure de pH :

Voir 2.3.1 f

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Chapitre III

Diagnostic et évaluation

Chapitre III Diagnostic et évaluation 4.3. Les analyses organoleptiques : Ce sont des critères de contrôle

4.3. Les analyses organoleptiques :

Ce sont des critères de contrôle de qualité essentiels pour certains produits alimentaires et secondaire pour d’autre, il consiste à contrôler l’apparence, la saveur et la flaveur de la denrée.

Dans notre étude on a observé que ses analyses ne prennent pas une grande importance pour le personnel du laboratoire, cette ignorance est justifie par l’absence de changement des caractères organoleptique du lait stérilisé UHT sauf pour le goût de cuisant observé, qui est obtenu grâce au traitement thermique subit.

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