BIOLOGIE CELULAR

BIBLIOGRAFIE Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2008) MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, ediia a V-a, Editura Garland Science (New York & London).

1. 2. 3.

4.
5. 6.

Organite implicate n conversia energiei: mitocondria i sinteza ATP Organite implicate n sinteza i transportul macromoleculelor. Mecanismele de sortare i traficul vezicular intracelular Citoscheletul: filamentele de actin, microtubulii i filamentele intermediare Receptorii membranari i cile de semnalizare intracelular Controlul proliferrii celulare Rspunsul celular la factori de stres

Organite implicate n conversia energiei: Mitocondria i sinteza ATP

MITOCONDRIA
Organizare structural i funcii:
- Sinteza ATP - Apoptoza

Figure 1-30 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science 2008)

Consideraii generale
Mitocondriile sunt organite specializate n transformarea energiei ce rezult din catabolizarea substanelor nutritive ntr-o form adecvat reaciilor celulare, reprezentat de adenozin trifosfat (ATP). Denumirea de mitocondrie a fost introdus n 1903 de Carl Benda, pe baza morfologiei organitului, reprezentnd etimologic un cuvnt obinut prin reunirea a dou cuvinte din limba greac: mito (mitos) fir, a, filament i ondrion (chondrion), diminutiv de la ondro (chondros) grune, bucic, granul.

 Numrul mitocondriilor este relativ constant n diverse tipuri de celule fiind cuprins ntre 500 i 2000 mitocondrii per celul. n unele tipuri de celule mitocondriile constituie o fracie relativ mare din masa citoplasmatic (circa 22% n celula hepatic i 50% n celula miocardic). n general mitocondriile sunt localizate n apropierea structurilor intracelulare ce necesit un aport mare de ATP sau n apropierea unor surse de combustibil celular. Mitocondriile au dimensiuni cuprinse ntre 0,5 1 m; mrimea i forma depind de tipul celular.

Mitocondriile nu sunt organite statice. Mrimea i forma se pot modifica rapid n funcie de starea metabolic i sub influena unor diveri factori.

Figure 14-15 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Ultrastructura mitocondriilor a fost precizat prin studii de

microscopie electronic iniiate de ctre Palade i Sjstrand (1953). Mitocondria este nconjurat de un sistem dublu de membrane, format din membrana extern i membrana intern. Membranele mitocondriale delimiteaz dou compartimente: spaiul intermembranar i matricea mitocondrial.

Membrana mitocondrial extern

Membrana extern conine n proporii egale lipide i proteine i prezint un coninut ridicat de colesterol. n structura membranei externe exist o protein integral de membran numit porin (formeaz canale pentru ap n bistratul lipidic al membranei externe). Membrana extern este permeabil pentru molecule mai mici de 10kDa. Din acest motiv se poate aprecia c spaiul intermembranar este echivalent cu citosolul n privina compoziiei n ioni i molecule de dimensiuni reduse. Canalele proteice din membrana mitocondrial extern au fost denumite porine mitocondriale prin analogie cu porinele din membrana extern a unor bacterii i care confer, de asemenea, permebilitate pentru moleculele mici. Porinele mitocondriale sunt denumite i canale VDAC (voltage dependent anion selective channels, canale selective pentru anioni dependente de voltaj) Membrana extern conine proteine cu funcia de receptor, proteine implicate n transportul proteinelor din citosol n mitocondrii (translocaze TOM), precum i proteine cu funcii enzimatice (enzime implicate n sinteza lipidelor la nivel mitocondrial i enzime care transform o serie de substrate lipidice n compui ce sunt ulterior metabolizai n matricea mitocondrial).

Membrana mitocondrial intern

Membrana intern este cutat sub form de criste, cu aspect lamelar sau tubular, care i mresc foarte mult suprafaa total. Membrana intern are un coninut ridicat de proteine (70%) care sunt implicate n: (i) reaciile de oxido-reducere ale catenei respiratorii (lanului respirator); (ii) sinteza de ATP la nivelul complexului numit ATP sintaza; (iii) transferul metaboliilor din spaiul intermembranar n matricea mitocondrial i invers; (iv) importul de proteine din citosol mediat de proteine numite translocaze TIM; Membrana intern are un coninut ridicat de cardiolipin (difosfatidilglicerol), proprietate care i confer impermeabilitate pentru ioni.

Formula structural a cardiolipinei

Acest difosfatidil glicerol are o regiune hidrofil puternic electronegativ (2-). Spre deosebire de celelalte fosfogliceride care au n structura lor dou lanuri alifatice, cardiolipina prezint patru cozi hidrofobe.

Matricea mitocondrial
Matricea mitocondrial conine enzime ce particip la procesele metabolice specifice acestui organit: ciclul Krebs, oxidarea acizilor grai, reacii de transaminare. n matricea mitocondrial exist ADN mitocondrial (dublu catenar circular), ribosomi mitocondriali (70S) i proteine necesare expresiei genelor mitocondriale. Ribosomii mitocondriali prezint numeroase asemnri cu ribosomii de la bacterii. Matricea mitocondrial are o consisten vscoas, similar unui gel, datorit concentraiei mari de proteine (500 mg/ml). Sinteza proteic din matricea mitocondrial este relativ restrns, fiind sintetizate numai 13 tipuri de proteine. Marea majoritate a proteinelor mitocondriale sunt importate din citosol.

Funciile mitocondriilor
Catena respiratorie mitocondrial i sinteza ATP Rolul mitocondriei n iniierea, executarea i controlul apoptozei

Sinteza ATP Interdependena dintre procesele oxidative mitocondriale i catena respiratorie.

CATENA RESPIRATORIE MITOCONDRIAL

(LANUL RESPIRATOR, LANUL TRANSPORTOR DE ELECTRONI)

Interdependena ntre procesele oxidative mitocondriale i CR Metabolismul oxidativ n mitocondrii este ntreinut de piruvatul format n cursul glicolizei (n citosol), i de acizii grai. Aceti compui sunt transportai selectiv prin membrana intern mitocondrial n matrice unde sunt transformai n acetil-CoA. n matricea mitocondrial piruvatul este decarboxilat oxidativ sub aciunea complexului multienzimatic numit piruvat dehidrogenaza: Piruvat + NAD+ + CoA-SH Acetil-CoA + CO2 + NADH + H+ Acizii grai sunt oxidai n cursul procesului de -oxidare: Cn-acil-CoA + FAD + NAD+ + H2O + CoA-SH Cn-2acil-CoA + FADH2 + NADH + Acetil-CoA + H+

Acetil-CoA este transformat n cursul ciclului Krebs: Acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + ADP + Pi + 2H2O 2CO2 + 3NADH + 3H+ + FADH2 + ATP + CoA-SH Echivalenii de reducere NADH, H+ i FADH2 reprezint principalele surse care alimenteaz cu electroni lanul transportor de electroni din membrana intern mitocondrial.

Ciclul Krebs

Figure 14-10 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

CATENA RESPIRATORIE MITOCONDRIAL

Transportul de electroni n membrana intern mitocondrial se desfoar printr-o succesiune de reacii de oxido-reducere, prin intermediul unor componente specifice ale catenei respiratorii cu rol de transportori de electroni, organizate sub form de complexe respiratorii. Exist 4 tipuri de enzime i proteine implicate n transferul de electroni: NAD+-oxidoreductaze Flavin enzime (cu grupare prostetic FMN sau FAD) Proteine Fe-S Citocromii i o component lipidic numit ubichinona sau coenzima Q Din membrana intern mitocondrial au fost izolate 4 complexe respiratorii (I IV) care pot cataliza in vitro reaciile pariale de oxido-reducere specifice catenei respiratorii. Complexele respiratorii reprezint uniti morfo-funcionale care pot reface in vitro integritatea catenei respiratorii.

Cuplul NADH, H+/ NAD+ Eliberarea din structura NADH a ionului hidrur (H:-) i transformarea acestuia ntr-un proton i 2 electroni cu energie nalt.

Figure 14-9 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

NADH + H+

Cuplul NADH, H+/ NAD+ are potenialul redox standard E0 = -320mV

Variaia potenialului redox standard

E0=1140 mV
G0=-nFE0= 52,7 Kcal/mol

G0=-52,7 Kcal/mol
Figure 14-12a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Catena respiratorie mitocondrial

CR I

CR III

CR IV

Alimentarea cu electroni provenind de la NADH i de la substrate FAD-dependente (de ex. succinat) a lanului transportor de electroni din membrana intern.

Transportul de electroni din catena respiratorie este mediat de coliziunile dintre donorii de e- i acceptorii de e-. Ubichinona (coenzima Q) i citocromul c sunt molecule mobile ce difuzeaz uor n planul membranei, realiznd coliziuni cu complexele respiratorii.

Coenzima Q10 Citocromul c

Mecanismul fosforilrii oxidative

Cuplarea ntre CR i sinteza ATP (fosforilarea oxidativ)

1948 Lehninger a adus primele dovezi experimentale privind faptul c sinteza ATP are loc pe seama energiei eliberate pe parcursul transportului de electroni de-a lungul catenei respiratorii.

Mecanismul fosforilrii oxidative - Teoria cuplrii chemiosmotice Conform teoriei lui Mitchell, sinteza ATP depinde de procesul chemiosmotic care face legtura ntre procesele chimice i procesele de transport membranar. 1978 - Premiul Nobel pentru Chimie pentru elaborarea teoriei chemiosmotice.

Peter D. Mitchell

 Lanul transportor de electroni din MIM este protontranslocator i pompeaz protoni din matricea mitocondrial n spaiul intermembranar atunci cnd electronii circul ntre complexele respiratorii. MIM este impermeabil pentru protoni, anioni i cationi. n MIM exist un complex proteic proton-translocator reversibil, care poate utiliza energia de hidroliz a ATP pentru a pompa protoni prin membran, iar n condiiile unui gradient electrochimic de protoni complexul transport protonii n sens invers i realizeaz sinteza ATP. MIM conine o serie de proteine transportoare ce mediaz importul i exportul metaboliilor eseniali i a ionilor anorganici.

Energia eliberat pe parcursul transportului de electroni este folosit pentru a pompa protoni prin MIM (din matrice n spaiul intermembranar). Acest proces genereaz n MIM un gradient electrochimic de protoni. Revenirea protonilor n matricea mitocondrial are loc la nivelul complexului numit ATP sintaza.

Gradientul electrochimic de protoni

PMF = 160mV (potenialul de membran) + 61,5mV (gradientul de pH)=

= 221,5mV

Ageni decuplani ai fosforilrii oxidative

(decupleaz transportul de electroni de sinteza ATP) Decuplani sintetici :

2,4-dinitrofenol

carbonil cianid fenilhidrazona

Decuplant natural: termogenina (protein din esutul adipos brun)

ATP sintaza (complexul FoF1-ATPaza)

Studiile de microscopie electronic au evideniat pe faa dinspre matrice a MIM prezena unor proeminene (particule Fernandez-Moran, F1-ATPaza).

Figure 14-15 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Particule submitocondriale

Efraim Racker a precizat rolul proeminenelor n sinteza ATP.

Tripsin, uree

F1-ATPaza

FoF1-ATPaza (ATP sintaza)

Structura ATP sintazei

Fo (fracia sensibil la oligomicin) este segmentul membranar cu rol de transportor de protoni (canal prin care protonii trec din spaiul intermembranar n matrice) F1 (fracia 1) este segmentul localizat n matrice, cu rol catalitic, ce cupleaz ntoarcerea protonilor n matrice cu sinteza ATP. Este alctuit din 5 tipuri de subuniti ce formeaz o structur oligomer 33.
Paul D. Boyer i John E. Walker 1997 - Premiul Nobel pentru Chimie pentru elucidarea structurii i mecanismului de aciune al ATP sintazei

Dovada direct privind funcia ATP sintazei. Dac n lipozomi se nglobeaz ATP sintaza mitocondrial (izolat din inim de bou) i bacteriorodopsina (pomp de protoni activat de lumin izolat din Halobacterium halobium) i apoi lipozomii sunt expui iluminrii, prin activitatea bacteriorodopsinei de pompare a protonilor n lipozomi se creaz o for proton-motrice capabil s activeze ATP-sintaza.

Halobacterium halobium (H. salinarum)

Bacteriorodopsina

ATP sintaza dispozitiv reversibil de cuplare a transportului de protoni cu sinteza ATP

Controlul respirator
Mitocondriile pot oxida NADH numai n prezena unei surse de ADP, proces numit control respirator. In vivo celulele se afl permanent sub un control respirator deoarece oxidarea NADH sau FADH2 i producerea de ATP sunt cuplate prin intermediul forei proton-motrice. n unele tipuri de celule (esut adipos brun), respiraia celular poate fi decuplat de sinteza ATP i cea mai mare parte a energiei este disipat sub form de cldur, n loc s fie convertit n ATP (celulele oxideaz stocurile lipidice i produc cldur n loc de ATP). Membrana intern mitocondrial conine o protein, numit termogenin (UPC1, uncoupling protein 1), care este un decuplant natural al fosforilrii oxidative. Acest mecanism joac un rol important la animalele hibernante i la nou-nscui.

Rolul gradientului transmembranar de protoni

Figure 14-16 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Sisteme de transport membranar acionate de fora proton-motrice: - sistemul antiport ADP/ATP

- transportorul pentru anionii fosfat - transportorul pentru piruvat

Mecanismele chemiosmotice de la bacterii

cuplarea chemiosmotic reprezint un mecanism general, care funcioneaz nu numai n mitocondrii ci i la bacterii.
lanuri transportoare de e- cu acceptori finali: compui cu N, S, C

glicoliza

Figure 14-33 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Funciile mitocondriilor
Sinteza ATP

Iniierea i controlul apoptozei

Metabolizarea monoaminelor (turnoverul neurotransmitorilor sub aciunea catalitic a MAO) Stocarea tranzitorie a ionilor de Ca2+ (homeostazia calciului) Furnizarea de energie termic la nou-nscui i animalele din zonele polare

Rolul mitocondriilor n apoptoz

Diverse forme de moarte celular:
(A) apoptoz; (B) fagocitoz; (C) necroz

Cuvntul apoptoz vine din limba greac de la apoptein (apo din, de pe i ptosis - cdere) tradus prin cderea frunzelor. Acest termen sugereaz ncetarea funciilor vitale ale celulei.

Fenomenul a fost menionat prima dat de ctre Carl Vogt n 1842. Termenul de apoptoz a fost introdus de John Kerr i colaboratorii si Wyllie i Currie n 1972, referindu-se la apoptoz ca la un proces ordonat al morii celulare, care necesit funcionalitatea mecanismelor genetice i sintez de proteine, fiind un proces activ, cu consum energetic, care duce n final la moartea celulei. Este o form fiziologic de moarte celular, cu activarea secvenial a unor gene ale morii i a unor ci enzimatice de suicid.

Dezvoltarea degetelor la vertebrate presupune eliminarea prin apoptoz a membranelor interdigitale. (A) seciune prin picior de embrion de oarece (a 15-a zi de dezvoltare embrionar); (B) separarea incomplet a dou degete (sindactilie) la om, cauzat de absena apoptozei.

(A)

(B)

Leucocit normal (stnga) Leucocit n apoptoz (dreapta)

Apoptoz versus necroz

Moartea celular poate surveni prin ci alternative: moarte programat: apoptoz, paraptoz, autofagie, catastrof mitotic sau moarte accidental: necroz.
Caracteristica
Mecanism Necesar energetic Sinteza proteic Activare enzimatic Consecine asupra esuturilor nvecinate

APOPTOZ
moarte programat; o singur celul proces activ (consum de ATP) necesar caspaze i endonucleaze fagocitoza corpilor apoptotici; nu exist rspuns inflamator

NECROZ
moarte accidental; mai multe celule proces pasiv blocat enzime lizosomale declaneaz rspuns inflamator

Mecanismul apoptozei
Primele observaii privind mecanismele implicate n apoptoz au fost realizate prin studii genetice pe nematodul Caenorhabditis elegans. La acest nematod au fost identificate 14 gene ce induc i controleaz apoptoza, numite genele morii ced (cell death).
Gene proapoptotice: ced3 i ced4 Gene antiapoptotice: ced9

Ulterior au fost identificate i genele omoloage de la vertebrate.

Caenorhabditis elegans (nematod hermafrodit)

Organismul adult are 1090 de celule somatice care se formeaz n timpul dezvoltrii, dintre care exact un numr de 131 celule sunt eliminate prin apoptoz. Genele ced3 i ced 4 sunt necesare pentru moartea celor 131 de celule.

Mecanismul apoptozei
Sunt descrise dou ci de inducere i realizare a apoptozei ntr-o celul: Calea extrinsec, care pornete de la receptori ai suprafeei celulare, numii i receptori ai morii, activai prin legarea unui ligand specific. Calea intrinsec n care este implicat mitocondria (n principal prin eliberarea factorilor mitocondriali proapoptotici, respectiv a citocromului c i formarea apoptozomului care activeaz caspaza 9). Existena celor dou ci ale apoptozei i marea diversitate a stimulilor care declaneaz ci de semnalizare celular permit fiecrei celule s elaboreze cel mai adecvat rspuns celular, n conformitate cu nevoile de adaptare la mediul extracelular.

Mitocondria ndeplinete un rol activ n apoptoza declanat de stimuli intracelulari (calea intrinsec) Factori inductori ai apoptozei Citocromul c Proteina Diablo/Smac (second mitochondria derived activator of caspases) AIF (apoptosis inducing factor) Caspaze (cysteinil aspartate-specific proteases) Factori antiapoptotici Proteine aparinnd familiei Bcl-2 (B cell lymphoma-2)

Citocromul c

Este o molecul bifuncional: n calitate de component a catenei respiratorii mitocondriale particip la transferul de electroni, iar n calitate de component a programului apoptotic iniiaz asamblarea apoptozomului, dup eliberarea sa din mitocondrie.

AIF (factorul inductor al apoptozei)

Este o flavoprotein (57kDa) ce prezint omologie cu oxidoreductazele bacteriene. Este localizat n spaiul intermembranar i n urma declanrii procesului apoptotic este translocat n citosol i ulterior n nucleu. AIF induce condensarea cromatinei i fragmentarea ADN n fragmente de 50 kb. AIF este principalul factor mitocondrial ce determin modificari apoptotice la nivel nuclear.

DIABLO (Smac)
Proteina Diablo este o protein mitocondrial de 25 kDa care este eliberat n citosol mpreun cu citocromul c dup iniierea apoptozei. Proteina Diablo asigur executarea rapid a apoptozei, interfernd n procesul de activare al procaspazelor la nivelul apoptozomului (anuleaz efectul de blocare exercitat de proteinelor inhibitorii ale apoptozei IAP).

CASPAZELE:
Membrii familiei caspazelor sunt enzime cu rol proteolitic. Numele acestor proteaze vine de la faptul c prezint n centrul catalitic activ Cys i hidrolizeaz legturi peptidice la care particip resturi de Asp. Pn n prezent au fost descrise 14 tipuri de caspaze, cu meniunea c nu toate sunt implicate n apoptoz, i nu toate sunt localizate la nivel mitocondrial. Caspaza 9 este localizat n spaiul intermembranar Cele mai multe se exprim ca precursori inactivi (zimogene) Au o organizare structural similar: un prodomeniu aminoterminal variabil ca lungime i secven de aminoacizi i dou domenii ce formeaz dou subuniti catalitice: p20, p10 . n cursul apoptozei caspazele inactive sunt transformate n forme catalitic active prin clivare proteolitic, ce poate decurge autocatalitic sau sub aciunea altor caspaze. Se clasific n: Caspaze de iniiere a apoptozei (caspazele 2, 8, 9, 10) Caspaze efectoare (caspazele 3, 6, 7) Activarea secvenial a caspazelor creaz o cascad a activitii proteolitice n mediul intracelular.

Activarea procaspazelor n cursul apoptozei

Captul NH2-terminal (prodomeniu) prezint domeniul CARD (caspase recruitment domain), cu rol important n formarea complexului de activare al procaspazelor de iniiere. Forma catalitic activ este o structur tetramer.

p20
p10

Familia de proteine Bcl-2

Este o familie de proteine ce acioneaz ca reglatori intracelulari ai apoptozei, dintre care o parte inhib apoptoza, iar altele au activitate proapoptotic: Bcl-2, Bcl-XL, Bag, Bid inhib apoptoza Bcl-XS, Bax, Bad, Bak promoveaz apoptoza Capacitatea membrilor familiei Bcl-2 de a regla fiziologia mitocondrial este rezultatul proprietii lor de a interaciona cu membranele. Majoritatea prezint un domeniu C-terminal hidrofob, important pentru ancorarea n membran (i direcionarea ctre mitocondrie). O trstur caracteristic a proteinelor din familia Bcl-2 este capacitatea de dimerizare (tendina de a forma homo- i heterodimeri). De exemplu, efectul antiapoptotic al proteinei Bcl-2 este blocat prin legarea proteinelor proapoptotice Bax, ca urmare a formrii de heterodimeri Bax/Bcl-2.

Proteinele antiapoptotice prezint omologie privind unul sau mai multe domenii structurale numite BH (Bcl-2 homology): BH1, BH2, BH3 i BH4 Factorii anti-apoptotici dein domenii BH1-BH4 (Bcl-2, Bcl-XL). Factorii pro-apoptotici se clasific n funcie de numrul domeniilor Bcl-2 omoloage n factori BH1-BH3 (Bax, Bak) i factori BH3only (Bad, Bid).

 Proteinele familiei Bcl-2 anti-apoptotice sunt ancorate prin domeniile lor hidrofobe C-terminale la suprafaa mitocondriilor, prevenind eliberarea citocromului c din spaiul intermembranar Proteinele pro-apoptotice se gsesc n general n citosol unde acioneaz ca senzori pentru leziunile celulare sau pentru factorii de stres. Aciunea stimulilor stresani determin relocalizarea lor intracelular, fiind direcionai spre suprafaa mitocondriilor. Interaciunea dintre proteinele pro- i anti-apoptotice la nivelul suprafeei mitocondriilor perturb funcia normal a proteinelor anti-apoptotice. Membrii familiei Bcl-2 cu activitate pro-apoptotic aparinnd grupului de factori BH1-BH3 (Bax i Bak), redirecionai spre mitocondrie ca rspuns la stimulii apoptotici, formeaz canale MAC (mitochondrial apoptosisinduced channels) n membrana mitocondrial extern prin care pot fi eliberai citocromul c i ceilali factorii apoptotici din spaiul intermembranar. Raportul dintre proteinele anti- i pro-apoptotice controleaz susceptibilitatea la apoptoz.

APOPTOZA - Calea mitocondrial (intrinsec)

Factorii interni declanatori ai apoptozei sunt greu de identificat. Totui, o diversitate de procese pot induce aceast cale de realizare a apoptozei: privarea de oxigen privarea de nutrieni (glucoz) absena semnalelor de supravieuire concentraia crescut a ionilor de Ca2+ n matricea mitocondrial Se apreciaz c cel mai important stimul intern declanator al apoptozei l reprezint leziunile ireparabile ale ADN. Calea intrinsec este condiionat de eliberarea n citosol a unor proteine care n mod normal sunt localizate n spaiul intermembranar: citocromul c, AIF, procaspaza 9.

Porii de tranziie a permeabilitii mitocondriale (MTP)

MTP sunt canale oligoproteice neselective ce se formeaz n membranele mitocondriale sub aciune unor factori declanatori ai apoptozei (de ex.creterea concentraiei ionilor de calciu), n puncte de contact ale membranei externe i interne. Din punct de vedere structural sunt alctuii din canalul anionic dependent de voltaj (VDAC) din membrana extern i transportorul adenin nucleotidic (ANT) din membrana intern, de care se asociaz i alte proteine (ciclofilina D). Proteinele familiei Bcl-2 influeneaz funcionarea MTP cu consecine asupra permeabilitii membranelor mitocondriale.

Apoptoza declanat de stimuli intracelulari (calea intrinsec)

Eliberarea citocromului c n citosol permite formarea unui complex multiproteic de 1,4 MDa numit apoptosom, alctuit din molecule de citocrom c i Apaf-1.

Apaf1 (Apoptotic peptidase activating factor 1)

Factor de iniiere a apoptozei, component a apoptozomului. n absena stimulilor apoptotici este fixat de Bcl-2. Semnalele de declanare a apoptozei determin disocierea Apaf1 de Bcl-2. Prin fixarea sa de citocromul c i dATP este indus modificarea conformaiei sale ntr-o form adecvat asamblrii apoptozomului. Apoptozomul este un complex proteic rezultat prin oligomerizarea Apaf1 i a citocromului c, n prezena deoxiATP. Cinetica asamblrii apoptosomului i mecanismele de reglare sunt extrem de complexe. Exist mecanisme care blocheaz formarea apoptozomului ca rspuns la eliberarea accidental a unor mici cantiti de citocrom c.

Activarea caspazei-9 la nivelul apoptozomului

Apoptozomul servete ca platform pentru i activarea procaspazei 9 (inactiv) care decurge prin prin procesare autocatalitic. Caspaza 9 iniiaz cascada biochimic a caspazelor efectoare care cliveaz diverse substrate celulare (de exemplu laminele nucleare, proteinele citoscheletului).

Rolul proteinelor IAP (inhibitor of apoptosis protein) i Diablo/Smac

IAP familie de proteine cu rol de inhibitori ai caspazelor (previn activarea accidental a caspazelor). Smac/Diablo factor proapoptotic mitocondrial, care se leag de IAP permind derularea apoptozei.

Etapele apoptozei
Procesul apoptotic poate fi mprit n 3 etape distincte:
- angajarea, etapa n care celula ce a primit un semnal apoptotic letal devine angajat ireversibil pe calea morii; - executarea, etapa pe parcursul creia apar majoritatea modificrilor biochimice i structurale; - clearance-ul, etapa n care sunt ndeprtate prin fagocitoz resturile celulare (corpii apoptotici).

Modificri morfologice pe parcursul derulrii apoptozei

(A)

(B)

Modificrile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei (imagine stnga): Celul normal (A). Celul n cursul procesului de apoptoz (B); Sgetile indic fragmente de cromatin condensat.

Apoptoza i procesele patologice:

Controlul echilibrului celular dintre supravieuire i moarte

Anomalii n reglarea apoptozei nsoesc o mare diversitate de patologii. Apoptoza excesiv poate sta la originea unor boli degenerative (Alzheimer, Parkinson) sau hematologice. n schimb, scderea ratei apoptozei are drept rezultat promovarea semnalelor de supravieuire i acumularea n organism de celule anormale, cu generarea de tumori (cancer colorectal, cancer hepatic, cancer de prostat, leucemii).

Genomul mitocondrial
Genomul mitocondrial este reprezentat de o molecul de ADN circular dublu catenar de dimensiune mic (16.569 pb pentru genomul mitocondrial uman). Genomul mitocondrial are o pondere de aproximativ 1% din cantitatea total de ADN din celul. Genomul mitocondrial uman conine 37 de gene dintre care 13 codific proteine (componente ale catenei respiratorii mitocondriale i ale ATP sintazei), iar celelalte codific diferite tipuri de ARN: 2 tipuri de ARN ribosomal (12S i 16S rARN) i 22 tipuri de ARN de transport. Aceste molecule sunt eseniale pentru funcionarea aparatului de sintez a proteinelor la nivel mitocondrial.

Organizarea i particularitile genomului mitocondrial

mtADN, spre deosebire de cromatina eucariotelor, nu se asociaz cu histone. Moleculele de mtADN, spre deosebire de ADN nuclear, se gsesc ntr-o celul sub form de copii multiple (de ordinul miilor). Replicarea mtADN nu se limiteaz la faza S a interfazei ci se desfoar pe tot parcursul ciclului celular (nu este sincron cu replicarea ADN nuclear). n mtADN toate nucleotidele fac parte din secvene codificatoare. mtADN are puine secvene repetate. Frecvena substituiei nucleotidelor pe parcursul evoluiei a fost de 10 ori mai mare n genomul mitocondrila comparativ cu genomul nuclear.

Genomul mitocondrial uman

Genomul mitocondrial uman a fost caracterizat i secveniat n anul 1981 de ctre Anderson. Organizarea genomului mitocondrial din diverse celule animale este similar organizrii genomului mitocondrial uman (codific aceleai gene, cu o localizare identic).

Intr-o celul exist mii de copii ale genomului mitocondrial (fiecare mitocondrie are 2-10 copii ale mADN, i ntr-o celul sunt 500-2000 de mitocondrii).

Diviziunea mitocondriilor
Diviziunea mitocondriilor se realizeaz prin fisiune. Observaiile realizate pe celule vii prin tehnici de microscopie au evideniat procese de fisiune, dar i procese inverse, de fuziune a mitocondriilor. Mitocondriile se motenesc strict pe linie matern.

Maladii mitocondriale (mitocondriopatii)

mtADN prezint o frecven foarte ridicat a mutaiilor ntr-o celul nucleat exist mii de copii ale mtADN n momentul n care se produce o mutaie la nivelul mtADN, celula va conine un amestec de copii ale mtADN tip slbatic i mutante, situaie cunoscut sub numele de heteroplasmie. n cursul diviziunii celulare moleculele mtADN tip slbatic i mutante vor fi distribuite la ntmplare celulelor fiice, astfel nct dup mai multe generaii genotipul mtADN al unei linii celulare poate s fie reprezentat predominant de tipul slbatic sau mutant, proces cunoscut sub numele de segregare replicativ. Acest mecanism explic de ce aceeai mutaie la nivel mitocondrial poate s determine simptome diferite la membrii aceleiai familii, n funcie de procentul de molecule mtADN mutante pe care le-a motenit fiecare individ.

Complexitatea genetic i fenotipic a mitocondriopatiilor

n situaia n care procentul de copii mutante ale mADN crete, potenialul energetic al celulei scade. n situaia n care scade sub o valoare prag reprezentnd aportul minim de energie necesar pentru funcionarea normal a celulelor i esuturilor se manifest simptomele bolii. Maladiile mitocondriale determinate de mutaii la nivelul genomului mitocondrial se transmit pe linie matern. Mutaiile de la nivel nuclear pot de asemenea s afecteze funcia mitocondrial (transmitere mendelian). Aadar, transmiterea mitocondrioptiilor la descendeni se poate face pe linie matern (non-mendelian, extranuclear), mendelian sau combinat. La aceast complexitate genetic se adaug faptul c fenotipul maladiilor mitocondriale este foarte divers: aceeai mutaie a mtADN poate determina fenotipuri diferite (n funcie de procentul de copii mtADN mutante), dar n acelai timp mutaii diferite pot produce fenotipuri similare.

Severitatea fenotipului bolii depinde de numrul de copii mutante de mtADN motenite de la mam.

 Cele mai importante aspecte funcionale corelate cu patogeneza se refer la producerea de energie, generarea speciilor reactive de oxigen, reglarea apoptozei. Exemple de maladii mitocondriale:
Neuropatia optic ereditar Leber (Leber Hereditary Optic Neuropathy): leziuni ale nervului optic i orbire bilataral; pierderea vederii se instaleaz la vrste cuprinse ntre 15 i 35 de ani. Epilepsia mioclonic cu fibre musculare roii n lambou (Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fibers): se manifest prin contracii musculare necontrolate.

Electron micrographs showing characteristic ultrastructural changes of mitochondria in patients with pathological mtDNA mutations. a: Ring mitochondria; b: giant mitochondria with membrane fusion and circular cristae; c: concentric cristae; d and e: giant organelles with irregularly whorled and undulated cristae. Uranyl acetate, lead citrate; magnification, x5600 and (a and d), x16,000 (b) and x9600 (c and e).

Expresia fenotipic a bolilor mitocondriale implic 2 factori: (1) mutaia ca factor de predispoziie la boal, i (2) naintarea n vrst care determin un declin al funciei mitocondriale i care amplific defectul motenit.

Transportul proteinelor cu destinaie mitocondrial codificate de gene nucleare, sintetizate n citosol

Proteinele sintetizate n citosol destinate importului mitocondrial au n structura lor secvene de aminoacizi (secvene semnal de localizare mitocondrial sau presecven) ce dirijeaz transportul lor selectiv n compartimentele mitocondriale. Secvena semnal de localizare mitocondrial este situat la captul NH2-terminal i cuprinde 20-80 aa dispui ntr-un -helix amfipatic. Procesul de transport este complex, se desfoar n mai multe etape i nu este similar pentru toate proteinele mitocondriale. Transportul prin membranele mitocondriale se desfoar la nivelul unor complexe proteice: Complexul TOM (translocator outer membrane) Complexul TIM (translocator inner membrane

-Helix amfipatic

Translocatorii din membranele mitocondriale

implicai n importul proteinelor mitocondriale

Etapele importului proteinelor mitocondriale

n matrice

Importul proteinelor mitocondriale sintetizate n citosol necesit intervenia proteinelor de oc termic (hsp) i consum de energie.

Importul proteinelor mitocondriale n membrana intern

Importul proteinelor mitocondriale n spaiul intermembranar.