UNIVERSITATEA DE VEST VASILE GOLDI DIN ARAD

FACULTATEA DE TIINE ALE NATURII

ANA-MARIA GHEORGHE
CERCETRI ASUPRA MECANISMELOR CELULARE I MOLECULARE ALE APOPTOZEI ERITROCITARE. APLICAII N PATOLOGIE, TRANSFUZIA SANGUIN, TOXI- I ECOTOXICOLOGIE

Rezumatul tezei de doctorat

Conductor tiinific: Prof. univ. dr. Aurel ARDELEAN

- ARAD 2011 -

CUPRINS
INTRODUCERE CAPITOLUL I. CONSIDERAII GENERALE ASUPRA ERITROCITULUI I.1. ASPECTE MORFOLOGICE, STRUCTURALE I DE FIZIOLOGIE A ERITROCITULUI ANUCLEAT (UMAN)

9 12 13 13 14 15 19 20 20 20 21 22 25 30 31 32 32 33 34 34 35 35 35 36 36 37 38 39 40 41 41 44 44 45 46 47 48 50 50 50 51 52

I.1.1. Structura membranei eritrocitare umane: de la extracie i purificare spre analiza proteomic complet 1.1.1.1. Proteinele membranare I.1.1.1.1. Glicoproteinele integrate I.1.1.1.2. Proteinele periferice ale citoscheletului I.1.1.2. Lipidele membranare I.1.1.2.1. Colesterolul I.1.1.2.2. Fosfolipidele I.1.1.2.3. Glicolipidele I.1.1.3. Aspecte ale interaciunii proteine-lipide n forma i integritatea eritrocitelor I.1.1.4. Permeabilitatea membranei, transportul de substane nutritive i reglarea volumului eritrocitar I.1.2. Structura i funcia hemoglobinei I.1.3. Metabolismul eritrocitar I.1.3.1. Rolul catabolismului glucozei I.1.3.2. untul raportului I.1.3.3. Calea pentozo-fosfat I.1.3.4. Metabolismul nucleotidelor cu adenin I.1.3.5. Utilizarea altor componente I.1.3.6. Metabolismul glicogenului I.1.3.7. Metabolismul glutationului I.1.3.8. Sistemul de reducere al methemoglobinei I.1.3.9. Alte enzime I.1.3.10. Metabolismul fierului I.1.3.11. Hemoliza i metabolismul hemoglobinei
I.2. ASPECTE MORFOLOGICE, STRUCTURALE I DE FIZIOLOGIE A ERITROCITELOR NUCLEATE

I.2.1. Banda marginal a eritrocitelor nucleate I.2.2. Proprietile morfologice i mecanice ale eritrocitelor nucleate I.2.3. Hemoliza eritrocitelor nucleate I.2.4. Caracteristicile eritrocitelor din Familia Ranidae, Genul Rana
I.3. CARACTERISTICILE MBTRNIRII I APOPTOZEI ERITROCITARE N CONTEXTUL APOPTOZEI CELULARE CLASICE

I.3.1. Noiuni generale de apoptoz I.3.1.1. Caracteristicile celulelor apoptotice I.3.1.2. Cile de derulare a apoptozei I.3.1.3. Activarea fenomenului de apoptoz celular I.3.1.4. Molecule implicate n apoptoz I.3.2. Apoptoza eritrocitar I.3.2.1. mbtrnirea hematiilor - mai mult dect o asemnare superficial cu fenomenul de apoptoz I.3.2.1.1. Diminuarea progresiv a taliei prin emisia de vezicule/modificri morfologice ale hematiei I.3.2.1.2. Alterarea citoscheletului prin aciunea unor proteaze sau calpaine care conduc la modificri ale morfologiei celulelor I.3.2.1.3. Desialilarea i capturarea hematiilor de ctre macrofage

I.3.2.1.4. Pierderea asimetriei de membran a dublului strat lipidic i externalizarea fosfatidilserinei I.3.2.1.5. Activarea caspazelor -3 i -8 I.3.2.1.6. Activarea calpainelor I.3.2.1.7. Eliminarea de corpi apoptotici i fagocitarea de ctre macrofage I.3.2.1.8. Recunoaterea hematiilor senescente de ctre macrofage
I.4. ASPECTE GENERALE PRIVIND PATOLOGIA ERITROCITULUI: ANEMII I PROLIFERRI MALIGNE

53 54 56 56 57 63 63 64 64 66 67 68 69 69 72 72 74 74 75 77 77 77 78 78 78 79 80 81 83 84 84 84 85 85 87 89 90

I.4.1. Anemiile I.4.1.1. Aspecte generale i hematologice n boala Gaucher I.4.1.1.1. Aspecte generale ale bolii Gaucher I.4.1.1.2. Aspecte hematologice n boala Gaucher I.4.2. Sindroame proliferative (poliglobulii) I.4.2.1. Policitemia vera
CAPITOLUL II. TRANSFUZIA SANGUIN I PROBLEMELE EI ACTUALE. PERSPECTIVE II.1. NOIUNI GENERALE DESPRE TRANSFUZIA SANGUIN I PROBLEMELE EI ACTUALE II.2. DIRECII DE CERCETARE PENTRU AMELIORAREA CONDIIILOR DE PRELEVARE I STOCARE A HEMATIILOR DESTINATE TRANSFUZIEI

II.2.1. Autotransfuzia la sportivii de performan

CAPITOLUL III. APLICAII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR N TOXI- I ECOTOXICOLOGIE III.1. TENDINE MODERNE N TOXICOLOGIA I ECOTOXICOLOGIA MOLECULAR; INTRODUCEREA DE BIOMARKERI I TESTE CELULARE PE BAZ DE ERITROCITE

III.1.1. Fenomenul de apoptoz celular i relevana acestui fenomen n ecotoxicologie

CAPITOLUL IV. MATERIALE I METODE UTILIZATE N CADRUL CERCETRILOR PROPRII IV.1. MATERIALE I PRODUSE BIOLOGICE

IV.1.1. Produse chimice IV.1.2. Produse biologice

IV.2. METODE APLICATE N REALIZAREA PRII EXPERIMENTALE

IV.2.1. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor IV.2.2. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor cu inhibitori de apoptoz IV.2.3. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor pentru studiul aciunii radiaiilor laser asupra viabilitii hematiilor stocate n mediul SAGM IV.2.4. Prepararea pungilor de conservare a sngelui pentru elaborarea unui test de depistare a autotransfuziei la sportivi IV.2.5. Evaluarea in vitro a toxicitii i ecotoxicitii unor nanoparticole (nanomateriale) pe baz de apoptoz a eritrocitelor nucleate IV.2.6. Metode biochimice de analiz IV.2.6.1. Dozarea ATP-ului IV.2.6.2. Dozarea hemoglobinei IV.2.7. Metode de analiz bazate pe citometrie n flux IV. 2.7.1. Noiuni generale de citometrie n flux IV.2.7.2. Analiza i prezentarea datelor obinute prin citometrie n flux IV.2.7.3. Estimarea modificrilor de morfologie celular prin msurarea absorbiei i difuziei luminii (FSC/SSC) prin citometrie n flux IV.2.7.4. Aprecierea viabilitii eritrocitare prin msurarea activitaii esterazelor intracelulare cu Calcein-AM

IV.2.7.5. Studiul fenomenului de apoptoz celular prin citometrie n flux IV.2.7.6. Analiza nivelului de desialilare a glicoconjugatelor de membran eritrocitar IV.2.7.7. Evidenierea simultan a condrocitelor viabile, n apoptoz sau necroz, prin dublu marcaj Anexin V-FITC/Iodur de Propidiu IV.2.7.8. Determinarea activitii caspazelor -8 i -3 IV.2.7.9. Determinarea markerului de antirecunoatere CD47 IV.2.8. Metode de analiz pe baz de microscopie IV.2.8.1. Analiza prin microscopie n lumin direct IV.2.8.2. Analiza prin microscopie electronic
CAPITOLUL V. CERCETRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ N PATOLOGIA ERITROCITULUI V.1. STUDII DE EVIDENIERE A APOPTOZEI ERITROCITARE N ANEMII

92 93 94 95 96 97 97 97

99 99 99 100 100 102 105 106 106 107 107 109 111 112 112 113 113 114 115 116 118 119

V.1.1. Analiza i caracterizarea eritrocitelor n maladia Gaucher V.1.1.1. Analiza modificrilor de morfologie V.1.1.1.1. Analiza direct prin citometrie n flux n sistem FSC/SSC V.1.1.1.2. Analiza prin microscopie electronic de baleiaj (SEM) V.1.1.2. Analiza viabilitii celulare a hematiilor n Maladia Gaucher V.1.1.3. Analiza citometric a markerilor de eritrofagocitoz V.1.1.3.1. Aprecierea gradului de desializare a glicoconjugatelor V.1.1.3.2. Evidenierea gradului de externalizare a resturilor de fosfatidilserin la suprafaa celular V.1.1.3.3. Determinarea markerului de antirecunoatere CD47 DISCUII CONCLUZII
V.2. STUDII DE EVIDENIERE A APOPTOZEI ERITROCITARE N SINDROAME PROLIFERATIVE

V.2.1. Analiza i caracterizarea eritrocitelor n policitemia vera V.2.1.1. Analiza eritrocitelor din policitemia vera nainte i dup tratament V.2.1.1.1. Analiza prin citometrie n flux a modificrilor de morfologie n sistem FSC/SSC V.2.1.1.2. Evidenierea modificrilor de morfologie prin microscopie optic n faz invers V.2.1.1.3. Evidenierea modificrilor de morfologie prin microscopie de scanare V.2.1.1.4. Aprecierea gradului de desializare a glicoconjugatelor ca marker de captur n eritrofagocitoz V.2.1.1.5. Analiza viabilitii celulare cu Calcein-AM V.2.1.1.6. Externalizarea de fosfatidilserin V.2.1.1.7. Evidenierea prin analiza de citometrie n flux a gradului de activare pentru caspaza -8 iniiatoare i caspaza -3 efectoare n fenomenul de apoptoz DISCUII CONCLUZII

119 120 122

CAPITOLUL VI. CERCETRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ I MODULAREA ACESTUIA N CONSERVAREA SNGELUI DESTINAT TRANSFUZIEI PENTRU AMELIORAREA CALITII ACESTUIA 123 VI.1. CARACTERIZAREA PRIN CITOMETRIE N FLUX A CALITII SNGELUI N ACTUALELE CONDIII DE PRELEVARE I CONSERVARE DIN CENTRELE DE TRANSUZII 124

VI.1.1 Analiza calitii sngelui conservat n centrele de transfuzii pe baza criteriilor clasice de viabilitate VI.1.1 1. Testul de determinare a ATP-ului VI.1.1 2. Determinarea hemolizei

124 124 125

VI.1.2. Analiza calitii sngelui conservat n centrele de transfuzii pe baz de noi criterii de viabilitate prin citometrie n flux VI.1.2.1. Criteriul morfologic determinat prin analiza modificrilor n sistem FSC/SSC VI.1.2.2. Testul cu Anexin V-FITC de evideniere a externalizrii fosfatidilserinei VI.1.2.3. Test de viabilitate cu Calcein-AM DISCUII CONCLUZII VI.1.3.ncercri de ameliorare a stocrii sngelui prin utilizarea de inhibitori de apoptoz VI.1.3.1. Criteriul morfologic VI.1.3.2. Determinarea modificrii asimetriei membrane cu Anexin V-FITC (externalizare de fosfatidilserin) DISCUII CONCLUZII IV.1.4.Studiul aciunii radiaiilor laser asupra viabilitii eritrocitelor stocate n mediu SAGM VI.1.4.1. Evidenierea modificrilor morfologice prin citometrie n flux i microscopie electronic de baleiaj VI.1.4.2. Evidenierea prin citometrie n flux a asimetriei de membran cu Anexin V-FITC VI.1.4.3. Aprecierea viabilitii celulare prin citometrie n flux cu Calcein-AM DISCUII CONCLUZII
VI.2. UTILIZAREA APOPTOZEI ERITROCITARE CA FUNDAMENT PENTRU ELABORAREA UNUI TEST DE DEPISTARE A AUTOTRANSFUZIEI LA SPORTIVI

126 126 129 130 131 134 135 135 135 139 139 140 140 142 143 145 148 149 149 150 151

VI.2.1. Aprecierea viabilitii celulare cu Calcein-AM DISCUII CONCLUZII

CAPITOLUL VII. APLICAII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR NUCLEATE N TOXI- I ECOTOXICOLOGIE VII.1. EVALUAREA IN VITRO PE MODEL EXPERIMENTAL DE LABORATOR A EFECTULUI TOXIC I ECOTOXICOLOGIC INDUS DE NANOPARTICOLE ASUPRA ERITROCITELOR NUCLEATE DE BATRACIAN

152

VII.1.1. Analiza prin citometrie n flux n sistem FSC/SSC a modificrilor de morfologie VII.1.2. Evidenierea fenomenului de apoptoz celular indus de nanoparticole i testarea toxicitii celulare pe eritrocite prin tehnici de microscopie VII.1.2.1. Analiza prin microscopie optic VII.1.2.2. Analiza prin microscopie electronic de scanare (SEM) VII.1.2.3. Analiza prin microscopie electronic de transmisie (TEM) VII.1.3. Evidenierea influenei porfirinelor asupra viabilitii celulare determinat prin citometrie n flux cu Calcein-AM VII.1.4. Evidenierea influenei porfirinelor asupra morii celulare utiliznd dublul marcaj Anexin V/Iodur de propidiu VII.1.5. Determinarea activitii caspazelor -8 i -3 sub aciunea porfirinelor DISCUII CONCLUZII
CONCLUZII GENERALE BIBLIOGRAFIE LISTA LUCRRILOR TIINIFICE REALIZATE N CADRUL TEZEI DE DOCTORAT

152 153 155 155 155 157 169 172 174 177 179 180 183 202

CAPITOLUL I. CONSIDERAII GENERALE ASUPRA ERITROCITULUI Hematia, descoperit n secolul al 17-lea de ctre Swammerdam (1658) i perfect descris de Leeuwenhoek care a pus n eviden regularitatea formei sale discoidale i a estimat diametrul su la 8 m, rmne celula cel mai intens studiat datorit uurinei cu care poate fi obinut i importanei sale fiziologice de a transporta oxigen i dioxid de carbon. Durata de via a eritrocitelor este programat i variaz n proporii mari de la o specie la alta. Conform cercetrilor lui Clark, 1988, durata de via a eritrocitelor unui cal este de 150 zile, pentru om de 120 zile, pentru pisici i soareci 40 zile, etc. Precizia asemntoare unui ceas fiziologic, a intrigat de foarte mult vreme cercettorii i a condus la apariia multor studii cu scopul de a identifica markerii membranari ai morii celulare programate pentru aceste celule. Ultimii zece ani au generat teme noi de cercetare legate de fenomenul de apoptoz eritrocitar, n special cu aplicabilitate direct n ameliorarea condiiilor de pstrare a sngelui n centrele de transfuzii (Bratosin et al., 2002a), dar i pentru eventuala implicare a acestui fenomen n multe boli hematologice (Lang et al., 2008).

CAPITOLUL II. TRANSFUZIA SANGUIN I PROBLEMELE EI ACTUALE. PERSPECTIVE Transfuzia de snge reprezint unul din puinele tratamente folosite pentru restaurarea oxigenrii esuturilor atunci cnd se impune suplimentarea cantitii de oxigen. Ea este larg folosit n zilele noastre n cazul pacienilor care au suferit pierderi acute de snge, a celor la care se manifest o producere inadecvat la nivel de maduv osoas sau atunci cnd apare un fenomen de distrugere sporit a eritrocitelor. nainte de a fi transfuzate, eritrocitele pot fi stocate n condiii controlate o perioad de pn la 42 zile, ns n timpul stocrii apar numeroase modificri ca urmare a unei mbtrniri accelerate. n mod generic acestea au fost denumite leziuni de stocare, ce pot altera funcia biologic a eritrocitelor (Tinmouth et al., 2006). nelegerea leziunilor de stocare este nc incomplet, Hogman et al., (2006) sugernd c atenia cercettorilor ar trebui s fie focusat pe conservarea funcionalitii eritrocitelor n timpul stocrii. n acest sens, introducerea de noi teste sensibile i rapide de control a calitii sngelui destinat transfuziilor s-a impus cu necesitate (Mitrofan - Oprea et.al., 2007), la fel ca i ameliorarea condiiilor de prelevare i conservare a sngelui n centrele de transfuzie.

CAPITOLUL III. APLICAII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR N TOXI- I ECOTOXICOLOGIE Apoptoza este astzi de un interes major n toxicologia molecular, jucnd un rol central n aciunea multor substane toxice, ceea ce i confer un rol important n studiul potenialului lor toxicologic. n aceste condiii, gsirea unor biomarkeri celulari de apoptoz, sensibili, care furnizeaz informaii mult mai obiective asupra gradului de poluare acvatic, poate conduce la imaginarea unor biosenzori celulari extrem de performani (Leung et al., 2008). Eritrocitele nucleate de peti i batracieni, pot fi considerate pe de o parte, adevrai biosenzori celulari pentru studiul ecotoxicologic al amestecurilor complexe de poluani, iar pe de alt parte, un sistem alternativ pentru monitorizarea ecologic a mediului acvatic, n perfect armonizare cu legislaia n vigoare (Bratosin et al., 2007a). Astfel, ansamblul datelor actuale pledeaz pentru utilizarea mai multor biomarkeri, aflai la diferite nivele de organizare biologic n snul unui individ (molecular, celular, tisular) sau la nivel de individ n ansamblul su (biomarkeri fiziologici). n schimb, utilizarea biomarkerilor ca instrumente de previziune a riscului ecologic deschide pentru deceniile viitoare un vast cmp de cercetare i aplicaii.

CAPITOLUL IV. MATERIALE I METODE UTILIZATE N CADRUL CERCETRILOR PROPRII Cercetrile ntreprinse n cadrul prezentei teze de doctorat s-au nscris pe direcia completrii i aprofundrii cunotinelor privind descifrarea fenomenului de apoptoz eritrocitar i gsirea de modaliti pentru modularea acestui fenomen, constituind un aport la crearea bazelor unor noi terapii n bolile hematologice, precum i n ameliorarea condiiilor de prelevare i stocare a sngelui n centrele de transfuzie. De asemenea, innd cont de tendina actual din toxicologie i ecotoxicologie, care se bazeaz din ce n ce mai mult pe nlocuirea testelor pe animale cu teste celulare, ne-am propus totodat utilizarea eritrocitului i a fenomenului su de apoptoz n aceste domenii, ca o prioritate absolut, pentru nlocuirea culturilor celulare, costisitoare i greu de intreinut. IV.1. MATERIALE I PRODUSE Sngele uman folosit n experiene a fost obinut de la donatori sntoi i furnizat de Centrul de Transfuzii al Armatei sau Centrul de Transfuzie al Municipiului Bucureti, iar pentru maladiile luate n studiu a fost obinut de la Institutul Clinic Fundeni, Centrul de Hematologie i Transplant Medular t. Berceanu, Bucureti. Recuperarea eritrocitelor de

la bolnavii cu boala Gaucher s-a fcut pe snge colectat pe heparin iar pentru studiul eritrocitelor de la bolnavi cu policitemia vera, sngele a fost recoltat pe citrat. n ambele cazuri sngele a fost prelucrat la maximum 1 h dup colectare. S-a utilizat de asemenea snge de batracieni (Rana sp.), colectat sub anestezie, pe heparin. Eritrocitele umane sau de batracian au fost sedimentate prin centrifugare (1000 g, 4 C, 5 min) pentru eliminarea plasmei, leucocitelor i plachetelor sanguine prin aspirare mpreun cu o mic cantitate de hematii. Sedimentul eritrocitar a fost ulterior splat de 3 ori cu o soluie tampon fosfat salin Dulbecco pH 7,4 i supus analizelor. IV.2. METODE APLICATE N REALIZAREA PRII EXPERIMENTALE Prepararea pungilor pentru conservarea hematiilor s-a realizat conform protocoalelor aplicate n centrele de prelevare i conservare a sngelui pentru transfuzii. Sngele a fost prelevat prin puncionarea clasic n urmtoarele condiii: 450 ml de snge au fost recoltai n 63 ml de soluie anticoagulant CPD (Citrat - Fosfat - Dextroz) de pH 5,5. Dup 24 ore la 20C, suspensiile eritrocitare au fost centrifugate iar concentratul globular obinut deleucocitat prin trecerea printr-un filtru Leucoflex LST (Brevet MacoPharma) a fost introdus la un hematocrit de 60% ntr-o soluie de conservare SAGM de pH 5,1 0,3. Pungile au fost apoi pstrate la 4C timp de maxim 6 sptmni. Pentru experienele referitoare la tentativa de ameliorare a calitii i condiiilor de stocare a hematiilor n centrele de transfuzii, sngele a fost prelevat i conservat conform procedurii detaliate anterior, dup care pungile au fost repartizate n alte pungi fabricate special de Laboratoarele MacoPharma, mai mici, coninnd inhibitori de apoptoz, respectiv Ac-DEVD-cmk, Ac-DEVD-CHO, Ac-YVAD-fmk i Ac-Leu-Leu-Arg-CHO (leupeptin), cu o concentraie variind ntre 200 M i 3 mM. Pentru obinerea mai rapid de rezultate am procedat la o inducere accelerat a mbtrnirii hematiilor prin incubare la 37C n prezen sau n absen de inhibitori. Experimentele pentru studiul efectului de rentinerire exercitat de radiaiile laser asupra hematiilor conservate n mediu SAGM s-au efectuat pe hematii provenind de la 2 donatori, conservate n pungi special confecionate de ctre MacoPharma, coninnd eritrocite (obinute prin centrifugarea i deleucocitarea sngelui total) i pstrate n mediu SAGM, la 4C pentru o perioad de pn la trei sptmni. Pentru a defini cele mai bune condiii de iradiere n ceea ce privete doza i durata expunerii, dou serii a cte 10 pungi au fost iradiate la doze variind treptat de la 0,1 la 1 J x cm-3 pentru = 465 nm i de la 0,2 la 1,8 J x cm -3 pentru = 660 nm la 11, 14 i 21 de zile dup colectare. La un interval de 12 ore de la iradiere eritrocitele au fost analizate prin citometrie n flux i tehnici complementare.

Pentru protejarea datelor ce fac obiectul unei cereri de brevet, condiiile de lucru i rezultatele privind experienele de punere la punct a unui test de depistare a autotransfuziei la sportivi, nu vor fi facute publice n prezentul rezumat, ele fiind cuprinse doar n teza de doctorat. Pentru studiile de toxicitate i ecotoxicitate n care am dorit s utilizm un nou model celular, respectiv eritrocitul de batracian, ne-am propus s luam n studiu mai multe nanoparticole pe baz de porfirine i hibrizi ai acestora care au fost activate cu UV timp de 10 minute i incubate ulterior n ser fiziologic pentru 24 de ore. Supernatantele au servit la obinerea unor diluii seriale, variind ntre 0,008 i 0,0005 g/ml, n plci cu godeuri pentru culturi celulare. Eritrocitele nucleate de Rana sp. au fost incubate n aceste diluii pentru 24h, la 20C i analizate pentru investigarea efectului toxic produs de nanoparticole.

IV.2.7. METODE DE ANALIZ BAZATE PE CITOMETRIE N FLUX Analizele de citometrie n flux (CMF) au fost realizate cu un citofluorimetru FACScan Becton Dickinson (San Jose, USA), achiziia i analiza rezultatelor fiind efectuate cu un soft CellQuest Pro. Toate studiile au fost realizate de cel puin 3 ori i analizate n triplicat de fiecare dat. IV.2.7.3. Estimarea modificrilor de morfologie celular prin msurarea absorbiei i difuziei luminii (FSC/SSC) prin citometrie n flux innd cont de caracteristicile celulelor n apoptoz, respectiv de diminuarea taliei i de creterea densitii i a coninutului celular/granulozitate putem discrimina celulele viabile de cele n apoptoz sau moarte, acestea avnd o poziionare pe citogram de tipul low FSC (forward scatter)/high SSC (side scatter). Mod de lucru: 100 l de suspensie celular (105 celule) au fost transferai ntr-un tub de analiz pentru FACS (Citometrul FACScan Becton Dickinson) i s-au adaugat 900 l PBS. Celulele au fost analizate n sistem linear FSC/SSC. viabilitii msurarea activitaii

IV.2.7.4.

Aprecierea

eritrocitare

prin

esterazelor intracelulare cu Calcein-AM Viabilitatea celular s-a determinat conform protocolului elaborat de Bratosin et al., (2005b). Mod de lucru: a fost preparat o soluie stock 10 mM de Calcein-AM n DMSO (dimetilsulfoxid) (1mg n 100 l DMSO) care s-a conservat la -20 C i apoi s-a preparat extemporaneu o soluie de lucru 100 M n tampon PBS, pH 7,4. Celulele (4 x 105 n 200 l

tampon PBS) au fost incubate cu 10 l de soluie de lucru Calcein-AM (concentraia final a calceinei fiind de 5 M), timp de 45 minute, la ntuneric. naintea analizei prin citometrie n flux s-a adugat 0,5 ml de tampon PBS. Achiziia i analiza celulelor s-a realizat n sistem linear pentru FSS/SSC i n sistem logaritmic pentru FL1. IV.2.7.6. Analiza nivelului de desialilare a glicoconjugatelor de membran eritrocitar n studiul modificrilor glicoconjugatelor membranare sau n studiul receptorilor de membran, lectinele sunt mult utilizate. Lectinele utilizate de noi au fost specifice pentru acid sialic sau pentru resturi de -Gal care puteau rezulta din desialilarea glicoconjugatelor, cu o specificitate i mai exact, aa cum este prezentat n Tabelul 3. Tabelul nr. 3. Lectinele utilizate n studiul nivelului de desialilare al glicoconjugatelor membranare
LECTINA

ABREVIERE

SPECIFICITATEA DE GLUCID

Maackia amurensis Agglutinin, RCA120 Sambucus nigra Triticum vulgaris

MAA RCA SNA WGA

Gal NeuNAc( -Gal NeuNAc( Gal/GalNAc (GlcNAc)2, NeuNAc

Pentru fiecare lectin folosit s-au testat concentraii optime subaglutinante, variind ntre 0 i 50 mM, efectundu-se o analiz comparativ de apreciere a nivelului de fixare al lectinei pe structurile glucidice specifice, prin compararea mediei (MFI) de fluorescen. Mod de lucru: n vederea evidenierii nivelului de desialilare al glicoconjugatelor membranei eritrocitare, legarea lectinelor fluorescente s-a fcut prin incubarea n tuburi de FACS a 50 l de suspensie celular coninnd 2x106 hematii cu 100 l dintr-o soluie de lectin marcat cu FITC (de concentraii diferite n funcie de lectina utilizat), n tampon PBS, pH 7,4. Dup incubarea pentru 1 h la 4 C s-au adugat nca 350 l PBS i celulele au fost analizate prin CMF. IV.2.7.7. Evidenierea simultan a condrocitelor viabile, n apoptoz sau necroz, prin dublu marcaj Anexin V-FITC/Iodur de Propidiu Marcarea simultan cu Anexin V i PI ofer posibilitatea discriminrii ntre celulele aflate n apoptoz i cele n necroz sau n fazele trzii de apoptoz care conduc la moartea celulei. Astfel, celulele necrotice vor fixa att Anexina V ct i Iodura de Propidiu, fluorocrom care ptrunde n celul i se fixeaz de nucleu, n timp ce celulele apoptotice vor fixa doar Anexina V care se leaga de resturile de fosfatidilserin.

Mod de lucru: 100l de suspensie celular (2 x 105 celule) resuspendai n 1X tampon de legare HEPES calcic (10 mM HEPES/NaOH, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH 7,4) au fost incubai cu 5 l Anexin V-FITC i 10 l PI timp de 30 minute la temperatura camerei, n condiii de obscuritate. nainte de analiz s-au adugat 400 l de 1X tampon de legare, iar suspensia a fost analizat prin citometrie n flux, n sistem biparametric FL1/FL2 (fluorescena verde FITC/fluorescena roie PI) prin tehnica cadranelor. IV.2.7.8. Determinarea activitii caspazelor -8 i -3 Determinarea activitii caspazelor -3 i -8 s-a realizat cu reactivi coninnd inhibitori specifici de caspaze marcai cu fluorocromi, precum reactivii CaspGlow (FITC-DEVD-fmk pentru caspaza -3 i FITC-IETD- fmk pentru caspaza -8). Mod de lucru: 100 l de suspensie celular (105 celule) au fost transferai ntr-un tub de analiz pentru citometrie n flux i incubai cu 1 l FITC-DEVD-fmk pentru caspaza -3 sau 1 l FITC-IETD-fmk pentru caspaza -8, timp de 1h la 37 C n atmosfer de 5% CO2. Dup incubare, suspensia celular a fost splat de trei ori cu 0,5 ml tampon de splare furnizat n kit i celulele au fost analizate prin citometrie n flux utiliznd fie canalul FL1 (pentru fluorescena n verde) fie canalul FL2 (pentru fluorescena n rou), n funcie de fluorescena reactivului folosit. IV.2.7.9. Determinarea semnalului de antifagocitoz CD47 ( dont eat me) Mod de lucru: n vederea determinrii semnalului de antirecunoatere CD47, 100 l de suspensie celular (105 celule) n tampon fosfat salin (PBS: 10 mM Na2H PO4, 1,8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl) cu 1% albumin seric uman i 0,1% NaN3 au fost incubai cu 10 l anti-CD47-PE (phycoerythrin) sau cu IgG1-PE pentru martorul negativ (martor de verificare a marcrii nonspecifice datorat eritrofiliei fa de anticorpi), la temperatura camerei i la intuneric timp de 30 minute. Celulele au fost apoi splate de trei ori i resuspendate n 0,5 ml PBS dup care au fost analizate prin citometrie n flux n sistem monoparametric FL2 (fluorescena roie a PE). IV.2.8. METODE DE ANALIZ PE BAZ DE MICROSCOPIE Pentru studiul microscopic, s-au utilizat metode de analiza prin microscopie n lumin direct i analiza de microscopie electronic.

IV.2.8.1. Analiza prin microscopie n lumin direct Analiza prin microscopie n lumin direct s-a realizat cu ajutorul unui microscop optic inversat model MCX1600 fabricat n Austria i camera Micro Publisher RTV 3 mp cu rcire. Mod de lucru: Pentru vizualizare, 100 l de suspensie celular (106 celule) de analizat s-au transferat ntr-o plcu de cultur cu godeuri i s-au diluat prin adugarea a 900 l PBS. Celulele s-au vizualizat n suspensie. IV.2.8.2. Analiza prin microscopie electronic a) Microscopia electronic de scanare sau baleiaj (Scanning Electron Microscopy SEM) Mod de lucru: Eritrocitele au fost fixate pentru 4 h cu o soluie de 1,25%

glutaraldehid n tampon cacodilat de sodiu 0,1 M pH 7,2 i post-fixate timp de 4 h n tetraoxid de osmiu 1% n acelai tampon. Suspensiile au fost apoi filtrate pe filtre Anodisc de 0,2 , deshidratate n etanol, uscate cu dioxid de carbon prin metoda punctului critic dup care a avut loc vizualizarea probelor la SEM. b) Microscopia electronic de transmisie (Transmission Electron Microscopy TEM) Mod de lucru: Eritrocitele au fost supuse unei fixri iniiale cu glutaraldehid 2,5% n tampon cacodilat 0,14 M timp de 30 de minute. Celulele au fost apoi postfixate timp de 15 minute n tetraoxid de osmiu 1%. Dupa osmificare, probele au fost colorate n bloc cu uranil acetat 2% timp de 15 minute, deshidratate, incluse n Epon 812 i polimerizate la 60 C timp de 48 de ore. La final, eritrocitele au fost secionate la ultramicrotom la 60 nm i contrastate cu acetat de uranil i citrat de plumb. Microscopia electronic de transmisie s-a realizat cu un microscop Carl Zeiss EVO LS15 i Philips EM 2008S, iar microscopia electronic de scanare s-a realizat cu diferite microscoape de baleiaj, respectiv: Carl Zeiss EVO LS15, Carl Zeiss Sigma VP i JEOL35 CF. CAPITOLUL V. CERCETRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ N PATOLOGIA ERITROCITULUI

O prim direcie de cercetare abordat n cadrul prezentei teze de doctorat a fot investigarea existenei unui posibil fenomen de apoptoz n patologia eritrocitului. Am luat n studiu dou boli, i anume boala Gaucher i policitemia vera.

n cazul bolii Gaucher, bazndu-ne pe cunotinele actuale i pe faptul c aceste procese nu au fost nc investigate n aceast boal, am emis ipoteza c eritrocitele pot avea proprieti anormale ceea ce poate favoriza i accelera fagocitarea lor. Cercetrile noastre au vizat un studiu de caracterizare prin citometrie n flux i tehnici complementare de microscopie electronic de baleiaj, pentru investigarea unor biomarkeri de apoptoz eritrocitar posibil implicai ntr-o apoptoz accelerat avnd drept consecin direct un mecanism de eritrofagocitoz masiv i ca urmare apariia anemiei. Au fost luai n studiu 7 pacieni, numerotai cu G1 pn la G7 i diagnosticai cu boala Gaucher de tip 1. Pacienii G6 i G7 au fost analizai att nainte ct si dup tratament. Rezultatele obinute pot fi sintetizate astfel: Analiza prin citometrie n flux a artat modificri morfologice semnificative ale eritrocitelor Gaucher n cazul pacienilor netratai (Figura 40). Valorile pentru XGeoMean (cell side scatter) proporionale cu diametrul celular, au variat de la 157 (pacientul G2) la 354 (pacientul G6a) comparativ cu valorile eritrocitelor normale, i.e. 313 28. n aceai manier, valorile pentru YGeoMean, valoare proporional cu granularitatea intern, au variat de la 213 (pacientul G2) la 301 (pacientul G4) comparativ cu valorile eritrocitelor normale, i.e. 298 25. Dup un tratament de nou luni cu enzim de substituie aceste modificri morfologice nu au mai fost observate la pacienii G6 i G7, aa cum se observ i n Figura 40 (G6b i G7b). Analiza SEM a evideniat pentru toi pacienii luai n studiu, prezena a numeroase celule agregate i o mare varietate de eritrocite dismorfice care nu au fost gsite n eantioanele martor, confirmnd, prin urmare, datele obinute prin analiza de citometrie. Multe dintre celulele observate prezentau caracteristicile morfologice ale echinocitelor, schistocitelor, ovalocitelor i dacriocitelor (celule lacrimi), fiind observate i alte eritrocite cu forme foarte ciudate, inclusiv unele celule aparent cu trei fee asemntoare knizocitelor (Figura 43). Cu toate acestea, nu au fost gsite dacriocite la pacienii G4 i G5. Aceast tendin spre poikilocitoz nu a mai fost observat la nou luni dup nceperea ERT la pacienii G6 i G7.

Fig. 40. Reprezentarea bidimensional (A) i tridimensional (B) a analizelor dot-plot n sistem FSC/SSC, a eritrocitelor normale (N) i i a eritrocitelor Gaucher netratate (G1 la G5) i de la pacienii G6, G7 nainte (G6a-g7a) i dup (G6b-G7b) nou luni de tratament ERT (enzyme replacement therapy). Abcisa i x: forward scatter (dimensiunea celulei); ordonat i y: side scatter (densitatea celular); z: numrul de celule.

Fig. 43. Analiza prin microscopie electronic de baleiaj a unor forme de eritrocite dismorfice ntlnite n maladia Gaucher. Anumite forme au fost anterior descrise n eliptocitoza ereditar i n mielofibroza cu metaplazie mieloid ca: eliptocite sau ovalocite (11,16), dacriocite sau celule n lacrim (16,20), schistocite sau fragmente de RBCs (7,10,17), eritrocite n form de triunghi (9,21) knizocite (8, 19, 24), n form de casc (11), crenellate (6 i 7) sau alte forme (2,14,22,25).

n ceea ce privete gradul de desializare a glicoconjugatelor, nu s-a putut evidenia cu ajutorul lectinelor utilizate un fenomen de desialilare urmat de demascarea de resturi de -galactozil care s induc capturarea hematiilor de ctre macrofagele splenice, dei, teoretic, aceasta desialilare ar fi fost perfect justificabil. Analiza prin citometrie n flux a evideniat

MFI-uri identice, att pentru hematiile martor ct i pentru hematiile pacienilor atini de boala Gaucher. Rezultatele obinute din analiza viabilitii celulare a hematiilor n boala Gaucher au evideniat la toi pacienii o descretere a MFI pentru calcein (Means of Fluorescence Intensity), ceea ce se traduce printr-o scdere a viabilitii celulare. Aceast descretere a variat n procente de la 8% (Pacientul G5) la 42% (Pacientul G3) cu o medie de 22%. Aceste rezultate pot fi explicate prin pierderea calceinei intracelulare datorit permeabilizrii membranelor sau chiar perforrii acestora aa cum se evideniaz n Figura 44.

Fig. 44. A: Suprapunerea histogramelor (un singur parametru) de determinare a activitii esterazice (testul de viabilitate celular cu Calcein-AM) a eritrocitelor normale (N) i a eritrocitelor Gaucher (G) provenind de la pacientul G4. MFI-Mean de fluorescen. X: FL1 n sistem logaritmic, reprezint fluorescena Calceinei, produsul de clivare al Calcein-AM. Y: numrul relativ de celule. B: Analiza prin microscopie electronic de baleiaj a eritrocitelor Gaucher ce prezint membrana perforat.

Analiza comparativ a expresiei antigenului CD47 pe suprafaa hematiilor Gaucher a artat o diminuare semnificativ a valorii MFI, aceasta variind ntre 1% (Pacientul G6) i 26% (Pacientul G3). n plus, aa cum se prezint i n Figura 47 pentru pacientul G7, s-a observat o mare diversitate n expresia pe suprafaa celular a receptorului CD47 evideniind din acest punct de vedere mai multe subpopulaii. Proporia ntre 2 dintre acestea, ex regiunile M1 si M2 au prezentat o descretere dramatic a regiunii cu expresie mare a CD47 i o cretere a regiunii care conine hematii cu un numr redus de receptori CD47, celule susceptibile (prin dispariia semnalului Dont eat me) de a fi fagocitate, genernd astfel o fagocitoz accelerat urmat de anemia cunoscut i caracteristic acestei boli.

Fig. 47: Analiza prin citometrie n flux a receptorului de membran CD47 (dont eat me) de la eritrocite normale (N) i respectiv eritrocite Gaucher provenind de la pacientul G7. X: FL-2 n sistem logaritmic reprezint fluorescena anticorpului anti-CD47-PE; Y: numrul relativ de celule. MFI: Mean de fluorescen.

n ceea ce privete sindroamele proliferative, am luat n studiu boala policitemia vera, propunndu-ne ca plecnd de la cunotinele actuale s caracterizm i s investigm eritrocitele mature provenind de la bolnavi cu policitemia vera presupunnd existena unui mecanism de blocare a morii programate la acest nivel, ceea ce ar putea conduce la o durat de via mult mai mare a acestora i n consecin la creterea volumului total de eritrocite circulante. Rezultatele obinute pot fi sintetizate astfel: Analiza direct a eritrocitelor prin citometrie n flux n sistem FSC/SSC, respectiv talie/coninut celular a evidenit prezenta unor modificri de morfologie, aa cum se poate constata din comparaia cu martorul sau cu eritrocitele provenind de la un pacient cu policitemia vera sub tratament (Figura 48). Valorile pentru XGeoMean i YGeoMean au fost mult mai mici n cazul hematiilor de policitemia vera, n special pentru YGeoMean (densitate celular) indicnd probabil o cantitate mai mic de hemoglobin

(YGeoMean=196,87), cantitate ce ncepe s creasc dup tratament (YGeoMean=222,58).

Fig. 48. Analiza modificrilor de morfologie n sistem FSC/SSC. M-T0: Martor; Eritrocitele de policitemia vera nainte (PV-T0) i dup tratament (PVt-T0). Abscisa: forward scatter (dimensiunea celulei); ordonat: side scatter (densitatea celular).

Prin analiza de microscopie optic morfologia hematiilor n policitemia vera avea aparent forma discoidal, ns un studiu mai fin, de detaliu, obinut prin microscopie de scanare, a demonstrat, dup cum se observ n Figura 51, n special n Figura 51B, c ntalnim morfologii ce se abat de la forma clasic, prezentnd forma de cup sau stomatocite.

Fig. 51. Analiza prin microscopie electronic de scanare a eritrocitelor de policitemia vera. Avedere de ansamblu; B-detalii de morfologie.

Ne-am propus totodat, s evalum cu ajutorul lectinelor specifice de acid sialic i de resturi de -Gal, gradul de sialilare al eritrocitelor provenind de la bolnavi de policitemia vera nainte i dup tratament ca baz eventual de identificare a unui marker de diagnostic. Evaluarea s-a facut cu lectina WGA-FITC specific de -GlcNAc i de -NeuAc; MAAFITC specific de -2,3-NeuAc; SNA-FITC specific pentru -2,6-NeuAc i RCA-FITC specific pentru resturi de -Gal. Rezultatele obinute sunt prezentate n Figura 52 sub form de histograme comparative, prin suprapunere pentru fiecare lectin n parte. Dei teoretic ar fi trebuit sa avem de-a face cu o hipersialilare, care ar fi explicat meninerea prelungit n circulaie a acestor eritrocite, rezultatele au fost contrare. Astfel, n cazul lectinei WGA-FITC s-a putut observa o cantitate de acid sialic comparativ cu martorul (MFI=122,8) mult mai scazut, att n cazul eritrocitelor de policitemia vera nainte (MFI=86,3) ct i dup tratament (MFI=90,67). Comparativ, n cazul legrii lectinei MAA-FITC am observat c eritrocitele de policitemia vera provenind de la pacieni netratai au o capacitate foarte redus de legare a lectinei (MFI=23,05), care crete (MFI=36,77) dup tratament, ceea ce este mult mai apropiat de capacitatea de fixare a eritrocitelor martor (MFI=47,88).

Lectina SNA-FITC s-a fixat de asemenea relativ mai puin pe eritrocitele netratate (MFI=4,86) fa de cele tratate (MFI=5,52), Mean-ul de fluorescen fiind mult mai apropiat de cel al martorului (MFI=5,65). Dei normal, n urma aparentei desialilri dovedit prin fixarea lectinelor WGA, MAA i SNA, ar fi trebuit ca lectina din RCA sa se fixeze mai mult pe eritrocitele de policitemia vera netratate, MFI de 61,7 fiind mai apropiat de martor (76,73) dect MFI-ul pentru eritrocitele de PV dup tratament (46,31), acest fapt ramnnd o enigm.

Fig. 52. Analiza prin citometrie n flux a histogramelor de legare pentru lectinele WGA-FITC, MAA- FITC, SNA-FITC, RCA- FITC pe eritrocite de policitemia vera nainte de tratament (PV) i dup tratament (PVt) n comparaie cu eritrocite martor (M). X: FL1 n sistem logaritmic, reprezint fluorescena lectinei marcat cu FITC. Numerele reprezint MFI (Media Intensitii de fluorescen) Y: numrul relativ de celule.

Aplicarea testului de viabilitate celular cu Calcein - AM, aa cum se observ din Figura 53, a demonstrat o viabilitate superioar, aprroape dubl, a eritrocitelor de la pacienii cu policitemia vera fa de normal, exprimat n valoarea intensitii de fluorescen, MFI=160 fa de MFI=81 pentru martor. S-a e observat dup tratament o lejer diminuare a acesteia, MFI ajungnd la 156. Aceast activitate esterazic crescut n cazul hematiilor de la bolnavi cu policitemia vera ar putea fi o eventual cauz a unei durate de via mai mari, ceea ce ar determina i o cretere a hematocritului circulant.

Fig. 53. Determinarea prin citometrie n flux a activitii esterazice (testul de viabilitate celular cu Calcein-AM) a eritrocitelor martor (M-T0) i a eritrocitelor de policitemia vera nainte (PV-T0) i dup tratament (PVt-T0). X: FL1 n sistem logaritmic, reprezint fluorescena Calceinei, produsul de clivare al Calcein-AM. Y: numrul relativ de celule.

CAPITOLUL VI. CERCETRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ I MODULAREA ACESTUIA N CONSERVAREA SNGELUI DESTINAT TRANSFUZIEI PENTRU AMELIORAREA CALITII ACESTUIA n cadrul acestei direcii de cercetare abordate de noi, ne-am propus ntr-o prim etap s studiem comparativ calitatea hematiilor aplicnd att criteriile clasice de studiu, respectiv determinarea cantitii de ATP i hemoliza din mediul de conservare, ct i noi criterii bazate pe analiza prin citometrie n flux, respectiv analiza modificrilor de morfologie n sistem FSC/SSC, evidenierea externalizrii fosfatidilserinei i determinarea viabilitii hematiilor. Dozarea ATP-ului s-a realizat pe snge conservat timp de 6 sptmni. Dup cum se observ n curba din Figura 56 cantitatea de ATP descrete progresiv ajungnd de la concentraia iniial de 97 g/dL la o concentraie de 30 g/dL dup 6 sptmni (ceea ce reprezint doar aproximativ o treime din concentraia iniial). Paralel cu dozarea ATP-ului s-a urmrit gradul de hemoliz din pungile de snge ca expresie a nivelului de moarte celular a hematiilor. S-a constatat c gradul de hemoliz n primele dou sptmni este foarte sczut, aproape inexistent n prima sptmn i crete progresiv n sptmnile 3 i 5, cnd ajunge la aproximativ 0,5%. Hemoliza devine mai mare n sptmna 5-6 de conservare, nedepind 1%, conform graficului din Figura 57, rmnnd deci moderat i conform cu standardele admise n practicile transfuzionale.

Fig. 56. Curba de evoluie a cantitii de ATP din eritrocitele stocate timp de 6 sptmni n condiiile de conservare practicate n centrele de transfuzii.

Fig. 57. Curba de evoluie a gradului de hemoliz n timpul conservrii hematiilor timp de 6 sptmni n condiiile practicate n centrele de transfuzii.

Dup aplicarea criteriilor clasice, am utilizat pentru determinarea calitii hematiilor conservate i noile criterii bazate pe analiza prin citometrie n flux. Aa cum se observ n Figura 58, analiza n sistem FSC/SSC (talie celular/densitate) pe durata conservrii sngelui timp de 6 sptmni a artat o diminuare important a taliei celulare i o cretere a densitii acestora, celulele trecnd de la forma discoidal la cea de sferoechinocite i sferocite netede. La sfritul celor 6 sptmni fenomenul a fost accentuat, predominnd sferocitele netede. Analiza modificrilor de morfologie prin citometrie n flux s-a dovedit astfel un test simplu i extrem de sensibil care poate da informaii importante despre calitatea hematiilor conservate, citogramele biparametrice fiind n concordan cu analiza prin microscopie de scanare, putnd n acest fel s substituie o metod mult mai laborioas. Ea prezint n acelai timp avantajul de a fi statistic i cuantificabil prin analiza XGeoMean i YGeoMean.

Fig. 58. Analiza bidimensional (A) i tridimensional (B) n sistem FSC/SSC a hematiilor conservate n mediu SAGM timp de 6 sptmni. Abcisa i x: forward scatter (dimensiunea celulei); ordonat i y: side scatter (densitatea celular, granularitate i refractivitate); z: numrul de celule.

Aceste analize au fost n concordan cu determinarea gradului de externalizare de fosfatidilserin, care a rmas discret, nedepind 3,89 i 6,56% la 3 i 6 sptmni de conservare, iar n ceea ce privete media viabilitii fa de martorul iniial, s-a putut observa o pierdere a activitii esterazice dup 3 i 6 sptmni, ceea ce semnific o mbtrnire celular, dup cum se poate observa n figura 63.

Fig. 63. Studiul comparativ al viabilitii (test citofluorimetric n FL1 cu Calcein-AM) hematiilor conservate n mediul SAGM timp de 3 sptmni (3S) i 6 sptmni (6S). T: hematii martor la momentul prelevrii i stocrii. Numerele reprezint MFI (Mean of fluorescence intensity). X: FL1 n sistem logaritmic, reprezint fluorescena Calceinei, produsul de clivare al Calcein-AM. Y: numrul relativ de celule.

VI.1.2. NCERCRI DE AMELIORARE A STOCRII SNGELUI PRIN UTILIZAREA DE INHIBITORI DE APOPTOZ n contextul stadiului de cunoatere n domeniu, odat cu evidenierea morii eritrocitare ca fenomen de apoptoz, s-a demonstrat i posibilitatea blocrii acesteia cu inhibitori de apoptoz (Bratosin et. al., 2001a), ceea ce ne-a condus la ideea ameliorrii condiiilor de stocare prin utilizarea acestor inhibitori, cu posibilitatea ulterioar de obinere a unor noi medii de conservare pentru centrele de transfuzii. Pentru aceasta, am testat prin citometrie n flux efectul inhibitorilor de caspaze (Ac-DEVD-CHO, Ac-YVAD-fmk) i calpaine (Ac-Leu-Leu-Arg-CHO (leupeptin), cu o concentraie variind ntre 200 M si 3 mM. Analiza n sistem FSC/SSC (talie celular/densitate), a artat c inhibitorii utilizai reuesc s mpiedice modificarea morfologiei celulare, ceea ce semnific inhibarea enzimelor implicate n apoptoz, tiut fiind c modificarea morfologiei hematiilor se datoreaz alterrii citoscheletului prin atac enzimatic. Dup cum se observ n Figura 67, nivelul de externalizare a resturilor de fosfatidilserin a fost mai mic, fiind inhibat n prezena inhibitorilor de apoptoz, att pentru caspaze (47,5% i 30,5%) ct i pentru calpain (56%) fa de 74,9% pentru hematiile mbtrnite n absen de inhibitori.

Fig. 67. Analiza comparativ prin citometrie n flux a gradului de externalizare de fosfatidilserin determinat cu Anexin V-FITC, a hematiilor conservate n mediu SAGM n absena (b) i n prezen de inhibitori de apoptoz: Ac-DEVD-CHO (c), Ac-YVAD-fmk (d), leupeptin (e) i amestec Ac-YVAD-fmk + leupeptin (f). Hematiile la momentul To al conservrii (a). Conservarea a avut loc la 37C, mbtrnire n sistem accelerat, timp de 4 zile. Concentraia de inhibitori a fost de 3mM pentru fiecare inhibitor. FL1: fluorescena Anexinei V-FITC. FL2: autofluorescena rosie.

Se observ de asemenea c mecanismul de moarte eritrocitar a fost mult mai bine inhibat prin utilizarea unui amestec pentru ambele sisteme enzimatice implicate n degradarea eritrocitului (sistemul caspaze/calpain), respectiv prin utilizarea unui amestec n concentraii egale de Ac-DEVD-CHO+ leupeptin, unde procentul de celule moarte este de doar 23%. Utilizarea unor concentraii crescute de inhibitori nu a mrit efectul protector i nu a mpiedicat moartea hematiilor. Dintre toi inhibitorii utilizai, s-a constatat c Ac-YVAD-fmk inhib mai bine modificrile de morfologie celular fa de Ac-DEVD-CHO, ceea ce semnific blocarea caspazei 8 iniiatoare. Protecia a fost crescut n prezena amestecului n pri egale a acestui inhibitor cu leupeptin. IV.1.4. STUDIUL ACIUNII RADIAIILOR LASER ASUPRA VIABILITII ERITROCITELOR STOCATE N MEDIU SAGM n scopul ameliorrii condiiilor de conservare a eritrocitelor destinate transfuziei am ncercat de asemenea o rentinerire a acestora prin aplicarea unor tehnici de iradiere cu laser de joas frecven. Experimentele s-au efectuat pe snge provenind de la 2 donatori iar analiza calitii hematiilor s-a bazat pe aceleai teste de citometrie n flux descrise la Capitoul IV, derulate pe o perioad de timp de pn la 3 sptmni. Figura 68 i Figura 69 prezint, de o manier comparativ, valorile obinute pentru XGeoMean i YGeoMean rezultate din analiza n sistem FSC/SSC a eventualelor modificri de morfologie (FSC) sau de lejera hemoliz (SSC) survenite prin iradierea minipungilor de stocare a hematiilor. Am putut constata c fa de martorul de hematii la momentul T0 i fa de martorul de conservare fr iradiere (a1 i b1, pentru ambii donatori) hematiile iradiate nu au prezentat variaii semnificative ale XGeoMean-ului, deci de morfologie, i nici nu au suferit o hemoliz importan, plednd astfel pentru efectul benefic, de rentinerire al radiaiilor laser asupra sngelui conservat i iradiat dup 21 zile.

Fig. 68. Variaiile XGeoMean i YGeoMean pentru probele de hematii provenind de la donatorul 1 conservate n mediu SAGM timp de 3 sptmni i iradiate cu laser de joas frecven.

Fig. 69. Variaiile XGeoMean i YGeoMean pentru probele de hematii provenind de la Donatorul 2 conservate n mediu SAGM timp de 3 sptmni i iradiate cu laser de joas frecven.

S-a observat de asemenea un efect benefic, de rentinerire, al iradierii laser, conform Figurii 71, unde n sistemul de suprapunere a histogramelor s-a constatat creterea viabilitii celulare n cazul eantioanelor iradiate fa de martor (procent de celule viabile de aproximativ 97 % i respectiv 98,8% fa de 66% pentru martor).

Fig. 71. Determinarea viabilitii cu Calcein-AM a hematiilor neiradiate (M) i iradiate (b9 i b19) ale donatorului 2. : lungimea de und a iradierii; M: regiunea de celule fluorescente cu membrana celular intact (celule vii) i M2: regiunea de celule nefluorescente cu membrana celular alterat (celule moarte). Abscisa: intensitatea fluorescenei verzi a calceinei (FL-1) n sistem logaritmic. Ordonat: numrul de celule.

CAPITOLUL VII. APLICAII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR NUCLEATE N TOXI- I ECOTOXICOLOGIE Cercetrile ntreprinse de noi s-au focalizat cu prioritate pe identificarea efectelor produse de nanomateriale i pe stabilirea concentraiilor de risc pentru sntate i mediu prin noi metode de investigare celular bazate n special pe tehnici de citometrie n flux corelate cu tehnici de microscopie optic i electronic. Analiza prin citometrie n flux a artat modificri morfologice semnificative a eritrocitelor nucleate incubate timp de 24 ore n supernatantele saline ale diferitelor nanomateriale luate n studiu (P1=Meso-tetra-tolil-porfirin; P2=Sol-gel_Meso-tetra-tolil-porfirin, cataliz acidobazic, HCl:TEOS=0,02:1; NH3: TEOS=0,0142:1; P3=Zn (II) -meso-tetra-piridil-porfirin; P4=Sol-gel_Zn(II)-meso-tetra-piridil-porfirin, cataliz acid; P5=Sol-gel_Zn (II) -meso-tetrapiridil-porfirin, cataliz acido-bazic; P6=Meso-tetra-(3,4-dimetoxi-fenil)-porfirin meso5,10,15,20-tetra(3,4dimetoxi-fenil) porfirin; P7=Sol-gel_Meso-tetra-(3,4-dimetoxifenil)-

porfirin, cataliz acid; P8=Sol-gel_Meso-tetra-(3,4-dimetoxifenil)-porfirin, cataliz acidobazic) comparativ cu eritrocitele nucleate incubate doar n soluie salin izoton (T24h), martorul de control. Imaginile de microscopie optic prezentate n Figura 75 au confirmat n ntregime datele obinute prin analiza citometric n sistem FSC/SSC i au artat c modificrile morfologice ale eritrocitelor nucleate au fost asociate cu contracia i modificarea formei celulelor (cell shrinkage) demonstrate prin diminuarea parametrului FSC i creterea parametrului SSC, una dintre trsturile caracteristice ale fenomenului de apoptoz. Imaginile microscopice ale eritrocitelor nucleate incubate n supernatantele obinute prin preincubarea nanomaterialelor n soluie salin fiziologic au evideniat schimbri morfologice ce nu sunt uniforme pentru toate probele, nici ca intensitate i nici ca manier de manifestare, dovedind faptul c ele reflect n mod corect toxicitatea probabil a diferitelor probe. Modificarea morfologiei elipsoidale la forme rotunde, ne-a dus cu gndul la un fenomen de apoptoz. Aceste modificri sunt foarte numeroase n cazul probelor P2 i P3, iar atunci cnd sunt nsoite de un aspect transparent, dovedesc c aceste celule sunt moarte.

Probele P4 i P7 au indus un aspect morfologic neateptat, comparabil cu o roat de biciclet, datorat unui fenomen de hemoliz intens. Foarte interesant, n proba P5, nanomaterialul corespunztor nu a modificat de aceeai manier structura celular, ci a produs, i mai bizar, un fel de mega pori sau guri. Acelai fenomen am putut observa i la proba P8, dar mai puin evident.

Fig. 75. Analiza modificrilor de morfologie prin microscopie optic a eritrocitelor nucleate normale (To i T24h) i expuse aciunii nanomaterialelor (P1-P8) la 0,008 g/ml. Sgeata neagr: eritrocite cu mega pori sau guri. Sgei albe: eritrocite n form de roi de biciclet.

Pentru o analiz detaliat a modificrilor de morfologie observate prin microscopie optic s-a realizat att o analiz prin microscopie de scanare (SEM) ct i microscopie electronic de transmisie (TEM). ntr-o prim etap ne-am propus s comparm efectele produse de cele trei tipuri de nanoparticole P1, P3 i P6. Modificrile de morfologie evideniate prin analiza SEM au fost urmatoarele: - Expunerea eritrocitelor nucleate la aciunea a 0,008 g/ml de prob P1 a condus la apariia unor pori cu mrimi ce au variat ntre 0,71 m i 2,22 m precum i la reliefarea nucleelor rmase central, probabil datorit unui fenomen de hemoliz. Analiza din Figura 78, obinut prin examinarea eritrocitelor nucleate expuse la aciunea aceleiai probe (P1), a confirmat hemoliza prin existena a numeroase nuclee proeminente (Figura 78 a i b) precum i existena porilor aa cum se prezint n detaliu n Figura 78 (d, e i f). De asemenea, s-a observat aderarea puternic a nanoparticolelor la suprafaa celular.

Fig. 78. Analiza prin microscopie electronic de baleiaj a modificrilor de morfologie pentru eritrocitele nucleate expuse aciunii probei P1(Meso-tetra-tolil-porfirin) la 0,008 g/ml.

- Modificrile de morfologie induse de aciunea probei P3 au fost mult mai profunde, nsoite de schimbarea formei elipsoidale la celule rotunde i de o puternic ataare a nanoparticolelor la suprafaa celular (Figura 79).

Fig. 79. Analiza prin microscopie electronic de baleiaj a modificrilor de morfologie pentru eritrocitele nucleate expuse aciunii probei P3 (Zn (II) -meso-tetra-piridil-porfirin) la 0,008 g/ml.

- Sub efectul produs de P6 la 0,008 g/ml, s-au confirmat observaiile noastre de microscopie optic, respectiv apariia unui aspect de roi de biciclet (Figura 80 a i b) care de fapt se datoreaz unei puternici hemolize cu pstrarea poziionrii centrale a nucleului, fapt evideniat foarte clar prin analiza SEM. De asemenea, s-au confirmat mega-porii observai, precum i ataarea nanoparticolelor la suprafaa celular. Lund n comparaie derivaii de nanoparticole, respectiv probele P2, P4 i P5, am observat efectul net toxic al probei P2 cu modificarea formei elipsoidale a eritrocitelor la forme rotunde, precum i aderarea (n toate cazurile) a nanoparticolelor la suprafaa eritrocitelor nucleate.

Fig. 80. Analiza prin microscopie electronic de baleiaj a modificrilor de morfologie pentru eritrocitele nucleate expuse aciunii probei P6 (Meso-tetra-(3,4-dimetoxi-fenil)-porfirin meso5,10,15,20-tetra(3,4dimetoxi-fenil) porfirin) la 0,008 g/ml.

Pentru evidenierea modificrilor de ultrastructur, eritrocitele nucleate martor i cele asupra crora s-a exercitat efectul toxic al nanoparticolelor, au fost analizate prin microscopie electronic de transmisie, n special pentru a se confirma (sau infirma) existena mega-porilor observai anterior. Astfel, rezultatele obinute prin microscopie electronic de transmisie n sistem direct (fr includere i tiere n parafin) au evideniat sub efectul nanoparticolelor din proba P8, o condensare nuclear cu schimbarea poziiei acestuia, din centrul celulei spre periferie, umflarea mitocondriilor i localizarea lor lng membrana celular, probabil n vederea unei expulzri ulterioare sub form de corpi apoptotici precum i numeroase vacuole (Figura 84A). n Figura 84B i 84C, se poate observa un detaliu ultrastructural al unui megapor, cu talie de aprox. 500 nm, remarcndu-se pstrarea continuitii membranare n jurul acestuia.

Fig. 84. Evidenierea prin microscopie electronic de transmisie n sistem de analiz direct a porilor aprui n structura eritrocitelor nucleate sub aciunea nanoparticolelor (A i B); C reprezint detaliu de structur al unui por. Sgeata indic prezena mitocondriilor modificate la marginea celulei.

Observaiile obinute prin microscopie de transmisie efectuate pe seciuni de eritrocite nucleate nglobate n parafin i prezentate n Figura 85, ne-au furnizat detalii suplimentare ale modificrilor morfologice induse de diferitele tipuri de nanoparticole, respectiv schimbarea

formei elipsoidale la alte morfologii, inclusiv forma rotund (a, c, g, j), desprinderea nucleului de materialul trans-BM (TBM) n vederea expulzrii sub form de corpi apoptotici (c, d, f) i fragmentarea nucleului n vederea eliminrii sub form de corpi apoptotici (b i k).

Fig. 85. Evidenierea prin microscopie electronic de transmisie a principalelor modificri induse asupra eritrocitelor nucleate prin aciunea nanoparticolelor.

n ceea ce privete efectul nanomaterialelor asupra viabilitii eritrocitelor nucleate, aa cum se arat n Figura 86, numrul de celule viabile (regiunea M1) a sczut drastic ca o expresie a toxicitii nanomaterialelor n special pentru P3 (n jur de 31,5%) sau P2 (aproximativ 43,2%), comparativ cu populaia de eritrocite martor (aproximativ 94%). Posibilitatea obinerii de curbe cantitative doz-rspuns face din acest test, un test de toxicitate sau de eco-toxicitate, permindu-ne s determinm EC50. Pentru a investiga tipul de moarte celular indus de porfirine, am aplicat apoi un dublu marcaj cu Anexin V i Iodur de propidiu (PI), conform protocolului descris la Capitolul IV Materiale i Metode. Eritrocitele normale precum i cele incubate au fost analizate prin citometrie n flux pentru a observa expunerea la suprafaa celular de fosfatidilserin (PS) cu ajutorul fixrii de aceste resturi a Anexinei V-FITC i urmrindu-se n acelai timp permeabilitatea membranei prin marcare cu PI. Dup cum se poate observa n Figura 89, nanomaterialele pe baz de porfirine sau hibrizii lor au avut in vitro efecte extrem de toxice asupra eritrocitelor nucleate ntr-un mod dependent de doz, ceea ce permite calcularea EC50.

Fig. 86. Analiza comparativ a histogramelor de viabilitate obinute cu Calcein-AM pentru eritrocite normale nucleate (To i T24h) i expuse aciunii nanomaterialelor (P1-P8) la 0,008 g/ml. M1: regiunea de celule fluorescente cu membran celular intact (celule vii) i M2: regiune de celule nefluorescente cu membrana celular alterat (celule moarte). Abscisa: intensitatea fluorescenei verzi a calceinei (FL-1) n sistem logaritmic. Ordonat: numrul de celule.
80 70 % Celule moarte 60 50 40 30 20 10 0 0 0.0005 0.001 0.002 0.004 0.008 Concentratie (g/ml) T24h P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

Fig. 89. Cubele doz-rspuns de calcul a EC-50 conform cu procentul de eritrocite moarte determinate prin dublul marcaj Anexin V-FITC i iodur de propidiu. Abscis: concentraia de nanomateriale. Ordonat: % de celule moarte (celulele n apoptoz i necroz) obinut prin scderea din % de celule totale (100%) a % de celule viabile din cadranul stnga jos din analiza prin tehnica cadranelor a celulelor marcate cu Anexin V-FITC i Iodur de propidiu. Rezultatele noastre au demonstrat c eritrocitele nucleate pot reprezenta un model excelent de studiu, uor de folosit, fr costuri legate de cultivarea i de meninerea n cultur a celulelor eucariote.

De asemenea, rezultatele noastre au indicat pe de o parte faptul c sensibilitatea eritrocitelor nucleate la nanomateriale a crescut i mai mult, iar informaiile ar putea fi utile pentru dezvoltarea de teste rapide i cu pre sczut de ecotoxicitate. Totodat, s-a evideniatfaptul c apoptoza eritrocitar poate fi un biomarker ecotoxicologic eficient, capabil s furnizeze informaii semnificative referitoare la un stres de mediu, indiferent care este acesta. CONCLUZII GENERALE 1. Analiza eritrocitelor din boala Gaucher i din policitemia vera prin citometrie n flux n sistem FSC/SSC i tehnici de microscopie electronic au evideniat pentru prima dat n literatur modificri de morfologie importante ce se abat de la forma clasic discoidal. 2. Reducerea viabilitii eritrocitelor n boala Gaucher evideniat prin citometrie n flux cu Calcein-AM asociat i cu o expresie redus a receptorului CD47, marker de anti-fagocitoz, poate fi explicaia unei eritrofagocitoze masive i implicit a anemiei caracteristice acestei boli. 3. Studiul citofluorimetric cu ajutorul unor lectine specifice de acid sialic a evideniat de asemenea pentru prima dat un grad redus de sialilare a glicoconjugatelor din membrana eritrocitelor de policitemia vera, care ns revine aproape de normal dup tratament, confirmnd studii ntreprinse prin spectrometrie de mas/cromatografie n faz gazoas, rezultat ce ar putea constitui un test de depistare i diagnostic uor de aplicat. 4. Viabilitatea mrit a eritrocitelor din policitemia vera, aproape dubl, poate cauza o durat mai lung de circulaie a acestora generatoare de hematocrit crescut, care se completeaz cu un nivel de externalizare normal al resturilor de fosfatidilserin explicnd de asemenea hematocritul crescut. 5. Procentajul de celule caspaz-3 activ mai mare la eritrocitele din policitemia vera, att nainte ct i dup tratament, demonstreaz ncercarea organismului de restabilire a unui hematocrit normal prin activarea mecanismului propriu de apoptoz n vederea asigurrii homeostaziei organismului. 6. Aplicarea noilor criterii de viabilitate a hematiilor, bazate n principal pe utilizarea citometriei n flux, au permis o evaluare comparativ cu criteriile clasice referitor la conservarea sngelui destinat transfuziei n mediu SAGM timp de 6 sptmni. Acest studiu a demonstrat n dinamica conservrii apariia leziunilor de conservare i implicit

necesitatea imperioas de ameliorare a condiiilor de prelevare i stocare a hematiilor n centrele de transfuzii. 7. Noile criterii aplicate se dovedesc metode simple, statistice i eficiente de apreciere a calitii sngelui conservat n centrele de transfuzii ce ar putea fi introduse pentru testarea pungilor de snge nainte de practicarea actului transfuzional, n vederea eliminrii riscurilor transfuzionale, n special la pacienii politransfuzai. 8. Utilizarea inhibitorilor clasici de apoptoz (Ac-YVAD-fmk pentru caspaza-8, DEVD-CHO pentru caspaza-3 efectoare dar i leupeptina pentru calpaine) adugai n mediul clasic SAGM a condus la blocarea fenomenului de apoptoz eritrocitar, dovedit prin conservarea morfologiei discoidale i a blocrii fenomenului de externalizare a fosfatidilserinei, rezultate ce deschid perspectiva unor cercetri aprofundate pentru modularea morii hematiilor n sistemele de conservare a sngelui i n special a identificrii unor inhibitori de origine vegetal acceptai n terapia transfuzional. 9. Supunerea eritrocitelor unui tratament cu laser de joas frecven a condus, pe baza aplicrii noilor criterii prin citometrie n flux, la creterea spectaculoas a viabilitii hematiilor, efectele de ntinerire a hematiilor conservate n mediu SAGM fiind proporionale cu doza i timpul de iradiere, cea mai bun practic dovedindu-se iradierea sngelui chiar nainte de transfuzie. 10. Cercetrile noastre bazate pe exploatarea unei metode originale de apreciere a viabilitii hematiilor umane asociat cu metoda de studiu ecotoxicologic stress on stress ne-au condus la stabilirea condiiilor pentru elaborarea unui test simplu i sensibil de depistare a autotransfuziei la sportivii de performan. 11. Nanomaterialele porfirinice sau pe baz de porfirine au demonstrat in vitro un efect nociv asupra eritrocitelor nucleate prin inducerea unui fenomen de apoptoz iar modificrile tuturor parametrilor eritrocitari investigai sunt puternic corelate cu creterea concentraiei de nanoparticole sau tipul de nanomaterial, ceea ce permite calcularea concentraiei EC50 12. Determinarea viabilitii eritrocitelor nucleate prin citometrie n flux precum i discriminarea morii celulare ar putea oferi un instrument rapid i precis de analiz pentru evaluarea in vitro a rspunsurilor biologice la aciunea nanoparticulelor, pentru evaluarea toxicitii i biosecuritii nanomaterialelor precum i pentru determinarea nanotoxicitii mediului, dar i pentru studiul aciunii unor ali factori poluani.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV 1. Benga G., Popescu O., Pop V.I., Holmes R. P., P-(Chloromercuri) benzenesulfonate binding by membrane proteins and the inhibition of water transport in human erythrocytes, Biochemistry, 25, 1535-1538, 1986a. Benga G., Water channel proteins (later called aquaporins) and relatives: past, present and future (Review), IUBMB Life, 61, 112-133, 2009. Beutler E., Back to the future in RBCs preservation, Transfusion, 40, 893-895., 2000. Bratosin D., Estaquier J., Petit F., Arnoult D., Quatannens B., Tissier J.P., Slomianny C., Sartiaux C., Alonso C., Huart J.J., Montreuil J., Ameisen J.C., Programmed cell death in mature erythrocytes: a model for investigating death effector pathways operating in the absence of mitochondria, Cell. Death. Differ., 8,1143-1156, 2001a. Bratosin D., Estaquier J., Ameisen J.C., Montreuil J., Molecular and Cellular Mechanisms of Erythrocyte Programmed Cell Death: Impact on Blood Transfusion, Vox Sanguinis 83, 307-310, 2002a. Bratosin D., Estaquier J., Slomianny C., Tissier J-P., Quatannes B., Bulai T., Mitrofan L., Marinescu A., Trandaburu I., Ameisen J-C., Montreuil J., On the evolution of erythrocyte programmed cell death: apoptosis of Rana esculenta nucleated red blood cells involves cysteine proteinase activation and mitochondrion permeabilization, Biochimie, 86, 183-193, 2004. Bratosin D., Mitrofan L., Palii C., Estaquier J., Montreuil J., A novel fluorescence assay using calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability and ageing, Cytometry A, 66A, 78-84, 2005b. Griffitt R.J., Weil R., Hyndman K.A., Denslow N.D., Powers K., Taylor D., Barber D.S., David S., Exposure to copper nanoparticles causes gill injury and acute lethality in zebrafish (Danio rerio), Environ. Sci.Technol. 41, 8178-8186, 2007. Hess J.R., Conventional blood banking and blood component storage regulation: opportunities for improvement, Blood. Transfus., 8, Suppl 3, s9-s15, 2010. Lang, F., Gulbins E., Lerche H. , Huber S. M., Kempe D.S., Fller M., Eryptosis, a Window to Systemic Disease, Cell. Physiol. Biochem., 22, 373-380, 2008.

2. 3. 4.

5.

6.

7.

8.

9. 10.

LISTA LUCRRILOR TIINIFICE REALIZATE N CADRUL TEZEI DE DOCTORATcuprinde 12 titluri

ANEXA NR.1 cuprinde List Abrevieri