Sunteți pe pagina 1din 8

BIOSENZORI Un biosenzor este un instrument analitic care transforma un raspuns biologic intr-un semnal electric.

Termenul de biosenzor este adesea utilizat pentru a ingloba dispozitivele utilizate in scopul determinarii concentratiilor unor substante sau a altor parametri de interes biologic, chiar daca acestea nu utilizeaza un sistem biologic in mod direct. Aceasta definiie este in mod larg utilizata de unele reviste stiintifice (de exemplu Biosensors, Elsevier Applied Science). Aceste dispozitive nu se vor discuta in acest curs nefiind de fapt ceea ce nseamn un biosenzor. Accentul in acest curs se pune pe utilizarea enzimelor ca material biologic responsabil, dar trebuie sa mentionam ca si alte sisteme biologice pot fi utilizate pentru realizarea de biosenzori, de exemplu, celule intregi, celule microbiene etc. Schema generala a unui biosensor este reprezentata in figura 1 :

Fig. 1 Diagrama schematica a principalelor componente ale unui biosenzor. Biocatalizatorul (a) converge substratul la produs. Aceasta reacie este constatata de traductor (b) care o converge intr-un semnal electric. Iesirea din traductor este amplificata (c), prelucrata (d) si prezentata (e). Producerea de Biosenzori reprezinta, in present, un domeniu cu o extindere rapida, a carei viteza de crestere anuala a fost estimate la 60%. Impulsul major provine din industria producatoare de dispozitive pentru sanatate (de exemplu 6% din populatia Europei de vest este diabetica si trebuie sa beneficieze de disponibilitatea unor biosenzori rapizi, exacti si simpli pentru determinarea glucozei) dar si alte domenii solicita astfel de instrumente, asa cum sunt aprecierea calitatii alimentelor sau monitorizarea mediului inconjurator. Cercetarile si dezvoltarile din acest domeniu sunt vaste si multidisciplinare cuprinzand biochimia, stiinta bioreactoarelor, fizica, chimia, electrochimia, electronica si ingineria de programare (software).

Cele mai multe dintre incercarile curente se refera la biosenzori potentiometrici, amperometrici si benzi de hartie cu enzime imobilizate. Totusi, in prezent si in viitorul apropiat , se preconizeza studierea intensa a tuturor tipurilor de traductori principali, astfel incat sa se largeasca utilizarea de biosenzori cat mai rapid in urmatorii ani. Un biosenzor adecvat trebuie sa posede cel putin urmatoarele caracteristici: Biocatalizatorul trebuie sa fie inalt specific pentru scopul analizei; sa fie stabil in conditii de depozitare normale si, cu exceptia benzilor enzimatice de hartie, sa prezinte o buna stabilitate pentru un numar larg de determinari (de exemplu mai mult de 100); Reactia nu trebuie sa fie afectata de parametrii fizici cum sunt: agitarea, pH sau temperatura. Aceasta ar permite analiza probelor cu un minim de pre-tratament. Daca reactia implica cofactori sau coenzime, acestea ar trebui, in mod preferabil, sa fie co-imobilizati cu enzima; Raspunsul trebuie sa fie exact, prcis, reproductibil si liniar pe domeniul analitic utilizat, fara dilutie sau concentrare. Trebuie de asemenea sa fie liber de zgomot electric; Daca biosenzorul trebuie sa fie utilizat pentru monitorizarea sistemelor invazive in situatii clinice, trebuie sa fie mic si biocompatibil, sa nu aibe efecte antigenice sau toxice. Daca se vor utiliza in bioreactoare trebuie sa fie sterilizabili. Sterilizarea se realizeaza preferabil prin autoclavare dar nici un biosenzor cu enzime nu poate rezista unui asemenea drastic tratament termic-umed. In ambele cazuri, biosenzorul nu trebuie sa fie predispus spre viciere; Biosenzorul complet trebuie sa fie ieftin, mic, portabil si capabil de a fi utilizat chiar de operatori mai putin dotati; Trebuie sa existe o piata pentru biosensori. Este clar ca exista o mica sansa sa se dezvolte un biosenzor daca alti factori (de exemplu subventii guvernamentale, angajerea continua a unor analisti dotati, sau slaba perceptie a consumatorilor) incurajeaza utilizarea metodelor traditionale si descurajeaza descentralizarea laboratoarelor de testare.

Raspunsul biologic al biosenzorului este determinat de membrane biocatalitice care realizeaza conversia reactantului in produs. Enzimele imobilizate prezinta un numar de caracteristici avantajoase care le fac, in mod particular, aplicabile in astfel de sisteme. Ele pot fi re-utilizate, ceea ce inseamna ca aceiai activitate catalitica este disponibila pentru o serie de analize. Acesta este un factor important in asigurarea unor rezultate reproductibile .

Multe enzime sunt intrinsec stabilizate prin procesul de imobilizare, dar chiar acolo unde aceasta nu se intampla exista in mod obisnuit o stabilizare aparenta considerabila. In interiorul sistemului de senzor imobilizat este normal sa se utilizeze un exces de enzima. Aceasta da un surplus catalitic care este suficient pentru a asigura o crestere in stabilitatea aparenta a enzimei imobilizate. Chiar daca apare o oarecare inactivare a enzimei imobilizate dupa o anumita perioada de timp, aceasta inactivare este in mod obisnuit stationara si previzibila. Orice scadere a activitatii este usor incorporata in schema analitica prin interpolarea regulata a standardelor, intre analizele probelor necunoscute. Din aceste motive, multe dintre asemenea enzime imobilizate sunt reutilizabile pana la 10.000 ori pe o perioada de cateva luni. In mod clar aceasta conduce la o considerabila economie in raport cu costul enzimelor fata de utilizarea analitica a enzimelor libere solubile. Cand reactia, ce are loc la membrana cu enzima imobilizata a biosenzorului, este limitata de viteza difuziei externe, procesul reactiei va dobandi un numar de calitati analitice de valoare. In particular, ea va asculta de relatia aratata in ecuatia: vA = kL[So] (1)

vA = vmax pe unitatea de suprafata, kL = constanta coeficientului de transfer de masa (difuzia substratului), So = concentratia substratului in masa solutiei. Aceasta relatie arata ca biocatalizatorul da o schimbare proportionala a vitezei de reactie in raport cu concentratia reactantului (substrat) pe un domeniu substantial liniar, si care este de cateva ori propriul K m. De mare ajutor este faptul ca adesea concentratiile analitului sunt aproximativ egale cu valorile Km respective ale enzimelor. De asemenea din reactia (1) reiese independenta vitezei de reactie fata de pH, tarie ionica, temperature si inhibitori. Aceasta evita in mod simplu problemele spinoase intalnite adesea datorita variabilitatii probelor analitice reale (de exemplu mediul de fermentatie, sangele si urina) si conditiile externe. Controlul raspunsului biosenzorului prin difuzia externa a analitului poate fi imbunatatit prin utilizarea unor membrane permeabile intre enzima si masa solutiei. Consistenta acestora poate fi diferita determinand efecte asociate asupra constantei de proportionalitate dintre concentratia substratului si viteza de reactie (de exemplu crescand grosimea membranei creste stratul neagitat () care, la randul sau descreste constanta de proportionalitate kL din ecuatia (1)). Chiar daca dependenta totala a vitezei, de difuzia externa nu este realizata (sau realizabila), orice crestere in dependenta vitezei de reactie de difuzia interna sau externa va cauza o reducere in dependenta de pH, tarie ionica, temperature si concentratiile inhibitorilor. Piesa cheie a biosenzorului este traductorul care face posibila o inregistrare a unei schimbari fizice care insoteste reactia. Acesta poate fi: 1. caldura rezultata sau absorbita prin reactie (biosenzor calorimetric);

2. schimbarile in distributia sarcinilor electrice fapt ce determina producerea unui potential electric (biosenzori potentiometrici); 3. miscarea electronilor produsi intr-o reactie redox (biosenzori amperometrici); 4. producerea de lumina in timpul reactiei sau o diferenta de absorbanta a luminii intre reactanti si produsi (biosenzori optici); sau 5. efecte datorate masei de reactanti sau produsi (biosenzori piezo-electrici). Din punct de vedere al semnalului inregistrat de traductori, exista asa numitele generatii de biosenzori:

prima generatie la care produsul normal al reactiei difuzeaza spre traductor si determina un raspuns electric; a doua generatie sunt biosenzorii care implica mediatori specifici intre reactie si traductor in scopul de a genera raspunsul ce se valorifica; a treia generatie de biosenzori unde reactia insasi determina raspunsul si nu este implicat in mod direct nici un produs sau mediator.

Semnalul electric de la traductor este adesea slab si suprapus pe fondul relativ inalt si zgomotos al traductorului (de exemplu fie datorita unui component cu semnal de frecventa inalta, aparent de natura intamplatoare, fie datorita interferentei electrice sau generate in interiorul componentelor electronice ale traductorului). Prelucrarea semnalului implica eliminarea semnalului de fond, de referinta, derivat dintr-un traductor similar dar fara nici o membrana biocatalitica, din semnalul probei. Semnalul rezultat din diferenta dintre proba si referinta, este filtrat in afara in mod electronic (netezire) eliminandu-se astfel semnalele zgomotoase nedorite. Semnalul rezultat este apoi amplificat. Natura relativ lenta a raspunsului biosenzorului, usureaza considerabil problema filtrarii zgomotului electric. Semnalul analog produs in aceasta etapa poate fi produs direct, dar de obicei este convertit intr-un semnal digital si trecut spre un microprocesor unde datele sunt procesate, convertite in unitati de concentratie si prezentate pe un sistem de etalare sau intr-un depozit de date. Biosenzori Calorimetrici Multe reactii catalizate de enzime sunt exoterme, generand caldura (tabelul 1). Aceasta poate fi utilizata ca baza pentru masurarea vitezei de reactie si astfel concentratia analitului. Aceasta reprezinta tipul de biosenzor cel mai aplicabil la modul general. Schimbarile de temperatura se determina, in mod obisnuit, prin intermediul termistorilor la intrarea si la iesirea dintr-o coloana mica, ce contine un pat cromatografic realizat cu enzima imobilizata si care se afla intr-un mediu cu temperatura constanta (fig2). In asemenea conditii, precis controlate, pana la 80% din caldura generata in reactie poate fi inregistrata ca o schimbare de temperatura in procesul de curgere a probei prin coloana. Schimbarea de temperatura poate fi usor calculata din modificarea entalpiei si cantitatea care a reactionat. Daca 1 mM reactant este complet convertit in produs, intr-o reactie care genereaza 100 kJ/mol atunci fiecare ml de solutie genereaza 0,1 J de caldura. La o eficienta de 80%, aceasta va determina o schimbare in temperatura solutiei cu aproximativ 0,020C. Aceasta este in general schimbarea de temperatura intalnita la

procesele enzimatice si pentru ca biosenzorul sa fie utilizabil, acesta trebuie sa aibe o rezolutie a temperaturii de 0,00010C. Tabel1 Productia de caldura (entalpii molare) a reactiilor catalizate de enzime Reactant Cholesterol Esteri Glucoza Hydrogen peroxid Penicillina G Peptide Amidon Sucrosa Urea Acid uric Enzima Cholesterol oxidase Chymotrypsin Glucose oxidase Catalase Penicillinase Trypsin Amylase Invertase Urease Uricase Caldura produsa - H (kJ mol-1) 53 4 - 16 80 100 67 10 - 30 8 20 61 49

Fig2 Diagrama schematica a unui biosenzor calorimetric. Curentul de proba (a) trece prin cutia exterioara izolata (b) spre schimbatorul de caldura (c) din interiorul unui bloc de aluminiu (d). De acolo, curentul de proba depaseste termistorul de referinta (e) si curge in patul cromatografic al bioreactorului (f, 1ml volum), ce contine biocatalizatorul, unde are loc reactia. Schimbarea de temperature este determinate prin intermediul termistorului (g) si solutia trece la vasul cu

reziduuri (h). Sisteme electronice externe (l) determina diferenta in rezistenta, si astfel diferenta de temperatura, dintre termistori.

Termistorii, utilizati sa detecteze schimbul de temperatura, functioneaza prin modificarea rezistentelor lor electrice cu temperatura, si asculta de relatia:

(2) sau:

(3) unde R1 si R2 sunt rezistentele termistorilor la temperaturile absolute T1 si T2 respectiv, iar B este o caracteristica constanta de temperatura pentru termistor. Cand schimbul de temperatura este foarte mic, ca in cazul prezent, valoarea B(1/T1)-(1/T2) este mult mai mica decat unu si relatia (3) poate fi substantial simplificata folosind aproximatia, cand x<<1 atunci ex 1 + x [am notat aici x = B(1/T1)-(1/T2)]. Relatia (3) devine:

(4) Deoarece T1 T2 acestea pot fi inlocuite la numitor prin T1

(5) Descresterea relativa in rezistenta electrica (R/R) a termistorului este proportionala cu cresterea temperaturii (T). O constanta de proportionalitate tipica (B/T12) este de - 4%0C-1. Modificarea rezistentei este convertita intr-o schimbare proportionala de voltaj, folosindu-se o punte Wheatstone balansata, ce incorporeaza un rezistor de precizie, inainte de amplificare. In cazul acestor biosenzori presupunerea ca exista o corelatie liniara intre raspuns si activitatea enzimatica a fost confirmata in practica.

O problema majora cu acest tip de biosenzori, este dificultatea de a se gasi o potrivire cat mai stransa intre constantele de temperatura a termistorilor de masurare si a celor de referinta. O schimbare termica egala cu numai 1 0C in temperatura de fundal, a mediului inconjurator a ambilor termistori cauzeaza in mod obisnuit o modificare aparenta in rezistentele relative ale termistorilor, echivalenta cu 0,010C. Aceasta valoare este de multe ori egala cu intreaga scala de schimb datorata reactiei. Este in mod clar, de mare importanta ca o asemenea schimbare a temperaturii mediului inconjurator sa fie evitata. Aceasta a condus la includerea unui bloc de aluminiu bine izolat in proiectul biosenzorului. Senzitivitatea (10-4M) si domeniul (10-4 10-2 M) a biosenzorilor cu termistori sunt ambele destul de scazute pentru majoritatea aplicatiilor, desi senzitivitati mai mari sunt posibile prin folosirea unor reactii mai exoterme (de exemplu catalaza). Slaba senzitivitate a sistemului poate fi crescuta substantial prin cresterea caldurii de reactie. In cel mai simplu caz aceasta se poate realiza prin cumularea mai multor reactii, intr-o cale complexa de reactii, toate contribuind la producerea de caldura. Astfel senzitivitatea analizei glucozei folosind glucoz-oxidaza poate fi mai mult decat dublata prin coimobilizarea cu catalaza in coloana reactorului in scopul de a descompune peroxidul de hidrogen produs. Un model de astfel de amplificare este prezentat in ciclul schemei de detectie a ADP:

ADP este analitul ce se determina si se adauga in sistem la un exces de glucoza, fosfoenol piruvat, NADH si oxigen pentru a se asigura maximum de reactie. Patru enzime (hexokinaza, piruvat kinaza, lactat dehidrogenaza si lactat oxidaza) sunt co-imobilizate in patul cromatografic al reactorului. In ciuda unei entalpii pozitive a reactiei piruvat kinazei, procesul global conduce la o crestere de 1000 de ori in senzitivitate, in primul rand datorita ciclului dintre piruvat si lactat. Limitarea reactiei datorata scazutei solubilitati a oxigenului, poate fi depsita prin inlocuirea lui cu benzochinona, care este redusa la hidrochinona de catre flavo-enzime.

Asemenea sisteme de reactii, insa, au serioase dezavantaje prin faptul ca ele cresc probabilitatea existentei unor interferente in determinarea analitului de interes. Reactiile implicand generarea de ioni de hidrogen pot fi facute mult mai sensibile prin includerea unei baze care degaja multa caldura la protonare. De exmplu, caldura produsa prin reactia penicilinazei poate fi aprope dublata prin utilizarea Tris(tris(hidroximetil)aminometan) ca tampon. In concluzie, principalele avantaje ale biosenzorilor cu termistori sunt aplicabilitatea generala si posibilitatea utilizarii lor in solutii tulburi sau puternic colorate. Cel mai important dezavantaj este dificultatea de a se asigura ca temperatura curentului de proba sa ramana constanta ( 0,010C).