Sunteți pe pagina 1din 42

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

DUMITRIA OLIVIA RUGIN

CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE BOGATE N FLAVAN-3-OLI CU POTENIAL ANTIOXIDANT I APOPTOTIC REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCTOR TIINIFIC Prof. Dr. CARMEN SOCACIU

Cluj-Napoca 2009
I

CUPRINS
CUPRINS ....................................................................................................................................... II INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE....................................................................................III REZULTATE EXPERIMENTALE..............................................................................................VI I. CARACTERIZAREA EXTRACTELOR DE CEAI VERDE I EVALUAREA ACTIVITII LOR ANTIOXIDANTE.............................................................................................................. VII MATERIALE I METODE.................................................................................................... VII REZULTATE I DISCUII .................................................................................................. VIII Analiza cantitativ HPLC a extractelor de ceai verde........................................................ VIII Coninutul total de polifenoli .............................................................................................. XII Corelarea metodelor HPLC i Folin-Cioclteu ................................................................... XII Capacitatea de absorbie a radicalului oxigenului (ORAC) ............................................... XIII Echivalentul Trolox al capacitii antioxidante (TEAC)....................................................XIV Corelarea metodelor ORAC, TEAC i Folin-Cioclteu...................................................... XV CONCLUZII ..........................................................................................................................XVI II. EVALUAREA SISTEMULUI ANTIOXIDANT N CULTURA CELULAR RPE ... XVII MATERIALE I METODE................................................................................................ XVII Cultura celular i extractul proteic total ......................................................................... XVII Viabilitatea celulelor D407 .............................................................................................. XVII Determinarea cantitativ a glutationului .......................................................................... XVII Determinarea activitii glutation peroxidazei ................................................................. XVII Determinarea activitii superoxid dismutazei................................................................ XVIII Determinarea activitii catalazei .................................................................................... XVIII Determinarea nivelului de specii reactive intracelulare .................................................. XVIII REZULTATE I DISCUII ............................................................................................... XVIII Morfologia celulelor D407 dup tratamentul cu H2O2.................................................... XVIII Efectele induse de PolyphenonE asupra viabilitii celulelor D407 ..................................XIX Determinarea nivelului de glutation...................................................................................XXI Determinarea activitii glutation peroxidazei ................................................................. XXII Determinarea activitii catalazei .................................................................................... XXIII Determinarea activitii superoxid dismutazei................................................................ XXIV Determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului................................................. XXV CONCLUZII ....................................................................................................................... XXVI III. EVALUAREA EFECTULUI ANTITUMORAL AL CEAIULUI VERDE....................XXVII MATERIALE I METODE...............................................................................................XXVII Testul viabilitii ............................................................................................................XXVII Analiza ciclului celular...................................................................................................XXVII Determinarea concentraiei proteinelor totale utiliznd metoda Bradford.....................XXVII Metoda Western Blotting ...............................................................................................XXVII Determinarea activitii caspazei-3 .............................................................................. XXVIII Analiza fragmentrii ADN ........................................................................................... XXVIII Tehnica colorrii imunologice a clusterinei ................................................................. XXVIII REZULTATE I DISCUII ............................................................................................ XXVIII Morfologia celulelor PC-3 tratate cu PolyphenonE ..................................................... XXVIII Analiza proliferrii celulare ............................................................................................ XXIX Analiza ciclului celular..................................................................................................... XXX Colorarea nuclear cu DAPI ..........................................................................................XXXII Analiza fragmentrii ADN-ului ................................................................................... XXXIV Caspaza-3, marker de identificare al apoptozei ........................................................... XXXIV BIBLIOGRAFIA....................................................................................................................... XLII II

INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE

n timpul metabolismului celular normal, aproximativ 98% din oxigenul molecular este n totalitate redus la ap. Restul de 2% produce specii reactive de oxigen, afectnd n mod direct esuturile, prin oxidarea proteinelor celulare, a lipidelor i a acizilor nucleici. n condiii fiziologice normale, exist un echilibru ntre formarea radicalilor liberi i ndeprtarea lor de ctre sistemele de aprare antioxidant ale corpului. Acestea includ enzime ca superoxid dismutaza, glutation peroxidaza i catalaza, dar i antioxidani neenzimatici ca gluationul, acidul ascorbic, tocoferolii, etc. n condiii patologice, producia radicalilor liberi crete, mpreun cu o cretere a consumului i o descretere a produciei acestor molecule antioxidante de aprare, conducnd la afeciuni celulare sau chiar la moarte. Flavan-3-olii, un subgrup al flavanoidelor, care include catechinele, contribuie alturi de sistemul antioxidant enzimatic la aprarea antioxidant a celulelor. Flavan-3-olii pot lupta de asemenea mpotriva CANCERULUI, contribuind la prevenirea acestei boli. Scopul acestei teze a fost: Utiliznd tehnica Cromatografiei de Lichide de nalt Performan (HPLC) ne-am propus s separm, s identificm i s evalum coninutul de catechine din extracte de ceai verde. Pentru extractele caracterizate ne-am propus s monitorizm i s comparm activitatea antioxidant utiliznd diferite metode: ORAC, TEAC, DPPH. Metoda de determinare a capacitii de absorbie a radicalului oxigenului, ORAC este o metod nou de evaluare a activitii antioxidante a alimentelor. Ne-am propus s determinm potenialul antioxidant al extractelor de ceai verde bogate n catechine i capacitatea acestora de a proteja in vitro celulele epiteliale pigmentate din retina uman, n scopul utilizrii lor ca suplimente n prevenirea degenerescenei maculare senile. Am ales celulele RPE (linia D407) pentru a studia mecanismul molecular la rspunsul adaptativ la stresul oxdativ. Acesta este primul studiu ce evalueaz efectul catechinelor asupra sistemului antioxidant de aprare al celulelor RPE.
III

Asemeni altor cercettori, am ncercat s gsim alte strategii pentru a controla evoluia cancerului de prostat, o abordare a acestei probleme fiind prevenirea i/sau intervenia terapeutic a ceaiului verde i a compuslui su majoritar EGCG, ca supliment alimentar al dietei zilnice. Datele recente demonstreaz c polifenolii din ceaiul verde pot induce evenimente ale semnalizrii celulare, implicate n inhibarea creterii celulare, progresia ciclului celular, inducia apoptozei, inhibiia angiogenezei, a invaziei tumorii i a metastazei cancerului de prostat. Ca atare am elaborat diferite studii experimentale utiliznd extractul Polyphenon E ca potenial agent chemopreventiv n cancerul de prostat. Am fost interesai n mod special s urmrim cile moleculare i mecanismele de aciune ale acestui extract asupra metabolismului celular. Principalele obiective ale tezei au fost: Extracia flavan-3-olilor din cele 5 extracte de ceai verde. Ceaiurile au fost procurate de pe piaa romneasc (Vedda) i de pe piaa japonez (ceai verde japonez). Suplimentele alimentare au fost obinute de la companiile comerciale (Pharmanex; Teacalon; Japan; Polyphenon E); Caracterizarea extractelor de ceai verde prin Cromatografia de Lichide de nalt Performan; Evaluarea activitii antioxidante a extractelor de ceai verde, utiliznd metodele ORAC, TEAC i DPPH i determinarea coninutului total de polifenoli; Efectele extractului de ceai verde (Polyphenon E) asupra viabilitii celulelor epiteliale din retina uman (D407) i determinarea nivelului de specii reactive de oxigen intracelulare; Evaluarea activitii superoxid dismutazei, catalazei, glutation peroxidazei i cuantificarea glutationului, dup tratamentul cu Polyphenon E i catechine. Studiul influenei produsului Polyphenon E asupra morfologiei celulelor PC-3 n funcie de concentraia i durata tratamentului; Efectele induse de Polyphenon E asupra proliferrii, folosind metoda WST-1 i colorarea cu cristal violet; Evaluarea apoptozei prin flow citometrie;

IV

Evaluarea efectelor induse de Polyphenon E asupra expresiei proteinei PCNA utiliznd analiza Western blot. Structura tezei: teza este structurat pe dou pri, studiu de literatur i contribuii originale (cu rezultate i discuii, precum i o prezentare a metodelor de lucru). Prima parte Studiul bibliografic - conine patru capitole (1-4): Capitolul 1 i 2 caracterizeaz flavan-3-olii, n funcie de proprietile lor chimice i biochimice, i trece n revist metodele analitice de separare i dozare a acestora. Capitolul 3 prezint implicaiile stresului oxidativ n etiologia degenerescenei maculare senile i importana protejrii epiteliului pigmentat al retinei Capitolul 4 rezum date referitoare la implicarea polifenolilor din ceaiul verde n inducia apoptozei, inhibarea invaziei tumorii i metastazei cancerului de prostat. Partea a doua a tezei Cercetrile proprii - cuprinde 3 capitole (5-7): Capitolul 5 cuprinde un studiu comparativ privind coninutul n flavan-3-oli corelat cu activitatea antioxidant a celor cinci extracte de ceai verde. Capitolul 6 conine un experiment realizat pe celule epiteliale din retina uman, pentru evaluarea sistemului de aprare antioxidant, dup tratamentul cu Polyphenon E i catechine pure. Capitolul 7 prezint efectul antitumoral indus de Polyphenon E n celulele tumorale de prostat PC-3. Aceast tez evideniaz efectul chemopreventiv al ceaiului verde i al compusului su majoritar EGCG asupra cancerului uman de prostat i asupra degenerescenei maculare senile. Ca perspective, ar fi extrem de util s contribuim cu mai multe informaii referitoare la tratamentul catechinelor att n cancerul de prostat, ct i n degenerescena macular senil, la complexitatea i interconexiunile ntre cile de semnalizare celular, identificarea mai multor molecule int, realizarea unor studii epidemiologice i clinice mai ample, att pentru populaia european, asiatic, african i american.

Aceast tez este rezultatul unei colaborri ntre Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar, Cluj-Napoca, Romania, Departamentul de Chimie i Biochimie i Universitatea din Parma, Italia, Facultatea de Medicin, Departamentul de Medicin Experimental. REZULTATE EXPERIMENTALE n zilele noastre ceaiul este consumat n mai mult de 30 de ri din ntreaga lume, cu un consum mediu per cap de locuitor de 120 ml/ zi, ca i butur ceaiul ocupnd locul doi n lume, dup ap (Graham, H. N., 1992). n funcie de procesul tehnologic de obinere ceaiurile sunt clasificate astfel: ceai verde nefermentat, ceaiul oolong semifermentat i fermentat ceaiul negru sau rou. Flavan-3-olii sunt un subgrup al flavonoidelor, care include catechinele. Frunzele de ceai verde conin ase catechine majoritare: (+)-catechina (C), (-)-epicatechina (EC), (+)-galocatechina, (-)-epicatechin galat (ECG), (-)-epigalocatechina (EGC) i (-)epigalocatechin galat (EGCG) (Fig.1).
3 1 7 1 3 4 5 7 1 1

4 3 1 1 4 5

A
5

C
4 3

A
5

C
4 3 7

A
5

C
4 3

Epigalocatechin galatul (EGCG)

Epicatechingalatul (ECG)

Galocatechina

3 3 1 7 1

3 4 1 7 1

4 5 7

A
5

C
4 3

A
5

C
4 3

A
5

C
3 4

Epigalocatechina (EGC)

Epicatechina (EC)

Catechina (C)

Fig.1. Structurile reprezentative ale catechinelor din ceaiul verde; gruparea galat este ncercuit (original) Fig.1. Representative structures of green tea catechin; the gallate moiety is rounded off (original)

VI

I. CARACTERIZAREA EXTRACTELOR DE CEAI VERDE I EVALUAREA ACTIVITII LOR ANTIOXIDANTE

Coninutul total de catechine a fost evaluat utiliznd tehnica HPLC. Diferite metode antioxidante au fost utilizate pentru a monitoriza i compara activitatea antioxidant a extractelor de ceai verde: ORAC, TEAC, DPPH.

MATERIALE I METODE Extracia: 0.2 g pudr (Pharmanex, Teacalon, Polyphenon E, Japan Green Tea) sau frunze (Vedda) cu 10 ml ap Millipore fiart, au fost sonicate, centrifugate i filtrate. Cromatografia de nalt Performan (HPLC) este o metod uzual utilizat pentru separarea unor antioxidani ca i catechinele. Analiza HPLC s-a realizat cu ajutorul unui sistem Shimadzu, echipat cu detecie cu fotodiod. A fost utilizat o coloan SUPELCOSIL TM LC-18, 5m, 25 cm x 4.6 mm. S-a folosit un gradient de eluare: faza mobil A- metanol: acid acetic: ap bidistilat i faza mobil B, metanol: acid acetic: ap bidistilat. Coninutul total de polifenoli: Compuii albatrii formai ntre fenolai i reactivul Folin-Cioclteu sunt independeni de structura compuilor fenolici, dezvoltnd astfel complexe ntre centrul metalic i compuii fenolici. Absorbia a fost nregistrat la lungimea de und 765 nm. Coninutul total de fenoli a fost exprimat n echivaleni de acid galic. Capacitatea de absorbie a radicalului oxigenului (ORAC) determin capacitatea de inhibare a radicalului peroxil, inducnd oxidarea, evideniind eliberarea clasic radicalului, prin transferul atomului de H. Valorile ORAC au fost raportate ca echivaleni Trolox, fiind exprimate ca mol TE/DW. Intensitatea fluorescenei, ex. 485nm, em. 525 nm a fost monitorizat pentru 35 min. Metoda echivalentului Trolox al capacitii antioxidante (TEAC) se bazeaz pe capacitatea de neutralizare a radicalului anion ABTS+ de ctre antioxidani. ABTS este oxidat de ctre radicalii peroxil sau ali oxidani la radicalul su cationic ABTS. +, intens colorat (max = 734 nm). Capacitatea antioxidant este exprimat ca i potenialul

VII

compuilor testai de a decolora radicalul ABTS.

prin reacie direct cu acesta.

Capacitatea antioxidant a compuilor testai a fost exprimat ca i echivaleni Trolox. REZULTATE I DISCUII Analiza cantitativ HPLC a extractelor de ceai verde Fig. 2 evideniaz separarea amestecului de catechine standard pure, n 22 minute. Ordinea de eluare a fost: GC, C, EGC, EGCG, EC, GCG, ECG, CG.

Fig. 2. Separarea HPLC a opt catechine standard: GC, C, EGC, EGCG, EC, GCG, ECG i CG. Pentru prescurtri, vezi lista abrevieri 1 Fig. 2. HPLC separation of pure standards of catechins: GC, C, EGC, EGCG, EC, GCG, ECG and CG. for abbreviations see abbreviation list 1 n acest experiment au fost luate n studiu cinci probe de ceai verde, dou obinute de pe piaa romaneasc (Vedda), respectiv japonez (Japan green tea) i trei suplimente alimentare: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon E. Cromatogramele extractelor de ceai verde analizate sunt reprezentate in Fig. 3. Coninutul (mg/g) n catechine al probelor de ceai verde, conform determinrii HPLC i calibrrii cu standarde pure se regsete n Tabelul 1.

VIII

Coninutul total de catechine a fost foarte sczut n probele Vedda (12.03 mg/g) i Japan Green Tea (17.56 mg/g), posibil datorit oxidrii polifenolilor i /sau polimerizrii induse de fermentarea frunzelor de ceai. Acest fapt ar putea de altfel explica i activitatea antioxidant redus a acestora, evideniat cu ajutorul metodelor: ORAC, TEAC, DPPH. Coninutul total de catechine din suplimentele alimentare (Pharmanex, Teacalon and Polyphenon E) este semnificativ mai ridicat, comparativ cu probele de ceai verde, datorit concentrrii probei n urma tehnologiei de extracie prin pulverizare uscat. EGCG, ECG i EC sunt catechinele ce se regsesc n concentraie mai mare n extractele de ceai verde. Suplimentul alimentar Teacalon conine EC (134.67 mg/g), C (22.83 mg/g) i GCG (23.64 mg/g), compui identificai n cantiti mici n alte dou suplimente alimentare Pharmanex i Polyphenon E. Proba Pharmanex conine 56.58 mg/g EC i 42.07 mg/g ECG, n comparaie cu Polyphenon E 11.62 mg/g EC i 63.39 mg/g ECG. Coninutul de GC din probele Pharmanex i Teacalon a fost similar: 11.69 i respectiv 11.43 mg/g.

IX

A).

B). Fig.3. Cromatogramele extractelor de ceai verde analizate: A).Pharmanex; B).Teacalon Fig.3. Chromatograms of green tea extracts analyzed: A).Pharmanex; B).Teacalon

Tabel 1. Coninutul (mg/g) n catechine al probelor de ceai verde, conform determinrii HPLC i calibrrii cu standarde pure Table 1. Contents (mg/g) of catechins n green tea extracts, as determined by HPLC and calibrated with pure standards
mg/g extract Sample name mg/g extract Denumire prob Pharmanex Teacalon Polyphenon E Vedda Japan Green Tea GC GC 11.69 0.05 11.43 0.05 8.330. 06 1.300. 05 1.190. 05 C C EGC EGC EGCG EGCG EC EC GCG GCG ECG ECG CG CG Total Total

16.63 0.1 10.14 0.09 22.830.01 26.19 0.07 10.720.02 4.280.02 4.040.04 1.56 0.07 0.86 0.11 1.73 0.05

108.930.87 176.200.43 196.320.72 1.950.04 6.830.05

56.580.3 134.670.6 11.620.05 3.430.02 2.560.02

7.710.06 23.640.15 21.550.1 0.340.02

42.070.04 73.930.3 63.390.14 0.210.05 0.710.02

1.110.02 3.490.05 1.890.11 0.160.01

254.85 472.37 315.39 12.03 17.56

XI

Coninutul total de polifenoli Coninutul total de polifenoli variaz de la 74 la 695 mg/g acid galic. Cel mai redus coninut de polifenoli s-a ntlnit n proba Japan green tea (74.431.60 mg/g acid galic) n timp ce proba Teacalon (695.13.56 mg/g acid galic) nregistreaz cel mai ridicat coninut de polifenoli, urmat de proba Polyphenon E (677.58.63 mg/g acid galic). Coninutul altor probe de ceai verde a fost 284.28.63, 75.382.56 mg/g acid galic acid n proba Pharmanex, respectiv proba Vedda (Fig. 4). Coninutul de polifenoli totali variaz considerabil ntre probele de ceai verde i suplimentele alimentare.
800 Galic acid (mg/ g DW) 600 400 200 0
Te ac al on Po ly ph en on Ph ar m an V ed da Ja pa n ex

Sample name

Fig. 4. Coninutul total de polifenoli din cele cinci extracte de ceai verde: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan green tea. Valorile sunt exprimate ca media SEM. Fig. 4. Total polyphenol content of five different green tea extracts: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan green tea. Values are mean SEM.

Corelarea metodelor HPLC i Folin-Cioclteu Coeficientul de corelare Pearson pentru analiza cantitativ determinat prin metoda HPLC i coninutul total de polifenoli a fost obinut utiliznd programul de analiza statistic PRISM, versiunea 5 (GraphPad Software, San Diego, CA). Analiza HPLC s-a corelat semnificativ cu analiza spectrofotometric a coninutului total de polifenoli, Pearson r- 0.93, p < 0.01 (Fig. 5).
XII

Quantity of catechins (mg/g extract)

500 400 300 200 100 0

HPLC

Teacalon

Polyphenon Pharmanex

Vedda Japan

40

60

Galic acid (mg/ g DW)

Fig. 5. Corelarea analizei HPLC cu determinarea spectrofotometric a coninutului total de polifenoli (acid galic mg/g DW) Fig.5.Correlation between HPLC analysis and the spectrophotometric determination of of total tea polyphenol content (gallic acid mg/g DW)

Capacitatea de absorbie a radicalului oxigenului (ORAC) Polyphenon E i Teacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori ORAC (5143 mM TE/g prob, respectiv 4988 mM TE/g prob). Cel mai ridicat coninut n EGCG (dup cum s-a obinut n urma analizei HPLC) i cele mai mari valori ORAC au fost nregistrate pentru probele Teacalon i Polyphenon E. EGCG este considerat catechina cu cel mai mare potenial antioxidant. Pharmanex conine o cantitate redus de EGCG, ca atare prezint o activitate antioxidant mai redus comparativ cu probele Polyphenon E i Teacalon. Probele de ceai verde Vedda i Japan green tea au nregistrat cele mai mici valori ORAC (1033 mM TE/g, respectiv 898 mM TE/g). Valorile ORAC s-au corelat cu valorile obinute n urma determinrii coninutului total de polifenoli, dup cum se observ n Fig. 5.

80

20

XIII

mM Trolox Equivalent/g DW)

8000 6000 4000 2000 0


ar m an yp he no n ed da V on Te ac al Ja p an ex

Sample name

Fig.6. Valorile obinute prin metoda capacitii de absorbie a radicalului oxigenului (ORAC) pentru cinci extracte de ceai verde. Valorile sunt prezentate ca medie SEM. Fig. 6. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay values of five different green tea extracts. Values are mean SEM. Echivalentul Trolox al capacitii antioxidante (TEAC) Polyphenon E i Teacalon sunt extractele de ceai verde cu cele mai mari valori TEAC (1796.6 mM TE/g prob, respectiv 2013.6 mM TE/g prob). Pharmanex prezint o activitate antioxidant mai redus comparativ cu Polyphenon E i Teacalon, 116.5 1.97 mM TE/g. Vedda i Japan green tea au nregistrat cele mai mici valori TEAC (711.08 mM TE/g, respectiv 58.5 1.28 mM TE/g). Valorile TEAC s-au corelat cu coninutul total de polifenoli, dup cum se observ n Fig. 7.

Po l

Ph

XIV

mM Trolox Equivalent/g DW)

250 200 150 100 50 0

ed da
mM Trolox Equivalent/g DW)

Ph ar m an ex Te ac al on Po ly ph en on

Sample name

Fig. 7. Capacitatea antioxidant a echivalentului Trolox (TEAC) pentru cele cinci extracte de ceai verde: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan; Fig. 7. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay values of five different green tea extracts: Pharmanex, Teacalon, Polyphenon, Vedda, Japan; Corelarea metodelor ORAC, TEAC i Folin-Cioclteu Coeficientul de corelare Pearson pentru activitatea antioxidant determinat prin metodele TEAC, ORAC i coninutul total de polifenoli, cu ajutorul programului de analiz statistic PRISM. Activitile antioxidante determinate prin metodele TEAC i ORAC s-au corelat semnificativ cu coninutul total de polifenoli, Pearson r- 0.99, p = 0.0011, respectiv r- 0.98, p =0.0026 (Fig. 8).
mM Trolox Equivalent/g DW)
4000

250 200 150 100 50 0

Ja pa n
TEAC
Teacalon Polyphenon Pharmanex Vedda Japan

ORAC
3000 2000 Pharmanex 1000 0 Vedda Japan Polyphenon Teacalon

20

40

60

80

20

40

60

Galic acid (mg/ g DW)

Galic acid (mg/ g DW)

Fig. 8. Corelarea metodelor antioxidante TEAC, respective ORAC cu cantitatea de polifenoli totali din extractele de ceai verde. Valorile sunt exprimate ca media SEM; Fig. 8. Correlation of antioxidant activity determined using TEAC or ORAC to total tea polyphenol content. Values are means SEM;
XV

80

Capacitatea antioxidant determinat prin metoda TEAC i ORAC evideniaz diferene reduse ntre probele Teacalon i PolyphenonE (201 mM Trolox/g, reaspectiv 179 mM Trolox/g pentru TEAC) i (4988 mM Trolox/g, reaspectiv 5143 mM Trolox/g pentru ORAC). Rezultate similare i bine corelate cu metodele ORAC i TEAC au fost obinute i de ali autori (Proteggente, A. R. et al., 2002). n studiul realizat de Navindra et al. activitatea antioxidant utiliznd metodele TEAC i ORAC variaz de la 187 la 15340 i respectiv de la 166 la 13690 mol Trolox Equiv/g capsul. n concluzie, ambele metode de determinare a activitii antioxidante s-au corelat semnificativ cu coninutul total de polifenoli (r) 0.95, p < 0.0001) (Seeram, N. P. et al., 2006). CONCLUZII 5 ceaiuri achiziionate de pe piaa romaneasc (Vedda) i japonez (Japan Green Tea) i trei suplimente alimentare (Pharmanex, USA; Teacalon, Japan; Polyphenon E, USA) au fost analizate prin RP-HPLC, pentru cuantificarea catechinelor din ceaiul verde (GC, C, EC, EGC, EGCG, ECG, GCG, GC); EGCG, ECG i EC sunt catechinele majoritare din ceaiul verde i suplimentele alimentare, dup cum s-a demonstrat prin analiza cantitativ HPLC; Coninutul total de polifenoli din extracte variaz de la 74 la 695 mg/g acid galic. Cel mai sczut coninut a fost nregistrat pentru proba Japan green tea, n timp ce proba Teacalon a nregistrat cel mai ridicat coninut; Probele Teacalon, Polypheon E i Pharmanex prezint activitatea antioxidant (ORAC, TEAC, DPPH) cea mai ridicat i cel mai mare coninut total de polifenoli; Metodele antioxidante (TEAC, ORAC) s-au corelat cu analiza spectrofotometric a coninutului total de polifenoli; Analiza cinetic a DPPH evideniaz c panta cea mai abrupt fost nregistrat pentru proba Polyphenon E

XVI

II. EVALUAREA SISTEMULUI ANTIOXIDANT N CULTURA CELULAR RPE

Acesta este primul studiu realizat n vederea evalurii efectelor catechinelor asupra sistemului de aprare antioxidant al celulelor RPE. MATERIALE I METODE Cultura celular i extractul proteic total Celulele epiteliale din retina uman D407 au fost cultivate n mediu Dulbecco Eagle Medium suplimentat cu ser fetal 10%, la o temperatur de 37C, 5% CO2, i umditate relativ 90%. Dup atingerea confluenei, celulele au fost tripsinizate i nsmnate n vase de cultur. Extractul, decafeinizat Polyphenon E a fost solubilizat n ap, i adugat pn la concentraia final n mediu de 100 g/ml. Dup 24 de ore de la tratamentul cu Polyphenon E, celulele au fost expuse unui tratament pentru 1h cu 500 M H2O2 la 37 C n medium DMEM fr rou de fenol. Determinarea proteinei totale s-a realizat prin metoda cu acid bicinconinic dup lizarea celulelor cu Triton X100. Concentraia proteinei a fost calculat folosind o curb de calibrare cu opt concentraii de albumin. Absorbana a fost citit la 562 nm, dup 30 min. Viabilitatea celulelor D407 Viabilitatea celulelor D407 a fost evaluat prin metoda MTT. Determinarea cantitativ a glutationului S-a utilizat o metoda prezentat n kitul GSH Cayman pentru cuantificarea GSH, metod ce utilizeaz glutation reductaza. Determinarea activitii glutation peroxidazei Pentru determinarea activitii glutation peroxidazei s-a utilizat kitul Cayman. Glutationul oxidat (GSSH), produs de GPx dup reducerea hidroperoxidului este reciclat de glutation reductaza GR i NADH. Oxidarea NADPH la NADP+ este nsoit de o

XVII

scdere a aborbanei, la 340 nm. Activitatea GPx, nregistreaz o descretere a absorbanei la 340 nm, fiind proportional cu activitatea GPx din prob. Determinarea activitii superoxid dismutazei O unitate de enzim este definit ca i cantitatea enzimei necesar s exercite o dismutare a radicalului superoxid cu 50%. Activitatea SOD a fost determinat utiliznd o curb standard SOD. Metoda a fost realizat conform instruciunilor din kit (Cayman). Determinarea activitii catalazei Metoda folosit se bazeaz pe reacia catalazei cu metanol, n prezena unei concentraii optime de H2O2. Formaldehida este msurat colorimetric cu 4-amino-3hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (Purpald) ca i cromogen, care i schimb culoarea la purpuriu. Determinarea nivelului de specii reactive intracelulare Metoda determinrii nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) se bazeaz pe oxidarea 2,7-dichlorodihidrofluorescein (DCHF) de ctre speciile reactive de oxigen
generate intracelular cu formarea compusului fluorescent 2,7-diclorofluoresceina (DCF), a

crei fluorescen a fost nregistrat cu ajutorul unui cititor de plci.

REZULTATE I DISCUII Morfologia celulelor D407 dup tratamentul cu H2O2 Celulele D407 au fost tratate cu diferite concentraii de H2O2: 100 M, 500 M, 2600 M pentru 1h. Dup cum se observ n Fig. 12 celulele i schimb morfologia, la o form ovalar dup un tratament cu 500 M H2O2, ns rmn ataate de microplac. Detaarea de microplac a fost observat doar la concentraii mai mari de 2000 M H2O2.

XVIII

Control

100 M

500 M

2600 M

Fig. 9. Morfologia comparativ a celulelor netratate i tratate cu H2O2 pentru 1 h. Morfologia celulelor a fost imortalizat utiliznd microscopia cu inversie, magnificaie 10X Fig. 9. Comparative morphology of D407 cells non-treated and treated with H2O2 for 1 h. The morphology of D407 cells was observed under nverted microscopy with magnification X10 Efectele induse de PolyphenonE asupra viabilitii celulelor D407 Viabilitatea celular este exprimat ca procent din control, aceasta fiind considerat 100%. Prin aceast metod s-a demonstrat c incubarea cu Polyphenon E nu determin nici o scdere semnificativ a numrului de celule viabile, n intervalul de concentraii 0 g/ml - 200 g/ml. Polyphenon E este citotoxic la concentraii mai mari de 200 g/ml. Eroarea este reprezentat ca SEM (Fig. 10).

XIX

200 150 100 50 0


0 50 100 150 200 250

Viability(%)

PolyE concentration (g/ml)

Fig. 10. Rezultatele testului MTT de proliferare celular (viabilitate %) epiteliale pigmentate din retina uman (D407) tratate cu Polyphenon E Fig. 10. Results of MTT proliferation assay (viability %) of retina pigmented epithelial human (D407) cells Polyphenon E treated Viabilitatea celulelor D407 a fost testat i pentru tratamentul cu H2O2. Cultura celular ajuns la confluen a fost tratat cu diferite concentraii de H2O2, n intervalul 01800 M, pentru 1 h (Fig. 11). Concentraia de 500 M H2O2 induce stresul oxidativ celulelor epiteliale din retina uman reducnd viabilitatea cu 50%. Concentraii mai mari de 1400 M reduc viabilitatea celulelor cu 80%, devenind citotoxice.
100 80 Viability(%) 60 40 20 0 0 300 600 900 1200 1500 1800 Concentration of H2O2 ( M)

Fig. 11. MTT testul de proliferare (viabilitate %) a celulelor epiteliale pigmentate din retina uman tratate cu H2O2 Fig. 11. MTT proliferation assay (viability%) of retina pigmented epithelial human (D407) cells H2O2 treated
XX

Viabilitatea celulelor D407 a fost evaluat dup tratamentul cu 50 M EGCG. Stresul oxidativ a fost indus cu 500 M peroxid de hydrogen n celulele netratate i tratate cu EGCG. Metoda MTT a fost aplicat pentru 24h, respectiv 48h de tratament. Probele netratate reprezint procentul de 100%. Celulele D407 tratate cu EGCG nregistreaz o viabilitate de 95% dup 24h de tratament. Stresul oxidativ a fost indus cu 500 M peroxid de hidrogen pentru 1 h, determinnd o scdere a viabilitii cu 55% n celulele D407. Tratamentul cu peroxid de hidrogen i EGCG determin o descretere a viabilitii, comparativ cu tratamentul H2O2, dup 24h. Tratamentul cu EGCG dup 48h a produs efecte similare asupra viabilitii celulelor D407 (Fig. 12).
150 C C+H2O2 EGCG EGCG+H2O2

Viability(%)

100

50

24h

Time (hours)

48h

Fig. 12. MTT testul de proliferare (viabilitate %) a celulelor epiteliale pigmentate din retina uman tratate cu 50 M EGCG Fig. 12. MTT proliferation assay (viability%) of retina pigmented epithelial human (D407) cells 50 M EGCG treated Determinarea nivelului de glutation Pentru evaluarea efectului citoprotector indus de Polyphenon E s-a msurat nivelul de glutation intracelular. Concentraia de glutation din celulele D407 a fost calculat folosind o curb de calibrare pentru standardul GSSG. Tratamentul cu 500 M peroxid de hidrogen determin o scdere a nivelului de GSH. Preincubarea cu 100 g/ml Polyphenon E determin o scdere a nivelului intracelular al GSH, comparativ cu controlul netratat. 100 g/ml Polyphenon E cu peroxidul de hidrogen scad nivelul de GSH intracelular de 1.3 ori comparativ cu Polyphenon E. Barele reprezint SEM (Fig. 13).

XXI

10 GSHM / mg protein 8 6 4 2 0
C P

Sample name
C - control; Cox - control + H2O2; P - Polyphenon E; Pox - Polyphenon E+H2O2

Fig. 13. Nivele de concentraii ale GSH n celulele epiteliale pigmentate din retina uman, tratate cu Polyphenon E Fig. 13. Levels of GSH concentrations n human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated n concluzie, Polyphenon E cu H2O2 determin o scdere a coninutului de glutation de 1.3 ori, comparativ cu Polyphenon E, ns aceste rezultate nu sunt statistic semnificative, poate datorit existenei altor compusi bioactivi din extract. A fost gsit aceast explicaie din doua motive: rezultatele prezentate anterior nu sunt semnificative din punct de vedere statistic, iar dintr-un alt experiment rezult ca tratamentul cu EGCG i H2O2 aplicat celulelor D407 nu a modificat nivelul de glutation, comparativ cu tratamentul cu EGCG (Fig. 13). Determinarea activitii glutation peroxidazei Celulele D407 au fost tratate cu 100 g/ml Polyphenon E pentru 24 h i peroxid de hidrogen. Polyphenon E reduce activitatea glutation peroxidazei de 3.7 ori, comparativ cu celulele netratate. Activitatea glutation peroxidazei a fost redus de peroxidul de hidrogen de 1.2 ori, comparativ cu celulele netratate (Fig. 14). Polyphenon E i peroxidul de hidrogen nu exercit nici un effect asupra activitii GPx, comparativ cu tratamentul cu Polyphenon E. Polyphenon E nu a nregistrat nici un efect asupra activitii GPx n celulele D407. Tratamentul cu EGCG induce o scdere a activitii GPx, dar fr nici un efect asupra nivelului de GSH.

Po x

ox

XXII

GPx activity nmol/min/mg protein

40 30 20 10 0

C ox

Sample name
C - control; Cox - control + H2O2; P - Polyphenon E; Pox - Polyphenon E

Fig. 14. Activitatea GPx n celulele epiteliale pigmentate din retina uman, tratate Polyphenon E Fig. 14. GPx activity n human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated

Determinarea activitii catalazei Celulele D407 netratate sau tratate cu 100 g/ml Polyphenon E pentru 24 h i peroxid de hidrogen pentru 1h. Activitatea catalazei a fost semnificativ diminuat de ctre peroxidul de hidrogen, comparativ cu cea din celulele netratate (Fig. 15). n proba tratat doar cu Polyphenon E activitatea catalazei este mai sczut comparativ cu proba control, ns n celulele supuse stresului oxidativ i tratate cu Polyphenon E se nregistreaz o cretere a activitii enzimei comparativ cu cele netratate. n consecin, extractul determin o stimulare a activitii catalazei doar n condiii de stres oxidativ.

Po x

XXIII

CAT activity nmol/min/mg protein

20 15 10 5 0
ox C

Sample name
C - control; Cox - control; P - Polyphenon E; Pox -Polyphenon E

Fig. 15. Activitatea CAT n celulele epiteliale pigmentate din retina uman, tratate cu Polyphenon E Fig. 15. CAT activity n human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated

Determinarea activitii superoxid dismutazei H2O2 determin o scdere a activitii SOD, n celulele D407, comparativ cu controlul. Tratamentul cu Polyphenon E pentru 24h, determin o cretere semnificativ a activitii SOD, comparativ cu controlul. Mai mult, n celulele tratate cu Polyphenon E i peroxid de hidrogen, activitatea SOD a fost seminificativ mai ridicat dect n celulele ce au fost tratate cu inductorul de stres oxidativ. n concluzie, extractul bogat n catechine intensific activitatea SOD, att n condiii normale ct i n condiii de stres oxidativ (Fig. 16).

Po x

XXIV

120 90 60 30 0

SOD units (%)

C ox

Sample name
C - control; Cox - control+H2O2; P - Polyphenon E; Pox - Polyphenon+H2O2

Fig. 16. Activitatea SOD n celulele epiteliale pigmentate din retina uman, tratate cu Polyphenon E Fig. 16. SOD activity n human retina pigmented epithelial cells, Polyphenon E treated

Determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului Ca urmare, am investigat dac Polyphenon E ar putea contribui la inhibarea generrii speciilor reactive ale oxigenului n cultura de celule D407. Celulele au fost incubate pentru 24 h cu sau fr Polyphenon E, iar cantitatea ROS a fost nregistrat cu ajutorul unui cititor de microplci. Cu 60 minute nainte de nceperea msurtorii celulele au fost pretratate cu peroxid de hidrogen. Dup cum se observ n Fig. 17, s-a nregistrat o cretere semnificativ a nivelului fluorescenei, deci generarea unei cantiti mari de specii reactive de oxigen intracelular i instalarea stresului oxidativ. Celulele D407 tratate doar cu Polyphenon E prezint o fluorescen mai sczut fa de control, dar n mic msur. Comparnd ns probele tratate cu peroxid de hidrogen, se poate observa c celulele tratate n prealabil cu Polyphenon E au fluorescen semnificativ mai sczut, ceea ce dovedete faptul c extractul este capabil s inhibe generarea ROS intracelulare sau s le neutralizeze prin reacia direct cu acestea.

Po

XXV

100 DCF fluorescence (arbitrary units) 75 50 25 0


C C ox P

Sample name C-control; C-control+H2O2; P-Polyphenon E; Pox-Polyphenon E + H2O2

Fig. 17. Efectul Polyphenon E asuspra ROS generate n celulele RPE Fig. 17. The effect of Polyphenon E on ROS generation n RPE cells

CONCLUZII

1. Extractul Poly E extract nu este citotoxic pentru celulele RPE la concentraii mai mici de 200 g/ml; 2. Peroxidul de hidrogen la 500M H2O2 induce stresul oxidativ n celulele D407, fr a avea efecte citotoxice; 3. Polyphenon E induce o cretere a activitii SOD, att n celule tratate cu Polyphenon E, ct i n cele tratate cu Polyphenon E i H2O2; 4. Polyphenon E i peroxidul de hydrogen scad semnificativ activitatea catalazei; 5. Polyphenon E neutralizeaz ROS, inhibnd generarea peroxidului de hidrogen, stimulat de ROS.

Po x

XXVI

III. EVALUAREA EFECTULUI ANTITUMORAL AL CEAIULUI VERDE

Acest capitol conine date experimentale privind evaluarea efectului apoptotic al catechinelor i al extractului de ceai verde pe culturi celulare tumorale. Scopul acestui capitol a fost investigarea tipului de moarte celular, apoptoza, indus de Polyphenon E. S-a testat extractul Polyphenon E (PolyE), o mixtur decafeinizat de catechine pe culturi celulare tumorale de prostat uman. MATERIALE I METODE Celulele PC-3 deriv dintr-un adenocarcinom uman de grad IV, androgenindependent. Aceast linie celular a fost cultivat n mediu Hams F12 (ICN), coninnd 7% ser fetal bovin i glutamin (2mM), n condiii standard, atmosfer umidificat, 5% CO2 i 37C. Etoposidul, un agent antineoplastic, a fost folosit ca tratament pentru celulele D407, n concentraie de 400 M. Testul viabilitii Testul viabilitii s-a realizat cu ajutorul reactivului WST-1 (Jatoi, A. et al.) i colorarea cu crystal violet. Analiza ciclului celular Iodura de propidiu se ataeaz de ADN, intercalndu-se ntre baze, aleator i cu o stoichiometrie de o molecula de colorant la 4-5 perechi de baze de ADN. Determinarea concentraiei proteinelor totale utiliznd metoda Bradford Metoda determinrii proteinei totale s-a realizat cu ajutorul instruciunilor din kitul Bio-Rad Bradford. Metoda Western Blotting Cu ajutorul analizei Western blot se poate identifica doar o singur protein dintrun amestec proteic, numai pe baza informaiei oferite de mrimea proteinei.

XXVII

Determinarea activitii caspazei-3 Activitatea caspazei-3 a fost determinat utiliznd kitul colorimetric MBL International Corporation. Metoda colorimetric pentru determinarea activitii caspazei3 se bazeaz pe hidroliza substratului peptidic acetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilidei (Ac-DEVD-pNA), avnd ca rezultat eliberarea p-nitroanilinei (pNA). p-Nitroanilina are maximum absorban maxim la 405 nm. Analiza fragmentrii ADN Apoptoza este o form de moarte celular programat, caracterizat prin condensarea citoplasmei, picnoz nuclear, conducnd la o distrugere a ADN-ului nuclear n fragmente oligonucleosomale multiple de ~200 bp. Probele au fost ncrcate n gel de agaroz 1.8 %. Tehnica colorrii imunologice a clusterinei Localizarea clusterinei s-a realiyat cu ajutorul tehnicii de colorare imunologic a clusterinei. Celulele au fost fixate cu paraformaldehid, membrana celular a fost permeabilizat, celulele au fost incubate cu soluie de blocare a situsurilor non specifice i hibridizate cu anticorpul primar al clusterinei i anticorpul secundar Alexa 488, dar i colorate cu DAPI. Fotografiile au fost realizate cu ajutorul microscopului Zeiss, utiliznd excitaia de 495 nm, emisia de 519 nm. REZULTATE I DISCUII Morfologia celulelor PC-3 tratate cu PolyphenonE Celulele PC-3 au fost tratate cu diferite concentraii de Polyphenon E: 125 g/ml, 145 g/ml, 170 g/ml, pentru 12h, 24h i 48h. Pentru comparaie, celulele PC-3 au fost tratate cu inductorul de apoptoz, etoposid, la o concentraie 400 M. Celulele prezint o cretere n volum dup 12h de tratament cu Polyphenon E, devenind celule gigant, cu 2-3 nuclei, dup 72h de tratament, comparativ cu controlul. Membrana celular este intact, forma celulei se schimb, din forma alungit, caracteristic liniei celulare la o form poligonal sau oval. Comparativ cu controlul, morfologia celulelor PC-3 se schimb proporional cu creterea concentraiei extractului administrat. De exemplu morfologia

XXVIII

celulelor PC-3 tratate cu 170 g/ml Polyphenon E dup 24h este similar cu a celulelor tratate cu concentraia de 125 g/ml Polyphenon E, dup 48h, dup cum se constat din fotografiile preluate cu ajutorul microscopului cu faz inversat Zeiss. n concluzie, celulele tumorale de prostat i schimb morfologia n funcie de concentraia de extract i perioada de administrare a tratamentului. Analiza proliferrii celulare IC50 sau concentraia de tratament inhibitorie a fost calculat n vederea identificrii dozei care inhib 50% din celulele tumorale de prostat PC-3. Utiliznd metoda proliferrii celulare WST-1 i metoda colorrii cu cristal violet, s-a demonstrat c Polyphenon E inhib creterea celulelor tumorale de prostat PC-3 cu o valoare IC50 de 145 g/ml (echivalentul a 189 mol/l EGCG) (Fig. 18). Polyphenon E conine aproximativ 60% EGCG, compus ce are aceeai capacitate de inhibare a celulelor tumorale PC-3 ca i extractul (Fig. 19). La doze mai mari de 230 g/ml, att Polyphenon E i EGCG sunt citotoxice pentru celulele PC-3. Rezultatele sunt exprimate ca procent al creterii, 100% reprezentnd controlul celulelor netratate.
150

150

% of viability

% of viability

100

100

50

50

0 -1.5 -1.0 -0.5

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

log[mM] EGCG

log[mM] EGCG

Fig. 18. Inhibarea creterii celulare de ctre Polyphenon E obinut cu reactivul WST-1 pentru celulele umane tumorale de prostat PC-3. SD obinut din 3 teste Fig. 18. Inhibition of cell growth by Polyphenon E n human prostate cancer cells PC-3 estimated with WST-1. Bars, SD of triplicate assays

Fig. 19. Inhibarea creterii celulare de ctre EGCG obinut cu reactivul WST1 pentru celulele umane tumorale de prostat PC-3. SD obinut din 3 teste Fig. 19. Inhibition of cell growth by EGCG n human prostate cancer cells PC-3 estimated with WST-1. Bars, SD of triplicate assays

XXIX

Analiza ciclului celular Celulele au fost tratate cu 145 g/ml Polyphenon E i 400 M etoposid i analizate prin citometria de flux a ADN-ului. Procentul celulelor aflate n fiecare faz a ciclului celular a fost calculat i evideniat n Fig. 20. n figura 20 se regsesc rezultatele obinute n urma analizei citometriei de flux, ale celulelor PC-3 tratate cu Polyphenon E i iodura de propidiu (PI). PI legat de ADN emite o fluorescen roie. Pentru a specifica dac inhibarea creterii pe care observat pentru linia celular PC-3 a fost asociat cu modificrile ciclului celular, s-a realizat analiza ADN-ului prin citometria de flux. Procentul celulelor n fazele G0/G1, S, i G2/M a fost calculat cu ajutorul programului citometrului. n cazul n care celulele au fost tratate cu 145g/ml Polyphenon E pentru 48h, procentul celulelor n faza G0/G1 a crescut, aceast cretere fiind asociat cu o descretere a celulelor n fazele S i G2/M ale ciclului celular (Fig. 20). Procentul celulelor apoptotice crete n funcie de timpul de tratament aplicat. Totui, procentul celulelor apoptotice a crescut foarte ncet comparativ cu controlul, dovedind o mare rezisten a celulelor tumorale de prostat PC-3, fa de tratamentul cu Polyphenon E. Numrul celulelor apoptotice dup 12h de tratament s-a dublat, ns dup 72 h de tratament cu Polyphenon E a crescut cu 20%, comparativ cu controlul. Tratamentul cu etoposid a determinat inducerea apoptozei pentru 83% dintre celule.

XXX

Control

Etopoi de

Polyphenon E 24h

Polyphenon E 48h Fig. 20. Histogramele analizei ciclului celular, prezentnd efectele induse de PolyphenonE asupra progresiei ciclului celular n celulele PC-3 Fig. 20. Histograms of the cell cycle analysis showing effects of Polyphenon E on cell cycle progress on PC-3 cells

Polyphenon E 72h

XXXI

Antigenul nuclear de proliferare celular (PCNA) este o protein de 36 kDa cunoscut sub denumirea de ciclin. PCNA este o protein sintetizat n fazele G1 i S ale ciclului celular, cu rol n progresia ciclului celular, replicarea ADN i repararea ADN. Analiza ciclului celular prin Western blotting, demonstreaz efectul indus de Polyphenon E asupra expresiei proteinei PCNA. Celulele preconfluente au fost tratate cu Polyphenon E pentru 24h, 48h i 72h i de asemenea cu inductorul de apoptoz etoposid la concentraia de 400 M. Hibridizarea s-a realizat cu ajutorul anticorpului primar (antiPCNA) i anticorpului secundar. Fig. 21 evideniaz reducerea ciclului celular al celulelor tratate, comparativ cu celulele netratate. Proliferarea celular este dependent de timp, reducerea expresiei proteinei este vizibil dup 72h, intensitatea benzilor western scade, explicaia fiind blocarea ciclului celular n faza G1. Rezultatele se coreleaz cu cele obinute n urma citometriei de flux. PCNA 36kDa

-Actina 42kDa C E 24h 48h 72h

Fig. 21. Expresia proteinei PCNA din celulele PC-3 analizat folosind metoda Western Blotting; Imaginile reprezint bloturile evideniind efectul indus de Polyphenon E, dup 24h, 48h, 72h i tratamentul cu etoposid, asupra expresiei nivelului proteinei PCNA. Fig. 21. Western Blot analysis of PCNA protein on PC-3 cells; The panels are representative Western blots showing the effect of Polyphenon E after 24h, 48h, 72h and etoposide treatment on the expresion of PCNA protein level. Colorarea nuclear cu DAPI DAPI (diamidino-2-phenylindol) este un fluorofor care se ataeaz de ADN-ul dublu catenar. DAPI are o excitaie maxim la 345 nm i o emisie maxim la 455 nm. Sau luat n studiu celule control (netratate) sau celule tratate cu diferite concentraii de Polyphenon E pentru 12h, 24h, 48h, 72h i etoposid pentru 48h. Dup cum se poate observa n Fig. 22, dup 12h de tratament cu Polyphenon E sau identificat corpii apoptotici, ns schimbri proeminente ale morfologiei celulare s-au putut observa dup 48h i 72h, o cretere nuclear, o agregare i o condensare a ADNului.

XXXII

Etoposide treatment

Fig. 22. Colorarea nucleilor cu DAPI Modificrile morfologice nucleare ale celulelor PC-3 tratate i netratate. Evaluarea strii de degradare a celulelor PC-3 s-a realizat folosind colorantul nuclear DAPI. Celulele tratate cu 400 M etoposid i 145 ug/ml Polyphenon E demonstreaz o cretere nuclear, o agregare i o condensare a ADN ului. Morfologia celulelor PC-3 a fost observat cu ajutorul microscopiei de fluorescen, magnificaie10X.

Untreated 12h Polyphenon E 48h Polyphenon E DAPI nuclear Contrast phase

24h Polyphenon E t t t 72h Polyphenon E t t t DAPI nuclear Contrast phase

XXXIII

Analiza fragmentrii ADN-ului O caracteristic distinctiv a apoptozei la nivel biochimic este fragmentarea ADN n fragmente oligonucleosomale reprezentate de multiple perechi de baze 180-200. Formarea fragmentelor de ADN n celulele PC-3 indus de Polyphenon E, comparativ cu martorul, ncepe s fie vizibil dup 12h de tratament. Dup 72h se observ o urm lsat n gelul de agaroz de fragmentele de ADN, similar cu aceea a etoposidului, inductorul apoptozei (400M pentru 48h) (Fig. 23).
M C E 12h 24h 48h 72h

Fig. 23. Fragmentarea ADN de ctre Polyphenon E n celulele PC-3 M-marker (1kQiagen); C-control, netratat; E-etoposid (400M); 12h, 24h, 48h, 72h-timp pentru tratamentul cu Polyphenon E Fig. 23. DNA fragmentation by Polyphenon E n PC-3 cell M-marker (1k-Qiagen); Ccontrol, untreated; E-etoposid (400M); 12h, 24h, 48h, 72h-time for Polyphenon E treatment Caspaza-3, marker de identificare al apoptozei Metoda colorimetric de determinare a activitii caspazei-3 Activarea caspazei-3 joac un rol important n apoptoz, iniiind procesul de moarte celular. Incubarea celulelor PC-3 cu Polyphenon E pentru 12h i etoposid crete semnificativ activitatea caspazei-3, comparativ cu controlul. Contrar, tratamentul cu
XXXIV

Polyphenon E pentru 24h, respectiv 48h determin o scdere a activitii caspazei-3, comparativ cu tratamentul cu Polyphenon E pentru 12 h (Fig. 24).
0.03

Caspase 3 unit

0.02

0.01

0.00

E to po si de Po ly E -1 2h Po ly E -2 4h
Sample name

Fig. 24. Activarea caspazei-3 dup tratamentul cu Polyphenon E (la 12h, 24h, 48h); Activitatea caspazei-3 a fost msurat cu ajutorul metodei din Kitul Colorimetric Chemicon, n care caspaza-3 activ recunoate clivarea secvenei DEVD Fig. 24. Activation of caspase-3 after Polyphenon E treatment (at 12h, 24h, 48h); The activity of caspase-3 was measured with a Colorimetric Assay Kit (Chemicon) that recognizes cleavage of the sequence DEVD by active caspase-3

Analiza Western Blotting a expresiei proteinei caspaza-3 Caspaza-3 este proteina apoptotic cea mai intens studiat. Caspaza-3 este sintetizat ca o proenzim (32 kDa) care este clivat n celulele ce intr n apoptoz, prin autoproteoliz sau de ctre alte proteaze. Forma activ a caspazei-3 are dou subuniti, una mare (17 kDa) i alta mic (12 kDa). Apoptoza a fost analizat i prin analiza Western Blotting, evalund efectul indus de Polyphenon E asupra nivelului de expresie al proteinei caspaza-3. Celulele preconfluente au fost tratate cu Polyphenon E pentru 12h, 24h, 48h, utiliznd concentraiile de 125 g/ml, 145 g/ml and 170 g/ml i 400 M etoposid. Hibridizarea s-a realizat cu anticorpul policlonal iepure al caspazei-3 i -actinei, respectiv anticorpul secundar anti-iepure. -actina a fost folosit ca i control. Fig. 25 evideniaz clivarea caspazei-3 n celulele tumorale de prostat, dup 12h i 24h de tratament cu Polyphenon E n concentraii de 125 i 145 g/ml. Activarea
XXXV

Po ly E -4 8h

C on tr ol

caspazei-3 este vizibil i dup un tratament de 48h cu Polyphenon E n concentraii de 125, 145 i 170 g/ml. Caspaza-3 Clivat 19kDa

-Actina

42kDa 1 2 3 4 2 3 4

1-Control; 24h tratament: 2- 125g/ml; 3- 145 g/ml; 4-170g/ml Polyphenon E; 48h tratament: 2- 125g/ml; 3- 145 g/ml; 4170g/ml Polyphenon E; Caspaza-3 Clivat 19kDa

-Actina

42kDa 1 2 3 4

1-Control; 12h tratament: 2- 125g/ml; 3- 145 g/ml; 4-170g/ml Polyphenon E; Fig. 25. Analiza Western Blot a expresiei proteinelor caspaza-3 din celulele PC-3; Imaginile demonstreaz efectul extractului Polyphenon E, dup un tratament de 24h, 48h, 72h i etoposid, asupra nivelului de expresie al proteinelor menionate Fig. 25. Western Blot analysis of caspase-3 protein expression in PC-3 cells; The panels are representative Western blots showing the effect of Polyphenon E after 24h, 48h, 72h and etoposide treatment on the expression of the protein level.

Imunocolorarea clusterinei A fost evaluat expresia clusterinei i localizarea acesteia, in urma declanrii apoptozei n celulele PC-3. Celulele netratate evideniaz o slab localizare citoplasmatic i nucleara a clusterinei. Tratamentul cu 400M etoposid pentru 48h pune n eviden existena unor celule gigant, n care se observ o supraexpresie nuclear a
XXXVI

clusterinei (verde). Pentru a pune n eviden nucleii multipli s-a realizat colorarea cu DAPI (albastru). O imagine a microscopiei n contrast de faz a acestor celule gigant este prezentat n fotografia din stnga. Colorarea imunologic a celulelor PC-3 pentru clusterin, dup tratamentul cu 145 g/ml Polyphenon E pentru 24h i 48h, evideniaz existena corpilor apoptotici, prin colorarea cu DAPI i o supraexprimare a clusterinei nucleare (Fig. 26).

XXXVII

Contrast de faz 20X E

Imunocolorarea clusterinei

Colorarea nuclear cu DAPI

Fig. 26.

Contrast de faz 20X

Imunocolorarea clusterinei

Colorarea nuclear cu DAPI

XXXVIII

24h

Contrast de faz 20X 48h

Imunocolorarea clusterinei

Colorarea nuclear cu DAPI

Contrast de faz 20X

Imunocolorarea clusterinei

Colorarea nuclear cu DAPI

Fig. 26. Colorarea imunologic a clusterinei din celulele PC-3; Evaluarea localizrii clusterinei din celulele PC-3 a fost realizat utiliznd anticorpul clusteinei (Upstate) i fluorocromul Alexa 488. Celulele cu corpi apoptotici i localizare nuclear a clusterinei sunt indicate prin sgei. Celulele PC-3 au fost analizate cu ajutorul microscopiei de fluorescen, magnificaie
XXXIX

20X. Rezultatele prezentate sunt cele mai reprezentative din dou experimente; C-control; E-etoposid; 24h, 48h- tratament Polyphenon E pentru 24h, 48h. Fig. 26. Clusterin imunostaining in PC-3 tumor prostate cells; The assessment of clusterin localization in PC-3 cells was done using clusterin antibody (Upstate) and fluorescent Alexa 488. The cells with blebs and nuclear clusterin localization are indicated by arrows. PC-3 cells were observed under fluorescence microscopy, the magnification was X20. Presented results are from one representative experiment of two; C-control; E-etoposide; 24h, 48h- Polyphenon E treatment for 24h, 48h.

XL

CONCLUZII Datele experimentale relev: Celulele tumorale de prostat PC-3 i modific morfologia n funcie de concentraia de PolyphenonE, extractul de ceai verde decafeinat i de perioada tratamentului aplicat; Polyphenon E inhib creterea celulelor tumorale PC-3 la o valoare IC50 de 145 g/ml (echivalentul a 189 mol/l EGCG); Numrul celulelor apoptotice, determinat prin flow citometrie, se dubleaz dup 12h de tratament cu Polyphenon E, comparativ cu controlul. Un tratament mai ndelungat (72 h) cu Polyphenon E determin o crete cu 20% a celulelor apoptotice. Tratamentul cu etoposid pentru 48h induce apoptoza n procent de 83% n celulele tumorale de prostat PC-3. Tratamentul cu Polyphenon E pentru 72h reduce expresia proteinei PCNA, aa cum a fost evideniat prin analiza Western blotting. n concluzie Polyphenon E determin blocarea ciclului celular n faza G1. APOPTOZA este moartea celular indus de Polyphenon E, ce determin o cretere n volum a nucleului, o agregare i o condensare a ADN-ului, efecte demonstrate cu ajutorul metodelor fragmentrii ADN, colorarea clusterinei i colorarea nuclear cu DAPI. Toate aceste rezultate aduc o contribuie important n cercetarea romneasc i internaional. Testarea acestor compui pe celulele tumorale i celule epiteluale din retina uman dovedesc c att cancerul de prostat degenerescena macular senil pot fi prevenite.

XLI

BIBLIOGRAFIA

1.

DI LORENZO, G., TORTORA, G., D'ARMIENTO, F. P., DE ROSA, G.,

STAIBANO, S., AUTORINO, R., D'ARMIENTO, M., DE LAURENTIIS, M., DE PLACIDO, S., CATALANO, G., BIANCO, A. R. and CIARDIELLO, F., 2002. Expression of epidermal growth factor receptor correlates with disease relapse and progression to androgen-independence in human prostate cancer, Clin Cancer Res, 8(11): 3438-3444. 2. 3. GRAHAM, H. N., 1992. Green tea composition, consumption, and polyphenol JATOI, A., SUMAN, V. J., SCHAEFER, P., BLOCK, M., LOPRINZI, C., ROCHE, chemistry, Prev Med, 21(3): 334-350. P., GARNEAU, S., MORTON, R., STELLA, P. J., ALBERTS, S. R., PITTELKOW, M., SLOAN, J. and PAGANO, R., 2003. A phase II study of topical ceramides for cutaneous breast cancer, Breast Cancer Res Treat, 80(1): 99-104. 4. PROTEGGENTE, A. R., PANNALA, A. S., PAGANGA, G., VAN BUREN, L., WAGNER, E., WISEMAN, S., VAN DE PUT, F., DACOMBE, C. and RICE-EVANS, C. A., 2002. The antioxidant activity of regularly consumed fruit and vegetables reflects their phenolic and vitamin C composition, Free Radic Res, 36(2): 217-233. 5. ROY, S., KHANNA, S., ALESSIO, H. M., VIDER, J., BAGCHI, D., BAGCHI, M. and SEN, C. K., 2002. Anti-angiogenic property of edible berries, Free Radic Res, 36(9): 1023-1031. 6. SEERAM, N. P., HENNING, S. M., NIU, Y., LEE, R., SCHEULLER, H. S. and HEBER, D., 2006. Catechin and caffeine content of green tea dietary supplements and correlation with antioxidant capacity, J Agric Food Chem, 54(5): 1599-1603.

XLII

S-ar putea să vă placă și