CUPRINS

PREFA... 1 CAP. 1 - INTRODUCERE N GENETIC.... 3 1.1. Genetica - definiie, obiect de studiu.. 3 1.2. Scurt istoric al geneticii.. 4 1.3. Legtura geneticii cu alte tiine. 8 1.4. Metode de cercetare folosite n genetic. 10 1.5. Materialul de cercetare n genetic. 12 1.6. Dezvoltarea geneticii vegetale n Romnia. 13 CAP. 2 - BAZELE CELULARE ALE EREDITII I VARIABILITII (CITOGENETICA).................... 15 2.1. Structura celulei procariote 16 2.2. Structura celulei eucariote. 18 2.3. Organizarea genomului la eucariote.. 25 2.3.1. Morfologia cromozomilor...... 25 2.3.2. Structura molecular a cromozomului... 33 2.3.3. Tipuri particulare de cromozomi.................................... 36 2.4. Organizarea genomului la procariote (bacterii i virusuri)..... 38 2.5. Reproducerea celulei.............................................................. 39 2.5.1. Mitoza............................................................................. 39 2.5.2. Meioza............................................................................. 44 2.6. Gametogeneza i syngamia..................................................... 48 2.6.1. Gametogeneza la animale................................................48 2.6.2. Sporogeneza i gametogeneza la plante.......................... 49 2.6.3. Syngamia........................................................................ 51 CAP. 3 - BAZELE MOLECULARE ALE EREDITII.................... 53 3.1. Proteine i acizi nucleici......................................................... 53 3.2. Dovezi privind rolul genetic al ADN..................................... 55 3.2.1. Transformarea la procariote........................................... 56 3.2.2. Transfecia la procariote................................................ 57 3.2.3. Transformarea la eucariote............................................ 59 3.2.4. Materialul genetic al ribovirusurilor.............................. 59 3.3. Acizii nucleici i rolul lor genetic.......................................... 60 3.3.1. Structura molecular a acidului dezoxiribonucleic (ADN) ..............................................................................60 3.3.2. Alte tipuri de ADN......................................................... 63 3.3.3. Acidul ribonucleic (ARN).............................................. 65 3.3.4. Denaturarea i renaturarea ADN.................................... 68 3.3.5. Specificitatea ADN........................................................ 69 3.3.6. Replicaia ADN.............................................................. 69 3.3.7. Replicaia acizilor nucleici la bacterii i virusuri........... 71

3.3.8. Sinteza acizilor nucleici "in vitro"................................... 72 3.4. Codul genetic.......................................................................... 73 3.4.1. Caracteristicile codului genetic...................................... 76 3.5. Biosinteza proteinelor............................................................ 77 3.5.1. Transcripia informaiei genetice.................................... 77 3.5.2. Translaia informaiei genetice....................................... 78 3.6. Reglajul genetic al activitii genelor..................................... 80 3.6.1. Reglajul activitii genetice la procariote...................... 81 3.6.2. Reglajul activitii genelor la eucariote......................... 86 3.7. Noiunea de gen i evoluia ei............................................. 89 3.7.1. Gena n concepia geneticii clasice................................ 89 3.7.2. Gena n concepia geneticii moleculare......................... 91 3.7.3. Gene suprapuse i gene sritoare................................... 93 3.8. Reproducerea i recombinarea genetic la procariote........... 95 3.8.1. Reproducerea bacteriilor i virusurilor.......................... 95 3.8.2. Recombinarea genetic la bacterii.................................. 96 3.8.3. Recombinarea genetic la virusuri................................. 100 CAP. 4 - NOIUNI DE INGINERIE GENETIC............................... 102 4.1. Sinteza artificial a genei....................................................... 103 4.2. Izolarea genei......................................................................... 104 4.3.Transferul de gene (transgeneza)............................................ 105 4.3.1. Principalii vectori utilizai n transgenez...................... 109 4.3.2. Realizri ale transgenezei la plante................................. 109 4.3.3. Transferul genelor fixatoare de azot................................110 4.4. Hibridarea celular la animale.................................................111 4.5. Hibridarea celular la plante....................................................113 4.6. Haploidia prin androgenez la plante......................................115 CAP. 5 - EREDITATEA MENDELIAN...............................................117 5.1. Terminologia folosit n genetica mendelian.........................117 5.2. Legile mendeliene ale ereditii...............................................118 5.2.1. Legea segregrii caracterelor (legea puritii gameilor)........................................................................ 119 5.2.2. Legea segregrii independente a perechilor de caractere...........................................................................121 5.3. Probabilitatea i raporturile mendeliene de segregare.............123 5.4. Mecanismul citologic al segregrii caracterelor......................126 5.5. ncruciarea analizatoare......................................................... 127 CAP. 6 - INTERACIUNEA GENELOR.............................................. 130 6.1. Abateri aparente de la raporturile mendeliene de segregare....130 6.1.1. Abateri aparente datorate interaciunilor alelice..............130 6.1.2. Abateri aparente datorate interaciunilor nealelice..........138 6.2. Abateri reale de la raporturile mendeliene de segregare......... 145

CAP. 7 - TEORIA CROMOZOMIC A EREDITII....................... 148 7.1. Gene i cromozomi................................................................. 148 7.2. Plasarea liniar a genelor pe cromozomi................................ 150 7.3. Transmiterea nlnuit a genelor (linkage)............................ 150 7.4. Schimbul reciproc de gene ntre cromozomii omologi (crossing-over)......................................................................... 152 7.5. Mecanismul citologic al crossing-over-ului........................... 153 7.6. Tipuri de crossing-over.......................................................... 156 7.7. Factorii care influeneaz crossing-over-ul........................... 160 7.8. Hrile cromozomice.............................................................. 161 7.9. Hrile citologice.................................................................... 163 CAP. 8 - DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI......................165 8.1. Generaliti.............................................................................. 165 8.2. Teoria genetic a determinrii sexului.................................... 166 8.2.1. Determinismul cromozomic al sexelor........................... 166 8.3. Sexul n cazul nmulirii partenogenetice................................ 168 8.4. Determinismul genetic al sexului la plante............................. 169 8.5. Determinismul genetic al sexului la organismele inferioare... 170 8.6. Teoria cantitativ a determinrii sexului................................ 171 8.7. Anomalii n ereditatea sexului................................................ 173 8.7.1. Ginandromorfismul......................................................... 173 8.7.2. Intersexualismul.............................................................. 174 8.8. Ereditatea caracterelor legate de sex....................................... 175 8.8.1. Ereditatea legat de sex n cazul heterogamiei sexului mascul (Drosophila)........................................... 175 8.8.2. Ereditatea n cazul nondisjunciei cromozomilor sexului n meioz............................................................ 177 8.8.3. Ereditatea legat de sex n cazul heterogamiei sexului femel................................................................... 178 8.9. Caracterele influenate de sex..................................................180 8.10. Caracterele limitate de sex.....................................................180 8.11. Inversiunea sexului................................................................ 180 8.12. Raportul dintre sexe.............................................................. 181 CAP. 9 - EREDITATEA EXTRANUCLEAR......................................183 9.1. Metode de evideniere a ereditii extranucleare.....................183 9.1.1. Fenomenul merogoniei.................................................... 184 9.1.2. Ereditatea extranuclear n hibridarea reciproc............. 184 9.1.3. Testul heterocarion.......................................................... 185 9.1.4. Segregarea nemendelian................................................ 185 9.2. Manifestarea ereditii extranucleare.......................................186 9.2.1. Ereditatea prin plastide.................................................... 186 9.2.2. Ereditatea prin intermediul incluziunilor citoplasmatice................................................................. 187

9.2.3. Ereditatea mitocondrial................................................. 188 9.2.4. Androsterilitatea citoplasmatic i nucleo-plasmatic... 189 9.3. Aparatul genetic al ereditii extranucleare............................ 192 9.4. Fenomene cu care se poate confunda ereditatea extranuclear........................................................................... 192 9.4.1. Predeterminarea.............................................................. 192 9.4.2. Modificrile de durat.................................................... 193 9.4.3. Ereditatea aparent......................................................... 194 9.4.4. Alte surse de erori........................................................... 194 9.5. Raporturile genetice dintre genom i plasmon........................ 194 9.6. Caracterele i nsuirile influenate de plasmotip................... 195 CAP. 10 - SISTEME GENETICE PENTRU CONTROLUL REPRODUCERII ORGANISMELOR................................ 196 10.1. Ereditatea n cazul reproducerii asexuate i sexuate............ 196 10.2. Ereditatea n cazul unor forme particulare de reproducere...................................................................... 197 10.3. Sisteme genetice pentru controlul reproducerii................... 198 10.4. Vigoarea hibrizilor (heterozis)............................................. 200 10.4.1. Teorii care explic fenomenul heterozis....................... 201 10.4.2. Manifestarea heterozisului............................................ 204 10.4.3. Consangvinizarea i folosirea ei n crearea liniilor destinate ncrucirii..................................................... 204 10.4.4. Consangvinizarea la animale........................................ 207 10.5. Hibridarea sexuat ndeprtat.............................................. 208 10.5.1. Obinerea i comportarea primei generaii hibride....... 208 10.5.2. Comportarea celei de a doua generaii hibride............. 211 10.5.3. Rolul hibridrii ndeprtate n evoluia speciilor.......... 211 CAP. 11 - MUTAIILE I MECANISMUL LOR MOLECULAR.... 213 11.1. Clasificarea mutaiilor.......................................................... 213 11.2. Detectarea mutaiilor............................................................ 215 11.3. Mutaiile spontane................................................................ 217 11.4. Mutaiile artificiale............................................................... 219 11.4.1. Radiaiile mutagene...................................................... 220 11.4.2. Temperatura.................................................................. 224 11.4.3. Substanele chimice mutagene...................................... 225 11.4.4. Factorii mutageni biologici........................................... 229 11.4.5. Mecanismul molecular al mutaiilor............................. 229 11.5. Mecanisme de reparare a ADN............................................. 231 11.6. Importana mutaiilor............................................................ 232 CAP. 12 - MUTAII N STRUCTURA CROMOZOMILOR............. 233 12.1. Tipuri de restructurri cromozomice i comportarea lor n mitoz..................................................... 234

12.2. Restructurrile cromozomice i mecanismul meiozei.......... 239 12.3. Efectul de poziie.................................................................. 244 12.4. Restructurrile cromozomice i importana lor pentru evoluie.................................................................................. 245 CAP. 13 - MUTAIILE DE GENOM..................................................... 247 13.1. Clasificarea variaiilor numeric cromozomice...................... 248 13.2. Euploidia............................................................................... 249 13.2.1. Monoploidia.................................................................. 249 13.2.2. Poliploidia..................................................................... 250 13.3. Modificrile morfologice i fiziologice ale poliploizilor..................................................................... 254 13.4. Poliploidia natural i rolul ei n evoluie............................ 255 13.5. Poliploidia artificial............................................................ 257 13.6. Poliploidia la animale........................................................... 259 13.7. Aneuploidia.......................................................................... 259 13.8. Pseudopoliploidia................................................................. 261 CAP. 14 - ELEMENTE DE GENETICA POPULAIILOR............... 263 14.1. Noiunea de populaie........................................................... 263 14.2. Metodele folosite n studiul geneticii populaiilor............... 264 14.3. Structura genetic a unei populaii........................................ 265 14.4. Panmixia i structura genetic a populaiilor, legea Hardy Weinberg....................................................... 265 14.5. Frecvena genelor legate de sex............................................ 268 14.6. Frecvena genelor n cazul a mai multor loci........................ 270 14.7. Frecvena genelor n cazul nlnuirii locilor........................ 270 14.8. Frecvena genelor n cazul alelelor multiple......................... 271 14.9. Factorii care modific structura genetic a populaiilor........ 272 14.9.1. Selecia...........................................................................272 14.9.2. Migraia......................................................................... 273 14.9.3. Mutaia.......................................................................... 274 14.9.4. Drift-ul genetic.............................................................. 275 14.9.5. Factorii care modific frecvena genotipurilor ntr-o populaie............................................................. 276 14.9.6. Homeostazia genetic i evoluia populaiilor.............. 276 GLOSAR................................................................................................... 278 BIBLIOGRAFIE SELECTIV............................................................... 295

Prefa
Tot mai muli oameni de tiin susin c, la nceputul mileniului trei, putem percepe derularea unei revoluii genetice care, prin realizrile din acest domeniu, genereaz optimism n unele medii tiinifice dar i pesimism, n altele. Anul 2000 a fost considerat anul genomului uman. S-a reuit descifrarea acestuia, dar au fost raportate i multe alte realizri n diferite domenii ale biologiei, crora genetica le-a furnizat informaii. n toate domeniile geneticii (microbian, vegetal, animal, uman) s-au produs mutaii profunde n nelegerea mecanismelor de stocare codificat a informaiei i de traducere a acesteia n miliardele de molecule ale unui organism. Dac la nceputuri, genetica era fericit s explice ereditatea i variabilitatea organismelor prin acel dans al cromozomilor, astzi, aceste nsuiri eseniale ale lumii vii sunt explicate la nivel molecular, printr-un joc al moleculelor unde hazardul are loc din ce n ce mai puin. Acest manual ncearc o parcurgere succint a drumului informaiei genetice, n limita programei analitice a cursului de Genetic vegetal, predat de autor studenilor de la facultile de Agricultur i Horticultur pe parcursul unui semestru. Am abordat, de la nceput, bazele celulare i moleculare ale ereditii i variabilitii cu gndul c tinerii studeni, cu mintea iscoditoare vor accepta, n final, c toate aspectele geneticii clasice (segregarea caracterelor, recombinarea, mutaiile, heterozisul etc.) pot fi, i trebuie explicate, la nivel molecular. Nu ne-am propus tratarea n detaliu a tuturor domeniilor geneticii. Complexitatea i multitudinea lor, rapiditatea cu care se succed realizrile n aceast tiin fac imposibil acest demers. Msura n care am reuit prezentarea sintetic a cunotinelor despre microcosmosul ce-l reprezint un organism unicelular sau multicelular, rolul fiecruia ntre celelalte, ne-o va da cititorul, cruia i mulumim. Autorul

CAPITOLUL 1 INTRODUCERE N GENETIC

1.1. GENETICA - DEFINIIE, OBIECT DE STUDIU
Genetica, definit succint, este tiina ereditii i variabilitii organismelor. Termenul genetic provine din grecescul gennaein care nseamn a nate i este atribuit tiinei ereditii i variabilitii, n anul 1905, de englezul William Bateson (1861-1926), la cea de a treia Conferin internaional de hibridare i ameliorare a plantelor de la Londra. Ereditatea (latinescul hereditas-motenire) este o nsuire esenial a organismelor, care denot asemnarea dintre prini i urmai (descendeni). Indiferent de gradul de evoluie al organismelor (procariote sau eucariote), informaia genetic este codificat n acizii nucleici (ADN sau ARN ), care intr n structura cromozomilor prinilor, iar n urma proceselor de replicaie, de tip semiconservativ, este transmis la descendeni. Diviziunea celular, replicaia acizilor nucleici, transcripia i translaia informaiei genetice, asigur constana caracterelor ereditare, dar aceast constan nu trebuie apreciat la modul absolut. Ca funcie biologic, ereditatea n general, dar mai ales a unor caractere morfo-fiziologice, biochimice i de comportament, este influenat, ntr-o msur oarecare, de factorii de mediu. Aceste interaciuni ale informaiei genetice cu factorii mediului, determin apariia unor deosebiri de ordin calitativ sau cantitativ, ntre indivizii aceleiai uniti sistematice, totalitatea acestora, fiind denumit variabilitate. Variabilitatea, ca nsuire general a lumii vii, poate fi determinat de structura celulei - variabilitate intraindividual, de diferenele dintre indivizii unei grupri sistematice restrnse (populaie) - variabilitatea individual, sau de deosebirile dintre diferite populaii - variabilitate de grup. Variabilitatea este determinat, pe de o parte de factorii genetici (mecanismele de recombinare intra i intercromozomice i prin mutani), dar i de factori de mediu (fizici, chimici sau biologici). Dac n primul caz, putem afirma c variaiile genetice se transmit cu mare fidelitate la urmai, variaiile determinate de factorii de mediu pot provoca modificri temporare, care de obicei nu se transmit n descenden. Obiectul de studiu al geneticii s-a diversificat, pe msura abordrii ereditii i variabilitii de la nivel individual la nivel molecular. Azi, distingem n mod curent, domenii ca: genetica clasic (fenomenologic), care studiaz modul de transmitere a caracterelor de la un individ la altul; genetica molecular, studiaz ereditatea la nivel molecular, de la structura molecular a genei, pn la mecanismele de codificare i decodificare a informaiei genetice, dar i mutaiile i recombinrile genetice la acest nivel; genetica dezvoltrii individuale
3

(ontogenetica) care i propune cunoaterea nceperii i sistrii activitii genelor, a mecanismelor de difereniere celular, a celor de reglaj genetic; genetica populaiilor, studiaz frecvena genelor i genotipurilor n vederea realizrii unui echilibru genetic, modificrile acestora pe termen lung (evoluie); ingineria genetic, care are un domeniu din ce n ce mai amplu, de la izolarea i sinteza artificial a genelor la transferul interspecific al acestora, clonarea genelor, a organismelor, hibridarea celulelor somatice, obinerea de organisme transgenice. Dac ne referim la grupe distincte de organisme, cercetrile de genetic, se realizeaz la plante (genetic vegetal), la animale (genetic animal), la microorganisme (genetic microbian), la om (genetic uman). Amploarea cercetrilor de genetic molecular depete orice imaginaie. Nu exagerm dac afirmm c, genetica a realizat o coeziune a tuturor tiinelor biologice, prin tratarea unitar a sistemului ereditar, care permite explicarea oricrui proces biologic. n concluzie prin prisma geneticii moleculare, genetica se ocup cu studiul genelor: codificarea i decodificarea informaiei genetice (corect sau eronat), reglajul activitii genice la nivel molecular i individual, recombinrile i mutaiile genice, identificarea i sinteza genelor i transferul acestora peste barierele de specie.

1.2. SCURT ISTORIC AL GENETICII

Primele observaii referitoare la asemnrile i deosebirile dintre indivizii aceleiai grupri sistematice, dateaz din cele mai vechi timpuri. n timp s-au conturat dou concepii diferite, ce au ncercat s dea o explicaie concret asupra transmiterii caracterelor de la prini la urmai i asupra variabilitii caracterelor: transmiterea direct a caracterelor i transmiterea indirect a acestora. Concepia clasic a transmiterii directe a caracterelor, susinea participarea unor substane sau particule, sintetizate de diferite pri ale organismului, la formarea i transmiterea direct a caracterelor, de la prini la urmai. Aceast concepie o gsim formulat n diferite moduri, chiar n perioada antic, n gndirea unor filozofi, particulele materiale, responsabile de transmiterea caracterelor ereditare, primind diferite denumiri: gemule, micele, plastidule etc. Anaxagora (500-428 .e.n.) a formulat prima teorie preformist, conform creia n celulele sexuale mascule, se formeaz organismul n miniatur (homunculus), dezvoltarea sa ulterioar fiind simple acumulri cantitative. Hippocrates (460-377 .e.n.), cel mai mare medic al antichitii, n privina ereditii a elaborat teoria pangenezei (panspermiei), ce susine participarea tuturor prilor corpului n formarea substanei ereditare, care, se acumuleaz n celulele sexuale ale prinilor. Aristotel (384-322 .e.n.), cel mai mare filozof al antichitii, n domeniul ereditii, a elaborat teoria hematogen a spermei,
4

conform creia, sngele st la baza originii i transmiterii caracterelor ereditare de la o generaie la alta. Galenos (129-199 e.n.), anatomist, medic i filozof grec, a observat i demonstrat participarea n egal msur a celor dou sexe la transmiterea caracterelor la descendeni, explicnd prin acesta, apariia unor caractere intermediare a hibrizilor, fa de cei doi prini. Sfritul secolului XVI este marcat, n domeniul biologiei de inventarea microscopului (Z. i H. Jansen 1590), ceea ce a constituit nceputul apariiei citologiei i embriologiei, cu implicaii directe n conturarea geneticii ca tiin de sine stttoare. n anul 1667, fizicianul englez R. Hooke n lucrarea Micrographia descrie pentru prima dat celula, iar n anul 1831, R. Brown, a descoperit nucleul n celulele orhideelor. ntr-un interval de timp relativ scurt, pe baza datelor acumulate de citologie, M. Schleiden (1838) i Th. Schwann (1839), au elaborat teoria celular, potrivit creia, unitatea structural i funcional a corpului plantelor i animalelor este celula. Descoperirea diviziunii mitotice (W. Flemming, 1882) i a diviziunii meiotice la plante (L. Guignard, 1891), au permis studiul cromozomilor, denumii astfel de W. Waldeyer (1888). Dei citologia nregistra progrese n studiul structurii celulei, n domeniul strict al geneticii, secolul XIX a fost dominat de teoriile corpusculare ale ereditii. Aceste teorii ncercau o explicaie a ereditii, prin existena unor particule materiale (corpusculi), existente n fiecare celul, esut sau organ, care se acumuleaz n celulele organismului iar n urma fecundrii difuzeaz n noul organism. Aceste particule materiale, difer ca mrime, structur, funcie i denumire, de la o teorie la alta. Charles Darwin (1809-1882), formuleaz teoria pangenezei (1868), conform creia caracterele se transmit prin intermediul gemulelor, care se formeaz n tot corpul, apoi migreaz n celulele sexuale, iar prin acestea se transmit la urmai. Teoria plastidulelor, formulat de Ernst Haeckel (1834-1919) a fost elaborat n anul 1876. Plastidulele, sunt molecule complexe, care au capacitatea de a se reproduce. Karl Wilhelm Nageli, n anul 1884, a formulat teoria micelian, potrivit creia, particulele materiale, denumite micele sunt prezente numai n idioplasm (plasma ereditar), sunt capabile de autoreproducere, trofoplasma (plasma nutritiv), nefiind implicat n ereditate. Cea mai complex teorie corpuscular a fost teoria continuitii plasmei germinative, formulat n anii 1875-1876, definit n anul 1902 de zoologul german August Weismann (1834-1914). A preluat de la K. W. Nageli, mprirea corpului n dou pri distincte: ideoplasma (plasma germinativ) i trofoplasma (plasma nutritiv). Teoria lui A. Weismann, admite existena unor particule materiale, de diferite mrimi, cu anumite funcii n ereditate, prezente numai n plasma germinativ, plasma nutritiv nefiind implicat n ereditate. Plasma germinativ este structurat n particule complexe denumite idante, prezente n nucleul celulelor, acestea se structureaz n uniti mai simple, ide, iar idele conin
5

particule elementare numite determinani, care particip la formarea i transmiterea fiecrui caracter ereditar. Plasma germinativ se separ de cea nutritiv, chiar la prima diviziune a celulei ou (zigotului). Celulele germinale (gameii), se formeaz numai din plasma germinativ, transmindu-se, ca atare, la descendeni, n timp ce, trofoplasma nu are dect rol nutritiv. Teoriile corpusculare au avut meritul c au intuit un suport material al ereditii, particulele materiale avnd capacitatea de a se autoreproduce i de a se transmite la descendeni. Prima teorie care explic transmiterea indirect a caracterelor ereditare a fost teoria factorilor ereditari, elaborat de Johann Gregor Mendel (1822-1884). Experienele de hibridare la mazre , devenite celebre, i-au permis lui G. Mendel s formuleze cele dou legi ale ereditii: legea segregrii caracterelor i legea segregrii independente a perechilor de caractere. Factorii ereditari intuii de Mendel, sunt particule elementare, responsabile de formarea i transmiterea caracterelor, se gsesc n celulele somatice sub form de perechi, iar n celulele sexuale, sub form simpl. n urma fecundrii gameilor, dup legile hazardului, factorii ereditari se combin, (ca apoi s se separe n procesul de meioz), rezultnd o mare diversitate de indivizi. Cercetrile lui G. Mendel, sintetizate n lucrarea Versuche uber Pflanzenhybriden (Experiene asupra hibrizilor la plante), publicate n anul 1866, au rmas necunoscute pn n anul 1900, cnd au fost redescoperite de Hugo de Vries (1848-1935) (Olanda), Carl Correns (1864-1933) (Germania) i Erich Tschermak (1871-1962) (Austria), independent unul de cellalt. Anul 1900, este considerat anul apariiei geneticii ca tiin biologic. n anul 1905, William Bateson (1861-1926), propune denumirea de genetic, pentru noua tiin biologic, care are ca obiect de studiu, ereditatea i variabilitatea organismelor. Wilhelm L. Johannsen (1857- 1917), n anul 1909, propune termenii de: genotip (totalitatea genelor unui individ), fenotip (totalitatea caracterelor i nsuirilor unui individ) i gen (particul material care determin apariia unuia sau a mai multor caractere). nceputul secolului XX este marcat de o dezvoltare rapid a citologiei, care precizeaz rolul structurilor celulare n viaa celulelor i a organismelor, urmnd apoi, descoperirea rolului genetic al unor componente celulare, care a nsemnat un nou domeniu, respectiv citogenetica. Bazele citogeneticii, tiin de contact ntre genetic i citologie, au fost puse de Thomas Hunt Morgan (1866-1945), n urma elaborrii teoriei cromozomice a ereditii. Aceast teorie, presupunnd plasarea liniar a genelor n cromozomi, transmiterea nlnuit a genelor (linkage) i schimbul reciproc de gene ntre cromozomii omologi (crossing-over), a permis apoi alctuirea primelor hri cromozomice la plante i animale. Iat unele din marele descoperiri ale geneticii, majoritatea fiind ncununate cu premiul Nobel, din perioada ultimelor decenii:
6

O. T. Averi, C. M. Mac Leod i M. Mc Carty (1944) demonstreaz c substana chimic a materialului genetic din cromozomi este acidul dezoxiribonucleic (ADN). M. Delbruck, W. T. Bailey (1946), J. Lederberg i E. L. Tatum (1946) descoper recombinarea genetic, primii la bacteriofagi i ceilali la bacterii. J. D. Watson i F. H. C. Crick (1953) descoper structura acidului dezoxiribonucleic. S. Benzer (1955) determin structura fin a cromozomului fagic i bacterian. F. Jacob, J. Monod i Andre Lwoff (1961), presupun existena acidului ribonucleic (ARN) mesager care transport informaia genetic de la ADN la ribozomii din citoplasm i descriu mecanismul de reglaj al biosintezei enzimelor la procariote. S. Ochoa, W. Nirenberg i H. G. Khorana (1966) au descifrat codul genetic. R. H. Holley (1968) pentru prima oar reuete s izoleze gene. H. G. Khorana (1970) realizeaz sinteza unei gene specifice. Earl Wilbur Sutherland Jr. - mecanismul de tip hormonal, molecula de tip AMP ciclic (AMPc) prin intermediul creia, numeroi hormoni, dar i alte substane acioneaz asupra celulei (premiul Nobel n 1971). Albert Claude, George Emil Palade, Christian de Duve, completeaz prin noi descoperiri, organizarea structural i funcional a celulei eucariote (mitocondriile - centrul respiraiei celulare, ribozomii centre de sintez a proteinelor, biogeneza membranelor, lizozomii i peroxizomii), (premiul Nobel n anul 1974). Renato Dulbecco, Howard Martin Temin i David Baltimore, descoper interaciunile dintre virusurile tumorale i materialul genetic al celulei. Dogma central a geneticii, ADN ARNm protein este modificat, descoperindu-se reverstranscriptazele, se demonstra c, ARNv poate fi transcris n ADN (premiul Nobel n 1975). Werner Arber, Daniel Nathans i Hamilton O. Smith, descoper enzimele de restricie, adevrate bisturie moleculare care secioneaz molecula de ADN n situsuri de recunoatere precise, deschiznd etapa manipulrilor genetice, avnd ca efect modificarea structurii genetice a unui organism (ingineria genetic) (premiul Nobel n 1978). Jean Dausset, George Snell i Baruj Benacerraf, descoper structura suprafeelor celulare genetic determinate, care regizeaz reaciile imunologice (premiul Nobel n anul 1980). Barbara Mc Clintock, este laureat a premiului Nobel (1983) pentru descoperirea elementelor mobile de reglare a genomului (transpozoni), implicate n dezvoltarea organismelor; existena elementelor mobile a fost semnalat nc din anul 1950, dar aceast descoperire nu a atras atenia geneticienilor vremii, care considerau c genomul este foarte stabil, chiar rigid. Susumu Tonegawa, descoper principiul genetic care genereaz diversitatea anticorpilor a descifrat unul din cele mai mari mistere ale
7

mainriei moleculare din organismul uman: n timp ce ntreg genomul uman conine circa 100.000 gene, organismul este capabil s produc n jur de un bilion de tipuri deferite de anticorpi. (premiul Nobel n anul 1987) (V. Rusu, 1996). Michael Bishop i Harold Varmus au descoperit originea celular a oncogenelor retrovirale (premiul Nobel n anul 1989). Erwin Neher i Bert Sakman, descoper tehnica patch clamp, care permite msurarea activitii individuale a canalelor ionice membranare, metod care permite explicarea a numeroase procese celulare (excitabilitate, contractilitate, secreia, transportul transmembranar al moleculelor, fecundarea etc.) (premiul Nobel n anul 1991). Edmond H. Fischer i Edwin G. Krebs, descoper procesul de fosforilare reversibil a proteinelor ca mecanism general de reglare biologic, conturndu-se o imagine aproape complet asupra rolului fosforilrii reversibile a proteinelor n funcionarea celulei (premiul Nobel n 1992). Richard Roberts i Phillip Sharp, au fost laureai ai premiului Nobel n 1993 pentru descoperirea genelor cu structur discontinu: genele organismelor superioare sunt alctuite din fragmente informaionale denumite exoni, separate de poriuni noninformaionale denumite introni. n 1994, premiul Nobel a fost acordat pentru descoperirea proteinelor G, profesorilor Martin Rodbell i Alfred G. Gillman (S.U.A.). Edward B. Lewis, Christiane Nuesslein Voehard i Eric F. Wieschaus, au fost distini cu premiul Nobel n 1995, pentru descoperirea controlului genetic al dezvoltrii precoce a embrionului; mecanismele moleculare responsabile de morfogeneza tuturor animalelor sunt universale. Peter C. Doherty i Ralf M. Zinkernagel, au descoperit specificitatea aprrii i imunitii, mediate de celul (premiul Nobel n 1996). Stanley B. Prusiner, a fost laureat al premiului Nobel n anul 1997, pentru descoperirea prionilor un principiu nou al infeciei. Guten Blobel, a descoperit c proteinele au semnale intrinsece care guverneaz transportul i localizarea lor n celul (premiul Nobel n 1999). n anul 2001, Leland Hartwell, Tim Hunt i Paul Nurse au fost laureai ai premiului Nobel pentru cercetarea celulei canceroase.

1.3. LEGTURA GENETICII CU ALTE TIINE

Pentru a studia problemele pe care le implic ereditatea, genetica se servete de o serie de discipline: Evoluionismul, ce studiaz procesul de evoluie n lumea vieuitoarelor, de la apariia lui pn n ziua de astzi, legile dup care organismele vii au aprut i s-au modificat n decursul vremurilor. Se ocup de acea parte a biologiei care se mai numete i filogenetic (de la phyle - neam, gen i genesis - natere, origine). Fiziologia se ocup cu studiul fenomenelor vitale ce au loc n organismele vegetale i animale. ntre metabolism i procesele vitale este o strns legtur, iar partea de genetic care se ocup cu modul de aciune al
8

factorilor ereditari pentru realizarea caracterelor, se mai numete i genetic fiziologic. Botanica i zoologia se ocup cu studiul plantelor i a animalelor i ne ajut s determinm caracterele, nsuirile i variabilitatea lor, furnizndu-ne noiuni de morfologie i anatomie vegetal i animal. Pe baza acestor date putem clasifica formele noi, studiul cu care se ocup sistematica. Sistematizarea indivizilor are la baz asemnrile i deosebirile din interiorul fiecrui grup, care se menine prin existena unui mecanism ereditar. Citologia studiaz celula, unitatea de baz a organismelor vii. Ea ne d posibilitatea de a descoperi baza material a ereditii i structurile celulare cu rol n ereditate. Biochimia i biofizica sunt tiine care se ocup cu procese fizice i chimice ce au loc n materia vie i legtura lor n cadrul metabolismului. Ele ne ajut s studiem structurile chimice i fizice care rspund de ereditatea organismelor. O foarte strns legtur exist ntre genetic i ameliorarea plantelor i animalelor, cea dinti constituind baza teoretic a celei de a doua. Nu putem crea rase noi de animale i soiuri noi de plante, dac nu le cunoatem legile dup care se pot crea. Genetica a descoperit aceste legi pe baza crora ameliorarea elaboreaz metode practice de mbuntire i creare de soiuri i rase. Microbiologia, studiaz viaa microorganismelor. Cu ajutorul lor s-au adus contribuii serioase la identificarea, descrierea i funciile materialului genetic. Colaborarea strns dintre genetic i celelalte ramuri ale tiinelor a dus la apariia de noi ramuri ale geneticii. Din colaborarea geneticii cu citologia s-a nscut citogenetica. Ea studiaz structurile i funciile celulare ce stau la baza fenomenelor ereditare. Din colaborarea geneticii cu fizica nuclear s-a nscut genetica radiaiilor, care cerceteaz influena radiaiilor ionizante i neionizante asupra bazei materiale a ereditii. Din colaborarea geneticii cu biochimia s-a nscut genetica molecular, care studiaz fenomenele biochimice ale ereditii la nivelul molecular. Din colaborarea geneticii cu sistematica s-a nscut genetica populaiilor, al crui obiect de studiu este structura genetic a populaiilor de plante i animale i factorii care o modific. Din colaborarea geneticii cu medicina s-a nscut genetica uman, de mare importan pentru prevenirea i combaterea bolilor ereditate la om. Am enumerat principalele ramuri ale tiinelor cu care genetica colaboreaz. Mai sunt i alte tiine care aduc geneticii mari servicii, cum sunt de exemplu matematica i altele. Genetica are un vast cmp de activitate. n afar de agricultur, zootehnie, medicin veterinar, silvicultur, s-a interferat cu toate ramurile biologiei. Dup domeniile mari n care se studiaz fenomenul de ereditate deosebim genetica vegetal, animal, uman, microbian .a.

1.4. METODE DE CERCETARE FOLOSITE N GENETIC

Simplele observaii asupra modului de transmitere a caracterelor i nsuirilor ereditare, au generat o multitudine de ipoteze care ncercau s explice, n diferite moduri, ereditatea i variabilitatea organismelor vii. Iniierea, perfecionarea metodelor i tehnicilor de cercetare specifice, au determinat apariia i extinderea geneticii ca tiin, n rndul celorlalte tiine biologice. Aceste metode de cercetare, cronologic vorbind, au determinat abordarea aspectelor legate de ereditate i variabilitate, de la nivel individual, la nivel populaional i mergnd apoi spre nivelurile celular i molecular. Principalele metode de cercetare folosite n genetic sunt: metoda hibridologic (hibridarea experimental), metoda biometric, metoda analizei genealogice, metoda citogenetic, metoda biochimic i biofizic, metoda ontogenetic, metoda culturilor de celule i embrioni, metoda ADN recombinat. Metoda hibridologic const n ncruciarea dintre indivizi ce posed caractere ereditare distincte, urmat de analiza modului de manifestare a acestora, la indivizii din diferite generaii. n generaiile segregante (F2, F3,Fn) se analizeaz statistic modul de manifestare a caracterelor luate n studiu. Hibridarea s-a utilizat de mult vreme ca metod de obinere a unor forme noi, dar bazele teoretice ale acesteia au fost stabilite de Johann Gregor Mendel, de aceea metoda hibridologic se mai numete analiz genetic mendelian. Aa cum a procedat i Gr. Mendel, indivizii ce urmeaz a se ncrucia, sunt studiai n prealabil, cteva generaii, pentru a vedea dac caracterele luate n studiu se transmit constant, cu alte cuvinte, dac organismele sunt homozigote pentru celelalte caractere. Structura genetic a organismelor luate n studiu, fenomenele linkage i crossing-over se pot stabili printr-o ncruciare analizatoare (retroncruciare, backcross), cnd hibrizii cu caractere dominante se ncrucieaz cu un individ homozigot recesiv (tester). Metoda biometric, aplicat iniial la caracterele calitative s-a extins i n domeniul caracterelor cantitative, n cadrul unui grup mai restrns sau mai mare de indivizi. Legilor mendeliene ale ereditii, le-au urmat tezele teoriei cromozomice ale ereditii, T. H. Morgan tot pe baza statisticii, stabilind modul de interaciune dintre gene, probabilitatea recombinrilor inter i intracromozomice, poziia i distana dintre gene, n cadrul hrilor cromozomice. Metoda analizei statistice s-a extins i n analiza modului de transmitere a caracterelor cantitative, conturndu-se un domeniu foarte important al geneticii, genetica cantitativ. Pe baza msurtorilor biometrice (mrimea i greutatea fructelor, numrul seminelor pe plant, cantitatea de lapte la taurine, numrul de ou la psri etc.) se calculeaz o serie de valori biometrice, care dau indicaii deosebit de importante privind: interaciunea genotip-mediu n exprimarea fenotipic a acestor caractere i tipurile de interaciuni genice, corelaiile dintre diferite caractere, gradul de repetabilitate a acestora pe parcursul mai multor generaii.
10

Studiul matematic se aplic i n genetica populaiilor (naturale sau artificiale), obiectul acestei ramuri a geneticii fiind studiul frecvenei genelor i genotipurilor dintr-o populaie i cauzele ce determin modificarea echilibrului acestora. Metoda citogenetic, studiaz componenii celulari implicai n ereditate, n mod direct sau indirect (cromozomii i evoluia lor n timpul diviziunii celulare, plastidele, mitocondriile, plasmidele etc.) i efectul unor ageni mutageni asupra acestor componeni. Metoda citogenetic s-a perfecionat pe msura noilor cuceriri ale fizicii optice i electronice, ce au dus la modernizarea diferitelor tipuri de microscoape (de la cele optice pn la cele electronice). n ultimul timp se utilizeaz i alte metode de studiu a materialului genetic: cromatografia de diferite tipuri, cristalografia, autoradiografia, citofotometria i difracia n raze X. Cercetrile de citogenetic coreleaz modificrile materialului genetic la nivel celular, cu modificrile caracterelor ereditare ale organismelor, aducnd numeroase informaii privind activitatea genelor, grupelor de gene, a cromozomilor sau a altor componente celulare. Metoda biofizic i biochimic. n ultimul timp, materialul genetic a putut fi studiat n imensa sa complexitate i din punct de vedere fizico-chimic. Arhitectura structural deosebit de complex a moleculelor de ADN i ARN de diferite tipuri, a fost descifrat prin metode biofizice i biochimice. Perfecionarea microscopului electronic, izolarea componentelor celulare prin ultracentrifugare, analiza lor prin autoradiografie, microcinematografie, analiza componenei atomice, moleculare i spaiale ale acizilor nucleici sunt realizri recente ale biofizicii i biochimiei. Metoda biofizic i biochimic studiaz i efectul diverilor ageni mutageni asupra materialului genetic, vorbindu-se frecvent de o genetic a radiaiilor, iar genetica molecular constituie un domeniu fr de care, azi, nu putem explica nici un aspect la ereditii, dac nu acceptm stocarea informaiei genetice n molecule de ADN (sau ARN-v), copierea unor mesaje mai scurte sau mai lungi, n molecula de ARNm i transmise neschimbat de la o celul la alta, de la o generaie la alta. Metoda ADN recombinat. Constituie metoda cea mai modern de studiu a geneticii care reunete cele mai rafinate tehnici de lucru, pentru izolarea moleculelor acizilor nucleici sau numai a unor segmente din aceti acizi i realizarea de molecule hibride ale acestora. Izolarea genei, sinteza artificial a genei, inseria genelor ntr-o serie de vectori genetici (virusuri i plasmide), transferul genelor de la o specie la alta, sunt realizri recente ale unui nou domeniu al geneticii, ingineria genetic. Acestui domeniu aparin i tehnicile de manipulare a celulelor, embrionilor i esuturilor care, pe medii nutritive, n condiii aseptice, pot fi nmulite, reproducnd fie clone celulare sau organisme ntregi (la plante).

11

1.5. MATERIALUL DE CERCETARE N GENETIC

n cercetarea ereditii caracterelor, o importan deosebit l are materialul cu care experimentm. De acesta depind, n foarte mare msur, rezultatele obinute. Alegerea lui se face n funcie de scopul cercetrii. Sunt totui cteva condiii generale, de care trebuie s inem seama n alegerea acestui material: - s prezinte caractere distincte, uor de precizat i urmrit, la prini i la urmai; - s aib ciclul vital scurt; - s posede un numr mic de cromozomi; - s produc muli urmai; - s produc mutaii, sub influena factorilor mutageni; - s poat fi reprodus uor n laborator; - s menin n descenden caracterele i nsuirile ce ne intereseaz. Dintre mamifere, se folosesc mult oarecii, care au ciclul de dezvoltare de numai 2,5 luni i sunt destul de prolifici. Dintre insecte, a fost folosit foarte mult musculia de oet, Drosophila melanogaster. Aceasta se nmulete destul de repede, muteaz foarte uor, are puini cromozomi (2n=8), iar n glandele salivare conine cromozomi gigantici. La plante, se aleg de obicei plante anuale ce prezint caractere distincte, uor de sesizat i urmrit (culoarea pericarpului, a endospermului, culoarea spicului, a aristelor .a.). Se folosesc cu succes plante autogame, care pot fi reproduse, fie prin fecundare strin, fie prin autofecundare. Dintre ciuperci s-a folosit foarte mult, n ultimul timp, Neurospora crassa. O importan deosebit s-a acordat n special n ultimele decenii, bacteriilor i virusurilor, care au ciclul de via foarte scurt, cu funcii limitate, uneori numai la cea de reproducere i infeciozitate. Genetica molecular i-a cldit descoperirile cu privire la structura macromolecular a acizilor nucleici, procesele biochimice ce stau la baza substratului material al ereditii, structura fin a genei, folosind virusurile i bacteriile ca material de studiu. Pentru genetica animal, i n special pentru genetica dezvoltrii, s-a gsit un model ideal, n nematodul Caenorhabdites elegans (Crlan M., 2001): adulii au dimensiuni mici, aproximativ 1 mm, o generaie se realizeaz ntr-un ciclu de 3 zile, necesit condiii simple de cretere, produce un numr mare de descendeni (200-300), indivizii sunt alctuii din exact 959 celule, dintre care 300 de neuroni. n genetica uman, studiul gemenilor are o importan deosebit. Gemenii care se dezvolt din acelai zigot (monovitelini sau monozigotici) au o ereditate identic, iar deosebirile morfo-fiziologice dintre ei se datoreaz n special condiiilor de via. n felul acesta, se poate distinge n mod separat contribuia mediului sau a ereditii asupra exteriorizrii unor caractere. Nu acelai lucru se poate spune despre gemenii bivitelini (bizigotici), care provin din ovule diferite i cu legturi genetice asemenea frailor i surorilor.
12

1.6. DEZVOLTAREA GENETICII VEGETALE N ROMNIA

Primele cercetri de genetic n Romnia au fost efectuate de Constantin Vasilescu (1840-1902), profesor la coala Superioar de Medicin Veterinar Bucureti (actuala Facultate de Medicin Veterinar), care, n urma hibridrii la suine, a urmrit modul de transmitere al monodactiliei (piciorul are o singur unghie) i al caracterului normal. n urma acestor ncruciri a semnalat pentru prima dat, dominana i recesivitatea caracterelor n generaia F1 i segregarea acestora n generaia F2, ntr-un raport de aproximativ 3:1 (caracteristic monohibridrii). Rezultatele cercetrilor sale au fost comunicate naintea celor lui Gregor Mendel (18221884), putnd fi considerat un precursor al mendelismului. n domeniul geneticii vegetale, primele cercetri de genetic au fost iniiate de Constantin SanduAldea (18741927), care s-a ocupat de ameliorarea grului, reuind s creeze o serie de linii valoroase. Public n anul 1915, primul tratat romnesc de specialitate intitulat Ameliorarea plantelor agricole, cu un amplu capitol de genetic. Gheorghe IonescuSiseti (18851968), doctor n tiine la Universitatea din Jena, a contribuit la dezvoltarea ameliorrii plantelor i a tiinei experimentale agricole romneti. n urma seleciei individuale simple, din soiul de gru Tenmarq, a obinut soiul de gru A-15, cultivat de aproape 25 de ani n ara noastr. nfiinarea Academiei de tiine Agricole i Silvice, a Institutului de Cercetri Agricole a Romniei (I.C.A.R.) i a primei Societi de Genetic din Romnia, sunt legate de activitatea acestui savant. Genetica vegetal din Romnia a acumulat noi realizri prin activitatea tiinific de excepie a profesorului Nicolae Sulescu (18981977), care, dup o specializare la Institutul de Cercetri de Ereditate din Berlin, condus de Erwin Baur (18751933) a realizat numeroase hibridri la specia Antirrhinum majus (2n=16), a stabilit grupele de linkage a mai multor gene i a ntocmit prima hart genetic la aceast specie (1925). Studii de cariologie i citogenetic la plante a efectuat profesorul Victor Ghimpu (18961952), fiind printre primii romni care au abordat acest domeniu. Creatorul colii romneti de citologie este considerat profesorul Dimitrie Voinov (18671951), cnd citogenetica mondial era la nceputurile ei. Cercettor de mare finee, Dimitrie Voinov, a semnalat primul caz de aneuploidie, n anul 1912, la insecta Gryllotalpa gryllotalpa, a studiat formarea celulelor sexuale la insecte i a demonstrat c diviziunea mitocondriei are loc independent de regele celulei nucleul , putnd fi considerat i un pionier al ereditii extranucleare. Pentru aportul su n dezvoltarea tiinei, UNESCO, a comemorat n 1967, 100 de ani de la naterea lui Dimitrie Voinov. n domeniul hibridrii la plante, n vederea realizrii de noi forme, amintim contribuia profesorului tefan Popescu (18881961), care a statornicit bazele cercetrilor tiinifice de genetic i ameliorare a plantelor n Moldova, combtnd viguros ideile netiinifice ale lui T. D. Lsenko. Cursul de genetic,
13

editat n 1947, printre primele din ara noastr cuprindea i o parte de citogenetic, explicnd bazele citologice ale principalelor fenomene genetice. Genetica vegetal i ameliorarea plantelor agricole au fost impulsionate de activitatea rodnic a academicianului Nechifor Ceapoiu (19111992), fiind cunoscute rezultatele sale n cercetrile de genetic a grului, crearea unor soiuri noi de gru i cnep, fondarea revistei Probleme de Genetic Teoretic i Aplicat i organizarea Simpozioanelor Naionale de Genetic Vegetal i Animal. Petre Raicu (19291997) a avut contribuii deosebite n dezvoltarea geneticii vegetale, animale i umane i a nvmntului romnesc de genetic. A contribuit la nfiinarea seciei de Genetic n cadrul Societii de tiine Biologice din Romnia i a organizat primele simpozioane naionale de genetic din Romnia, dup nlturarea dogmei lui T. D. Lsenko (1964, 1967). George Emil Palade (nscut n 1912), laureat al premiului Nobel n 1974, savant de origine romn, stabilit n S.U.A., a perfecionat metodele de microscopie electronic, a descoperit ultrastructura ribozomilor (granulele lui Palade) i implicarea acestora n funcionarea celulei. Institutul de Biologie i Patologie Celular, a fost nfiinat de Nicolae Simionescu, cu sprijinul lui G. E. Palade. Cercetrile de genetic vegetal, se desfoar n principalele Universiti Agronomice din Romnia (Bucureti, Iai, Timioara, ClujNapoca, Craiova), n Staiunile de Cercetri Agricole, Institutul de Cercetri pentru Cereale i Plante Tehnice Fundulea (coordonate de Academia de tiine Agricole i Silvice). n ameliorarea porumbului, primele linii homozigote obinute din haploizi artificiali, a fost realizat de C. Panfil i C. Botez (Universitatea Agronomic ClujNapoca). Soiuri valoroase de trifoi tetraploid au ca autor pe Mircea Savatti (Universitatea Agronomic ClujNapoca). Lucrrile minuioase de mutagenez experimental, s-au realizat la Universitatea din Craiova (Marghitul Valeria i Corneanu G.), la Universitatea Agronomic Bucureti (Nicolae I.), la Universitatea Agronomic Iai (rdea Gh). Genetica i ameliorarea grului i orzului, au cunoscut progrese importante prin activitatea unor personaliti n domeniu (Ceapoiu N., Murean T., Sulescu N. N., Drghici L., Bude At.). Hibridrile intergenice i interspecifice, n special pentru obinerea de Triticale au fost coordonate de Gallia Butnaru (Universitatea Agronomic Timioara) i Gapar I. (Staiunea de Cercetri Agricole Suceava). n Romnia, numeroase reviste i publicaii de specialitate, fac cunoscute realizrile n domeniul geneticii vegetale i animale: Probleme de Genetic Teoretic i Aplicat (ICCPTFundulea), Cercetri de Genetic Vegetal i Animal (ICCPTFundulea), Genetics and Evolutions (Universitatea A.I. CuzaIai), Evolution and Adaptation (Universitatea BabesBolyai Cluj-Napoca).
14

CAPITOLUL 2 BAZELE CELULARE ALE EREDITII I VARIABILITII (CITOGENETICA)

Moto: "Precum istoria Pmntului este nscris n straturile sale geologice, tot astfel istoria unui organism este nscris n cromozomii si" H. Kihara

Ereditatea, proprietate esenial a vieii, trebuie s fie determinat, ca i celelalte proprieti, de un substrat material cu o anumit localizare, structur i funcie. Preocuprile filozofilor i oamenilor de tiin pn n secolul XIX pentru a gsi un suport material al ereditii s-au soldat cu formularea a numeroase ipoteze, de multe ori speculative. De abia n secolul XIX, odat cu apariia i dezvoltarea citologiei s-a putut trece la studiul sistematic al celulei, aceasta constituind unitatea structural de baz, comun organismelor vii, cu excepia virusurilor. Pentru cunoaterea ereditii, studiul celulei i a mecanismelor diviziunii celulare prezint o importan deosebit. ntr-adevr, cunotinele acumulate au permis identificarea materialului genetic, descoperirea mecanismului de transmitere a genelor de la o celul la alta, de la un organism la altul i a modului cum se realizeaz recombinarea genetic. Toate aceste fenomene sunt determinate de un complex de structuri i funcii celulare. Invenia microscopului la sfritul secolului al XVI-lea a deschis o nou er n cercetarea structurilor materiei vii. Astfel, n anul 1665 fizicianul englez R. Hooke, cu ajutorul microscopului, descoper celula. n anul 1831, R. Brown, cercetnd celulele din epiderma plantelor Orchideae i Asclepiadeae, descoper nucleul. Pe baza datelor acumulate despre celul, botanistul M. J. Schleiden (1838) i zoologul T. Schwann (1839) elaboreaz teoria celular, potrivit creia celula reprezint unitatea structural a materiei vii. O mare importan pentru dezvoltarea geneticii a avut-o descoperirea mitozei sau diviziunii nucleare indirecte (cariokineza) la plante, de ctre W. Flemming (1882). La interval scurt a fost descoperit meioza i fecundarea la animale de ctre E. van Beneden (1883), A. Weismann (1883) .a. i la plante de ctre L. Guignard (1889). Descoperirea diviziunii nucleului a permis studiul cromozomilor, denumii astfel de W. Waldeyer (1888), crora, datorit proprietilor pe care le au, li s-a atribuit un rol esenial n ereditate. Dependena fenomenelor ereditare de nucleu, respectiv de cromozomi a deschis drumul cercetrilor privind substratul
15

material al ereditii. n ultimele decenii, mijloacele moderne de cercetare au contribuit la mari descoperiri n domeniul citologiei. Pentru studiul celulei se folosete astzi microscopul cu contrast de faz, fluorescent, electronic i microscopul cu raze ultraviolete. Se obin imagini mrite pn la cteva sute de mii de ori. Alturi de succesul din domeniul opticii, progrese nsemnate s-au fcut i n domeniul metodelor biofizice i biochimice. Tabloul general al structurilor celulare s-a completat i s-a complicat mereu cu elemente noi. Pentru a rezolva multiplele probleme pe care le ridic citologia se face apel la chimie, fizic, fiziologie i alte discipline; genetica utilizeaz descoperirile citologice pentru elucidarea mecanismelor ereditii. Din colaborarea dintre genetic i citologie s-a nscut un domeniu nou al biologiei numit citogenetic. Celula este unitatea morfo-funcional elementar a oricrui organism procariot sau eucariot, constituind principalul nivel de organizare a materiei vii, capabil de autoreglare, autoconservare i autoreproducere. Celula poate fi considerat, conform organizrii sistemice a lumii vii, un sistem biologic deschis, n echilibru dinamic cu mediul ambiant (celula procariot) sau ca un subsistem, cnd constituie parte component a unui esut, organ sau organism pluricelular (celula eucariot). Celulele tuturor organismelor au acelai plan general de organizare, fiind formate din membran i protoplasm, ns analiznd evoluia aparatului genetic se disting dou mari grupe de organisme: procariote i eucariote.

2.1. STRUCTURA CELULEI PROCARIOTE

Procariotele sunt organisme cu o structur simpl, ce cuprind vieuitoare acelulare, din care fac parte viroizii, virusurile i micoplasmele i vieuitoare celulare, bacteriile i algele albastre-verzi (cianoficeele). Materialul genetic este reprezentat de o molecul de ADN sau ARN, necomplexat cu proteine histonice sau nehistonice. Cromozomul procariotelor se gsete n contact direct cu citoplasma, deoarece compartimentarea celular i specializarea membranelor este abia schiat. Viroizii sunt ageni infecioi reprezentai de o molecul scurt de ARN, lipsii de nveli proteic. Primii viroizi au fost identificai ca ageni ce produc boala cartofilor fuziformi sau stelarea cartofilor, ulterior identificndu-se n cazul mai multor boli grave. Majoritatea viroizilor se gsesc n nucleul celulei gazd, replicarea ARN viroidal depinznd strict de complexul enzimatic al celulei gazd. Virusurile sunt particule infecioase acelulare, submicroscopice, care produc bolile cunoscute sub denumirea de viroze. Virusurile atac toate organismele, de la bacterii (bacteriofagi), pn la celulele animale i vegetale. Virusurile sunt lipsite de complexul enzimatic necesar sintezei de substane energetice i reproducerii. De aceea, virusurile folosesc mecanismele i organitele celulei gazd pentru reproducere, fiind considerate organisme parazite obligatoriu sau, altfel spus, parazite la nivel genetic. Celula gazd produce i
16

furnizeaz precursorii necesari replicrii moleculei de acid nucleic viral i a proteinelor virale, care apoi se asambleaz, rezultnd o nou particul viral. Particulele virale, de obicei, lizeaz (distrug) membrana celulei gazd, putnd produce noi infecii. Structura particulei virale a fost descoperit de A.D. Hershey i M. Chase, n anul 1952. Particula viral este alctuit dintr-un nveli proteic, denumit capsid, format dintr-o singur protein sau din mai multe proteine stratificate, iar la virusurile mai mari se adaug lipide i glucide. Capsida poate avea diverse forme, n funcie de natura subunitilor proteice, care au fost denumite capsomere. La unele virusuri (R17, F2, virusul herpesului), capsida poate fi nconjurat de un nveli proteic extern (anvelop extern) cu ajutorul cruia fagul ader pe membrana celulei gazd. n interiorul capsidei se gsete materialul genetic reprezentat de o molecul de ADN (dezoxiribovirusuri) sau o molecul de ARN (ribovirusuri), de mrimi diferite, specifice fiecrui tip de virus. La unii bacteriofagi (virusuri ale bacteriilor) capsida se continu cu o coad cu simetrie elicoidal, la ale crei extremiti sunt prezente mai multe filamente codale, ce asigur contactul cu celula parazitat (figura 2.1.).

Fig. 2.1. Structura celulei la procariote: A-dezoxiribovirus; B-micoplasm; C-bacterie; D-cianoficee (mz-mezozom, rb-ribozom, p-peretele celular, pl-plasmalema, r-produs de rezerv, t-tilacoid) (dup Roland i Szllsi)

Micoplasmele sunt organisme extrem de simple, care nu au perete celular fiind delimitate de plasmalem, n interiorul creia se gsesc cteva sute de ribozomi i un cromozom reprezentat de o molecul de ADN. Dei au o structur foarte simpl, sunt capabile s-i sintetizeze n mod independent proteinele i ATP necesare metabolismului. Micoplasmele produc o serie de boli att la animale (pleuropneumonia taurinelor), ct i la plante (stolburul solanaceelor, cloroza asterului, nanismul porumbului etc.).
17

Celula bacterian. Este delimitat la exterior de un perete celular rigid, alctuit din glicoproteine complexe (de tipul mureinelor), care, n funcie de structura chimic, confer acesteia caracteristicile de imunitate i patogenitate. Plasmalema, de natur lipo-proteic este situat pe faa intern a peretelui celular, delimitnd citoplasma. Citoplasma nu este omogen din punct de vedere structural, nglobnd o serie de vezicule membranoase, microfibrile, ribozomi, glucide de rezerv etc. Zona central a citoplasmei cuprinde o mas dens de microfibrile, reprezentnd molecula de ADN, ce constituie materialul genetic. ADN este bicatenar, circular, necomplexat cu histone, cu o lungime de aproape 1 mm. Aceast molecul de ADN constituie cromozomul sau genoforul bacterian. n jurul su citoplasma este mai dens, rezultnd aa numitul nucleoid, care este lipsit de membran i nucleol. Cercetarea electronomicroscopic a bacteriilor a evideniat o serie de invaginri tubulare sau lamelare ale plasmalemei, denumite mezozomi. Mezozomii sunt accesorii ale genoforilor implicai n activitatea respiratorie, replicarea semiconservativ a ADN i diviziunea celulei (F. Jacob, 1966). Cianoficeele (algele albastre-verzi) sunt cele mai vechi organisme cunoscute, unicelulare, de form filamentoas (Oscillatoria), globuloas (Spirulina), care au o organizare destul de apropiat celei bacteriene. La cianoficee, invaginaiile plasmalemice au forme aplatizate, grupate n pachete de vezicule membranoase, denumite tilacoide, ce conin pigmeni fotosintetizatori.

2.2. STRUCTURA CELULEI EUCARIOTE

Celula eucariot, vegetal sau animal, delimitat de membrana celular este alctuit din protoplasm, care conine dou componente fundamentale: citoplasma i nucleul. Citoplasma are o compartimentare strict, coninnd organite citoplasmatice lipsite de membran (microtubuli, centrioli, microfilamente, ribozomi), cu membran simpl (reticul endoplasmic, aparatul Golgi, lizozomi, peroxizomi, glioxizomi, lomazomi) i cu membran dubl sau anvelop (nucleu, plastide, mitocondrii) (Toma C. i colab., 1995). Membrana celular. Constituie nveliul extern al celulei i are rol de efector al controlului schimburilor de substane dintre coninutul celulei i mediul ambiant. Ea este reprezentat de stratul bimolecular fosfolipidic, care poart pe faa sa extern un strat proteic bogat n hidrai de carbon, iar pe faa sa intern un singur lan proteic. La microscopul electronic apare format din dou straturi, fiecare de cte 20 grosime, ntre care se afl un spaiu clar de 35 . La animale, celula are la exterior doar membrana plasmatic. La plante, celulele sunt nvelite n plus, la exterior, de un perete celular impregnat cu celuloz, lignin, sruri sau alte substane. Aceasta prezint o mare importan economic, cum ar fi de exemplu n cazul plantelor textile, de la care se obin fibre pentru industria textil.
18

Structura i funciile membranei plasmatice sunt determinate genetic. Ea are un rol fiziologic i biochimic n viaa celulei, fr a participa direct la activitile formative i de transmitere ereditar. Citoplasma. Reprezint partea celulei situat ntre membrana plasmatic i membrana nuclear. Este alctuit dintr-o matrice citoplasmatic i organite citoplasmatice. Matricea const dintr-o plasm coloidal, reprezentnd un sistem heterogen format din lanuri macromoleculare i agregate moleculare, precum i enzime, substane metabolice de rezerv etc. Organitele citoplasmatice, caracteristice principial pentru toate celulele sunt: reticulul endoplasmic, mitocondriile, ribozomii, corpusculii Golgi (prezente n toate celulele), cloroplastele (la speciile vegetale fototrofe), centriolii (n celulele animale, la unele alge i ciuperci), lizozomii (n celulele animale i, probabil, ale unor plante). Reticulul endoplasmic. La microscopul electronic n citoplasm a fost descoperit un sistem de cisterne, vezicule i canalicule, denumite de K. Porter (1953) reticul endoplasmic. Canaliculele au un diametru de 500 , iar cisternele pn la 1500 . Starea n care la plante i animale ribozomii sunt ataai de reticulul endoplasmic s-a numit ergastoplasm. Mitocondriile. Sunt organite citoplasmatice care se gsesc n mod obinuit n toate celulele. Ele au fost studiate la animale mai mult dect la plante, dei, n general, au aceeai structur i funcie. Mitocondriile variaz ca mrime, de la 0,2 (limita de rezoluie a microscopului obinuit) pn la civa . Mitocondriile au diferite forme, dup celulele din care fac parte (bastonae, filiforme, sferice etc.). n celula vie ele apar mobile, fiind antrenate de micrile citoplasmice. Numrul acestor organite variaz de la un esut la altul; astfel, se gsesc n numr mare n celulele ce aparin unor esuturi cu activitate intens (celulele meristematice, miofibrile, tuburile renale etc.). Mitocondriile sunt nconjurate de o membran dubl, asemntoare aceleia de la exteriorul celulei. Membrana intern formeaz numeroase invaginri (criste mitocondriale), care mresc foarte mult suprafaa activ a mitocondriilor. Aceste organite constituie centrul unor trepte ale procesului de respiraie aerob. Ele posed enzimele necesare cu rol n oxidarea grsimilor i de fosforilare. Studiul complex al mitocondriilor a relevat existena unui ADN mitocondrial i a unui aparat enzimatic propriu, ce permite sinteza unor proteine caracteristice. ADN din mitocondrii este bicatenar, circular, asemntor ADN bacterian. De asemenea, cercetrile asupra ribozomilor mitocondriali au relevat faptul c acetia sunt de tip bacterian (cu o constant de sedimentare de 70 S). Pe aceast baz s-a tras concluzia c mitocondriile (ca i plastidele) deriv din organisme procariote, care au invadat celulele eucariotelor i s-au subordonat nucleului acestora. ntr-o mitocondrie pot exista pn la 6 molecule de ADN, n cantitate de 10-6-10-7 g (Borst i colab., 1967). Aparatul genetic mitocondrial explic
19

localizarea unor nsuiri la nivelul citoplasmic, deoarece astzi se tie precis c mitocondriile au proprietatea de a crete, de a se divide i posed continuitate celular i genetic. Genomul mitocondrial la metazoare este constant, alctuit din 37 gene, cu diferite roluri: 13 gene codific sinteza diferitelor proteine mitocondriale, 22 de gene responsabile de sinteza moleculelor specifice de ARNt i 2 gene ce dein informaia genetic necesar sintezei subunitilor mari i mici ale ribozomilor (ARNr). Genomul mitocondrial al plantelor este mult mai complex, dar, funcional, difer foarte puin de cel al metazoarelor. Genele mitocondriale se transmit pe cale citoplasmatic, pe linie matern. Mutaiile care apar la nivelul mitocondriilor afecteaz n primul rnd funciile de respiraie. Aceste mutaii pot s apar cu o frecven relativ mare i se transmit pe linie matern la descendeni. Ribozomii. Sunt corpusculi submicroscopici cu dimensiuni cuprinse ntre 50-300 , care se gsesc n citoplasm, cloroplaste, mitocondrii. Ribozomii conin acizi ribonucleici ribozomali i proteine ribozomale n proporie de aproximativ 1:1. Din cauza coninutului ridicat n acid ribonucleic ribozomal (ARNr), G. E. Palade (1953), descoperitorul acestor particule, le-a denumit ribozomi. Ei se gsesc liberi n citoplasm sau fixai de reticulul endoplasmic. n celul, ribozomii ndeplinesc un rol deosebit de important, prin participarea lor la sinteza proteinelor. Ei se gsesc n cantitate mare n esuturile cu diviziuni celulare intense, n care sinteza proteic se realizeaz, de asemenea, intens. n sinteza proteic, ribozomii devin activi prin asocierea lor cu moleculele de acid ribonucleic mesager (ARNm) mpreun cu care formeaz poliribozomi. Ribozomii liberi particip la sinteza proteinelor necesare proceselor de difereniere celular, a unor proteine cu funcii specifice i de formare a organitelor citoplasmatice, n timp ce ribozomii ataai reticulului endoplasmic particip la sinteza proteinelor destinate secreiei celulare i depozitrii proteinelor sintetizate la nivelul celulei. n ceea ce privete originea ribozomilor, cercetrile au artat c la nivelul nucleolului se produce sinteza componentelor de baz ale acestora (ARNr i proteine ribozomale), care la nivelul citoplasmei se asambleaz n proporie egal. Ribozomii au mrimi diferite i se pot clasifica dup constanta de sedimentare (S) la ultracentrifugare n: categoria de 70 S (140-180 ) prezeni la bacterii i alge verzi i de 80 S (260-300 ) prezeni n celulele eucariotelor (plante superioare, criptogame i animale). Sub aciunea ionilor de Mg2+, ribozomii se pot uni ntre ei formnd structuri polimere sau se pot descompune n subuniti. Aa de exemplu, la Escherichia coli s-a descoperit c ribozomii de 100 S sunt formai din 2 particule ribozomale de 50 S. Cloroplastele. Sunt organite prezente n citoplasma celulelor vegetale. Ele conin clorofil ce imprim culoarea verde esutului n care se gsesc, iar prin implicarea lor n procesul de fotosintez dein rolul de productori primari.
20

Prezena cloroplastelor n celule nu este permanent, ele se formeaz, ca i mitocondriile, cu care au trsturi comune, din formaiuni submicroscopice, cu dimensiuni de aproximativ 500 , numite proplastide. Studiile de microscopie electronic au evideniat 3 componente structurale ale cloroplastului: membrana dubl la exterior, stroma sau substana fundamental a cloroplastului i grana, un ansamblu de structuri bogate n clorofil. Membrana cloroplastului este dubl, ntre cea extern i cea intern fiind un spaiu liber. De obicei, la majoritatea plantelor, cele dou membrane sunt netede, ns la unele (plantele de tip C4), membrana intern prezint o serie de cute duble, care mresc suprafaa funcional a acesteia. Din punct de vedere biochimic i fiziologic, cele dou membrane se deosebesc: membrana extern este permeabil pentru moleculele cu greutate molecular mic, iar cea intern regleaz schimburile moleculare ntre strom i hialoplasm printr-o serie de molecule transportoare ce le conine (Toma C., 1995). Stroma este alctuit din substana fundamental i o serie de incluziuni, cum ar fi: granule de amidon, nucleotide grupate n fibrile de ADN, ribozomi, plastoglobule osmiofile. Substana fundamental este constituit din proteine, n mare parte enzime ce particip la replicarea ADN cloroplastic, sinteza ARNm (transcripie) i a moleculelor specifice fotosintezei. Pe lng proteine, substana fundamental conine un numr mare de molecule organice, din grupa zaharurilor, aminoacizilor, nucleotidelor, dar i ioni de Mg2+ i PO3-. Grana este un sistem membranar complex alctuit din particule verzi denumite granum, bogate n clorofil, de diferite tipuri, implicat n fotosintez. Prin constana i continuitatea celular, cloroplastul ndeplinete caracteristicile de baz ale materialului genetic. ADN cloroplastic este o molecul bicatenar, circular, cu o circumferin de 40-50 , ataat de membrana cloroplastului asemntor cromozomului bacterian. Pe lng ADN, ce stocheaz informaia genetic, cloroplastul posed ntregul complex macromolecular necesar replicaiei, transcripiei i translaiei acesteia: ADN-polimeraze, ARNpolimeraze, ARNm, ARNs, ARNr. La plantele superioare, genomul cloroplastic este alctuit din aproximativ 120 de gene: 4 gene pentru sinteza proteinelor ribozomale din cloroplast, gene ce codific subuniti ale polimerazelor, proteinele fitosistemelor I i II, ATP-sintetazei, 30 de gene pentru ARNs i n jur de 40 de gene ce codific proteine cu funcii nc necunoscute (Raicu P., 1997). O caracteristic important a plastidelor, i deci i a cloroplastelor, este aceea c, de regul, se transmit pe cale citoplasmatic, cel mai frecvent pe linie matern. Aparatul Golgi. A fost descoperit de Camillo Golgi (1844-1926), n anul 1898, mai nti n celulele nervoase animale. Ulterior, s-a evideniat n toate celulele animale i vegetale. Aparatul Golgi este bine dezvoltat n toate celulele active, reducndu-i extinderea n celulele aflate n repaus i dispare n celulele btrne. Este alctuit
21

din uniti morfologice i structurale denumite dictiozomi, complexate cu vezicule golgiene. Dictiozomii sunt formai din elemente de form tubular sau vezicular, aplatizate, curbate i dilatate la capete, delimitate de o membran lipoproteic. Veziculele golgiene, delimitate de membrane lipoproteice rezult din dictiozomi, printr-un proces de nmugurire lateral a tuburilor sau veziculelor. Cercetrile recente susin c originea aparatului Golgi este membrana nuclear (unele ciuperci i alge brune) sau ergastoplasma (n celulele animale i ale plantelor superioare). Complexul Golgi este localizat n apropierea nucleului, avnd un rol deosebit de important n transformarea unor substane sintetizate la nivelul reticulului endoplasmic i orientarea acestora spre plasmalem, pentru a fi utilizate n alte sinteze sau pentru a fi eliminate n exteriorul celulei. n afara rolului deinut de aparatul Golgi n procesele de secreie, la plante, veziculele golgiene particip la formarea fragmoplastului i a lamelei mediane n citokinez i chiar n regenerarea plasmalemei. Dup Fain-Maurel, 1992, aparatul Golgi, prin interaciunile sale cu reticulul endoplasmic granular (ergastoplasma), unde are loc sinteza i descompunerea proteinelor de secreie i biogeneza membranelor celulare, constituie "placa turnant a metabolismului celular i a traficului membranar" (Toma C. i colab., 1997). Centrozomul. Este o formaie citoplasmic ce se gsete n apropierea nucleului i care apare la microscop sub forma unei zone clare, luminoase, omogene, cu un centru granular opac, alctuit din doi centrioli. El este prezent n toate celulele animalelor i la plantele inferioare (lipsete la angiosperme). n jurul centrozomului se observ filamente radiare ce formeaz aa-numitul aster, precum i tubulii fusului de diviziune. Acestea apar numai n timpul diviziunii mitotice. Centrozomul joac rol important n diviziunea celular. El se divide n doi centrozomi-fii, numii sfere directrice. n jurul fiecruia se formeaz cte un aster. Sferele directrice se deplaseaz apoi spre cei doi poli ai celulei. Datorit autoreplicrii, n fiecare centrozom se gsesc doi centrioli. Acetia sunt nzestrai, n general, cu continuitate genetic. Centriolii se separ n structuri duplex la nceputul fiecrei noi diviziuni (profaza urmtoare). n citoplasm se afl factorii ereditari responsabili pentru ereditatea extranuclear - plasmagenele. O schem general a structurii celulei, alctuit dup imaginile obinute la microscopul electronic este prezentat n figura 2.2. NUCLEUL Datorit componentelor sale principale, cromozomii, nucleului i s-a acordat o deosebit atenie n cercetrile de genetic. De peste 200 de ani de cnd se studiaz acest principal element al celulei s-au acumulat multe date n legtur cu structura lui fizic, chimic i funcional.
22

La organismele eucariote, n majoritatea cazurilor, nucleul are o form ovoid i ocup zona central a celulei. La celulele cu metabolism intens, nucleul ia contururi foarte neregulate. De exemplu, nucleii din celulele endospermului leguminoaselor au form spiralat. Forme neregulate iau i nucleii unor esuturi bolnave, a cror activitate metabolic se mrete (celula canceroas).

Fig. 2.2. Schema unei celule alctuit dup datele obinute cu microscopul electronic (dup Brachet, 1961)

n timpul diviziunii, nucleul sufer schimbri structurale. n perioada dintre dou diviziuni, n interfaz, nucleul se caracterizeaz printr-o intens activitate de schimb cu citoplasma, din care cauz acestei perioade i s-a dat denumirea de perioad metabolic sau energetic. Nucleul ocup, de obicei, 10-20% din volumul celulei i conine 1525% din azotul acesteia. Excepie fac spermatozoizii i anterozoizii, la care citoplasma ocup un volum foarte mic.
23

La microscopul fotonic, nucleul apare cu o structur omogen, iar la cel electronic cu o structur mai complex, constituit dintr-o reea fin de fibre. Pentru a studia compoziia chimic a nucleului, el trebuie izolat de restul celulei. Pe baza analizei cantitative s-a stabilit c nucleul conine 14% ADN, 12% ARN, 22,5% proteine bazice i 51,5% proteine stabile. Din proteinele bazice fac parte protaminele i histonele, bogate n aminoacizii lizin, histidin i mai ales arginin. ADN se gsete n structurile cromatice, n timp ce ARN mai ales n nucleoli. n nucleu se mai gsesc enzime, lipide, ioni de Ca2+, Mg2+, Cu2+ etc. Nucleul este delimitat la exterior de o membran nuclear i conine n interior nucleoplasma, cromatina i nucleolii. Aa cum s-a precizat, la procariote, reprezentate de organisme unicelulare, nucleoidul este difuz i fr membran. Nucleoidul nu este complexat cu proteine bazice de tipul histonelor. Acesta se divide prin amitoz. Membrana nuclear. Datele actuale cu privire la membrana nucleului au fost obinute cu ajutorul microscopului electronic. Ea apare format din 2 foie, lipoproteice tripartite, fiecare cu o grosime de 75 , separate printr-un spaiu de 100 pn la 1000 . Structura membranei nucleare este foarte asemntoare cu aceea a membranei mitocondriilor. Spre deosebire de aceasta, ea este prevzut cu un sistem de pori ce permite schimbul de substane ntre nucleu i citoplasm i chiar direct cu exteriorul celulei. Marginile unui por sunt n legtur cu 8 fibre de cromatin cu diametru de 200 , alctuite din ADN i proteine histonice, dispuse sub forma unui ghem. Ultrastructura membranei nucleare este foarte complicat i joac un rol tot att de complex n schimburile nucleo-plasmatice. Muli cercettori consider membrana nuclear un domeniu n care se acumuleaz substane, se organizeaz n structuri, de unde migreaz n citoplasm. Cromatina. Este un complex biochimic constituit din fibre nucleoproteice (proteine i ADN) n proporie de aproximativ 96%, mai multe tipuri de holoproteine i fosfolipide. Se prezint sub forma unor aglomerri granulare, n vecintatea membranei nucleare. Unitile structurale ale cromatinei sunt nucleosomii, alctuii din molecule de ADN i 4 fracii de proteine histonice (H2A, H2B, H3 i H4). La fiecare nucleosom se asociaz fracia histonic H1, care joac un rol important n spiralizarea fibrelor de cromatin. Cariolimfa. n interiorul nucleului se gsete un lichid n stare de sol numit cariolimf, nucleoplasm sau suc nuclear. El conine proteine, lipoizi, enzime, acizi nucleici, o serie de cationi (Na, Ca, Mg) .a. n ultimul timp s-a determinat n cariolimf prezena unei structuri reticulare, asemntoare reticulului endoplasmic, dar mult mai fin, care conine bicatene de ADN ce formeaz complexe cu histonele i cu proteinele nehistonice, reprezentnd procromozomii. Filamentul de cromatin este lung i se gsete sub form despiralizat. Se cunosc puine date n legtur cu structura filamentului de cromatin, deoarece este prea fin pentru puterea de mrire a microscopului obinuit i prea
24

mare pentru cea a microscopului electronic. Densitatea i compoziia chimic a cariolimfei variaz n funcie de starea funcional a celulei. Nucleolul. Nucleolii sunt globuli refringeni, vizibili la microscopul obinuit sau cu contrast de faz, n interfaz. Numrul lor variaz n funcie de specie, fiind ns constant n celulele aceleiai specii. Dimensiunile nucleolilor depind de mrimea nucleului, durata interfazei, funcia celulelor .a. Nucleolii se formeaz n zona constriciei secundare a cromozomilor, asociai cu o anumit regiune denumit organizator nucleolar. n timpul diviziunii mitotice, nucleolii sufer un ciclu de transformri inverse acelora prin care trec cromozomii. Ei sunt vizibili n interfaz, dispar n profaz i reapar la sfritul anafazei. La microscopul electronic nucleolii apar constituii din aglomerri granulare de elemente filiforme. Din punct de vedere chimic nucleolii cuprind dou grupe de substane (proteine i acid ribonucleic), care formeaz un complex ribonucleoproteic. Pe lng aceste substane, nucleolul mai conine i o cantitate mare de fosfolipide i alte lipide. El sintetizeaz o mare cantitate de ARN care migreaz n citoplasm.

2.3. ORGANIZAREA GENOMULUI LA EUCARIOTE

Cromozomii sunt structuri permanente n nucleul celulei i constituie materialul genetic de baz. n cromozomi sunt localizate genele. La microscopul fotonic cromozomii devin vizibili numai n timpul diviziunii celulare. Cu ajutorul unor tehnici perfecionate de investigaie s-a stabilit c ei sunt prezeni tot timpul n celul, dar sufer unele schimbri n diferitele etape care se succed n viaa celulei. Numrul i structura lor genetic rmn ns constante de-a lungul generaiilor.

2.3.1. Morfologia cromozomilor

Aspectul cromozomilor poate fi bine studiat n cursul diviziunii celulare mitotice, n metafaz, cnd se coloreaz foarte intens. Ei sunt constituii din perechi identice, dar diferii ca mrime i form de la pereche la pereche. La speciile dioice exist o pereche de cromozomi, care difer morfologic de la un sex la altul, denumii heterozomi sau cromozomi ai sexului, avnd un rol special n determinarea sexului. Celelalte perechi de cromozomi, care alctuiesc majoritatea cromozomilor poart numele de autozomi. Segmentul cromozomic situat terminal fa de constricia secundar a cptat denumirea de satelit. Satelitul servete la identificarea cromozomilor cu organizator nucleolar. Deci, numrul nucleolilor dintr-un nucleu este egal cu numrul cromozomilor cu satelit. Fiecare cromozom este format din dou cromatide unite printr-o formaie cu diametrul mai mic dect al cromozomului numit centromer. Deoarece n zona centromerului cromozomul are diametrul mai mic, acestei zone
25

i s-a dat denumirea de constricie primar (spre deosebire de constricia secundar din regiunea organizatorului nucleolar). Centromerul are un rol important n timpul diviziunii celulare deoarece servete la ataarea cromozomilor de fibrele fusului nuclear, fiind considerat motorul neurochimic ce determin deplasarea cromozomilor n mixoplasma celulei n diviziune, iar n meioz determin sinapsa cromozomilor omologi i constituie locul ce marcheaz separarea cromatidelor la sfritul metafazei i nceputul anafazei. Structura centromerului cuprinde trei zone: kinetocorul, situat pe faa extern a fiecrei cromatide, o zon central cu o grosime mai mare i o zon intern responsabil de interaciunea dintre cromatide n subfaza G2, profaz i metafaz. Kinetocorul este un complex proteic sintetizat pe baza informaiei genetice a ADN din regiunea centromerului. Poziia centromerului n cromozom determin formarea a dou brae egale sau inegale, prin urmare existena mai multor tipuri morfologice de cromozomi: - metacentrici, centromerul este plasat la jumtatea distanei dintre cele dou capete, braele fiind egale; - submetacentrici, centromerul este localizat submedian, braele fiind inegale; - acrocentrici, centromerul este localizat subterminal, braele fiind accentuat inegale (figura 2.3.). Cromozomii telocentrici, cu centromerul situat strict terminal, nefiind stabili, s-a renunat la aceast grup morfologic (Swanson i colab., 1981, citai de Crlan M.,1996).

Fig. 2.3. Tipuri de cromozomi: a-metacentric; b-submetacentric; c-acrocentric; d-cromozomi de Lilium; P-constricie primar; S-constricie secundar, zona organizatorului nucleolar

Extremitile cromatidelor sunt delimitate de formaiuni denumite telomere. Telomerele reprezint zone n care cromatina este puternic condensat, asigurnd stabilitatea i individualitatea cromozomilor pe parcursul diviziunii celulare. Telomerele mpiedic fuzionarea cromozomilor cap-la-cap n metafaz i anafaz.
26

Fragmentele de cromozom fr centromer sunt capabile de a se replica, dar incapabile de a se orienta n mitoz spre polii celulelor. Unele cercetri efectuate la coccidii i scorpioni, dar i la plante (Luzula) au pus n eviden prezena unor centromeri dispersai pe toat lungimea cromozomului (centromeri difuzi). Aceti cromozomi policentromerici, n timpul diviziunii mitotice se pot fixa prin oricare segment, de tubulii fusului de diviziune. Centromerul este o formaiune capabil de autoreplicare. Diviziunea cromozomului este precedat de diviziunea centromerului, care implic replicarea ADN centromeric, ce acioneaz ca un locus al formrii kinetocorului. El se coloreaz foarte puin i adesea este acromatic i Feulgen negativ. Forma cromozomilor. Este caracteristic fiecrei specii, dar poate varia, n funcie de specializarea celulei n esut, de starea fiziologic a celulei i de influena diferiilor factori externi. O celul somatic de la Drosophila melanogaster n cursul diviziunii mitotice (figura 2.4.) are patru perechi de cromozomi i anume: dou perechi de forma literei V, o pereche de form sferic i o pereche heteromorf: la masculi, alctuit dintr-un cromozom sub form de bastona i unul sub form de crlig, n timp ce la femel ambii cromozomi ai perechii sunt identici. Aceti cromozomi au rol n determinarea sexului.

Fig. 2.4. Cromozomii somatici la Drosophila melanogaster ()

n celulele somatice cromozomii sunt perechi. Cromozomii unei perechi au aceeai form, mrime i aceleai gene alele i se numesc cromozomi omologi. n fiecare pereche de cromozomi omologi, unul este de provenien matern, iar cellalt, patern, caracteristic determinat de faptul c celula-ou (zigotul), rezultat al fecundrii, cumuleaz setul haploid de cromozomi ai mamei i ai tatlui. n metafaz, cromozomii se prind de fibrele fusului de diviziune la nivelul centromerului, lund forma de U, L, V, .a. Clivajul longitudinal ncepe ntotdeauna n acelai loc. Toate acestea demonstreaz, n plus, individualitatea pronunat a cromozomilor. Mrimea cromozomilor. Variaz n funcie de specie i, ntr-o msur foarte mic, de unele condiii de mediu. Ca lungime, pot atinge valori cuprinse ntre 0,1-30 , iar ca grosime valori de 0,1-2 . S-ar prea, n general, c mrimea
27

lor este proporional cu mrimea celulei i invers proporional cu numrul lor. De asemenea, cercetrile arat c lungimea cromozomului este, n general, proporional cu numrul de gene pe care le conine. Anumii factori de mediu pot influena mrimea cromozomilor. De exemplu, scderea temperaturii face ca n celulele vegetale n plin diviziune s apar cromozomi mai contractai, mai scuri. Prezena alcaloidului colchicin, n timpul diviziunii celulare, scurteaz, de asemenea, cromozomii. Numrul de cromozomi. Este relativ constant pentru indivizii ce alctuiesc o specie de plante sau animale. Acest numr variaz n limite mari la diferite specii, de la doi ci ntlnim n celulele somatice la Ascaris megalocephala, pn la cteva sute (Amoeba proteus). n celulele somatice numrul lor este dublu (diploid) i se noteaz cu 2n, iar n celulele sexuale este redus la jumtate (haploid) i se noteaz cu n. n tabelul 2.1. se indic la cteva specii de plante i animale numrul n i 2n de cromozomi. Tabelul 2.1. Numrul de cromozomi la diferite specii de plante i animale
Plante Triticum monococcum Triticum durum Triticum aestivum Zea mays Oryza sativa Secale cereale Hordeum sativum Medicago sativa Medicago lupulina Trifolium pratense Trifolium repens Trifolium hybridum Vicia sativa Vicia faba Pisum sativum Solanum tuberosum Helianthus annuus Beta vulgaris Cannabis sativa Vitis vinifera Pyrus communis Malus baccata Neurospora crassa Escherichia coli n 7 14 21 10 12 7 7 16 16 7 14 8 6 6 7 24 17 9 10 19 17 17 7 1 2n 14 28 42 20 24 14 14 32 32 14 28 16 12 12 14 48 34 18 20 38,76 34,51 34 --Animale Drosophila melanogaster Culex pipiens Bombyx mori Plasmodium malariae Ascaris megalocephala Cyprinus carpio Musca domestica Blatta orientalis Apis melifera Rana esculenta Gallus domestica Columba liva Lepus cuniculus Mus musculus Cannis familiaris Capra hircus Equus caballus Sus scrofa Ovis aries Bos taurus Felis domestica Felis tigris Cotumix cotumix Homo sapiens sapiens n 4 3 14 1 1,2 52 6 24 8,16 13 38 40 22 20 39 30 33 20 27 30 19 19 40 23 2n 8 6 28,56 2 2,4 104 12 48 16,32 26 76,78 79,80 44 40 78 60 66 40 54 60 38 38 80 46

Simbolul x indic numrul haploid de cromozomi ai speciilor diploide strmoeti denumit numr de baz, numr monoploid sau genom.
28

n celulele somatice cromozomii sunt perechi, iar din punct de vedere morfologic apar, n general, ca nedifereniai. Dei numrul lor reprezint un caracter de specie, se pot ntlni specii cu acelai numr de cromozomi, cu toate c aparin unor grupe ndeprtate din punct de vedere sistematic. Acest numr nu este legat deci de poziia sistematic a speciei n lanul filogenetic. Numrul i morfologia cromozomilor pentru diferite forme apropiate pot ns s fie folosite ca indicaii pentru nrudirea filogenetic a formelor de plante sau animale. Pe aceste constatri se bazeaz ramura sistematicii numit kariosistematica. Constana numrului de cromozomi este totui relativ. Starea organismului i condiiile externe pot produce modificri asupra numrului de cromozomi n celul. Numrul de cromozomi poate varia n funcie de esutul n care se afl celula. Astfel, n ficatul animalelor numrul garniturilor de cromozomi este un multiplu al numrului de cromozomi din celulele sexuale ale aceluiai organism (4x, 8x etc.). La speciile de plante angiosperme, nucleii din celulele endospermului, datorit fenomenului dublei fecundri, conin trei garnituri de cromozomi, fiind simbolizat 3n. Numrul, forma i mrimea cromozomilor n metafaz, din celulele somatice ale unui organism, sunt indicate prin noiunea de cariotip. n figura 2.5. sunt redate cariotipurile la diferite specii. Nu de mult s-au elaborat diferite metode pentru o identificare mai precis a cromozomilor la diferite specii de plante i animale. Una dintre acestea este i metoda de bandare. n anul 1940, C. Darlington i La Cour au elaborat o metod de colorare a celulelor din esuturile meristematice prin tratarea lor cu temperaturi sczute. Sub influena acestui factor pe cromozom apar benzi mai intens i mai puin colorate. Principalele tehnici moderne de bandare se mpart n 2 categorii: - tehnici bazate pe folosirea unor fluorocromi (quinacrina) ce se leag de ADN. n acest caz benzile caracteristice care apar se numesc benzi Q; - tehnici ce se bazeaz pe procesul de denaturare i renaturare a ADN, urmate de colorare cu colorantul Giemsa. Benzile care apar sunt notate cu G. n afar de benzile Q i G au mai fost descoperite i alte tipuri cum ar fi: C, R, T, N. Procedeele de bandare conduc la identificarea cert a perechilor de cromozomi i a modificrilor lor structurale (figura 2.6.) Structura cromozomului. Cromozomii sunt formai din dou uniti alipite n lungul lor numite cromatide. Cu ajutorul microscopului electronic s-a descoperit c aceste uniti se compun, la rndul lor, din cte dou subuniti numite cromoneme. n fiecare cromozom, dou cromoneme alctuiesc cte o cromatid. n preajma diviziunii celulare, cromonemele se spiralizeaz i se scurteaz. Spiralizarea este inegal, aa c exist zone cu spire mai dense i mai puin dense. La microscopul optic aceste poriuni apar ca o succesiune de granule, nirate ca mrgelele ntr-un irag, denumite cromomere. S-a crezut mult timp c aceste cromomere ar reprezenta uniti
29

funcionale - genele. n realitate, aceste ngrori vizibile sunt poriuni de spirale mai dense ce dau aspectul de granule de culoare mai nchis. Cromomerele includ un numr variabil de gene. Spiralizarea i scurtarea cromozomului este maxim n metafaz, cnd cromozomii apar destul de compaci. n telofaz, ncepe procesul de despiralizare al cromozomilor (figura 2.7.).

Fig. 2.5. Cariotipul la diferite specii de plante 30

O structur important care joac un rol n evoluia cromozomului este heterocromatina. n legtur cu particularitile ei s-au adunat multe date, unele contradictorii, aa nct, pn n prezent, nu s-a cristalizat o concepie unitar asupra acestei formaiuni. Se tie ns precis c n toate stadiile ciclului mitotic unele sectoare ale cromozomului se coloreaz intens. Acestea s-au denumit sectoare heterocromatice, spre deosebire de altele eucromatice, care se coloreaz mai slab. Colorarea mai intens se explic prin creterea densitii spirelor cromonemelor. Sectoarele cu heterocromatin se gsesc, n general, n apropierea centromerului.
Fig. 2.6. Reprezentarea diagramatic a benzilor cromozomice la om (Maximilian C., 1978)

Ele ns, ca localizare, sufer variaii determinate de influena diferiilor factori externi. Se consider c regiunile eucromatice conin, n general, marea majoritate a genelor, n timp ce regiunile heterocromatice sunt practic lipsite de gene. Heterocromatina se poate prezenta sub trei forme: - heterocromatina constitutiv este prezent n toi cromozomii nucleului i este localizat de o parte i de alta a centromerului. Ea se aglomereaz ntr-o mas compact cromatic, care se numete cromocentru. - heterocromatina facultativ, care inactiveaz genele pentru unul din cromozomii X. Se tie c la Drosophila melanogaster, la femel, care are doi cromozomi X, numai unul este activ. n felul acesta se realizeaz o egalitate n funcionarea genelor celor dou sexe la mamifere, deoarece sexul mascul are numai un cromozom X activ. - heterocromatina condensat este distribuit diferit la celulele din diferite esuturi i blocheaz aciunea genelor ce se gsesc n regiunea ei.
Fig. 2.7. Schema evoluiei cromozomilor n mitoz: 1-interfaza; 2,3,4-profaza; 5-prometafaza; 6-metafaza.

31

La unii cromozomi de porumb, n poziii diverse, se observ prezena unor noduli, care se coloreaz puternic, cunoscui sub denumirea de knobi. Numrul i poziia knobilor sunt constante pentru anumii cromozomi. Nu se cunoate precis rolul acestor formaiuni, dac conin sau nu gene. Se presupune c ar avea rol n procesul de gametogenez. O schem general privind structura microscopic a cromozomului este prezentat n figura 2.8.

Fig. 2.8. Morfologia i structura unui cromozom (dup Raicu P., 1997)

Compoziia chimic a cromozomilor. Analiza chimic a cromozomilor a relevat faptul c ei sunt constituii din macromolecule de ADN i ARN, proteine cu nsuiri bazice (histone), proteine acide (nehistone), alturi de alte substane n cantiti mai mici: lipide, magneziu, calciu, enzime. Complexul ADN-histone constituie substana structural fundamental a cromozomului, n timp ce ARN, care se formeaz la nivelul cromozomului, este transferat n citoplasm, avnd rol n procesul de biosintez a proteinelor. Dintre toi componenii cromozomilor, ADN se gsete n cantitate constant. n celulele somatice cantitatea lui este dubl fa de cantitatea din celulele sexuale ale aceluiai organism, variind ns de la specie la specie. ARN se gsete n cromozomi n cantiti foarte variabile, de la 3 la 35%. La fel de
32

variabil este i cantitatea de proteine nehistonice, aceasta fiind sub dependena activitii genelor. n tabelul 2.2. este prezentat compoziia chimic a cromozomilor. Tabelul 2.2. Compoziia chimic a cromozomilor (%)
Sursa Embrion de mazre Mugure de mazre Cotiledon de mazre Ficat de obolan Timus de viel Blastul de arici de mare Larv de arici de mare ADN 39,0 40,0 43,5 47,0 40,2 39,0 33,4 Histone 40,0 52,0 34,5 37,0 46,0 41,0 29,0 Nehistone 11,0 4,0 16,0 15,0 13,0 19,0 35,0 ARN 10,0 4,0 6,0 1,0 0,3 1,0 2,6 ADN activ n transcripie 12,0 6,0 32,0 20,0 15,0 10,0 20,0

2.3.2. Structura molecular a cromozomului

S-au acumulat multe date n legtur cu compoziia chimic a cromozomilor. Nu acelai lucru se poate afirma despre structura molecular a cromozomilor de la organismele eucariote, a configuraiei structurale a elementelor ce alctuiesc aceast compoziie chimic. Microscopia optic nu poate oferi detalii, iar microscopia electronic nu ne ofer nc imagini clare, deoarece cromozomii sunt foarte neregulai i au o lungime prea mare pentru a putea fi observai n ntregime. Din aceast cauz s-a ncercat a se crea diferite modele de structur, care s in seama de prezena unui numr mare de molecule de ADN, de dispunerea unui numr mare de gene pe cromozomi, de posibilitatea dublrii unei singure cromatide, de stabilirea structurii cromozomice i de replicaia ADN. Pn n prezent s-au conturat mai multe ipoteze privind modelul de structur molecular al cromozomului: Ipoteza polifibrilar presupune existena n fiecare cromatid a unui mnunchi de fibre ce corespund macromoleculelor de ADN. Cromozomul ar avea, n acest caz, diametrul de 4000 , fiind format din dou cromatide de cte 2000 . Acestea ar conine subuniti de dimensiunea ADN de 20 . Ipoteza este criticat pentru mai multe motive. Numrul mare de fibre identice ar constitui o risip de material genetic. Se tie c mutaia genetic afecteaz o poriune din molecula de ADN, de asemenea afecteaz o poriune din lungimea cromozomului. Din moment ce afecteaz numai o poriune de fibr nu mai poate fi prezent pe tot segmentul de cromozom. Odat cu clivarea cromozomilor, n timpul diviziunii celulare, mutaia ar fi repartizat numai la una din cele dou celule care se formeaz; ori aceasta contravine proprietii mutaiilor de a fi ereditare. Ipoteza structurii monofibrilare a cromozomului este reprezentat de diferite modele. Potrivit modelului lui J. A. Taylor (1957, 1960, 1963) i E. Freese (1958) fiecare cromatid este constituit dintr-un numr mare de molecule
33

de ADN, dispuse cap la cap, legate ntre ele prin legturi de tipul 3, formate din resturi de fosfoserin asociate nucleotidelor terminale de ADN i legturi de tipul 5 formate din puni difosforice. Al treilea tip de legturi ntre moleculele de ADN ar fi de natur peptidic (legturi H), care au rolul de a asigura stabilitatea structurii cromatidei (figura 2.9.). Un alt model presupus de J. A. Taylor (1958), susine c n lungul cromatidei ar exista o coloan dubl la care de o parte i de alta se leag moleculele de ADN. Replicarea cromatidei s-ar realiza prin clivarea coloanei centrale i separarea catenelor de ADN, dup care fiecare jumtate i reface jumtatea complementar (figura 2.10.).

Fig. 2.9. Modelul lui Taylor i Freese cu privire la structura monofibrilar a cromozomului

Fig. 2.10. Modelul lui Taylor privind structura molecular a cromozomului

Ipoteza fibrei cutate a lui E. J. Du Praw (1970) consider c fiecare cromatid este constituit dintr-o molecul lung de ADN asociat cu proteine, cutat neuniform transversal i longitudinal. n interfaz, fibrele elementare se cuteaz, constituind cromozomul, cu ajutorul unor proteine contractate n metafaz (figura. 2.11.). Aceast ipotez a fost sugerat lui Du Praw de existena inelului de translocaie la Oenothera, unde toi cromozomii sunt asociai. Ca urmare, ntregul set de cromozomi haploizi ar fi format dintr-o singur molecul de ADN gigantic i circular. Modelul nucleosomului a fost conceput pe baza cercetrilor de biochimie, de microscopie optic, electronic i de difracie n raze X. n alctuirea cromozomului de tip eucariot ADN este n cantitate de 1315%, ARN 12-13%, iar proteinele de 68-72%. Aceste procente difer de la specie la specie. La aceeai specie ns, mrirea cantitii de ADN se poate realiza prin
34

multiplicarea numrului de garnituri cromozomice, adugarea unui anumit numr de cromozomi, duplicaia genelor i mrirea cantitii de ADN repetitiv.

Fig. 2. 11. Modelul lui Du Praw cu privire la dispoziia fibrelor ntr-o cromatid: a-transversal; b-longitudinal; c-combinat; d-structura cuaternar a fibrei

ADN din cromozomii de tip eucariot este format din gene structurale (secvene unice de nucleotide) i poriuni care nu dein informaie genetic i au rolul de a ocupa spaiul dintre gene. A doua categorie sunt secvenele de nucleotide intermediar repetitive i care se gsesc n mai multe copii. A treia categorie sunt secvenele de nucleotide nalt repetitive ce se repet ntr-un numr mare de copii i sunt localizate n heterocromatin. Dintre aceste categorii variaia cantitii de ADN din genom este datorat secvenelor de nucleotide repetitive, care n cea mai mare msur sunt nefuncionale. n afar de aceste categorii de secvene mai exist formaiunile denumite palindroame. Ele sunt formate din secvene inversate dnd natere la nite bucle. Privit la microscopul electronic, cromatina apare format din granule cu diametrul de 70-100 , legate ntre ele cu o fibr de 20 . O granul este de fapt un nucleosom, care cuprinde un cilindru turtit de natur histonic n jurul cruia se nfoar un filament de ADN format din 100-140 nucleotide.
Fig. 2.12. Modelul nucleosomului 35

n nucleu, cromatina formeaz un filament de 100 , alctuit din aranjarea liniar a nucleosomilor i un filament cu diametrul de 200-300 format din rsucirea filamentului subire (figura 2.12.).

2.3.3. Tipuri particulare de cromozomi

n afara tipului obinuit al cromozomilor din celulele somatice (autozomi i heterozomi), au fost descoperii n anumite celule i alte tipuri de cromozomi: cromozomi uriai, cromozomi tip "perie de lamp" i cromozomi accesorii sau de tip "B". Cromozomii uriai au fost pui n eviden de Balbiani (1881) n glandele salivare ale larvelor de Chironomus. Ulterior, au fost evideniai i la Drosophila melanogaster, n glandele salivare, n celulele intestinului i a tuburilor lui Malpighi. Aceti cromozomi s-au format prin multiplicarea cromatidelor de peste 1000 de ori, care au rmas ns alipite, neseparate (sinaps mitotic) i despiralizate, fr ca nucleul s se divid. Din cauza numrului mare de cromatide, aceti cromozomi se mai numesc i polyteni. Structura cromozomilor polyteni este aceeai ca a celorlali cromozomi somatici, deosebindu-se de acetia prin lungimea i grosimea lor mult mai mari. Dimensiunile lor foarte mari permit cercetarea unor detalii de structur. Configuraia cromozomilor uriai este alta comparativ cu aceea a cromozomilor somatici obinuii. De exemplu, la Drosophila melanogaster formeaz cinci brae lungi i unul scurt, unite ntr-un singur punct, numit cromocentru. Cromozomii sexului sunt n prelungire formnd un singur bra, cromozomii perechii a doua i a treia formeaz alte patru brae, iar cromozomii perechii a patra un singur bra, foarte scurt (figura 2.13.).

Fig. 2.13. Cromozomii uriai din glandele salivare ale larvelor de Drosophila melanogaster i formarea "puff"-urilor: 1-cromozomii sexului; 2-cromozomii II; 3-cromozomii III; 4-cromozomii IV; a-un disc; b-formarea inelului lui Balbiani; c-un "puff"; d-ipoteza lui Beerman despre structura unui "puff". 36

De-a lungul lor, aceste brae formeaz benzi (discuri) ntunecoase, care alterneaz cu alte benzi, luminoase. Unii autori au presupus c aceste discuri ("discurile lui Balbiani") ar reprezenta locul genelor. Sunt aproximativ 6000 asemenea discuri ntunecoase. n anumite locuri, structura dens a lor se deslneaz formnd funde n jurul cromozomului, crora li s-a dat denumirea de "puff"-uri sau "bulbi". Aici are loc sinteza ARN, sugernd activitatea intens a genelor ce se gsesc n aceste segmente. Cromozomii lampbrush (perie de lamp) au fost pui n eviden n ovocitele vertebratelor n timpul profazei meiozei. Ating lungimea de peste 1000 i sunt considerai cei mai lungi cromozomi care se cunosc pn n prezent. Spre deosebire de cromozomii uriai, ei sunt foarte subiri, ajungnd uneori la limita vizibilitii microscopice. Cromozomii perie de lamp posed un ax central, n lungul cruia sunt nirate cromomerele, din care ies lateral perechi de bucle filiforme, dnd aspectul firelor de pr ale unei perii de lamp (figura 2.14.). Aceste bucle se presupune c sunt spirale ale cromonemei, active din punct de vedere genetic. Ele cresc n profaza I i descresc ctre metafaza I a meiozei. Nu se tie cum au aprut aceti cromozomi. Noua configuraie corespunde unei activiti intense, care contribuie la formarea de rezerve viteline n citoplasma ovocitelor.

Fig. 2.14. Cromozomii perie de lamp (lampbrush) a-schema unui bivalent; b-seciune printr-un singur cromozom; c-structura unei bucle i a cromonemelor

Cromozomii accesorii se gsesc n plus fa de cromozomii autozomi i ai sexului. Spre deosebire de cromozomii obinuii, notai cu "A", cromozomii accesorii se mai numesc i "cromozomii B". Numrul lor difer de la un organism la altul i de la un esut la altul i nu sunt omologi nici ntre ei i nici cu cromozomii obinuii pe lng care se gsesc. Sunt heterocromatici, mici i ineri din punct de vedere genetic. n meioz i mitoz nu se distribuie n mod egal n celulele n care se formeaz. Nu se cunoate nc originea lor, dar dup toate probabilitile s-au format din poriunile mijlocii ale cromozomilor normali, ale
37

cror extremiti s-au ataat altor cromozomi. Nici rolul lor nu este cunoscut. Ei pot lipsi fr a perturba viaa organismelor. Mai curnd s-ar putea considera pgubitoare existena lor. Astfel, la secara tetraploid, atunci cnd cromozomii "B" sunt prezeni, scade fertilitatea polenului i viabilitatea plantelor. Cromozomii suplimentari au fost pui n eviden la insecte, psri, porumb, secar .a.

2.4. ORGANIZAREA GENOMULUI LA PROCARIOTE (BACTERII I VIRUSURI)

Spre deosebire de eucariote, la procariote cromozomul are o organizare mai simpl, nu ns n ceea ce privete i structura lui molecular, care este aceeai la toate organismele. Aceasta a favorizat cercetrile de genetic, virusurile i bacteriile constituind materialul de baz pentru genetica molecular. Virusurile, care sunt cele mai simple forme de via, conin ca material genetic un singur cromozom, n care genele sunt dispuse liniar. Cu unele excepii, numrul de gene este destul de mic. La bacteriofagul T4, de exemplu, sunt prezente cca 200 de gene, n timp ce la fagul 2 numrul lor este de 4-5. La virusuri genomul viral este destul de variat fiind alctuit fie din ADN, fie din ARN (figura 2.15.). Aceti acizi pot fi monocatenari sau bicatenari. Volumul moleculei este aproximativ egal cu volumul particulei virale, ceea ce denot c ea este foarte strns torsionat. Virusurile se reproduc pe seama celulei gazd i din aceast cauz manifest o strict specificitate. Lungimea moleculei de acid nucleic poate fi foarte diferit. La fagul T2 masa este de 1,3 x 108 dal, cu 166.000 pb. La fagul masa este de 3,2 x 107 dal, alctuit din 47000 nucleotide. La bacterii, cromozomul este format din ADN. El este circular i nu este separat de citoplasm printr-o membran, nct relaiile lui cu citoplasma sunt directe.

Fig. 2.15. Cromozomul (ADN) fagului

Cromozomul bacterian reprezint cea mai mare molecul cu rol genetic i conine 2000-3000 de gene. La bacteria Escherichia coli masa moleculei este de 2 x 109 dal, iar lungimea de 1 mm. Genele situate n molecul constituie un grup de nlnuire. Tot la bacterii, pe lng cromozomul circular, mai pot exista i alte molecule de ADN tot de form circular, de dimensiuni mult mai mici, localizate n citoplasm sau ataate cromozomului, numite plasmide. Acestea reprezint un material genetic accesoriu. Exist i o clasificare a materialului genetic accesoriu n mai multe categorii:
38

- plasmide propriu-zise, constituite din uniti genetice cu replicaie (reproducere) autonom, cum ar fi factorul col (care determin sinteza de colicine, cu aciune bactericid), factorul F (care determin sexualitatea la bacterii i asigur capacitatea lor de conjugare), factorul R (care transfer rezistena la antibiotice prin conjugare) etc. - plasmide care pot funciona fie sub form autonom, fie integrate n cromozomi;

2.5. REPRODUCEREA CELULEI

Una din caracteristicile materialului genetic este continuitatea lui celular. Aceasta este asigurat prin reproducerea sa cu mare fidelitate, transmindu-se de la celul la celul, de la prini la urmai. La eucariote, materialul din cromozomi care dicteaz aceast reproducere este ADN. Procariotele conin n cromozomul lor fie ADN, fie ARN. Reproducerea acestor acizi nucleici dicteaz, n ultim instan, reproducerea materialului genetic, a celulelor organismului.

2.5.1. Mitoza
Reproducerea cromozomilor are loc odat cu reproducerea celulelor. Dintre formele de reproducere celular, mitoza este cea mai important i cuprinde duplicarea cromozomilor, a centrilor mitotici i separarea cromozomilor la cei doi poli ai celulei, n vederea formrii a dou celule fiice. Dintr-o celul iniial, prin diviziuni mitotice repetate, se formeaz n mod succesiv 2, 4, 8, 16 celule cu acelai numr de cromozomi care exist n celula iniial. Prin mitoz, materialul genetic, cromozomii, i menin structura i numrul constant. n procesul mitozei se desprind dou etape de baz: diviziunea nucleului (kariokineza) i diviziunea citoplasmei (citokineza). n perioada dintre dou diviziuni succesive, nucleul se afl n interkinez (interfaz). Interfaza. n interfaz nucleul crete i se pregtete de o nou diviziune. Cercetrile efectuate cu izotopi radioactivi i puse n eviden prin autoradiografiere au demonstrat c, n interfaz, cromozomii sunt monocromatidici, iar apoi, fiecare cromatid i reconstituie cromatida pereche, n urma unui proces de sintez a elementelor ce o compun. Dup unele observaii, aceast faz se mparte n trei perioade: G1, n care are loc sinteza proteic, S, n care se produce dublarea cantitii de ADN din celul i G2, n care nceteaz sinteza ADN i se desfoar kariokineza. n interfaz cromozomii sunt despiralizai i conin gene active. Profaza. Este prima faz a mitozei. n nucleu, structura lui reticular se transform n filamente vizibile, rsucite sub forma unui ghem numit spirem. Filamentul, prin rsucire (spiralizare) n jurul axei sale, se scurteaz, se ngroa i prin fragmentare d natere la cromozomi. nc de la nceputul profazei se observ natura dubl a lor. Prin dizolvarea membranei nucleului, cromozomii
39

rmn liberi n citoplasm. Se disting bine cele dou cromatide ca nite benzi longitudinale, paralele sau rsucite. De asemenea, se distinge i centromerul, ca un segment ce unete ntr-o singur structur, cele dou cromatide. Ctre sfritul profazei, n celul se formeaz un fus central filamentos, orientat ctre cei doi poli ai celulei. n celula animal, la sfritul profazei are loc diviziunea centrozomului, duplicarea i desprirea centriolilor, care migreaz ctre cei doi poli, dup care imediat ncepe formarea astrosferei i a fusului de diviziune. Terminarea profazei este indicat de dizolvarea nucleolilor i a membranei nucleare. Substana nuclear se rspndete n apropierea cromozomilor i sunt nc controverse dac ea se depune pe acetia sau rmne n apropierea lor. Aceast substan nsoete cromozomii n tot timpul diviziunii i ajunge astfel n nucleii celor dou celule care iau natere. Membrana nuclear se fragmenteaz n particule foarte mici, care pstreaz ultrastructura dubl i porii membranei. Se preconizeaz i un stadiu intermediar ntre profaz i metafaz, numit prometafaz. Acesta ar corespunde perioadei de dizolvare a membranei nucleare, a migrrii cromozomilor spre ecuatorul celulei i a formrii incomplete a fusului de diviziune. Ansamblul polilor, asterii, fusul acromatic i cromozomii formeaz aparatul mitotic. Apariia fusului constituie cea mai important schimbare structural a celulei de la sfritul profazei. Fusul acromatic este format din fibrile care, privite la microscopul electronic, alctuiesc microtubuli cu diametrul de 200 i din fibre cromozomice ce unesc centromerii de polii fusului. Fusul ncepe s se formeze n citoplasm, cnd nc nucleul mai este delimitat de membran i probabil c structura lui este datorat orientrii paralele a moleculelor proteice ce intr n compoziia lui. Mitocondriile, microzomii i alte organite citoplasmice nu ptrund n zona din interiorul fusului. n ce privete originea fibrelor exist prerea c ele se formeaz la poli, cresc spre cromozomi de ai cror centromeri se prind. O alt prere susine c fibrele se formeaz la nivelul cromozomilor, de unde cresc ctre polii celulelor; aceast prere este mai rspndit dei nu poate explica formarea fusului, care poate avea loc i n lipsa cromozomilor. Metafaza. Cromozomii se inser pe filamentele fusului de diviziune prin cte un punct de inserie din regiunea centromerului. Ei se dispun pe un plan perpendicular la mijlocul fusului, formnd placa ecuatorial. n metafaz, planul ecuatorial se mrete, iar odat cu el i fusul. n acest timp, cromozomii se ndeprteaz uor unul de altul i manifest tendina de a-i orienta braele paralel cu axul fusului. ntotdeauna ei rmn la periferia fusului. n metafaz, cromozomii pot fi bine studiai la microscop, deoarece sunt spiralizai la maximum, compaci i se coloreaz intens. Anafaza. Cromozomii i despart cromatidele prin clivarea lor, dup ce n prealabil s-a produs diviziunea centromerilor. Ei devin cromozomi monocromatidici i alunec pe fusul nuclear ctre cei doi poli ai si. Simultan cu deplasarea cromozomilor, fusul se stranguleaz la ecuator, grbind astfel
40

alunecarea cromozomilor ctre polii celulei. Centromerii nainteaz spre poli i trag dup ei braele cromozomilor. n cazul n care un cromozom i pierde centromerul, el rmne dezorientat i produce o deviere a mitozei de la mersul normal. Un astfel de cromozom se poate pstra i poate participa la mitoz numai dac se aloc altui cromozom ce posed centromer. Nu se cunoate astzi precis care este cauza i mecanismul de micare al cromozomilor spre cei doi poli ai celulei. n legtur cu explicaia acestor fenomene exist diferite ipoteze, dintre care unele pot fi luate n seam. Astfel, se consider c fiecare cromozom se deplaseaz n urma unei atracii dintre poli i centromeri, altele c ar exista o extindere i apoi o contracie a fibrelor fusului, ceea ce ar contribui la deplasarea cromozomilor. Mai exist i ipoteza c aparatul mitotic ar fi un fel de gel, n care are loc contractarea fibrelor cromozomice, drept consecin a hidratrii acestui gel. Contractarea fibrelor a fost comparat de unii cercettori cu contracia fibrelor musculare. Telofaza. n cursul telofazei, aparatul mitotic se transform. Fibrele fusului dispar, iar cromozomii ajung la cei doi poli, se despiralizeaz, reconstituind filamentele de cromatin, care se subiaz, se alungesc i iau forma unui ghem. Fragmentele membranei nucleare migreaz spre poli, se agreg n jurul filamentelor de cromatin, dnd natere cte unei membrane pentru fiecare din cei doi nuclei care se formeaz. n timpul acesta are loc procesul de reconstituire a nucleolilor n numrul n care au fost prezeni n nucleul iniial. Totodat, corpul celulei se tranguleaz i, prin formarea unui perete despritor, iau natere dou celule. n figura 2.16. este redat schema mitozei. Timpul n care are loc mitoza depinde de esutul n care se gsete celula, de starea fiziologic a organismului i de anumii factori externi. Ea poate dura de la cteva minute pn la 200 minute. S-a stabilit, de asemenea, c mitoza este mai activ n timpul odihnei i somnului la animale sau ntunericului la plante. Dintre toate fazele din tot ciclul mitotic, profaza este cea mai lung (cca 60%), telofaza mai scurt (cca 30%), iar metafaza i anafaza sunt i mai scurte (cca 5%). Citokineza. Diviziunea nucleului este nsoit aproape ntotdeauna i de diviziunea citoplasmei. Se crede c aparatul mitotic ar rspunde i de diviziunea citoplasmei, dar este greu de precizat dac el este absolut necesar pentru realizarea ei. Dei nu se cunosc toate procesele de legtur dintre kariokinez i citokinez, nu trebuie s ne ndoim c ele exist i trebuie s existe. Prerea c aparatul mitotic, n special centrele mitotice de la polii fusului au un rol n citokinez pare a avea o confirmare experimental. n cazul cnd se formeaz un singur pol, ciclul mitotic decurge n ntregime n afara micrii cromozomilor n anafaz, ns niciodat celula nu se divide, nu are loc diviziunea citoplasmei. n cursul diviziunii mitotice structura citoplasmei sufer modificri importante. Membrana nuclear dispare, coninutul cromozomic al nucleului se disperseaz n citoplasm, iar reticulul endoplasmic i modific structura, reducndu-se.
41

Vscozitatea celulei scade treptat, ajunge la minimum n metafaz, dup care crete din nou, ajungnd la starea iniial n telofaz.

Fig. 2.16. Reprezentarea schematic a mitozei la un organism cu 2n=4 cromozomi A-profaz timpurie; B-profaza; C-metafaza; D-anafaza; E-telofaza F-interfaza. 42

Cercetndu-se la microscop mitoza, s-a descoperit c citoplasma se mic n jurul fusului, la nceput paralel cu axul fusului, apoi perpendicular pe el. n acelai timp, n telofaz se formeaz fragmoplastul la ecuatorul celulei, alctuit din totalitatea unor poriuni limitate de membran. Acestea vor forma membrana ce va despri cele dou celule rezultate n urma mitozei. Formarea peretelui despritor ntre cele dou celule este ajutat i de trangularea celulei care se divide. Toi constituienii citoplasmatici se repartizeaz n pri egale n cele dou celule fiice. Din punct de vedere fiziologic, n mitoz celula trece printr-o perioad de scdere a activitii sale. Procesul de sintez proteic scade, dup prerea unora, pn la ntrerupere. Diviziunea mitotic prezint importan, deoarece n timpul ei are loc procesul de dedublare a materialului genetic, iar cromozomii, care apar destul de vizibil n metafaz, pot fi uor studiai la microscop. Amitoza. n afar de mitoz se observ n multe esuturi la plante sau animale o diviziune simpl, n care nucleul i citoplasma se mpart n dou sau un multiplu de doi, formnd mai multe celule. Amitoza a fost constatat n endospermul angiospermelor, n antipodele sacilor embrionari, n celulele somatice ale esuturilor reproductoare, n celulele epiteliului uterin al mamiferelor etc. Caracteristica amitozei este lipsa fusului acromatic. Este posibil ca la originea amitozei s stea dublarea sau multiplicarea cromozomilor n interiorul membranei nucleare, fenomen numit endomitoz. n ultimul timp s-au intensificat cercetrile pentru clarificarea cauzelor ce determin amitoza. Observaiile fcute la endospermul angiospermelor arat c amitoza este prezent nu n fazele timpurii ale dezvoltrii, ci n cele trzii, deci n faza cnd funciile endospermului se reduc la acumularea de substane de rezerv sau la trecerea acumulrii de substane energetice n embrion. Amitoza este caracteristic celulelor cu activitate fiziologic redus. Sunt date care arat c diviziunea mitotic se poate restabili la celulele care una sau mai multe generaii s-au reprodus pe cale amitotic. Endomitoza. Prin endomitoz se nelege multiplicarea numrului de cromozomi n nucleu fr ca membrana nuclear s se dezorganizeze. Cromozomii rezultai se duplic fr a se individualiza, conin un numr mare de cromatide i se numesc politeni. Endomitoza este urmat de creterea n volum att a nucleului, ct i a celulei. Endomitoza se ntlnete la celulele din diferite esuturi, cum ar fi acelea ce cptuesc anterele de la Spinacea oleracea. n nucleul acestor celule se observ la microscop apariia cromozomilor, scurtarea lor (ca i la profaza mitozei), dup care ei nu mai sunt vizibili. Endomitoza este condiionat de anumite stri fiziologice ale celulei, care mpiedic formarea aparatului mitotic.

43

2.5.2. Meioza
Meioza reprezint o form de diviziune celular caracteristic organismelor ce se nmulesc pe cale sexuat i n urma creia din celulele somatice cu 2n cromozomi se formeaz celulele sexuale cu n cromozomi. Reducerea numrului de cromozomi este fenomenul invers procesului de dublare al lor, care are loc n urma fecundrii. Dac organismele ar forma celule sexuale cu acelai numr de cromozomi ca n celulele somatice, n fiecare generaie numrul de cromozomi din celulele organismelor s-ar dubla. Meioza asigur, deci, meninerea constant a numrului de cromozomi de-a lungul generaiilor la organismele ce se nmulesc sexuat. Meioza cuprinde dou diviziuni succesive: meioza primar, numit i heterotipic sau reducional, n care din celulele diploide se formeaz celule haploide i meioza secundar sau homeotipic, n care din celulele haploide se formeaz tot celule haploide. n meioza primar, fazele prin care trece diviziunea celular sunt aceleai ca la diviziunea mitotic, numai c profaza este mult mai complex i cuprinde mai multe stadii: leptonema, zigonema, pachinema, diplonema i diachineza. Profaza I. n stadiul de leptonema, nucleul se mrete n volum. Cromozomii apar iniial sub forma unor filamente foarte fine, n lungul crora se pot distinge nite ngrori, cromomerele, ca urmare a unor zone mai dense de spiralizare a lor. Aparent, filamentul este format dintr-o singur cromatid, din care cauz cromozomii se numesc monovaleni, iar numrul lor este egal cu 2n. Stadiul de zigonema corespunde cu mperecherea cromozomilor omologi, doi cte doi, formnd perechi sau cromozomi bivaleni. Fenomenul de alturare a celor doi cromozomi n lungul lor poart numele de sinaps. n fiecare pereche se gsete un cromozom de origine matern i unul de origine patern. Sinapsa ncepe ntr-un anumit punct de pe lungimea cromozomului i se continu apoi n tot lungul acestuia, fiind att de perfect, nct toate segmentele omoloage se altur fa n fa. Prin omologie se nelege similitudinea structural i funcional a cromozomilor. Dac dintr-un cromozom lipsete un segment, poriunea corespunztoare a cromozomului pereche face o bucl, asigurnd sinapsa pentru celelalte regiuni ale cromozomilor. Sinapsa are loc n dou etape: n prima etap se produce o aliniere a cromozomilor omologi, iar n a doua etap apropierea lor fie la unul din capete sau ambele, fie n mai multe puncte pe lungimea cromozomilor, dup care se continu pe toat lungimea. Aceast apropiere duce la formarea aa-numitelor complexe sinaptinemale. Apropierea cromozomilor constituie unul din cele mai importante momente ale meiozei. n legtur cu forele ce acioneaz pentru atragerea cromozomilor, exist astzi mai multe ipoteze neconfirmate. Astfel, se presupune c ele ar fi de natur electrostatic sau, datorit structurii lor moleculare, ar poseda o energie de rezonan. n stadiul de pachinema, cromozomii se scurteaz, se ngroa, iar
44

legtura dintre perechi devine din ce n ce mai intim, fapt care a determinat denumirea de gemeni cromozomici. n stadiul de diplonema, la fiecare dintre membrii bivalentului se pot observa cte dou cromatide surori, astfel c perechea de cromozomi este constituit din patru cromatide care alctuiesc aa numita tetrad cromozomic. Cromozomii omologi au tendina de a se ndeprta unul de altul; cromatidele nesurori sunt ns reinute n mai multe puncte de contact numite chiasme. Chiasma este considerat ca reprezentnd manifestarea citologic a crossing-overului. Acest fenomen va fi analizat ntr-un capitol urmtor, el prezentnd o mare importan n studiul ereditii. n stadiul de diachinez, cromozomii ce alctuiesc perechile se ndeprteaz, scurtarea lor devenind i mai accentuat. Spaiile dintre chiasme se lrgesc, acestea se deplaseaz ctre extremitile perechilor de cromozomi, aa nct, la sfritul acestui stadiu, ei apar conectai numai la extremitile lor. Cu aceasta se ncheie profaza primar. Metafaza I. Membrana nuclear dispare i se formeaz fusul de diviziune. Tetradele cromozomice se repartizeaz n planul ecuatorial al celulei. Fiecare cromozom omolog alctuit din dou cromatide surori se ataeaz la nivelul centromerului de firele fusului, pentru a conduce cromozomii la polii celulari. Odat cu ndeprtarea lor dispar i ultimele chiasme. Anafaza I. Cromozomii bicromatidici migreaz la polii celulei. Ei pot diferi din punct de vedere genetic, n urma schimbului de segmente care a avut loc n stadiile anterioare. Telofaza I. Cromozomii ajuni la cei doi poli ai celulei formeaz cte un nucleu cu un numr haploid de cromozomi. Fenomenul care duce la separarea celor dou celule poart numele de plasmodierez, iar cele dou celule haploide formeaz o diad. Odat cu ncheierea acestei faze nucleii intr n interchinez. Cromozomii prezint cromatidele perechi separate, dar unite numai prin centromeri, aspect caracteristic numai meiozei. Dup un interval scurt ncepe a doua faz a diviziunii meiotice, homeotipic, care cuprinde urmtoarele faze: Profaza II i metafaza II. Cromozomii apar formai din cromatide surori, care se orienteaz n planul ecuatorial al fusului de diviziune, ce apare la sfritul profazei secundare. Cromozomii se cliveaz imediat dup clivarea centromerilor. Anafaza II i telofaza II. Cele dou cromatide se ndeprteaz spre cei doi poli, unde constituie doi nuclei. Din diada iniial cu celule haploide s-au format, deci, patru celule haploide ce formeaz o tetrad celular. Aceste celule, n urma unor procese, vor da natere la gamei. n figura 2.17. este redat schema general a meiozei.

45

Fig. 2.17. (partea I) - Schema meiozei la un organism cu 2n=4 cromozomi A-leptonem; B-zigonem; C-pachinem; D-diplonem E-metafaza I; F-anafaza I. 46

Fig. 2.17. (continuare) - Schema meiozei la un organism cu 2n=4 cromozomi G-telofaza I; H-interfaza; I-profaza II; J-metafaza II; K-anafaza II; L-telofaza II 47

2.6. GAMETOGENEZA I SYNGAMIA 2.6.1. Gametogeneza la animale

La animale, gameii (n) sunt reprezentai prin ovule i spermatozoizi, produi n organe speciale, ovare i, respectiv, testicule. La originea lor se afl celulele somatice (2n), care, n urma unui ir de diviziuni, dau natere la celule sexuale primare, nedifereniate din punct de vedere citologic. Din acestea se formeaz goniile, foarte asemntoare la nceput pentru ambele sexe, dup care, se difereniaz n spermatogonii primare, la masculi i ovogonii primare, la femele. La rndul lor, acestea, prin diviziuni mitotice repetate, se dezvolt i devin spermatogonii i ovogonii secundare. Urmeaz o alt serie de diviziuni mitotice, care duc la formarea celulelor sexuale nemature, cu un numr de cromozomi diploid, spermatocite i ovocite. Pn la acest stadiu ntreaga evoluie s-a desfurat n stare de diploidie, iar ca proces de multiplicare al celulelor a fost mitoza. Procesele ce urmeaz n continuare i care duc la formarea celulelor sexuale diferite sunt difereniate i se vor trata n mod separat. Formarea celulelor sexuale poart denumirea de gametogenez. Spermatogeneza. Spermatocitele primare sufer un proces de diviziune meiotic i dau natere la spermatocite de gradul doi, cu un numr haploid de cromozomi. Urmeaz apoi a doua diviziune, ns de tip mitotic, rezultnd patru spermatide, tot haploide. n sfrit, prin procesul spermiogenezei, destul de complex, din spermatide se formeaz spermatozoizii. Nucleul spermatidei devine partea voluminoas a lor. Organitele citoplasmice devin componeni citologici seminali ce-i asigur micarea i ptrunderea n ovul (de exemplu, mitocondriile formeaz filamente spiralate). Citoplasma reprezint numai o ptur foarte subire ce nconjoar nucleul. Forma spermatozoizilor este variat i caracteristic speciei. Ovogeneza. ntre formarea celulelor sexuale mascule, spermatozoizii i formarea celulelor sexuale femele, ovulele, se poate face un paralelism, dei exist i diferene ntre ele. Astfel: - ovocitele cresc ntr-o perioad de timp mai lung dect spermatocitele, deoarece au nevoie de acumularea de materii de rezerv mai mari pentru viitoarele ovule. n aceast perioad, uneori, cromozomii apar sub form specific numit "perie de lamp"; - ovocitul, prin dou diviziuni meiotice, produce un singur gamet capabil de a participa la fecundare, celelalte trei celule fiind avortate (numite i corpi polari); - diviziunea I i diviziunea a II-a meiotic din ovogenez poate dura pn n momentul cnd ovulul particip la fecundare sau chiar dup ptrunderea spermatozoidului n citoplasma ovulului. n cazul spermatogenezei I i a II-a, diviziunea meiotic se termin pn n momentul formrii spermatozoidului.
48

n figura 2.18. este reprezentat schema spermatogenezei, iar n figura 2.19. cea a ovogenezei.

Fig. 2.18. Schema spermatogenezei

Celulele sexuale provin din celule somatice nedifereniate. Ele se pot forma n stadiul embrionar, cum este cazul la mamifere, iar la altele n stadii i mai timpurii, ca la Ascaris megalocephala. La aceasta, primii doi blastomeri din diviziunea ovulului se deosebesc prin faptul c unul formeaz numai celule somatice cu 2n cromozomi, iar altul, mai mic, embrionul sexual, cu n cromozomi.

2.6.2. Sporogeneza i gametogeneza la plante

Procesul de gametogenez la plante se aseamn ntr-o oarecare msur cu acel al animalelor, dar prezint o serie de trsturi specifice. Formarea celulelor sexuale mascule la plante se aseamn cu cea de la animale pn la stadiul de spermatid, iar formarea celulelor sexuale femele pn la stadiul de oosfer nematur. Sporul haploid rezult n urma diviziunii meiotice, proces numit sporogenez. Din spor se dezvolt gametofitul, form sub care se prezint unele organisme n cea mai mare parte a vieii lor, cum este la ciuperci, muchi, ferigi. La angiosperme, faza haploid este redus ca timp i gameii se formeaz dup ce nucleii sporului mascul i femel sufer unele diviziuni mitotice.
49

Fig. 2.19. Schema ovogenezei

Microsporogeneza i microgametogeneza. n zona profund a anterelor florilor, dup mai multe diviziuni mitotice repetate se formeaz celulemam ale grunciorilor de polen. Acestea sunt analoage cu spermatocitele de ordinul I de la metazoare i cu ele se ncheie diplofaza. Fiecare celul-mam a grunciorilor de polen d natere n urma diviziunii meiotice la o tetrad de microspori, adic la patru grunciori de polen haploizi. Grunciorul de polen constituie gametofitul mascul. Megasporogeneza i megagametogeneza. n ovar se formeaz i se dezvolt sacul embrionar (megasporul). El poate s aib origine diferit: din mai multe celule ale nucelei; dintr-o celul din nucel; dintr-o celul din subepiderma nucelei. Se va urmri cazul al doilea, care este mai simplu i mai general la plante. Celula iniial din care i are originea sacul embrionar se divide n dou, formnd o celul superioar, care prin diviziuni repetate va da natere la un esut numit calot i o celul inferioar (celula-mam a tetrasporilor). Celula-mam a tetrasporilor sufer dou diviziuni, dintre care prima este reducional i din care iau natere patru celule haploide. Una din ele crete mai mult, devine sac embrionar, n timp ce celelalte trei se resorb.
50

Cu formarea megasporului se ncheie megasporogeneza. Megasporul (megasporangele) sufer urmtoarele transformri: nucleul se divide n doi nuclei, care se deplaseaz ctre cei doi poli ai megasporului. Fiecare se divide, dnd natere la cte patru nuclei. Cte unul din acetia se ndreapt spre centrul megasporului, unde fuzioneaz, dnd natere la nucleul secundar al sacului embrionar sau nucleul de fuziune. Cei ase nuclei rmai se nconjoar cu citoplasm i devin celule; la un pol este situat oosfera i dou sinergide, iar la cellalt pol trei antipode. O schem mai detaliat asupra etapelor care se succed n ciclul vital la o plant superioar (porumbul) i n care se poate urmri sporogeneza i gametogeneza este prezentat n figura 2.20.

Fig. 2.20. Sporogeneza i gametogeneza la porumb

2.6.3. Syngamia
Este fenomenul prin care se unesc doi gamei (n) pentru a forma un zigot (2n). Ea asigur trecerea de la faza haploid la faza diploid n ciclul de dezvoltare a unui organism. Cnd gameii sunt difereniai din punct de vedere morfologic se spune c ei sunt heterogami sau anisogami, iar fenomenul a fost denumit heterogamie sau anisogamie. De obicei, gametul femel este mai voluminos. La metazoare
51

poart numele de ovul, iar la plantele superioare de oosfer. Gametul mascul este mai mic i redus la un nucleu nconjurat de puin citoplasm. El se numete spermatozoid la animale i la plantele inferioare. La conifere i angiosperme, nucleul haploid al grunciorului de polen, dup o prim diviziune, d natere nucleului vegetativ i nucleului germinativ, iar dup o alt diviziune a nucleului germinativ rezult dou spermatii. Una din spermatii se unete cu oosfera, dnd natere zigotului diploid, iar a doua se unete cu nucleul diploid al sacului embrionar, dnd natere endospermului triploid. La animale, gametul mascul (spermatozoidul) vine n contact cu ovulul i prin eliberare de enzime hidrolizante dizolv membrana ovulului, ptrunznd n interior. Apoi, cei doi nuclei, acel al spermatozoidului i acel al ovulului realizeaz syngamia. Din punct de vedere genetic, syngamia reconstituie perechile de cromozomi omologi, ntrunind n acelai genotip ereditile celor doi prini. n acelai timp, fecundarea asigur continuitatea materialului genetic n generaiile urmtoare.

52

CAPITOLUL 3 BAZELE MOLECULARE ALE EREDITII

Moto: "Genetica molecular a luat natere cnd s-a recunoscut c gena este subdivizibil" Salvador Luria "Structura ADN trebuie neleas n raport cu toate funciile sale, aa cum nelegerea funciei necesit o cunoatere a structurii. Fiecare funcie trebuie descompus, apoi reconstituit n detaliile sale moleculare i, n final, orientat n arhitectura i economia celular" A. Kornberg

Progresele nregistrate n genetica clasic au ridicat, ulterior, numeroase probleme legate de natura biochimic a materialului genetic, respectiv a genelor. Identificarea i studierea aprofundat a materialului genetic ridicau numeroase probleme, de aceea nu au putut fi rezolvate dect prin cercetri interdisciplinare de genetic, biochimie, medicin, fiziologie, fizic, matematic i altele. Aceste cercetri constituie realizrile cele mai importante ale tiinei contemporane i au pus bazele geneticii moleculare, care studiaz ereditatea i variabilitatea organismelor la nivel molecular. Complexitatea structurilor macromoleculare, interaciunile de ordin informaional dintre acizii nucleici i proteine, multitudinea tipurilor de proteine ce alctuiesc organismele, au generat structuri supramoleculare care asigur existena, variabilitatea i continuitatea materiei vii. n urm cu trei decenii nimeni nu i-ar fi nchipuit c oamenii vor cunoate structura genelor i modul lor de exprimare ntr-un sistem celular. ntr-o perioad scurt de timp s-a demonstrat c moleculele de acid dezoxiribonucleic i acid ribonucleic, att la organismele inferioare ct i la cele superioare, conin n mod codificat informaia genetic pentru sinteza proteinelor. S-au descifrat mecanismele intime care stau la baza complicatelor reacii prin care se sintetizeaz o protein n organism, fenomene ce au fost reproduse apoi i n laborator, aa cum se va vedea ntr-un alt capitol referitor la ingineria genetic.

3.1. PROTEINE I ACIZI NUCLEICI

Studiile de biochimie privind substratul material al ereditii pretind o cunoatere temeinic a componentelor chimice din celul, precum i a proceselor de transformare a acestora.
53

Din multitudinea de componente chimice ce intr n alctuirea celulei, principalul substrat al materiei vii l constituie proteinele i acizii nucleici. Proteinele sunt grupate n holoproteine, constituite numai din aminoacizi i heteroproteine care, pe lng aminoacizi, mai posed o grup prostetic. Din grupul heteroproteinelor fac parte: fosfoproteinele, glicoproteinele, cromoproteinele, lipoproteinele i nucleoproteinele. Nucleoproteinele sunt formate dintr-o protein i o grupare prostetic reprezentat de nuclein. Se cunosc mai multe tipuri de holoproteine, unele aparinnd grupului de polipeptide cu greutate molecular mic, denumite protamine, care conin pn la 90% arginin i sunt lipsite de aminoacizi aromatici i cu sulf. Alte tipuri de proteine cum ar fi histonele, conin lizin i arginin, aminoacizi aromatici i cu sulf, leucin, alanin, glicin i acid glutamic. Ambele tipuri de proteine au caracter bazic i formeaz sruri cu acizii nucleici, de tipul nucleoproteinelor. Un alt tip de protein care conine i triptofan, l constituie proteina fibrilar care intr n constituia fibrelor celulare. Proteinele sunt formate din aminoacizi care sunt legai prin legturi peptidice, alctuind lanuri polipeptidice, avnd o structur macromolecular. Datorit faptului c proteinele conin n molecula lor lanuri i catene mari, cu structuri interne diferite, pot aprea n spaiu diferite configuraii, grupate n mai multe niveluri de organizare: structura primar, secundar, teriar i cuaternar. Structura primar a proteinelor se refer la constituia chimic a fiecrui lan polipeptidic ce intr n alctuirea lor. Specificitatea unei proteine este dat de numrul lanurilor polipeptidice, iar specificitatea unui lan polipeptidic este dat de numrul, felul i ordinea aminoacizilor ce l constituie. n lanurile polipeptidice, particip mai frecvent 20 de tipuri de aminoacizi, dei numrul aminoacizilor cunoscui se ridic la aproximativ 100. Faptul c fiecare protein se caracterizeaz printr-o anumit secven de aminoacizi, orice schimbare a acestei secvene va atrage modificri ale proteinei i ca atare i a fenotipului organismelor vii. Structura secundar se refer la orientarea spaial a aminoacizilor, unii fa de alii n cadrul lanului polipeptidic. Datorit unor fore de atracie necovalente sau covalente chiar, anumite poriuni din lanul polipeptidic se atrag, rezultnd o serie de torsionri i orientri n diferite direcii a lanului polipeptidic, dndu-i o anumit configuraie spaial. Structura teriar se formeaz cnd ntre aminoacizi ndeprtai ai aceluiai lan polipeptidic se formeaz legturi chimice, dnd moleculei proteice o configuraie spaial foarte neregulat. Structura cuaternar se ntlnete la proteinele formate din mai multe lanuri polipeptidice, ce por fi identice sau diferite ca structur. Din cercetrile efectuate de biochimiti se desprinde unul din cele mai importante principii ale biologiei moleculare: structura secundar, teriar i cuaternar a unei proteine este determinat de structura primar a lanului polipeptidic. Acest principiu a fcut posibil cunoaterea modului cum se realizeaz n celule sinteza enzimelor i a proteinelor.
54

Natura i structura proteinelor determin specificitatea biologic a organismelor, a fiecrei specii n parte, a organelor i esuturilor. Numrul mare de izomeri, succesiunea diferit a aminoacizilor din macromoleculele proteice asigur tocmai individualitatea biochimic i genetic a organismelor. Acizii nucleici i nucleoproteinele sunt componenii cei mai importani ai celulelor vegetale i animale. Ei particip la procesele de diviziune celular, de cretere i difereniere celular i determin specificitatea materiei vii. Acizii nucleici au fost descoperii n anul 1871 cnd F. Miescher identific n spermatozoizii petelui somon (Salmo salar) o substan denumit nuclein, format dintr-o protein i un acid organic ce conine fosfor. Acest acid organic a fost identificat pentru prima dat de ctre R. Altmann n anul 1899 i l-a denumit acid nucleic. Biochimistul Kossel a demonstrat c nucleina este format din doi acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) i acidul ribonucleic (ARN). Acidul dezoxiribonucleic se gsete n cea mai mare parte n nucleul celulelor vegetale i animale, iar acidul ribonucleic se gsete att n nucleu, ct i n citoplasm. Acizii nucleici, respectiv nucleoproteinele, constituie, alturi de alte proteine, substanele de baz din care este alctuit cromozomul. Organismele cele mai simple, cum ar fi virusurile, sunt alctuite aproape numai din nucleoproteine.

3.2. DOVEZI PRIVIND ROLUL GENETIC AL ADN

Descoperirile care au avut loc la nivelul celulei au permis o grupare a structurilor care dein funcii ereditare. Ne referim la acele structuri care dein o informaie ereditar i care au continuitate i stabilitate celular. Teoria cromozomic a ereditii a atribuit cromozomilor i genelor rolul principal n ereditate, dei nu se cunoteau nc prea multe despre structura chimic a materialului genetic. Identificarea materialului genetic constituie imperativul geneticii n perioada de la mijlocul secolului nostru. Pentru aceasta trebuiau descoperite i dovedite structurile chimice care dein caracteristicile de baz ale materialului genetic: de a stoca i transmite informaia ereditar i de a-i menine stabilitatea cantitativ i calitativ pe parcursul diviziunii celulare. Cercetrile care s-au fcut la nceputul secolului XX privind proteinele i enzimele, au demonstrat marea diversitate i complexitate a acestora, considerndu-se c i genele ar fi tot de natur proteic. Problema care se pune n aceast etap era dac genele, care ar avea o natur proteic, pot s determine sinteza altor proteine i respectiv enzime. Cercetrile au demonstrat c din punct de vedere chimic, un lan polipeptidic nu poate servi pentru propria sintez, n primul rnd datorit faptului c aminoacizii nu manifest atracie chimic pentru aminoacizi identici.
55

Prima ipotez a legturii dintre o gen i sinteza unei enzime a fost elaborat n anul 1908 de ctre medicul englez Garrod care a studiat maladiile ereditare umane ce afecteaz metabolismul intermediar al fenilalaninei. Identificarea materialului genetic a fost posibil datorit descoperirii unor fenomene ereditare de maxim importan: - transformarea bacterian prin intermediul ADN; - transformarea la eucariote prin intermediul ADN; - recombinarea genetic n cursul reproducerii sexuate la bacterii; - transducia bacterian cu ajutorul virusurilor; - transmiterea informaiei ereditare de ctre ARN viral.

3.2.1. Transformarea la procariote

n anul 1928, bacteriologul englez F. Griffith a efectuat mai multe experiene cu pneumococi (Diplococcus pneumoniae), o bacterie care produce la mamifere boala numit pneumonie. Virulena ei este determinat de existena unei capsule format din polizaharide care mpiedic fenomenul de fagocitoz. Coloniile acestor bacterii sunt netede i vscoase, motiv pentru care s-au notat cu S (engl. smooth = neted). Dup reacia imunologic, determinat de tipul de polizaharide ce alctuiesc capsula, exist mai multe tipuri de pneumococi S: SI, SII, SIII etc. Tipul S poate da natere prin mutaii spontane la forme lipsite de capsul, a cror colonii au suprafaa rugoas, notat cu R (engl. rough = aspru, rugos), care sunt nevirulente. Pneumococii de tip R pot fi: RI, RII, RIII, n funcie de tipul S din care provin. F. Griffith a injectat la oareci pneumococi neviruleni de tip RII mpreun cu pneumococi viruleni de tip SIII, ns acetia din urm fuseser omori prin cldur. Surprinztor a fost faptul c oarecii au murit de pneumonie, iar din acetia s-a separat att pneumococi de tip RII ct i pneumococi de tip SIII. Concluzia care s-a desprins a fost c pneumococii de tip RII s-au transformat n pneumococi de tip SIII. Mutaia este exclus n acest caz deoarece tipul RII ar fi trebuit s muteze n tipul SII. Cauza transformrii pneumococilor necapsulai i neviruleni n pneumococi capsulai i viruleni a rmas necunoscut pn n anul 1944, cnd un grup de cercettori americani, O. T. Avery, C. M. Mac Leod i M. Mc. Carty, au reluat experienele fcute de Griffith cu scopul de a identifica substana chimic ce induce transformarea. Ei au extras ADN de la pneumococii de tip SIII i l-au introdus n mediul de cultur al pneumococilor de tip RII. n cultur, pe lng pneumococii de tip RII au aprut i un numr mic de pneumococi de tip SIII, dovedindu-se c agentul transformator este ADN de la tipul donor. Aceast experien poate fi redat sintetic astfel:

RII + ADN de la SIII

nsuirea de virulen sau nevirulen este legat de prezena sau absena capsulei polizaharidice ce nconjoar pneumococul. ADN transformator a indus
56

in vitro RII + SIII 24 ore

pneumococilor neviruleni, acapsulai, nsuirea de virulen, de formare a acestei capsule. Cu ajutorul ADN s-au realizat transformri genetice i pentru alte nsuiri la bacterii. Pneumococii sensibili la streptomicin (Sts) au fost transformai n pneumococi rezisteni la streptomicin (Str) sub influena ADN extras de la pneumococii rezisteni la acest antibiotic. Fenomenul de transformare genetic s-a realizat i la alte specii de bacterii: Bacillus subtilis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli etc. Transformarea genetic este posibil numai dac bacteriile receptoare prezint o stare de competen, care le permite interaciunea cu un fragment de ADN exogen, asigurnd nglobarea ireversibil a acestuia. Competena este o stare fiziologic tranzitorie care variaz mult n cursul diferitelor faze ale ciclului de multiplicare celular. Celulele bacteriene rmn incompetente dac sunt cultivate la pH mai mic de 7,4, n prezena unor enzime proteolitice sau la densiti celulare mici, condiii n care proteina activator, ce induce competena nu este sintetizat sau este inactivat. Proteina activator este un polipeptid endogen cu greutate molecular mic, cationic, bogat n aminoacizi bazici i hidrofobi, sensibil la enzimele proteolitice i extrem de aderent la toate suprafeele. Starea de competen presupune o serie de modificri ale peretelui celular bacterian. Proteina activator determin o serie de alterri de suprafa prin aciunea murein-hidrolazei, peretele celular devenind mai poros i cu o suprafa intens electropozitiv, ceea ce favorizeaz legarea fragmentelor de ADN exogen, ncrcate electronegativ (Zarnea G., 1986). n ceea ce privete mecanismul de transformare genetic se afirm c ADN exogen ptrunde n celula bacterian printr-o regiune denumit mezozom. Cromozomul bacterian este ataat de membrana celular tot n zona mezozomului. Ptruns n celula bacteriei acceptor, ADN exogen realizeaz o sinaps, cu o zon cu nucleotide complementare din cromozomul acesteia. n final, ADN exogen, se integreaz n cromozomul bacteriei receptoare. ADN exogen este o secven de 900 de nucleotide, n medie, reprezentnd, frecvent, o singur gen, mai rar dou, trei gene. Integrarea ADN exogen n cromozomul bacterian, formeaz un ADN heteroduplex, deoarece nu se realizeaz o complementaritate perfect a nucleotidelor. n replicarea ulterioar a acestui ADN, vor rezulta dou molecule, una de tipul ADN receptor i cealalt de tip ADN transformat. (Raicu P., 1997).

3.2.2. Transfecia la procariote

Rolul genetic al ADN a fost pus n eviden i printr-o serie de experiene cu bacteriofagi (virusuri ce atac i distrug bacteriile). Importante n acest sens sunt experienele efectuate de A. Hershey i M. Chase (1952) privind infecia viral, constituind i primele experiene de transfecie, care const n introducerea de ADN exogen n celule receptor. Ei au folosit bacteriofagii din
57

seria T i n special bacteriofagul T2, unul din cei mai mari bacteriofagi (24002500 ). Bacteriofagul este constituit din cap i coad. Capul conine n interior ADN iar nveliul (capsida) i coada sunt constituite din proteine (figura 3.1). Fagii se reproduc numai n celulele bacteriene cu ajutorul aparatului enzimatic al acestora. Infecia viral are loc astfel: fagul se prinde cu filamentele codale de membrana bacteriei. Enzimele fagului dizolv n acest punct membrana bacteriei, iar ADN fagic este introdus prin coada acestuia n celula bacterian. ntr-un interval de timp destul de scurt, n interiorul bacteriei se formeaz cteva sute de bacteriofagi, bacteria fiind distrus (liza bacteriei) i fagii sunt eliberai putnd infecta alte celule. Faptul c bacteriofagii se reproduc n interiorul bacteriei, denot c ADN fagic are capacitatea de a se autoreproduce (funcia autocatalitic) i n acelai timp deine informaia genetic necesar sintezei proteinelor proprii necesare constituirii capsidei pe baza aminoacizilor liberi din celula bacterian (funcia heterocatalitic). Se pune ntrebarea dac, pe lng ADN fagic, n interiorul bacteriei nu ptrund i proteinele virale. Pentru a clarifica acest aspect A. Hershey i M. Chase au folosit izotopii radioactivi P32 i S35. Fosforul radioactiv marcheaz molecula de ADN iar sulful radioactiv marcheaz proteinele. S-au cultivat bacterii E. coli pe un mediu la care s-a adugat fosfor radioactiv (P32). Dac se infecteaz cultura cu bacteriofagi T2, vor rezulta bacteriofagi marcai radioactiv, deoarece ADN fagic incorporeaz izotopul P35. Cu aceti bacteriofagi marcai s-au infectat alte bacterii neradioactive.

Fig. 3.1. Structura fagilor de tip T

ADN fagic radioactiv a ptruns n interiorul bacteriilor, n timp ce capsida fagilor, nemarcat, a rmas la nivelul peretelui celular bacterian. Dac bacteriile au fost infectate cu bacteriofagi marcai cu S35, bacteriile nu devin radioactive pentru c n acest caz izotopul S35 s-a localizat numai la nivelul proteinei din capsid. i ntr-un caz i n altul capsidele au rmas aderente de suprafaa bacteriei, putnd fi izolate prin agitare. n interiorul bacteriei ptrunde numai ADN fagic, care realizeaz procesul de transfecie. La eucariote, transfecia s-a realizat prin mai multe metode: adiia de cromozomi metafazici la suspensii celulare, cu ADN exogen purificat sau prin folosirea unui vector retroviral care poart o anumit gen. Introducerea ADN exogen realizeaz modificri ale genomului receptor, n urma crora se realizeaz
58

organisme modificate genetic, respectiv plante i animale transgenice sau nlocuirea unor gene defective cu gene normale, ceea ce reprezint terapia genic.

3.2.3. Transformarea la eucariote

Transformarea genetic la organismele superioare a evideniat rolul genetic al ADN. Primele experiene de transformare genetic la eucariote au fost realizate n anul 1959 de J. Benoit, P. Leroy, R. i C. Vendrely. S-a extras ADN din spermatozoizii i eritrocitele masculilor din rasa de rae Khaki Campbell i s-a introdus intraperitoneal la bobocii de rae din rasa Pekin. Adulii din rasa Pekin, rezultai din bobocii tratai au prezentat o serie de modificri morfologice privind culoarea penajului, a ciocului i picioarelor, a taliei, realizndu-se o nou ras denumit Blanche-neige. n anul 1971, C. R. Merril i colab. au transferat gene de la Escherichia coli n celulele umane. Astfel, gena ce metabolizeaz galactoza la E. coli a fost preluat de fagul lambda i apoi transferat de acesta n celulele fibroblastice umane ce proveneau de la un bolnav de galactosemie (nu putea metaboliza galactoza). Fenomenul de transformare a fost realizat i la alte organisme superioare: Drosophila melanogaster, Bombyx mori, Petunia hybrida, Hordeum vulgare .a. La noi n ar, P. Raicu i colab. (1963), au introdus prin vacuum infiltraie ADN de la Triticum durum n boabe de gru de la specia Triticum aestivum. Plantele rezultate din boabele tratate cu ADN exogen prezentau modificri privind culoarea i ritmul de cretere.

3.2.4. Materialul genetic al ribovirusurilor

Astzi se consider c virusurile constituie sisteme complexe alctuite din dou componente: nveliul proteic care nu are rol genetic i ADN sau ARN ce dein mesajul genetic. nveliul proteic denumit i capsid conine uniti mai simple denumite capsomere. Exist dou categorii de virusuri, unele au ca material genetic ADN i sunt denumite dezoxiribovirusuri, iar altele conin ARN i sunt denumite ribovirusuri. Ribovirusurile cele mai cunoscute sunt: virusul mozaicului tutunului (VMT), virusul poliomielitei, al encefalitei, bacteriofagul F2, virusul gripal, virusul sarcomului Rous (RSV), multe virusuri tumorale etc. Rolul genetic al ARN a fost pus n eviden la virusul mozaicului tutunului de H. F. Conrat i R. Williams (SUA, 1955) i A. Gierer i G. Schramm (Germania, 1956). Virusul mozaicului tutunului conine aproximativ 6% ARNv i 94% proteine. Ei au izolat ARNv de proteina viral i au fcut infecii cu ambele componente pe frunze sntoase de tutun. S-a constatat c boala denumit mozaicul sau arsura frunzelor de tutun s-a manifestat numai la frunzele infectate
59

cu ARNv. Se poate afirma c la ribovirusuri, ARNv stocheaz informaia genetic necesar sintezei proteinelor virale care vor constitui capsida viral.

3.3. ACIZII NUCLEICI I ROLUL LOR GENETIC 3.3.1. Structura molecular a acidului dezoxiribonucleic (ADN)
Studii detaliate asupra structurii moleculare a acizilor nucleici au fost efectuate mai ales dup descoperirea rolului genetic, prin experienele de transformare genetic efectuate la organismele procariote i eucariote. Structura molecular a acidului dezoxiribonucleic (ADN) a fost descoperit n anul 1953 de cercettorii J. D. Watson i F. H. C. Crick care au studiat structura ADN prin difracie n raze X. Cei doi cercettori au studiat ADN "in vitro" netiindu-se dac structura lui corespunde cu cea existent n materia vie. Tot n anul 1953, M. Wilkins i colab. au efectuat cercetri asupra ADN "in vivo" confirmnd structura stabilit de Watson i Crick. n anul 1962, cei trei cercettori Watson, Crick i Wilkins au fost distini cu premiul Nobel pentru medicin i biologie, pentru contribuiile aduse la elucidarea structurii moleculare a materialului purttor al informaiei genetice. Structura chimic a moleculei de ADN Molecula de ADN este format din uniti simple denumite nucleotide. n componena unei nucleotide intr urmtoarele tipuri de molecule: o baz azotat, un zahar i un radical fosforic (figura 3.2.).

Fig. 3.2. Bazele azotate, zaharurile i radicalul fosforic din acizii nucleici 60

Bazele azotate ce intr n alctuirea de ADN sunt de dou tipuri: baze purinice i pirimidinice. Purina este o baz azotat alctuit dintr-un heterociclu ce cuprinde cinci atomi de C i patru atomi de N, iar pirimidina este o baz ce deriv din inelul benzenic, cuprinznd patru atomi de C i doi atomi de N. Bazele azotate purinice care intr n constituia moleculei de ADN sunt adenina (A) i guanina (G), iar bazele pirimidinice sunt citozina (C) i timina (T). Zaharul component al dezoxiribonucleotidului se numete dezoxiriboz ( - D - 2 dezoxiribofuranoz), fiind o pentoz. Radicalul fosforic are trei hidroxili liberi care pot fi esterificai. n cazul acizilor nucleici se esterific doi hidroxili, deci acizii nucleici sunt fosfodiesteri: OH O=P OH OH Radical fosforic O=P OH OR2 OR1 Fosfodiester

Prin unirea unei baze azotate purinice sau pirimidinice cu un zahar rezult un dezoxiribonucleosid iar prin ataarea la acesta a unui radical fosforic rezult un dezoxiribonucleotid. Ataarea radicalului fosforic se face n mod obinuit prin intermediul carbonului 5' al dezoxiribozei, prin pierderea unei molecule de ap. Radicalul fosforic al unui nucleotid, prin gruprile acide libere, poate s se lege fie cu ali radicali fosforici, fie cu alte nucleotide prin carbonul 3' al dezoxiribonucleotidului. Dac gruprile libere ale radicalului fosforic se leag de ali radicali fosforici, dezoxiribonucleotidele pot apare sub form de monofosfat, difosfat sau trifosfat, purtnd urmtoarele denumiri: adenozin 5'-fosfat (AMP), guanozin 5'-fosfat (GMP), citidin 5'-fosfat (CMP), timidin 5'-fosfat (TMP), ADP, GDP, CDP, TDP, ATP, GTP, CTP, TTP. Cnd nucleotidele (dezoxiribonucleotidele) se leag unele de altele, aceast legtur se realizeaz astfel: un nucleotid se leag de nucleotidul vecin inferior prin C 3', iar de nucleotidul vecin superior prin C 5'. Se realizeaz un lan polidezoxiribonucleic, cu o form de zig-zag, ce constituie structura primar sau monocatenar a moleculei de ADN. La majoritatea organismelor molecula de ADN este constituit din dou lanuri (catene) polinucleotidice complementare, aceasta fiind structura secundar a ADN stabilit de ctre J. D. Watson i F. H. C. Crick. Una din premisele importante pentru stabilirea structurii secundare a ADN a fost deducerea experimental a regulii lui E. Chargaff (1951), conform creia pot fi definite urmtoarele reguli cantitative: A+G = T+C; A+C = T+G; A = T i C = G sau exprimat altfel, A/T = G/C = 1. Aceste relaii dintre nucleotide a dus la concluzia c ADN este alctuit din 2 catene. Rsucirile pe care le sufer o caten sau
61

molecula bicatenar alctuiesc structura teriar iar interaciunea dintre dou sau mai multe molecule bicatenare alctuiesc structura cuaternar a acizilor nucleici. Watson i Crick au stabilit c macromolecula de ADN este alctuit din dou catene polinucleotidice, paralele, nfurate elicoidal n jurul unui ax comun imaginar, o caten avnd un sens ascendent (3' 5') iar cealalt un sens descendent (5' 3'). Distana dintre dou nucleotide succesive este de 3,4 iar pasul elicei este de 34 , ceea ce corespunde la 10 nucleotide. Diametrul macromoleculei de ADN este de 20 (figura 3.3.). Molecula de ADN are dimensiuni foarte mari fiind cea mai mare molecul biologic, cu o mas molecular ce poate ajunge la 12-16 x 106 daltoni (1 dalton = 1/12 din masa atomului de C). Cele dou catene din molecula de ADN se leag ntre ele prin puni de hidrogen ce se realizeaz ntre o baz azotat purinic de pe un lan i o baz azotat pirimidinic de pe cellalt lan. Prin urmare, n macromolecula de ADN exist urmtoarele tipuri de legturi: adenin-timin (A-T), timin-adenin (T-A), guanincitozin (G-C) i citozin-guanin Fig. 3.3. Modelul structurii bicatenare a (C-G). moleculei de ADN Cele dou catene polinucleotidice din molecula de ADN sunt complementare, n sensul c ordinea nucleotidelor de pe o caten determin ordinea nucleotidelor de pe cealalt caten. Legturile de hidrogen dintre bazele azotate, duble, ntre adenin i timin (A = T) i triple ntre guanin i citozin (G C), dei sunt legturi slabe, sunt destul de numeroase de-a lungul macromoleculei de ADN pentru a-i asigura stabilitatea i coeziunea. Legturile chimice slabe, cum sunt cele de hidrogen, sunt eficiente numai n cazul moleculelor complementare, cum este ADN i anume cnd o protuberan a unei molecule intr ntr-o cavitate a altei molecule. Luate separat, moleculele pirimidinice sunt mai mici dect cele purinice ns cuplurile purin-pirimidin sunt de aceeai dimensiune, conferind macromoleculei de ADN regularitate i stabilitate. Macromolecula de ADN este stabil la temperaturile fiziologice, datorit numrului mare de legturi chimice i faptului c moleculele de baze azotate se gsesc n interiorul moleculei contactul lor cu apa fiind limitat.
62

3.3.2. Alte tipuri de ADN

Arhitectura molecular a ADN stabilit de Watson i Crick a fost confirmat printr-un mare numr de msurtori fizice. Modelul propus de cei doi autori presupune mperecherea A-T, C-G i o rsucire a celor dou catene n sensul acelor de ceasornic, deci o dubl elice de dreapta (dextrors) (ADN - D). Cercetrile recente bazate pe perfecionarea metodelor de analiz (difracia n raze X) i a celor de sintez "in vitro" a unor fragmente scurte de ADN, au dus la descoperirea mai multor tipuri conformaionale de ADN, determinate de mperecheri "nelegitime" dintre bazele azotate (C-C, A-G), nlocuirea bazelor azotate cu analogi ai acestora sau schimbarea modului de rsucire a dublei elice. Tipurile de ADN ce au la baz dubla elice de dreapta, dar se deosebesc prin unele proprieti fizice au fost notate cu A, B, C i D, iar tipul de ADN ce posed dou catene cu rsucire spre stnga s-a notat cu Z. ADN de tip A se apropie mult de structura ADN originar, bazele azotate avnd ns o nclinaie ntr-un unghi de 20 fa de axul moleculei, ceea ce determin modificarea pasului elicei (2,8 n loc de 3,4 ) i a numrului de baze pe tur de elice (11 baze n loc 10). ADN de tip B este aproape identic cu modelul originar. Cea mai mare parte din ADN celular este de tipul B. ADN de tip C este tot o dubl elice de dreapta n care forele de "mperechere" a bazelor azotate sunt mult mai slabe, ceea ce modific conformaia moleculei de ADN n lungime. Este ntlnit n unele genomuri virale. ADN de tip D mai puin cunoscut, este o dubl elice dextrors cu un unghi mare de rsucire (45). ADN-Z a fost descris de Rich i Itakura n 1980 (Zarnea, G., 1986). Acest ADN posed dou catene care afecteaz o rsucire elicoidal spre stnga, datorit att unor legturi ntmpltoare ntre G-C, ct unei frecvene mai mari n molecul a acestui cuplu de baze. Diferenele dintre ADN-B i ADN- Z nu sunt fixe, fiind posibil transformarea reversibil a celor dou tipuri. Forma Z a ADN bicatenar a fost descris la un numr mic de specii: n cromozomii gigantici de la Drosophila melanogaster, Chironomidae i n cromozomii umani. Analizndu-se fragmente de ADN s-a putut constata c ntr-un ADN-Z pot exista scurte fragmente de ADN-B, diferenele dintre fragmente fiind uor de depistat prin mijloace adecvate, de nalt rezoluie, datorit modificrii pasului elicei, nclinrii bazelor azotate i a ordinii de succesiune a acestora. Aceasta face posibil recunoaterea acestor zone de ctre sistemele enzimatice implicate n reglajul activitii genelor: schimbarea direciei de rsucire a ADN la nceputul unei gene ar determina ncetarea activitii genei respective, controlul activitii genelor fiind foarte riguros.
63

Exist i ipoteza c n aceste zone de tranziie se pot ataa cu o mai mare frecven substanele mutagene i cancerigene, fapt ce ar putea explica baza molecular a mutagenezei cu o frecven mai mare. n celulele eucariote, pe lng ADN nuclear, exist n organitele citoplasmatice ADN specific acestora: ADN mitocondrial (ADN-mt) i ADN cloroplastic (ADN-cl). ADN - mitocondrial (ADN - mt) este bicatenar i de form circular, asemntor ntr-o mare msur cu ADN bacterian. ADN-mt nu este complexat cu histone, n electronografii aprnd ca nite fibrile cu un diametru de 25-30 . ADN-mt al metazoarelor este de tip A-T, coninutul n G-C fiind variabil. Dublul helix de ADN-mt are o caten grea, bogat n resturi de A i o caten uoar bogat n resturi de T. ADN-mt este singurul tip de ADN circular ce are n secvena sa ribonucleotide covalent integrate, ceea ce-l face sensibil la uree i ribonucleaz, modificnd forma moleculei i oferind locuri speciale de recunoatere pentru polimeraze. Mrimea moleculei de ADN-mt variaz n funcie de specie la organismele inferioare avnd n medie o greutate molecular de 107 daltoni, ceea ce corespunde la 15.000-17.000 perechi de baze. La plantele superioare ADN-mt are o greutate molecular mult mai mare 60-140 x 106 daltoni, iar coninutul n G-C este uniform (45-47%). Informaia genetic din ADN-mt este foarte compact, neexistnd secvene repetitive (introni). Se pare c pe parcursul evoluiei intronii au fost eliminai din ADN-mt. ADN - cloroplastic (ADN-cl). Fiecare cloroplast conine cel puin o molecul de ADN-cl localizat n stroma cloroplastului (zona genofor). Pot exista mai multe molecule de ADN-cl separate spaial, formnd zone genofore separate, ataate de un loc (situs) specific al membranei interne a cloroplastului. Cercetrile efectuate la plantele superioare i inferioare au artat c plastomul acestora este format din molecule de ADN-cl, dublu catenare, circulare, cu un perimetru de 40-50 corespunznd unei greuti moleculare de 92 x 106 daltoni, respectiv 130 Kilobaze. Un cloroplast are n medie aproximativ 10-14g ADN, ceea ce nseamn aproximativ 50 copii ale plastomului (Sitte P. i colab., 1991, dup Toma N. i Anghel I., 1985). Prin studii de denaturare i renaturare sau analiz biochimic direct, s-a constatat c la plantele inferioare coninutul n G+C este inferior celui de A+T, n timp ce la plantele superioare coninutul de G+C poate fi egal sau puin mai ridicat fa de cel de A+T. Experienele de hibridare molecular ADN-ADN au demonstrat c ntre ADN nuclear i cel cloroplastic exist un anumit grad de omologie. n ceea ce privete replicarea ADN-cl, are loc dup modelul semiconservativ, bidirecional, independent de replicarea ADN nuclear. ADN-cl se replic o singur dat, att n timpul gametogenezei, n gametul femel, n timp ce ADN-cl coninut de gametul mascul nu se replic. n dezvoltarea ontogenetic, ADN-cl provenit de la genitorul matern se replic i este deci meninut, n timp ce
64

ADN-cl de provenien patern (n cantiti foarte mici) este degradat enzimatic; n acest fel se explic transmiterea pe linie matern a genelor din ADN-cl. ADN-cl cuprinde cteva sute de gene, genomul cloroplastic fiind mult mai mare dect cel mitocondrial, avnd i un rol mult mai complex n formarea i metabolismul cloroplastului i a celulei, existnd i o cooperare complex ntre acesta i nucleu. ADN-satelitic (ADN-S). Acest tip de ADN formeaz blocuri de uniti repetitive (cteva milioane) n zona centromerului i a satelitului. Numrul de secvene repetitive variaz de la o specie la alta de la 1% pn la 5% per genom. ADN-satelitic deine funcia de reglare a replicrii ADN cromozomic, replicare ce presupune participarea proteinelor histonice. ADN-bicatenar-circular este caracteristic cromozomului bacterian i unor plasmide prezente n celulele procariote, cum ar fi plasmidele F, R sau Col. Dimensiunile acestui ADN sunt variabile de la o specie la alta. Avantajele structurii circulare nu sunt cunoscute. Se presupune c aceast structur asigur protecia moleculei de ADN fa de degradarea enzimatic prin exonucleaze care acioneaz asupra extremitilor libere ale moleculei. ADN monocatenar. Exist unele virusuri a cror material genetic este reprezentat de un ADN monocatenar. Astfel, la virusul x174, molecula de ADN monocatenar are o greutate molecular de 3 x 106 daltoni, are o form circular i nu liniar. Ulterior s-au descoperit i ali bacteriofagi a cror material genetic este reprezentat de un ADN monocatenar: bacteriofagul S13 i bacteriofagul F1. Structura monocatenar a ADN de la aceste virusuri constituie o excepie reprezentnd o adaptare la viaa specific parazitar a acestora.

3.3.3. Acidul ribonucleic (ARN)

Structura chimic a moleculei de ARN. Acidul ribonucleic (ARN) are o structur chimic asemntoare cu cea a acidului dezoxiribonucleic (ADN). n structura chimic a ARN intr trei componente: bazele azotate, zaharul i radicalul fosforic. Bazele azotate sunt: purinice, adenina (A) i guanina (G) i pirimidinice, citozina (C) i uracilul (U). Deci o prim deosebire structural ntre ADN i ARN este prezena uracilului n locul timinei. Uracilul are o structur destul de apropiat de cea a timinei. Zaharul care intr n structura moleculei de ARN este riboza, care are o form ciclic. Combinarea unei baze azotate cu zaharul d natere unui ribonucleosid, iar prin adugarea unui radical fosfat rezult un ribonucleotid. O alt deosebire important ntre ADN i ARN este faptul c macromolecula de ARN este monocatenar, fiind format dintr-un singur lan poliribonucleotidic. Acest fapt face ca bazele azotate purinice s nu fie n cantitate egal cu cele piridimice. innd seama de rolul pe care l ndeplinete ARN se apreciaz c sunt dou categorii: acidul ribonucleic viral (ARNv) i acidul ribonucleic celular, implicat n sinteza proteinelor.
65

Acidul ribonucleic celular este de trei tipuri: acidul ribonucleic mesager (ARNm), acidul ribonucleic de transport sau solubil (ARNt) i acidul ribonucleic ribozomal (ARNr). Acidul ribonucleic viral (ARNv) constituie materialul genetic al unor ribovirusuri cum ar fi: virusul mozaicului tutunului (VMT), virusul gripal, virusul poliomielitei, virusul stomatitei veziculare, bacteriofagii F2, R17, QB i altele. Studiindu-se molecula de ARNv de la virusul mozaicului tutunului s-a determinat c este alctuit din aproximativ 6.000 ribonucleotide, ntr-o anumit ordine, determinnd coninutul mesajului genetic. La mai multe virusuri molecula de ARNv este format din dou catene complementare nfurate elicoidal n jurul unui ax imaginar. Molecula de ARNv este n general liniar, cu excepia virusului encefalomielitei oarecilor, la care molecula de ARNv este circular. Aa cum s-a artat ntr-o experien anterioar, n momentul infeciei virale, n interiorul celulei infectate ptrunde numai molecula de ARNv, care are capacitatea de a se multiplica, avnd rolul de matri pentru formarea unor molecule noi, deinnd i informaia genetic necesar sintezei proteinei virale. Acidul ribonucleic mesager (ARNm). A fost descoperit n celulele bacteriene infectate cu bacteriofagi, apoi n toate celulele organismelor. A. D. Hershey i colab. (1953) au ajuns la concluzia c sinteza ARNm este dependent de ADN. Ei au identificat ntr-o celul bacterian infectat, pe lng ADN i o mic cantitate de ARN, care era complementar ADN. Acest tip de ARN are rolul de a copia informaia ereditar de pe o poriune din molecula ADN i de a o transmite n citoplasm la ribozomi, organite citoplasmatice la nivelul crora are loc sinteza proteinelor. De aceea acest tip de acid ribonucleic a fost denumit ARN mesager (messenger ARN), prescurtat ARNm (F. Jacob i J. Monod, 1961). Acidul ribonucleic mesager se sintetizeaz n procesul de transcripie a informaiei genetice. Cercetrile genetice au stabilit c ARNm are o durat foarte scurt, fiind foarte repede sintetizat, dar i foarte repede distrus. Molecula de ARNm se asociaz cu ribozomii i formeaz complexe denumite poliribozomi. Se afirm c n perioada asocierii ARNm cu ribozomii, molecula nu este supus degradrii. Lungimea catenei de ARNm este foarte variabil, deci i masa molecular este variabil, n funcie de lungimea segmentului de ADN de pe care este copiat informaia genetic. Acidul ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs sau ARNt). Acest tip de acid ribonucleic are o structur chimic asemntoare cu a celorlalte tipuri de ARN. Are o greutate molecular mic i anume 25.000 daltoni, avnd 75-90 nucleotide, este solubil n soluie de NaCl, de aceea i s-a dat numele de ARN solubil. Rolul ARNs este de a transporta aminoacizii din citoplasm la ribozomi, n procesul de sintez a proteinelor. Molecula de ARNs are la un capt tripleta citozin-citozin-adenin (CCA), iar la cellalt capt are un nucleotid ce conine guanina (G). Molecula
66

ARNs este monocatenar, dar are i poriuni bicatenare datorit legturilor de hidrogen dintre A-U i G-C, dndu-i forma caracteristic a unei frunze de trifoi. R. W. Holley de la Universitatea Cornell (SUA) a determinat, n anul 1965, ordinea nucleotidelor unui ARNs care transport alanina la ribozomi, la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) (fig. 3.4.):

Fig. 3.4. Structura ARN-s ce transport alanina la ribozomi la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae)

Spre deosebire de celelalte tipuri de ARN, acidul ribonucleic solubil are o serie de particulariti chimice: conine o serie de nucleotide neobinuite, baze ce au gruparea metilic cum ar fi: 1-metilguanina, N-dimetilguanina, 1metilhipoxantina, hipoxantina, pseudouracilul i altele. Macromolecula de ARNs are trei regiuni distincte pentru recunoaterea moleculelor sau structurilor celulare: a) Regiunea pentru recunoaterea aminoacidului este situat pe braul cu codonul CCA de la un capt al moleculei. Aminoacidul se fixeaz de aceast regiune cu ajutorul enzimei aminoacil - ARNs - sintetaza, care are o structur foarte variat de la un organism la altul, existnd cte o enzim pentru fiecare aminoacid. b) Regiunea anticodonului este format dintr-o triplet de nucleotide complementar unui codon din ARNm. Numrul anticodonilor este egal cu cel al codonilor. c) Regiunea pentru recunoaterea ribozomului este alctuit dintr-o secven de cinci nucleotide: G-T-P-C-G (P-pseudouracilul). Aceast regiune realizeaz legtura cu ribozomul n timpul procesului de sintez a proteinelor.
67

Sinteza ARNs este determinat de genele din cromozomi, gene care se gsesc ntr-un numr mare de copii. Teoretic ar trebui s existe attea tipuri de ARNs cte tipuri de codoni exist, dar n realitate numrul lor este mai mic deoarece sunt i codoni care servesc pentru punctuaie sau sunt sinonimi. Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr). Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) reprezint aproximativ 85% din cantitatea total a ARN din celul, fiind localizat numai n ribozomi. O caracteristic important a ARNr este aceea c se gsete ntotdeauna asociat cu proteinele. ARNr a fost izolat din ribozomii purificai de Escherichia coli i s-a stabilit c are o greutate molecular de 5 x 106, nefiind purttor al informaiei genetice. Ribozomii sunt structuri submicroscopice celulare, fixate pe reticulul endoplasmatic, constituind locul sintezei proteice. Structura ribozomului este foarte complex, fiind alctuit la procariote din dou subuniti: o subunitate mare de 50 S i o subunitate mic de 30 S. Subunitatea mare este alctuit dintr-o molecul foarte mare de ARNr, format din aproximativ 3200 nucleotide, dintr-o molecul mai mic cu 120 nucleotide i 34 proteine diferite. Subunitatea mic este format dintr-o molecul mare de ARNr compus din 1600 nucleotide i 21 proteine diferite. La eucariote, ribozomul este mai mare i anume 80 S, subunitatea mic (40 S) are o molecul de ARNr i 30 de proteine diferite, iar subunitatea mare (60 S) are dou fracii de ARNr i 37 proteine. Acidul ribonucleic ribozomal are o structur bicatenar n proporie de 60-70% iar restul are o structur monocatenar. Sinteza ARNr se realizeaz prin genele din ADN specializate n acest sens i a cror numr este foarte mare datorit necesitii de a se sintetiza o cantitate mare de ARNr ntr-un timp scurt. Astfel, la Drosophila melanogaster exist 130 de gene ce rspund de sinteza ARNr, la Xenopus laevis 450, la Zea mays 5200, la Triticum aestivum 12700, la Hyacinthus orientalis 32000 gene. Numrul de ribozomi din celulele procariotelor este de aproape 15000 iar la eucariote chiar mai mare, explicndu-se astfel necesitatea unui numr mare de gene ce rspund de sinteza unor fracii de ARNr.

3.3.4. Denaturarea i renaturarea ADN

nclzirea unei soluii de ADN la temperaturi de peste 65C, determin ruperea legturilor de hidrogen dintre bazele azotate, cele dou catene se separ rezultnd un ADN monocatenar, iar fenomenul se numete denaturare. Temperatura la denaturare variaz de la o specie la alta, de exemplu la Drosophila melanogaster este de 86C, la Escherichia coli 90C, Mycobacterium phlei 97C. Dac soluia respectiv este rcit brusc, ADN rmne monocatenar, fiind numit ADN denaturat. Dac soluia se rcete treptat, legturile de hidrogen se refac, rezultnd un ADN renaturat, iar fenomenul se numete renaturare. Aceste dou fenomene au o importan deosebit pentru realizarea de hibrizi moleculari ADN-ADN sau ADN-ARN.
68

Hibrizii moleculari ADN-ADN, dar de la specii diferite, ne dau informaii despre gradul de nrudire al speciilor respective. Hibridarea ADN-ARN permite localizarea pe cromozomi a genelor ce intervin n sinteza diferitelor tipuri de ARN.

3.3.5. Specificitatea ADN

n urma determinrii cantitii de ADN din nucleul procariotelor i eucariotelor s-a putut observa c acesta variaz foarte mult de la o specie la alta. n general, procariotele au o cantitate mai mic de ADN fa de eucariote, deoarece organismele superioare au nevoie de o cantitate mai mare de informaie genetic pentru cretere, dezvoltare i reproducere. n molecula de ADN raportul dintre bazele azotate purinice i bazele azotate pirimidinice A/T i G/C este constant i egal cu 1 (E. Chargaff, 1951). Deosebirile ce exist ntre ADN de la diferite specii const n faptul c raportul dintre A+T/G+C este foarte variabil. La plantele i animalele superioare acest raport este n favoarea bazelor A+T. La speciile nrudite i raportul A+T/G+C este apropiat, ceea ce arat c la acestea succesiunea nucleotidelor este asemntoare. Diferenele privind secvena de nucleotide asigur deosebirile genetice dintre specii.

3.3.6. Replicaia ADN

Una dintre nsuirile de baz ale macromoleculei de ADN este cea de replicaie sau autoreplicaie, constituind funcia autocatalic a materialului genetic. La eucariote, replicarea ADN i deci a genelor care nu sunt dect segmente de ADN, are loc n timpul diviziunii mitotice, asigurndu-se transmiterea exact de la o generaie la alta a caracterelor ereditare. Studiul ciclului mitotic a relevat existena unei variaii regulate a cantitii de ADN iar pe aceast baz ciclul celular a fost mprit n urmtoarele etape: M - mitoza, G1 - perioada anterioar sintezei de ADN (gol sintetic), S perioada sintezei de ADN i G2 - perioada de postsintez. Dup telofaz n G1 cantitatea de ADN rmne constant i egal cu 2C (dou catene). Biosinteza proteic ce are loc n aceast perioad determin creterea celulei, are loc sinteza de ADN i deci a unor proteine specifice ce declaneaz mitoza. n perioada S se produce replicarea ADN, care se ncheie prin dublarea cantitii de ADN, egal cu 4 C (patru catene). n timpul profazei i metafazei mitotice, cantitatea de ADN rmne constant iar n anafaz, cnd cromozomii migreaz spre cei doi poli, se mparte n dou, fiecare celul avnd o cantitate de ADN egal cu cea din celula mam. Diviziunea meiotic determin o reducere la jumtate a cantitii de ADN n gamei. Cantitatea dubl de ADN se reface n momentul fecundrii gameilor, cnd rezult zigotul diploid.
69

J. D. Watson i F. H. Crick (1953) n urma elaborrii modelului structural al moleculei de ADN au emis i ipoteza replicrii acestuia dup tipul semiconservativ. Acest tip de sintez const n ruperea punilor de hidrogen dintre cele dou catene complementare. Fiecare caten servete ca matri pentru sinteza unei catene noi. n final, dintr-o molecul veche de ADN vor rezulta dou molecule, dar care sunt noi numai pe jumtate. Au mai fost emise i alte ipoteze de replicare a macromoleculei de ADN. Un asemenea tip ar fi cel conservativ conform cruia molecula veche de ADN servete ca model pentru sinteza unei molecule complet noi. O alt ipotez consider c replicarea ADN se realizeaz dup tipul dispersiv. Conform acestui model, molecula de ADN se desface n prile componente i mpreun cu nucleotidele din celul particip la formarea a dou molecule de ADN, care vor conine att nucleotide vechi ct i nucleotide noi. Modelul replicrii dup tipul semiconservativ propus de Watson i Crick, asigur o mare fidelitate n sinteza noilor molecule de ADN. Termenul de replicaie deriv de la faptul c n acest proces fiecare caten servete ca matri pentru catenele noi sintetizate, informaia genetic fiind transmis fidel noilor molecule. Sinteza ADN dup tipul semiconservativ se realizeaz astfel: la o extremitate sau ntr-un punct oarecare al macromoleculei de ADN, punile de hidrogen se rup, fenomen ce continu pe toat lungimea moleculei, asemntor desfacerii unui fermoar. Fiecare caten se rsucete n spaiu cu 180, prin rotirea nucleotidelor n planul exterior, n jurul radicalului fosforic. n citoplasm se gsesc sintetizate cele patru tipuri de nucleotide care conin bazele azotate purinice i pirimidinice: adenin, guanin, citozin i timin. Pe baza fenomenului de complementaritate dintre bazele azotate purinice i pirimidinice, o nucleotid care conine adenin se va lega prin puni de hidrogen de una ce conine timin, iar una ce conine guanin se va lega de una ce conine citozin. n final, paralel cu catenele vechi s-au sintetizat dou catene noi, rezultnd dou molecule fiice, identice cu molecula mam (fig. 3.5.). Replicarea macromoleculei de ADN se realizeaz n trei etape: n prima etap are loc sinteza precursorilor nucleotidelor ce intr n alctuirea ADN de tipul acidului uridilic i acidului inosinic; n etapa a doua are loc sinteza nucleotidelor propriu-zise ce intr n structura ADN: dezoxiadenozintrifosfat, dezoxiguanozintrifosfat, dezoxicitidintrifosfat i dezoxitimidintrifosfat; n etapa a treia are loc polimerizarea nucleotidelor sub controlul Fig. 3.5. Modelul replicrii enzimei ADN-polimeraza. semiconservative a un diametru de circa 65 , mult mai mare dect a moleculei Enzima are macromoleculei de ADN de ADN (20 ) i este format din circa 1000 aminoacizi. Enzima ADN70

polimeraza determin esterificarea oxidrilului de la carbonul 3' al catenei polinucleotidice de ctre fosfatul ce esterific oxidrilul de la carbonul 5' al nucleotidei, aa nct dac catena veche are polaritatea 5 3', catena nou sintetizat va avea polaritatea invers 3' 5'. S-au descoperit mai multe tipuri de polimeraze (I, II, III), unele din ele intervenind n procesul de reparare a macromoleculei de ADN, atunci cnd unele nucleotide au fost ncatenate n mod eronat. Pentru desfurarea procesului de replicaie este necesar o anumit cantitate de energie. Aceast energie provine din hidroliza acidului adenozintrifosforic (ATP) n acidul adenozindifosforic (ADP) i un radical fosforic (P). O parte din energia rezultat se pierde sub form de cldur. Pentru ca pierderile s fie ct mai mici, n celul exist un grup de enzime denumite transferaze, care au rolul de a transfera grupe funcionale de la o molecul la alta. Astfel ATP transfer energia sa ctre GTP care este un precursor n sinteza acizilor nucleici, devenind o molecul activat. n celule exist o enzim puternic denumit pirofosfataz, care rupe legtura de nalt energie dintre radicalii de fosfor (P P) elibernd-o (P P P + P + 7 kcal/mol). Pentru unirea a dou nucleotide se consum 0,5 kcal/mol, restul de 6,5 kcal/mol rmne ca energie liber ce pstreaz echilibrul termodinamic al macromoleculei de ADN.

3.3.7. Replicaia acizilor nucleici la bacterii i virusuri

Celula bacterian conine un singur cromozom circular format dintr-o macromolecul de ADN cu o lungime de aproape 1000 . n timpul replicaiei la bacterii macromolecula de ADN i pstreaz forma circular. Geneticienii M. Meselsohn i F. W. Stahl (1958) au elucidat mecanismul de replicaie al ADN de la bacterii prin marcarea acestuia cu izotopi radioactivi. Eu au folosit izotopul stabil al azotului N15, care se poate izola destul de uor de azotul obinuit N14, prin ultracentrifugare. Bacteria Escherichia coli a fost cultivat pe un mediu ce coninea clorur de amoniu marcat cu N15. Dup prima diviziune a bacteriilor, au fost trecute pe mediu ce coninea N14 i au fost lsate s se divid de 1-3 ori. Dup numrul de bacterii din cultur se poate determina numrul de diviziuni. Dup aceea bacteriile au fost lizate i introduse ntr-o ultracentrifug. Sa constatat c bacteriile crescute pe mediu cu N15 aveau ADN marcat numai cu N15, iar dup ce au fost trecute pe mediu cu N14, dup prima diviziune exista o fracie de ADN hibrid, avnd o greutate molecular intermediar. Dup cea de a doua diviziune celular, 50% din ADN conine N14 i 50% N15, iar dup cea de a treia diviziune 75% coninea N14 i 25% hibrid. Aceste rezultate au demonstrat c replicarea cromozomului bacterian se realizeaz dup modelul semiconservativ. Procesul de replicaie a cromozomului bacterian ncepe ntr-un punct al acestuia denumit replicator, care este ataat de membrana celular ntr-o regiune denumit mezozom.
71

La bacterii, fiecare diviziune a bacteriei este precedat de o singur derulare complet a cromozomului circular. La virusuri s-a constatat c acest proces de derulare a cromozomului se repet de mai multe ori, rezultnd mai nti o formaiune liniar, lung, care apoi se fragmenteaz i rezult cromozomi circulari. Unele virusuri au ca material genetic o molecul de ADN monocatenar (x174, S 13, F etc.). La aceste virusuri, procesul de replicaie decurge astfel: n momentul n care ADN monocatenar notat cu (+) ptrunde n celula bacterian infectat, servete ca matri pentru sinteza unei catene complementare notat cu (-). n interiorul bacteriei infectate a rezultat un ADN dublu catenar, dar numai catena (-) servete ca matri pentru sinteza catenelor (+) ale virusului. Exist virusuri a cror material genetic este reprezentat de ARNv, care are o structur monocatenar. Replicaia acestui ARN n cazul ribovirusurilor este asemntoare cu replicaia ADN monocatenar de la virusul phi x 174. Studiindu-se, de exemplu, ciclul de via al ribovirusului F2, s-a constatat c dup ptrunderea ARNv monocatenar notat cu (+) n celula bacterian, se ataeaz de ribozomi, pentru a declana sinteza enzimei necesare desfurrii procesului de replicaie, ARN-polimeraza. Pe matria catenei (+) se formeaz o caten complementar notat cu (-), iar pe matria acesteia se formeaz un numr mare de molecule de ARNv (+). O parte din aceste molecule de ARNv (+) se ataeaz de ribozomi, sintetizndu-se proteinele virale dup care are loc unirea ARNv cu acestea rezultnd un numr foarte mare de fagi ce distrug celula gazd (liza bacteriei).

3.3.8. Sinteza acizilor nucleici "in vitro"

Sinteza artificial a acizilor nucleici a fost realizat de A. Kornberg (1954) i S. Ochoa i M. Grnberg-Manago (1955). A. Kornberg a fost distins cu premiul Nobel (1959) pentru aceast realizare. Pentru realizarea sintezei "in vitro" a macromoleculei de ADN sunt necesare urmtoarele componente: dezoxiribonucleotidele celor patru baze azotate, sistemul enzimatic format din ADN-polimeraza, ioni de magneziu (Mg2+) i o cantitate mic de ADN cu un grad nalt de polimerizare folosit ca amors (primer) i matri pentru ADN nou sintetizat. Ca amors poate fi folosit un ADN monocatenar sau un ADN bicatenar, dar n al doilea caz, molecula bicatenar trebuie denaturat cu ajutorul cldurii. n condiii favorabile de reacie s-a sintetizat o cantitate mai mare de 10 ori de ADN dect cea folosit drept amors. ADN sintetizat artificial este identic cu cel folosit drept amors, n privina raportului dintre bazele azotate, ns aceste molecule au fost inactive biologic. Lipsa activitii biologice a ADN sintetizat "in vitro" este pus pe seama ADN-polimerazei, care conine mici cantiti de dezoxiribonucleaz, enzim ce degradeaz parial molecula de ADN. n anul 1968 A. Kornberg a reuit s sintetizeze "in vitro" ADN monocatenar, activ biologic, i anume o molecul de ADN viral, identic cu ADN monocatenar al virusului phi x 174. Pentru aceasta, n mediul de reacie s-au
72

introdus: ADN-polimeraza, ADN monocatenar izolat de la virusul phi x 174, ca amors, precursorii dezoxiribonucleotidelor i polinucleotidligaza, enzim necesar realizrii formei inelare a ADN viral. S-au obinut monocatene negative (-) complementare catenelor iniiatoare (+), care formau un helix dublu, circular. Prin utilizarea unor enzime s-au izolat o serie de catene (-), care au fost utilizate apoi ca matrie pe sinteza unor catene (+) biologic active, cu nsuirea de a iniia multiplicarea virusului. n anul 1955 M. Grnberg-Manago i S. Ochoa, au realizat sinteza "in vitro" i a macromoleculei de ARN, dup aceeai metod folosit pentru sinteza ADN. Elementele mediului de reacie sunt: ribonucleotidele, enzima ADNfosforilaza i ioni de magneziu. Ca matri pentru sinteza ADN "in vitro" s-a folosit o molecul de ADN monocatenar. Sinteza artificial a acizilor nucleici deschide perspective mari n nlocuirea unor "gene defecte", prin segmente de ADN nou sintetizate.

3.4. CODUL GENETIC

Dup descoperirea structurii macromoleculei de ADN i a nsuirii ei de a se replica cu mare fidelitate, muli geneticieni i-au pus ntrebarea dac informaia genetic nu este codificat ntr-un anumit fel prin secvena de nucleotide, ce relaii se stabilesc ntre cele patru tipuri de nucleotide i aminoacizii din lanurile polipeptidice. Ciberneticianul G. Gamow (1954) este primul care a descoperit legtura dintre secvena de nucleotide din ADN i ordinea aminoacizilor, emind ipoteza c n macromolecula de ADN se gsete codificat biochimic informaia genetic, necesar sintezei moleculelor proteice. n general, prin informaie se nelege un mesaj, mai mult sau mai puin cuprinztor, despre o serie de fenomene care au avut loc, au loc sau vor avea loc ntr-un sistem biologic sau tehnic. Aceste informaii sunt nregistrate, stocate i apoi transmise printr-un sistem de codificare. De exemplu, codul Morse, folosete un sistem de linii i puncte pentru codificarea literelor i cuvintelor. Proteinele sunt alctuite din lanuri polipeptidice formate din 20 de aminoacizi a cror succesiune este specific pentru fiecare protein. Prin schem teoretic a unui cod genetic a fost elaborat de G. Gamow (1954). Potrivit concepiei acestuia, codificarea celor 20 de aminoacizi nu se poate realiza de un singur nucleotid (41=4) i nici de grupe formate din cte dou nucleotide (42=16), pentru c n ambele cazuri numrul total de combinaii este mai mic dect numrul aminoacizilor. Ca urmare, el a considerat c numai secvene de cte trei nucleotide (43=64) pot realiza codificarea celor 20 de aminoacizi (tabelul 3.1.). Grupul de trei nucleotide care codific un aminoacid a primit denumirea de codon. n cazul codului de tip triplet, numrul codonilor este 64, depind de trei ori numrul aminoacizilor, fapt ce confer o mare eficien i plasticitate n recunoaterea aminoacizilor.
73

n perioada care a urmat, o serie de geneticieni au adus numeroase dovezi experimentale privind codificarea informaiei ereditare, deci a relaiei nucleotide-aminoacizi, culminnd cu descifrarea n totalitate a codului genetic. Primele dovezi experimentale ale relaiei nucleotide-aminoacizi, au fost aduse prin studiul unor mutaii, induse cu acid nitros, la virusul mozaicului tutunului (VMT). La acest virus capsida este format din 2150 catene polipeptidice identice, fiecare coninnd cte 158 aminoacizi. Acidul nitros induce mutaii de tipul tranziiilor (nlocuirea unei baze purinice cu o baz purinic sau nlocuirea unei baze pirimidinice cu o baz pirimidinic n catena acizilor nucleici) i anume A G sau C U. Tabelul 3.1. Diferite tipuri teoretice de coduri
Codul monotipic (4 combinaii) A G C U Codul cu dublete (16 combinaii) AA GA CA UA AG GG CG UG AC GC CC UC AU GU CU UU AAA AGA ACA AUA GAA GGA GCA GUA CAA CGA CCA CUA UUA UGA UCA UUA Codul cu triplete (64 combinaii) AAG AGG ACG AUG* GAG GGG GCG GUG* CAG CGG CCG CUG UAG UGG UCG UUC AAC AGC ACC AUC GAC GGC GCC GUC CAC CGC CCC CUC UAC UGC UCC UUC AAU AGU ACU AUU GAU GGU GCU GUU CAU CGU CCU CUU UAU UGU UCU UUU

* codoni iniiatori ai sintezei unei catene polipeptidice codoni nonsens, care nu codific nici un aminoacid reprezentnd codonii terminali ai sintezei unei catene polipeptidice Apariia acestor mutaii la nivelul nucleotidelor din ARNv al virusului, care ndeplinete rolul de ARNm, apar modificri n secvena aminoacizilor din catena polipeptidic. Aceste modificri sunt de tipul substituiei unor aminoacizi: Prolin Serin Fenilalanin sau Prolin Leucin Fenilalanin S-a dedus c prolina este codificat de un codon, la care cel puin dou nucleotide sunt fie A fie C. Tranziia A G sau C U a uneia din aceste nucleotide genereaz codonul serinei i respectiv al leucinei. n codonul fenilalaninei, ambele nucleotide trebuie s fie G sau U.
74

Studiile efectuate la mutantele induse cu proflavin la bacteriofagul T4, n cadrul genei rIIB, au demonstrat c unitatea care codific un aminoacid este o triplet de nucleotide (codon). Descifrarea codului genetic a fost posibil i prin folosirea unor ARNm sintetizai artificial, care conineau o secven cunoscut de nucleotide, pe baza crora au fost sintetizate proteine. Experiene de acest fel au fost realizate de M. W. Nirenberg i J. H. Matthaei (1961). Ei au reuit s sintetizeze o caten de polifenilalanin, folosind un ARNm artificial care coninea numai nucleotide cu uracil (U), dovedind c tripleta (UUU) codific aminoacidul fenilalanin. S-au folosit apoi ARNm artificiali ce conineau o secven de dou nucleotide cunoscute. De exemplu, ARN artificial ce conine secvena UGUGUG, determin sinteza unui lan polipeptidic n care alterneaz cisteina i valina, deci cisteina este codificat de codonul UGU iar valina de GUG (figura 3.6.).
Prima nucleotid a codonului 5' A treia nucleotid a codonului 3' Cis Non 3 Tri Arg U C A G U C A G U C A G U C A G

A doua nucleotid a codonului U UUU UUC UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG Ser C UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG A UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G

Fen Leu

Tir Non 2 Non 1 His Glu Asp Liz Ac.asp Ac.glu

UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG

Leu

Pro

Ileu Met Val fMet

Ser Arg

Tre

Ala

Gli

Fig. 3.6. Codul genetic

75

Problema cea mai grea ce a trebuit rezolvat a fost precizarea poziiei nucleotidelor n cadrul codonului, pentru c cele dou nucleotide pot forma trei combinaii: GUU, UGU i UUG. Exist mai multe ci pentru precizarea ordinii nucleotidelor n cadrul codonului, cea mai folosit fiind studiul mutaiilor de substituie a unor aminoacizi din unele proteine mai bine cunoscute: hemoglobina, proteina virusului mozaicului tutunului, triptofan-sintetaza din Escherichia coli .a.

3.4.1. Caracteristicile codului genetic

Informaia genetic este codificat n acidul dezoxiribonucleic (ADN) sau n acidul ribonucleic viral (ARNv) la unele virusuri, sub forma unor secvene de trei nucleotide (codoni). Informaia genetic este copiat prin procesul de transcripie de ctre ARNm iar apoi tradus, prin procesul de translaie, ntr-o secven de aminoacizi, n catena polipeptidic. n prezent sunt cunoscui toi codonii din ARNm, care codific diferii aminoacizi (fig. 3.6). Codul genetic cuprinde 64 de codoni. Doi codoni marcheaz nceputul sintezei unei catene polipeptidice i anume AUG i GUG iar trei codoni sunt nonsens: UAA (ocru), UAG (ambr) i UGA (azur). Aceti codoni au rolul de a marca terminarea sintezei unei catene polipeptidice (codoni stop). Codul genetic are urmtoarele caracteristici: este universal, degenerat, lipsit de ambiguitate, neacoperit i fr virgule. Prin universalitatea codului genetic se nelege faptul c un anumit codon, codific acelai aminoacid la orice organism, indiferent de gradul su de evoluie. Dovada cea mai evident a universalitii codului genetic a fost urmtoarea: s-a izolat ARNm ce rspunde de sinteza hemoglobinei la iepure i s-a injectat n ovocitele de broasc. S-a constatat c n ovocitele de broasc se sintetizeaz hemoglobina, dei n mod normal, ovocitele nu sintetizeaz niciodat hemoglobin. Codul genetic este degenerat, n sensul c mai muli codoni codific acelai aminoacid. De exemplu, arginina este codificat de urmtoarele triplete: GGU, GGC, GGA, AGA i AGG. n ceea ce privete importana nucleotidelor din codon s-a constatat c primele dou sunt cele mai semnificative, n timp ce a treia poate fi uor nlocuit. Dac cea de a treia nucleotid este o baz purinic ea poate fi nlocuit tot cu o baz purinic sau dac este o baz pirimidinic, poate fi nlocuit tot printr-o baz pirimidinic. Diferii codoni, care au primele dou nucleotide identice, pot codifica acelai aminoacid. Numai metionina i triptofanul sunt codificai de cte un singur codon (AUG i respectiv UGG). Caracteristica de degenerare a codului genetic, prin care mai muli codoni diferii codific acelai aminoacid, poart numele de redundan, termen preluat din informatic. Redundana const ntrun exces de informaie, ntr-un sistem, pentru a asigura transmiterea corect a informaiei, chiar n cazul unor perturbri (Hartl D. L. i colab., 1989).
76

n mod obinuit fiecare codon (triplet) codific un singur aminoacid. Sa constatat, n unele cazuri, c un codon poate codifica mai muli aminoacizi. Aa este cazul codonilor GCG care codific alanina i arginina; CGG-prolina i arginina; GGA-glicerina i acidul glutamic; AGG-glicina i fenilalanina. Se afirm c aceast nsuire reprezint un avantaj evolutiv, deoarece nlocuirea unui aminoacid cu altul printr-o mutaie, ntr-o caten polipeptidic este mai puin duntoare, dac cei doi aminoacizi au proprieti asemntoare. Codul genetic este neacoperit n sensul c doi codoni vecini nu au nucleotide comune i este fr virgule, ntre doi codoni nu exist spaii sau ali codoni care s joace rolul unor semne de punctuaie. S-a demonstrat c citirea mesajului genetic ncepe dintr-un punct fix, se realizeaz ntr-un singur sens, astfel c, absena unui nucleotid (deleie) sau adugarea altuia (adiie), schimb sensul mesajului. Universalitatea codului genetic n lumea vie demonstreaz pe de o parte vechimea sa i, totodat, constana sa n timp.

3.5. BIOSINTEZA PROTEINELOR

Proteinele au un rol esenial n metabolismul celular, nsi funciile materialului genetic sunt condiionate de o serie de enzime sau proteine cu rol structural. Enzimele particip la replicarea ADN i ARN, la transcripia informaiei genetice i la sinteza proteinelor. Proteinele structurale intr n alctuirea cromozomului, a membranelor celulare, a componentelor celulare, particip la asamblarea ribozomilor. Procesul de biosintez a proteinelor este mult mai complex dect cel de sintez a acizilor nucleici i cuprinde dou etape importante: transcripia informaiei genetice i translaia informaiei genetice.

3.5.1. Transcripia informaiei genetice

Transcripia constituie fenomenul prin care informaia genetic de pe o poriune din catena de ADN este transcris (copiat) ntr-o molecul de ARNm. Transcripia mesajului genetic din molecula de ADN pe cea din ARNm se face ntr-o form care servete ca matri pentru sinteza proteinelor. Sinteza ARNm este catalizat de enzima ARN-polimeraza, enzim universal ce a fost identificat n celulele bacteriene, vegetale i animale. Mecanismul propriu-zis al transcripiei informaiei genetice din ADN n molecula de ARNm se realizeaz astfel: enzima ARN-polimeraza se leag specific ntr-o poziie a moleculei de ADN, ce corespunde cu nceputul unei gene. Legturile de hidrogen se rup pe poriunea genei respective, segmentul respectiv de caten se rotete cu 180 n spaiu, servind ca matri pentru sinteza catenei de ARNm. ARN-polimeraza asigur ncatenarea corect a ribonucleotidelor existente n nucleu. Odat cu naintarea ARN-polimerazei de-a lungul matriei ADN, se
77

elibereaz treptat noua caten n citoplasm, unde se asociaz cu ribozomii formnd complexe denumite poliribozomi. Dup ce s-a realizat transcripia, se refac legturile de hidrogen ntre catenele moleculei de ADN. De o foarte mare importan este descoperirea c procesul de transcripie la nivelul unei gene se realizeaz pe o singur caten de ADN. Aa se explic faptul c o gen deine informaia genetic necesar sintezei unei singure proteine. n ceea ce privete locul de pe catena de ADN unde se iniiaz procesul de transcripie, J. D. Watson (1974) arat c ARN-polimeraza este cea care recunoate codonii de iniiere. Spre deosebire de ADN-polimeraza care este format dintr-un singur lan polipeptidic, ARN-polimeraza este alctuit din cinci lanuri polipeptidice notate cu ', , , 2 i W, fiecare cu o mas molecular diferit. Enzima poate s catalizeze formarea legturilor dintre nucleotide, chiar dac lipsete lanul , deci acest lan nu are rol catalitic, ci acela de a recunoate catena matri i secvena de dezoxiribonucleotide, de unde se iniiaz transcripia. Poziia din molecula ADN unde se leag ARN-polimeraza pentru a iniia transcripia se numete promotor. ncheierea transcripiei ARNm este controlat de o protein specific numit factor . n sens mai larg, transcripia se refer i la sinteza celorlalte dou tipuri de ARN implicate n procesul de biosintez a proteinelor. Acidul ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs) se sintetizeaz tot pe o matri de ADN. Fiecare tip de ARNs este codificat de cte o singur secven de nucleotide din ADN, deci de cte o gen. Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr) este produsul direct al mai multor gene. Detalii despre ARNs i ARNr au fost precizate ntr-un paragraf anterior.

3.5.2. Translaia informaiei genetice

Translaia este mecanismul prin care secvena codonilor din ARNm este tradus ntr-o anumit succesiune de aminoacizi ce intr n constituia unui lan polipeptidic. Realizarea procesului de translaie implic participarea mai multor componente celulare ce alctuiesc un aparat de translaie. Aparatul de translaie cuprinde urmtoarele elemente: diferite tipuri de ARNs corespunztoare tipurilor de aminoacizi, aminoacizii, ribozomii, enzimele activatoare ale aminoacizilor, cofactorii energetici, ATP i GTP, factori de iniiere, alungire i terminare a sintezei lanului polipeptidic. Pentru sinteza celular a proteinelor este necesar o anumit cantitate de energie, formarea unei singure legturi peptidice necesitnd 0,5 kcal/mol. Aceast energie este asigurat de acidul adenozintrifosforic (ATP) care, prin hidroliz, pune n libertate unul sau doi radicali fosforici elibernd energia corespunztoare: ATP + H2O
78

AMP + P P + 8 kcal/mol

Sinteza proteic se desfoar concomitent cu hidroliza ATP n AMP i doi radicali fosforici, rezultnd 8 kcal/mol, din care 0,5 kcal/mol sunt folosite pentru realizarea legturii peptidice iar restul de 7,5 kcal/mol pentru meninerea echilibrului reaciei n favoarea sintezei proteice i nu a hidrolizei. O prim etap n sinteza proteinelor o constituie activarea aminoacizilor i formarea complexului aminoacil-ARNs. Activarea aminoacizilor se realizeaz cu ajutorul energiei rezultate din hidroliza ATP i n prezena enzimei aminoacilsintetaza (E). Reacia de activare a aminoacizilor poate fi redat astfel: AA1 + ATP + E AA1 AMP E + P P

Aminoacizii, dup ce au fost activai, se pot ataa de molecula unui ARNs specific: AA1 AMP E + ARNs1 + AMP + E Cele dou reacii au loc succesiv, sunt catalizate de aceeai enzim (aminoacilsintetaza) i ca atare se poate scrie reacia general: aminoacilsintetaza AA1 + ATP + ARNs1 + AMP + P P n urmtoarea faz complexul aminoacil-ARNs se ataeaz de poliribozomi, la nivelul crora are loc iniierea sintezei lanului proteic. Ribozomul asigur de aa manier asocierea acestor elemente nct zona anticodon a ARNs s poat recunoate codonul corespunztor din ARNm, ducnd astfel la o descifrare corect a mesajului genetic. Dup fixarea aminoacidului, ARNs devine liber putnd transporta alte molecule de aminoacid la nivelul ribozomului. ncatenarea aminoacizilor se realizeaz de ctre enzima peptidiltransferaza i const n realizarea legturilor peptidice ntre gruparea carboxil a unui aminoacid i gruparea aminic a celuilalt (figura 3.7.). Reacia de ncatenare a aminoacizilor poate fi redat astfel: peptidiltransferaza AA1 - ARNs1 + AA2 - ARNs2 + AA3 - ARNs3 + AA1 - AA2 - AA3 + ARNs1 + ARNs2 + ARNs3 + AA1 - ARNs1 + AA1 - ARNs1 +

79

Fig. 3.7. Reprezentarea schematic a procesului de translaie (dup Kimball, 1978)

ncheierea sintezei catenei polipeptidice se realizeaz cu ajutorul a doi factori proteici care sunt activai n prezena codonilor de ncheiere UAA, UAG i UGA. Ca urmare, catena polipeptidic se detaeaz de ribozomi i de ARNs care a adus ultimul aminoacid. n ceea ce privete viteza cu care se realizeaz biosinteza proteic, exist o serie de date att la procariote ct i la eucariote. Transcripia genei ce determin sinteza enzimei ce intervine n producerea triptofanului la Escherichia coli are loc cu o vitez de 28 nucleotide/sec., iar translaia cu viteza de 7 aminoacizi/sec. O molecul complet de hemoglobin uman este sintetizat n 35 secunde (gena ce determin hemoglobina conine 670 nucleotide). n prezent s-a reuit sinteza unor substane proteice ntr-un sistem celular liber (populaii de celule la care s-a distrus membrana celular), folosind ARNm artificial (M. W. Niremberg, 1961).

3.6. REGLAJUL GENETIC AL ACTIVITII GENELOR

Celula vie conine o cantitate mare de informaie genetic iar procesele metabolice ce au loc funcioneaz cu o mare eficien, asigurnd economisirea la maximum a energiei. Cantitatea mare de informaie din celulele procariotelor i eucariotelor permite funcionarea acestora n cele mai variate condiii de mediu. n timp ce virusurile posed n programul lor genetic 3-4 gene, bacteriile 2.000-3.000 gene, plantele i animalele superioare au un program genetic foarte complex, constituit din cteva zeci de mii de gene. Genele ce alctuiesc programul genetic al vieuitoarelor nu funcioneaz toate deodat, ci intr n funcie n mod succesiv, n funcie de tipul i cantitatea de enzime i proteine, pe msura dezvoltrii individului. Mecanismele de reglare a activitii genelor sunt foarte complexe att la procariote ct i la eucariote. Funcionarea celulei este dependent de cele dou laturi ale metabolismului: catabolismul (dezasimilaia), prin care o serie de substane sunt descompuse i se elibereaz i o anumit cantitate de energie i anabolismul (asimilaia) n urma creia se sintetizeaz substane complexe din substane simple. Fiecare etap a asimilaiei i dezasimilaiei este catalizat de o anumit enzim, care la rndul ei este dependent de informaia uneia sau a mai multor gene.
80

3.6.1. Reglajul activitii genetice la procariote

Teoria reglajului genetic la procariote a fost elaborat de geneticienii francezi Francois Jacob, Andr Lwoff i Jaques Monod, n anul 1961, realizare pentru care ei au fost distini, n anul 1965, cu premiul Nobel. n aceast lucrare ei demonstreaz experimental i practic c sinteza proteinelor i a enzimelor variaz n funcie de necesitile celulei i este controlat genetic. F. Jacob i J. Monod au descoperit mai multe moduri de reglare genic a sintezei proteice: - inducia enzimatic; - represia enzimatic; - retroinhibiia enzimatic. Inducia enzimatic este fenomenul prin care celulele produc sistemul enzimatic necesar pentru metabolizarea substanelor care de obicei nu sunt prezente n mediu. Proprietile enzimatice ale bacteriilor sunt influenate de mediul n care cresc, fenomen denumit adaptare enzimatic, ceea ce confer acestor organisme posibilitatea de a crete n medii diferite. Enzimele ce intervin n catalizarea diferitelor laturi ale metabolismului au fost mprite n dou categorii: enzime adaptive a cror cantitate i activitate variaz n funcie de condiiile de mediu i enzime constitutive a cror cantitate nu depinde de mediu i se sintetizeaz continuu. J. Monod (1941) a descoperit fenomenul de diauxie prin care o bacterie ce crete pe un mediu de glucoz i lactoz, crete i se nmulete pn ce glucoza este epuizat, iar dup o perioad de stagnare, crete din nou i se nmulete folosind ns lactoza. Un exemplu de inducie enzimatic a fost descoperit la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) care poate s fermenteze lactoza din lapte cu ajutorul enzimei lactaza. Tulpinile de drojdie de bere, care au fost crescute mai multe generaii pe mediu de lactoz, vor conine n cantitate mare enzima lactaza, iar n acest caz, fenomenul de fermentaie ncepe foarte repede (aproximativ o or de la incubaie). n cazul unor tulpini care nu au fost crescute n prealabil pe mediu de lactoz, fermentaia nu are loc pentru c acestor tulpini le lipsete lactaza. Dac aceste tulpini sunt inute n continuare n mediu de lactoz, dup aproximativ 14 ore, fermentaia se declaneaz, fapt ce arat c lactoza induce producerea lactazei de ctre celulele drojdiei. n acest caz lactoza ce trebuie metabolizat acioneaz ca un inductor. Inducia enzimatic a fost ilustrat de J. Monod i colab. la bacteria Escherichia coli, prin studierea sistemului lactoz. Acest mecanism va fi prezentat mai pe larg n cadrul modelului Jacob-Monod de reglaj genetic. n concluzie se poate afirma c inducia enzimatic este caracteristic sistemelor de catabolism (dezasimilaie) fiind declanat de substane denumite inductori. Represia enzimatic este un fenomen opus induciei enzimatice, prin care este inhibat sinteza unei proteine datorit unui produs final al unui lan
81

metabolic denumit represor. Fenomenul de represie enzimatic a fost pus n eviden la bacteria Escherichia coli. Astfel, s-a demonstrat c sinteza aminoacidului triptofan este inhibat atunci cnd n mediul de cultur se adaug cantiti mici de triptofan sau analogi ai acestuia. Represia enzimatic este caracteristic unor sisteme enzimatice ce intervin n anabolismul unor constitueni cu rol esenial n organism (aminoacizi, nucleotide). Represia enzimatic poate aciona asupra mai multor proteine ce fac parte din acelai lan metabolic, prin intermediul represorului. Dac un metabolit acioneaz asupra represorului suprimndu-i activitatea, se deblocheaz sinteza tuturor enzimelor din acelai lan metabolic. Efectul genetic al represorului const n blocarea uneia sau a mai multor gene prin aceasta sistarea sintezei uneia sau a mai multor proteine specifice. Substanele capabile s modifice efectul de represie al represorului se numesc efectori. Efectorii pot fi inductori, cnd inhib activitatea represorului i corepresori, cnd intensific activitatea de represie a represorului. Retroinhibiia enzimatic denumit i inhibiia prin feed-back sau inhibiia prin produs final este un sistem de reglare a sintezei proteice prin cantitatea de produs final. n cazul unui lan metabolic, exist mai multe etape, fiecare fiind catalizat de o anumit enzim, rezultnd un produs final. n cazul retroinhibiiei enzimatice, produsul final, ntr-o cantitate mai mare dect cea normal, acioneaz asupra enzimei din prima treapt a lanului metabolic i ntreg lanul metabolic este oprit. Fenomenul a fost studiat la bacteria Escherichia coli. Aminoacidul Ltreonin se transform ntr-un alt aminoacid, L-izoleucin n cinci etape, fiecare fiind catalizat de ctre o enzim (figura 3.8.).

Figura 3.8. - Represia enzimatic i retroinhibiia enzimatic n cazul cii metabolice ce asigur sinteza izoleucinei. 82

n acest exemplu, cantitatea de izoleucin poate fi reglat att prin retroinhibiie enzimatic ct i prin represie enzimatic. Prin retroinhibiie enzimatic, izoleucina n cantitate prea mare blocheaz activitatea primei enzime din lanul metabolic, treonin deaminaz i ntreg lanul metabolic este oprit. Prin represie enzimatic, aminoacidul izoleucin blocheaz activitatea tuturor celor 5 enzime din lanul metabolic. Prin urmare sinteza izoleucinei este controlat printrun sistem dublu, cele dou sisteme fiind independente. Independena celor dou sisteme a fost dovedit prin faptul c la E. coli s-au obinut dou mutante, una la care izoleucina nu poate s inhibe enzima treonin deaminaz, iar cealalt la care izoleucina nu inhib nici una din cele cinci enzime ale lanului metabolic. S-a demonstrat c cele dou mutaii sunt situate n loci diferii pe cromozom. n cazurile de mai sus, produii celulari sunt controlai numai de produii finali ai liniei metabolice respective. Sunt ns i cazuri cnd unii produi celulari sunt controlai de produii finali ai altei linii metabolice. De exemplu, bazele azotate purinice i pirimidinice ce intr n alctuirea acizilor nucleici sunt sintetizate de dou linii metabolice paralele, dar cele dou linii se regleaz reciproc. Acest lucru are o mare importan deoarece cele dou grupe de baze trebuie c fie ntr-un anumit raport n momentul replicrii acizilor nucleici. Experimental s-a demonstrat c proporia bazelor pirimidinice este controlat de produii finali pirimidinele, dar i de purine, astfel: pirimidinele n exces inhib prima enzim din lanul metabolic al pirimidinelor, iar purinele n exces stimuleaz activitatea aceleiai enzime. Prin acest proces, bazele azotate sunt sintetizate economic, exact n cantitile necesare replicrii acizilor nucleici. Modelul Jacob-Monod de reglare a activitii genelor F. Jacob i J. Monod (1961), pe baza experienelor efectuate la Escherichia coli asupra locusului lac (lactaz), privind fenomenele de inducie enzimatic i represie enzimatic, au ajuns la concluzia c reglarea sintezei proteice este de natur genic. n acest proces de reglaj sunt implicate trei categorii de gene: gene structurale, gene reglatoare i gene operatoare. Genele structurale sunt segmente din macromolecula de ADN i au rolul de a determina secvena aminoacizilor n moleculele proteice sintetizate de celul. Genele reglatoare sunt localizate tot pe ADN i au rolul de a sintetiza represorii specifici ce controleaz activitatea genelor structurale. Represorul nu interacioneaz direct cu genele structurale, ci prin intermediul celui de-al treilea tip de gene, genele operatoare sau operator. Operatorul este o gen adiacent genelor structurale, care are posibilitatea de a se combina sau nu cu represorul, inducnd sau blocnd funcionarea genelor structurale. Gena operatoare poate fi considerat un receptor al represorului. Gena operatoare este un fel de comutator chimic care declaneaz sau nu intrarea n activitate a genelor structurale. naintea genelor operatoare i structurale este localizat promotorul care iniiaz procesul de transcripie a informaiei genetice al genelor structurale. Ansamblul format din promotor, gena operatoare i genele structurale se numete operon, ocup un fragment de cromozom i funcioneaz coordonat.
83

Schema modelului Jacob-Monod privind reglarea sintezei proteice prin inducie i represie enzimatic este dat n figura 3.9. Interaciunile dintre represor i efector sau dintre represor i operator (gena operatoare) are loc astfel: n sistemele represibile gena reglatoare determin sinteza represorului R, activ, care interacioneaz cu gena operatoare i n acest caz, gena operatoare blocheaz activitatea genelor structurale, fapt ce face ca ARN-polimeraza s nu poat sintetiza ARNm i ca atare, nu se vor sintetiza proteine.

Figura 3.9. - Modelul Jacob-Monod privind reglarea sintezei proteice

n sistemele inductibile, un efector negativ sau inductor reacionnd cu represorul (R) l transform ntr-o form inactiv (R') care nu poate reaciona cu gena operatoare (O), fapt ce face ca ARN-polimeraza s iniieze procesul de transcripie a ARNm. n celule se pot forma molecule cu greutate molecular mic, denumite efectori pozitivi sau corepresori, care poate transforma represorul inactiv (R') ntr-o form activ (R), care reacionnd cu gena operatoare (O) oprete transcripia ARNm. n ceea ce privete modul de transmitere a informaiei genetice de ctre genele structurale dintr-un operon pentru sinteza unei proteine, s-au emis dou ipoteze: una aparine lui Jacob i Monod (1961) care susine c fiecare gen dintrun operon i transcrie un ARMm propriu (o gen - un mesager) iar a doua ipotez formulat de S. Spiegelman i R. G. Martin (1963) (citai de C. Panfil, 1974), susine c ntreaga informaie a unui operon este transmis ntr-o singur molecul de ARNm (un operon - un mesager). Un exemplu concret privind modul de funcionare al genelor n reglarea procesului de biosintez a proteinelor l constituie cel al operonului lac de la Escherichia coli (figura 3.10). La aceast bacterie se apreciaz c exist ntre 100 i 200 de operoni, dar numai activitatea unora este cunoscut. La bacteria E. coli utilizarea lactozei
84

din mediu se realizeaz cu ajutorul a trei enzime, a cror sintez este determinat de trei gene structurale ce alctuiesc operonul 1ac. Genele respective se gsesc dispuse alturat pe cromozomul bacterian: z+, determin sinteza enzimei galactozidaza, care se gsete liber n citoplasm i care desface lactoza n galactoz i glucoz; y+ determin sinteza - galactozid permeazei, care este localizat n membrana celulei bacteriene i permite intrarea lactozei n celul i gena a+ ce determin sinteza enzimei galactozid trans-acetilaza a crei aciune este necunoscut.

Figura 3.10. - Reglajul genetic al operonului lac la Escherichia coli

Dac lactoza lipsete din mediu, genele structurale ce determin sinteza celor trei enzime sunt inactive. Cnd se adaug lactoza n mediu, n cteva minute ncepe sinteza celor trei enzime, deci genele structurale sunt activate. Activitatea celor trei gene structurale (z+, y+ i a+) este controlat de o gen reglatoare prin intermediul unui represor. Cnd lipsete lactoza, gena structural sintetizeaz represorul care se cupleaz cu gena operatoare ce se afl naintea genelor structurale i activitatea celor trei gene este inhibat. Prin testul cis-trans s-a constatat c gena reglatoare este independent de operonul lac, plasat ntr-o alt regiune a cromozomului bacterian. Operonul lac este alctuit din urmtoarele subuniti dispuse n urmtoarea ordine: promotorul (P), gena operatoare (O) i cele trei gene structurale z+, y+ i a+. Promotorul are rolul de a recunoate enzima ARNpolimeraza, determinnd iniierea procesului de transcripie, gena operatoare are rolul de a se combina cu represorul sintetizat de gena reglatoare. Cele dou regiuni sunt formate din secvene de cte 10-30 nucleotide fiind regiuni ale operonului. Operonul lac este, de obicei, nefuncional, ceea ce nseamn c n absena lactozei represorul este activ i blocheaz activitatea genelor structurale.
85

n prezena lactozei represorul i modific structura i nu mai poate reaciona cu gena operatoare i ca atare ntreg operonul devine activ, lactoza putnd fi metabolizat. n ceea ce privete mrimea diferiilor operoni i a genelor reglatoare exist o serie de informaii la procariote, deoarece la eucariote nu au fost evideniai operoni. La E. coli operonul lactoz (lac) este alctuit din 5.113 perechi de nucleotide, iar gena reglatoare din 1.020 perechi nucleotide, operonul triptofan conine 6.600 perechi de nucleotide iar operonul histidinei de la Salmonella are 13.000 perechi de nucleotide. Mrimea genei operatoare de la E. coli se pare c este alctuit din 30 perechi de nucleotide (cu o lungime de aproximativ 100 ). Nu se cunoate prea bine modul de cuplare al genelor operatoare cu represorul, dar se pare c acesta din urm nu se ataeaz dect de un ADN bacterian, deoarece denaturarea ADN blocheaz activitatea represorului. Represorul operonului lac este o protein format din patru catene polipeptidice identice, cu o greutate molecular de 150.000 daltoni.

3.6.2. Reglajul activitii genelor la eucariote

Structura molecular a cromozomului la eucariote este mult mai complex dect la procariote. Cromozomii eucariotelor sunt alctuii din: 13-16% ADN, 12-13% ARN i 68-72% proteine histonice i nehistonice. La eucariote, programul genetic este alctuit dintr-un numr foarte mare de gene (cteva zeci de mii), gene care nu funcioneaz simultan, chiar mai mult, n unele celule difereniate, majoritatea genelor sunt inactive. Toate aceste aspecte fac ca reglajul genetic la eucariote s fie mult mai complex, reglajul sintezei proteice realiznduse la nivelul genei i nu la nivelul operonilor. Se poate spune c ARNm la eucariote transcrie mesajul genetic al unei singure gene, deci pentru un singur lan polipepidic. Acest fapt a fost demonstrat prin compararea mrimii poliribozomilor angajai n sinteza miozinei, hemoglobinei sau gammaglobinei. Funcionarea ADN al eucariotelor ca matri pentru sinteza ARNm este dependent de conformaia spaial tridimensional a nucleohistonelor. Superspiralizarea nucleohistonelor face ca ADN s nu poat funciona ca matri pentru ARNm. Ca regul, cromatina condensat nu poate fi transcris, pe cnd cromatina difuz permite ca ADN s funcioneze ca matri pentru ARNm, sinteza acestuia realizndu-se n interfaz. La eucariote, reglajul activitii genelor are loc la trei niveluri: a) Reglajul la nivelul transcripiei, care const n cuplarea proteinelor cromozomice cu un segment din macromolecula de ADN de pe care trebuie s se transcrie informaia genetic i n acest caz se blocheaz sinteza ARNm. b) Reglajul la nivelul translaiei, ce const n degradarea ARNm format prin transcripie de ctre enzime denumite nucleaze, localizate de o parte i de alta a membranei nucleare.
86

c) Reglajul posttranslaional ce se manifest la nivelul catenelor polipeptidice, unde intervin o serie de factori ce mpiedic agregarea monocatenelor pentru a forma stucturi cuaternare, tiindu-se c aceast structur este funcional. n realizarea reglajului genetic la eucariote, un rol deosebit de important l au proteinele cromozomice, histonele i nehistonele, care mpreun cu catena ADN i ARN cromozomic formeaz cromatina. Histonele sunt proteine bazice deoarece sunt bogate n aminoacizii bazici, arginina, lizina i histidina i complet lipsite de triptofan. Histonele sunt lipsite de specificitate fiind grupate n cinci clase n funcie de ponderea celor trei aminoacizi i n funcie de greutatea molecular. Histonele ca i ADN sunt sintetizate numai n faza S a interfazei, de ctre o serie de gene cromozomice. Histonele se caracterizeaz printr-o mare stabilitate n cursul evoluiei i o mare uniformitate de o specie la alta. De exemplu, histona H1 de la mazre difer numai prin doi aminoacizi fa de aceeai histon de la taurine. Aa cum s-a vzut ntr-un capitol anterior, cromozomul eucariotelor este constituit din uniti denumite nucleosomi, n care molecula de ADN este asociat cu histone i nehistone, fapt ce explic sinteza simultan a celor dou substane n faza S a ciclului mitotic. Histonele asigur stabilitatea structurii cromozomului i sunt implicate n transcripia mesajului genetic, n mod nespecific. Nehistonele sunt proteine cromozomice foarte variate ca structur i funcie, cu o greutate molecular cuprins ntre 10.000 i 15.000 daltoni. Din grupul proteinelor nehistonice fac parte: ADN i ARN polimerazele, enzimele ce intervin n sinteza i degradarea proteinelor, proteinele cu rol structural i reglator din cromozom. Proteinele nehistonice reacioneaz n mod specific cu molecula de ADN, determinnd transcripia difereniat a genelor n funcie de esut i de celule, determinnd ce gene vor fi transcrise, avnd un caracter reglator specific. Modelul de reglaj genetic la eucariote este prezentat n figura 3.11. Conform acestui model, proteinele nehistonice se ataeaz n mod specific la nivelul unei gene, care n mod obinuit este represat de proteinele histonice. ntre cele dou tipuri de proteine are loc o reacie de fosforilare, prin care se elibereaz un radical fosforic, n urma creia complexul histon-nehiston rmne ncrcat negativ. Acest complex este respins de molecula de ADN a crei sarcini electrice sunt tot negative, n aceast zon, ADN eliberat de histone, putndu-se realiza transcripia ARNm. n momentul n care gena respectiv nceteaz s mai funcioneze, se refac moleculele de histone pe segmentul respectiv de ADN. La organismele eucariote reglajul genetic se realizeaz nu numai la nivelul genelor individuale ci la nivelul segmentelor cromozomice, a cromozomilor sau chiar a genomului. Astfel, reglajul genetic se poate realiza i prin heterocromatinizare. Heterocromatina este de obicei localizat n jurul centromerului i n zona
87

satelitului cromozomului. n zona heterocromatic, cromatina este puternic spiralizat iar ADN are o funcionalitate redus. Heterocromatina este de dou tipuri: constitutiv i facultativ. Heterocromatina constitutiv conine o cantitate mare de ADN repetitiv (redundant) formnd de obicei gene nefuncionale. Heterocromatina facultativ rezult din heterocromatinizarea unor regiuni eucromatice. Prin transferul unui segment eucromatic n apropierea heterocromatinei constitutive, acesta se heterocromatinizeaz i invers. Un alt fenomen este heterocromatinizarea unuia din cei doi cromozomi X de la sexul femel al mamiferelor, formnd cromatina sexual, astfel nct, la ambele sexe funcioneaz numai cte un cromozom X din perechea de cromozomi ai sexului. Acest fapt a fost demonstrat la multe organisme la care sexul femel este homogametic.

Fig. 3.11. - Reglajul genetic la eucariote cu ajutorul proteinelor histonice i nehistonice 88

La Drosophila melanogaster genele ce determin culoarea galben deschis a ochilor este localizat pe cromozomul X, dar s-a constatat c ambele sexe produc aceeai cantitate de pigment. La om, gena ce determin sinteza enzimei glucoz-6-fosfat dehidrogenaza (G-6-PD) este plasat pe cromozomul X, ns ambele sexe produc aceeai cantitate de enzim. Heterocromatinizarea unui cromozom X se realizeaz numai n celulele somatice, n celulele sexuale ambii cromozomi X sunt funcionali. Se poate constata c, n cazul acesta, reglajul genetic se realizeaz la nivelul ntregului cromozom, deoarece toate genele de pe cromozomul X sunt inactive. Reglajul genetic se poate realiza la unele organisme prin inactivitatea ntregului genom sau cu ajutorul unor hormoni. n ultim instan diferenierea celular la eucariote este tot un proces de reglaj genetic celular, deoarece n unele celule sunt activate numai anumite gene i anume n celulele specializate.

3.7. NOIUNEA DE GEN I EVOLUIA EI

Rezolvarea complexelor aspecte ale ereditii sunt legate n mod permanent de elucidarea structurii i funciei genei. Pentru aceasta s-au efectuat cercetri minuioase, care au implicat mai multe discipline: genetica, biochimia, fizica, fiziologia, care formeaz o disciplin complex, biologia molecular. Obiectivele biologiei moleculare fiind descifrarea proceselor de sintez a produselor celulare i dependena acestora de informaia ereditar din molecula de ADN, au dus la modificarea concepiilor despre gen, de-a lungul timpului. Ideea de unitate ereditar este foarte veche, astfel, Maupertius (16981759) o denumete particul seminal, iar Buffon (1707-1788), molecul organic (citai de C. Maximilian, 1984). Darwin (1868) denumete aceste particule gemule, Ngeli (1884) le denumete micele, Hugo de Vries, pangene iar A. Weismann, determinante.

3.7.1. Gena n concepia geneticii clasice

G. Mendel arat c n celulele exist factori ereditari care determin caracterele ereditare perechi, n celulele somatice i sub form simpl, n celulele sexuale. Termenul de gen (gr. genos = urma) a fost introdus de W. Johannsen, n anul 1903, ns nu l consider ca pe o unitate fizic, ci pe un corespondent al factorilor ereditari imaginai de G. Mendel. n concepia clasic gena prezint trei caracteristici de baz: unitate funcional, unitate mutaional i unitate de recombinare. Ca unitate funcional, gena este cel mai scurt fragment dintr-un cromozom, n interiorul creia orice modificare afecteaz acelai caracter, deci
89

gena este cea mai mic unitate care produce un anumit efect fenotipic. Ca unitate mutaional, gena este cea mai mic parte dintr-un genom, care prin mutaie d natere la alela sau alelele sale, cu caracter modificat. Ca unitate de recombinare, gena este cel mai mic segment dintr-un cromozom, care se poate transfera prin crossing-over pe cromozomul omolog i n interiorul cruia nu are loc crossing-over (unitate indivizibil de crossing-over). Acest mod de a defini gena s-a dovedit a fi simplificat, deoarece chiar la nceputul secolului XX s-a demonstrat c gena este o unitate genetic mult mai complex, format din sublocusuri sau subgene. Existena subunitilor de gen a fost dovedit de E. B. Lewis n anul 1951 la locusul lozenge (lz) de la Drosophila melanogaster. Locusul lz se gsete pe cromozomul X n poziia 27,7 uniti de recombinare i determin modificri n pigmentaia ochilor, structura faetelor i fertilitatea femelelor. Heterozigoii obinui n urma ncrucirilor dintre mutante ale locusului lz, au avut fenotip mutant cu caractere intermediare. n urma analizei a peste 100.000 de indivizi, Lewis a gsit i 0,02% indivizi de tip normal (slbatic), nemutani, desprinznd concluzia c ntre subgenele locusului lozenge a avut loc un crossing-over. Locusul lozenge cuprinde cel puin trei uniti ntre care apare un mic procent de recombinare. Fiecare din cele trei subuniti, cnd apare singur n genom, este lz + + . Cnd individul recesiv i determin un fenotip normal, cu genomul: 1 +++ heterozigot cuprinde doi factori (lz1 i lz2), ei pot fi pe acelai cromozom (poziie lz 1 lz 2 + lz 1 + + sau cte unul de fiecare cromozom omolog (poziie trans). cis): +++ + lz 2 + Fenotipurile sunt diferite, n primul caz este normal iar n al doilea caz este mutant. Acesta demonstreaz c locusul lozenge este un locus complex, alctuit din mai multe subuniti. Pe baza efectului cis-trans s-a ajuns s se stabileasc dac dou mutaii foarte asemntoare aparin unei serii alelice ale aceluiai locus sau sunt nealele i aparin la doi loci diferii. Dou gene sunt alele, cnd aparin aceluiai locus i dac heterozigotul n poziie trans are un fenotip normal, nseamn c genele respective sunt nealele. Apogeul n concepia clasic despre gen, l-a constituit ipoteza "o gen - o enzim" elaborat de G. W. Beadle i E. L. Tatum (1941). Conform acestei ipoteze, sinteza fiecrei enzime este determinat de informaia unei gene, deci ntre gene i enzime ar exista raportul de 1:1. Mutaia unei gene determin blocarea sintezei unei enzime, care la rndul ei, determin oprirea ntregului lan metabolic. Elaborarea ipotezei "o gen - o enzim" a fost posibil n urma unor experiene efectuate la ciuperca Neurospora crassa. La aceast ciuperc s-a elaborat o metod rapid de identificare a mutantelor biochimice. Metoda const
90

n urmtoarele: se iradiaz conidii ale ciupercii n scopul obinerii de mutante biochimice defective, care se cultiv apoi pe un mediu minimal, ns conidiile mutante nu vor putea crete pe acest mediu. Pentru ca mutantele s creasc pe mediu minimal trebuie adugat n mediu substana pe care mutanta nu o poate sintetiza, deoarece la mutante s-a declanat lanul proceselor metabolice care duc la sinteza acelui produs. Dac se analizeaz schema de mai jos, a unei ci metabolice, ipoteza "o gen - o enzim" demonstreaz c fiecare enzim care intervine ntr-un proces metabolic este controlat de o gen: Gena A Enzima A Substrat Produsul A Gena B Enzima B Produsul B Gena C Enzima C Produsul C

Studiul mutantelor de Neurospora, a bacteriilor i algelor a dovedit c blocarea unei etape dintr-un lan metabolic este legat de mutaia unei gene care inactiveaz o enzim. Dei ipoteza "o gen - o enzim" nu poate fi neleas n sensul strict c o gen determin sinteza unei singure enzime, a constituit un pas important n evoluia conceptului de gen i pentru elucidarea funciilor acesteia.

3.7.2. Gena n concepia geneticii moleculare

Studiile de genetic molecular, metodele moderne de cercetare, folosirea intens a virusurilor i bacteriilor, au permis o analiz genetic foarte fin a genei, n urma creia s-a constatat c gena este o unitate foarte complex, alctuit din subuniti ntre care pot avea loc recombinri intragenice i pot fi modificate prin mutaii. Structura fin a genei a fost realizat de S. Benzer (1957) la gena rII a fagului T4 ce infecteaz bacteria Escherichia coli. Gena rII este alctuit din dou regiuni denumite cistroni i notai cu A i B. Mutaiile dintr-un grup sunt complementare numai cu mutaiile din cellalt grup. Cnd ntre doi bacteriofagi cu cte o mutaie n regiunile A i B are loc recombinarea, apar indivizi de tip normal, r+, care produc distrugerea (liza) bacteriei. Metoda de detectare a recombinrii este foarte sensibil deoarece d posibilitatea identificrii unui recombinant, chiar dac a aprut cu o frecven de numai 0,0001%. Acest fenomen permite identificarea recombinrilor chiar ntre regiuni extrem de apropiate ale genei. Cercetrile mai noi au demonstrat c unitatea mutaional este perechea de nucleotide, care, n acelai timp este i cea mai mic unitate de recombinare genetic.
91

Prin numeroase cercetri s-a ajuns la concluzia c secvena nucleotidelor dintr-o gen determin secvena aminoacizilor din catena polipeptidic, fenomen denumit colinearitate. Gena, n concepia geneticii moleculare, este definit drept un segment din macromolecula de ADN (sau ARN n cazul unor virusuri), format dintr-o secven anumit de nucleotide, care acioneaz ca o unitate funcional i care conine informaia genetic ce determin secvena nucleotidelor dintr-o molecul de ARN (transcripie genetic) i, respectiv, a aminoacizilor ntr-o caten polipeptidic (translaie genetic). S. Benzer (1958-1961) a denumit muton, cea mai mic unitate a genei n care poate avea loc o mutaie, independent de alta, recon cea mai mic unitate n care are loc recombinarea genetic i cistron cel mai mic segment de ADN (sau gen) care poate funciona unitar i ale crui limite pot fi stabilite prin testul cis-trans (testul de complementaritate). Se poate afirma c gena este identic cu cistronul. n concepia geneticii moleculare, gena poate fi definit succint astfel: o gen sau cistron - o caten polipeptidic. Din punct de vedere funcional, genele pot fi clasificate dup Paigen i Ganschow (1965) (citai de P. Raicu, 1980) n patru tipuri: gene structurale, ce determin secvena aminoacizilor ntr-o caten polipeptidic; gene reglatoare, ce controleaz sinteza proteinelor prin intermediul unui represor; gene arhitecturale, care determin integrarea proteinelor sintetizate n structuri celulare i gene temporare, care activeaz cele trei tipuri de gene, n timp, pe baza unui program genetic, pentru realizarea fenomenului de citodifereniere. Genetica molecular a adus noi elemente de detaliu i asupra structurii genei. La eucariote gena este constituit dintr-o secven linear de nucleotide, continu, ce codific o secven de nucleotide informaionale denumite exoni, separate prin segmente noninformaionale (ADN silenios) denumite introni. De exemplu, gena ovalbuminei la gin este format din opt exoni i apte introni (figura 3.12).

Fig. 3.12. - Structura genei ovalbuminei, format din exoni i introni 92

Pentru a se realiza fenomenul de transcripie a ARNm, se formeaz mai nti un ARN precursor care determin eliminarea segmentelor noninformaionale (introni), sintetizndu-se apoi un ARNm care copie informaia genetic numai a exonilor (R. J. Roberts i A. Ph. Sharp 1993). Se pare c secvenele noninformaionale au un rol important n evoluia materialului genetic. n genomul eucariotelor numrul de gene este relativ mic, comparativ cu cantitatea de ADN. La om, n funcie de mrimea genelor i de cantitatea de ADN, ar trebui s existe un numr de 3 x 106 gene. n realitate numrul de gene este mult mai mic, 5 x 104, ceea ce nseamn c o mic parte din ADN este informaional, iar restul este noninformaional, ndeplinind alte roluri n genom. Genele au dou funcii eseniale: funcia autocatalitic i hetorocatalitic. Funcia autocatalitic const n capacitatea genelor, deci i a macromoleculei de ADN, de a se replica cu mare fidelitate, dup modelul semiconservativ, aa nct celulele fiice vor moteni aceleai gene ca celulele mam. Funcia heterocatalitic a genelor, const n capacitatea acestora de a determina, prin secvena de nucleotide ce o posed, sinteze specifice de proteine, enzime, biomolecule, informaia genetic fiind deci decodificat i transformat ntr-o secven de aminoacizi, n catene polipeptidice. Cele dou funcii ale materialului genetic au dus la formularea dogmei centrale a geneticii, care poate fi redat sintetic prin urmtoarea relaie: ADN ARN proteine

n cazul unor ribovirusuri s-a descoperit c poate fi un transfer de informaie de la ARN la ADN. Fenomenul a fost descoperit de Howard Temin (1972) la virusul ce provoac sarcomul Rous la psri, care este un virus ARNADN, n sensul c ARNv se replic prin intermediul ADN. Descoperirea fcut de Temin constituie o excepie de la dogma central a geneticii, prin care s-a dovedit c ARN poate determina sinteza ADN.

3.7.3. Gene suprapuse i gene sritoare

n cadrul cromozomului bacterian i viral, genele sunt dispuse linear, ntr-o anumit ordine, alctuind o singur grup de linkage. Destul de recent, la fagul x174 s-au descoperit aa numitele gene suprapuse, ceea ce nseamn c o anumit secven de codoni poate fi decodificat de mai multe ori, realizndu-se sinteza a dou catene polipeptidice diferite. Structura genomului fagului x174 a fost descifrat integral, fiind constituit din nou gene, deoarece s-a constatat c prin infecia bacteriei E. coli
93

sunt produse nou proteine diferite. Identificarea tuturor nucleotidelor din genomul virusului a permis delimitarea celor nou gene ce au fost notate astfel: A, B, C, D, E, J, F, G, H. Exist poriuni de ADN noninformaional care separ aceste gene ntre ele. Genele A i B determin sinteza a dou proteine diferite. S-a constatat c gena B reprezint partea terminal a genei A care este mult mai mare, deci genele A i B sunt suprapuse, gena B fiind translat dintr-un punct de iniiere intern. Genele D i E sunt de asemenea gene suprapuse. Suprapunerea genelor nseamn, pe de o parte economie de material genetic, dar pe de alt parte poate fi i un dezavantaj, deoarece apariia unei mutaii ntr-o gen determin modificarea i celorlalte gene suprapuse. Gene suprapuse s-au observat i la ali fagi: S13, G4, SV40 etc. Genele sritoare (jumping genes) sunt acele gene care se pot include n diferite regiuni ale cromozomului. Fenomenul a avut la baz observaia c fagul se poate integra ntr-un loc specific a cromozomului bacterian cu o frecven de 100%. Acest sistem s-a determinat i pentru unele segmente de ADN, care nu au origine fagic. De exemplu, la bacterii s-au identificat segmente de ADN alctuite din 800-2.000 nucleotide, care se pot insera n diferite regiuni ale cromozomului i pot provoca mutaii. Aceste segmente au fost denumite segmente de inserie (insertion sequences) i au fost notate: IS1, IS2, IS3 i IS4. Factorul de fertilitate F, precum i unele plasmide, prezint n structura lor normal fragmente IS. De exemplu, factorul de fertilitate F are segmentele de inserie IS2 i IS3, ce determin capacitatea acestuia de a se integra n cromozomul bacterian. Unele segmente de ADN ce determin rezistena la antibiotice pot "sri" dintr-un locus n altul, gsindu-se la nivelul unui plasmid, apoi n genomul fagului, apoi n cromozomul bacterian i apoi iar n plasmid. Aceste gene sritoare sunt denumite i transpozoni, fiind uniti independente, n funcie de rezistena pe care o determin (streptomicin, penicilin, kanamicin, tetraciclin, cloramfenicol etc.). La eucariote, nc din anul 1951, Barbara Mc Clintock, studiind culoarea boabelor de porumb de-a lungul mai multor generaii, a artat c anumite structuri din masa genetic "sar" cte 1-2 generaii, ns observaia respectiv nu a atras atenia oamenilor de tiin. Dup aproape dou decenii s-a descoperit c este vorba de o gen structural ce deinea informaia genetic i alte dou tipuri de gene ce controlau strict elementele de disociere la nivel cromozomic. n anul 1983, Barbara Mc Clintock a primit laurii Premiului Nobel, iar pe baza descoperirii sale s-au formulat noi ipoteze privind geneza cancerului. n general, se consider c transpozonii (sau genele sritoare) determin o mare frecven de rearanjamente moleculare la nivelul macromoleculei de ADN (inversii, deleii, duplicaii, transpoziii, inserii etc.) cu un rol esenial n evoluia i, se pare, c i n procesul de citodifereniere.

94

3.8. REPRODUCEREA I RECOMBINAREA GENETIC LA PROCARIOTE

Procariotele (gr. pro = nainte, karyon = nucleu) sunt organisme primitive extrem de simple, de obicei unicelulare, fr nucleu, cu o structur genetic simpl, o singur macromolecul de ADN ce alctuiesc cromozomul. Principalele tipuri de procariote sunt: viroizii, virusurile, micoplasmele, bacteriile i cianoficeele. Virusurile sunt ageni infecioi considerai fie organisme extrem de rudimentare, fie molecule foarte complexe, de aceea, n mod obinuit, nu sunt incluse n grupul procariotelor. Pentru genetica molecular, bacteriile i virusurile au constituit obiectele de studiu de mare importan, deoarece au o structur foarte simpl i se reproduc ntr-un timp foarte scurt. Descoperirile structurii materialului genetic, a mecanismului a informaiei genetice, au fost posibile datorit folosirii ca material de cercetare a bacteriilor i virusurilor.

3.8.1. Reproducerea bacteriilor i virusurilor

Celula bacterian este alctuit din citoplasm nconjurat de o membran citoplasmatic, care la exterior are o membran rigid, iar la unele bacterii, de acest perete se ataeaz o capsul format din polizaharide sau polipeptide. n citoplasm se gsete o regiune mai dens denumit nucleoid, un numr mare de ribozomi (15-20.000), o formaiune denumit mezozom ce se formeaz prin invaginarea membranei celulare, de care se ataeaz cromozomul circular bacterian. Dup J. D. Watson (1965) n celula bacterian ar exista ntre 3.000 i 6.000 substane chimice, de la cele mai simple la cele mai complexe, pentru sinteza crora sunt necesare numeroase ci metabolice, ce alctuiesc metabolismul celular al bacteriei. Bacteriile posed un singur cromozom circular, format din ADN dublu catenar, cu o lungime de 700-900 , care formeaz un singur grup de linkage. Bacteriile se reproduc amitotic, deci prin simpl fisiune sau prin alte forme de reproducere asexuat, uneori i prin nmulire sexuat. Ciclul celular cuprinde trei perioade: de pregtire (cretere) pentru iniierea procesului de replicaie a ADN, de replicaie propriu-zis, urmat de diviziunea celulei. Bacteriile sunt haploide numai n stadiul de spori, n rest sunt parial diploide datorit procesului de replicaie, deoarece, uneori, naintea terminrii unui ciclu de replicaie ncepe un al doilea ciclu de replicaie sau chiar al treilea. Pe lng cromozomul bacterian exist i un alt material genetic reprezentat prin plasmide, alctuite tot din ADN, dar mult mai mici dect cromozomul propriu-zis. Principalele tipuri de plasmide sunt: factorul de fertilitate (F) ce creeaz deosebiri de sex ntre indivizi, factorul colicinogenic
95

(Col), care se gsete la unele bacterii (Col+) ce elaboreaz o substan toxic, colicina, un grup mai mare de factori ai transferului de rezisten (RTF). Se consider c originea plasmidelor ar fi exogen i anume virusuri, care au dobndit un nalt grad de echilibru cu celula bacterian, pe care nu o mai pot distruge. Virusurile sunt alctuite dintr-un nveli proteic denumit capsid, constituit dintr-un numr variabil (dar caracteristic pentru fiecare tip de virus) de uniti mai mici denumite capsomere. n interiorul capsidei se gsete macromolecula de ADN (dezoxiribovirusuri) sau ARN (ribovirusuri). Virusurile pot fi definite ca macromolecule nucleoproteice, care au capacitatea de a se autoreplica ntr-un sistem reprezentat de celula vie. Ciclul de via al virusurilor cuprinde urmtoarele etape: adsorbia la suprafaa celulei, infectarea celulei prin ptrunderea acizilor nucleici virali n celul, faza de eclips n care virusul este descompus n elementele sale devenind provirus. n faza de eclips ADN al celulei gazd este depolimerizat cu ajutorul dezoxiribonucleazei produs de virus. ncepe sinteza acizilor nucleici virali i a proteinelor virale, are loc asamblarea lor pe baza aparatului enzimatic al celulei gazd, iar faza se numete virus vegetativ. n faza de virus matur, particulele virale prsesc celula infectat n mod activ, prin strbaterea porilor membranei celulare sau n mod pasiv, prin distrugerea sau liza celulei gazd. Ciclul de via descris mai sus se numete ciclul litic. La bacteriofagi, virusuri ce infecteaz celulele bacteriene, pe lng ciclul litic, determinat de aa numiii bacteriofagi viruleni, exist i un ciclu lizogenic, produs de bacteriofagi temperai. n ciclul lizogenic materialul genetic al bacteriofagilor temperai se integreaz n cromozomul bacterian, se replic sincron cu acesta i celula bacterian nu mai este lizat. Materialul genetic al fagului integrat n cromozomul bacteriei poarte numele de profag. Ciclul lizogenic poate s se transforme n ciclul litic fie spontan, fie artificial prin iradieri cu raze X, ultraviolete sau tratamente cu azot-iperit. Fenomenul de lizogenie prezint urmtorul avantaj: celula bacterian ce posed un profag integrat n cromozomul su nu mai este distrus de o nou infecie a fagului respectiv. Acest fenomen a dus la descoperirea unui tip de recombinare genetic la bacterii, realizat cu ajutorul bacteriofagilor temperai, denumit transducie.

3.8.2. Recombinarea genetic la bacterii

Recombinarea genetic la bacterii se realizeaz pe urmtoarele ci: transformare, conjugare, sex-ducie i transducie. Transformarea. Prin transformare se nelege transferul intracelular al unui segment de ADN de la o bacterie donor, n genomul unei bacterii receptor. Frecvena cu care se realizeaz transformarea este foarte redus, sub 1%, iar dimensiunea minim a segmentului de ADN transformant este de 450 perechi de nucleotide.
96

Procesul de transformare se realizeaz atunci cnd este o cantitate mare de ADN implicat n proces i n starea de competen a celulelor bacteriene (modificri ale membranei ce permit ptrunderea ADN). Dup ce ADN exogen de la tipul donator a ptruns n bacteria receptoare are loc un fenomen de sinaps ntre cele dou molecule de ADN, n zona complementar, apoi ADN exogen se integreaz n cromozomul bacteriei receptor, n procesul de replicaie al acestuia. Transformarea realizeaz de obicei transferul unei singure gene, iar n cazuri mai rare, dou sau trei gene linkage, n cel din urm caz dovedindu-se c genele respective sunt dispuse alturat pe cromozom. Transformarea genetic se realizeaz cu o frecven mai mare la sue diferite ale aceleiai specii de bacterii i mai rar ntre specii diferite, dar nrudite. Transformarea genetic poate oferi informaii privind gradul de nrudire filogenetic a unor specii. Tot cu ajutorul transformrii genetice s-au putut localiza unele gene pe cromozomul bacterian. Conjugarea. Fenomenul de conjugare a fost descoperit n anul 1946 de J. Lederberg i E. L. Tatum, fiind considerat un fenomen de parasexualitate, similar oarecum cu reproducerea sexuat de la organismele eucariote. Conjugarea se realizeaz numai ntre dou bacterii de sex opus, iar sexul este determinat de o plasmid, denumit factor de fertilitate sau sex factor, notat cu F. Celulele care posed acest factor sunt "mascule", notate cu F+ iar cele ce nu posed acest factor sunt "femele", F-. Factorul de fertilitate se poate gsi liber n citoplasm i n acest caz se replic independent de cromozomul bacteriei, dar n acest caz fenomenul de conjugare se produce cu o frecven destul de redus, i anume de 10-5. n unele cazuri, factorul de fertilitate poate fi integrat n cromozomul bacterian, iar aceste celule mascule au fost notate cu Hfr (high frequency of recombination). ntre celulele Hfr i celulele F-, conjugarea are loc cu o frecven mult mai mare, i anume 10-1. Factorul de fertilitate are o serie de caracteristici structurale i funcionale: - are o form circular, coninnd n jur de 100.000 perechi de nucleotide, fiind deci mult mai mic dect cromozomul bacterian; - factorul F are capacitatea de a se replica mai repede dect cromozomul bacterian, astfel c, dac ntr-o cultur de celulele F- se introduce o singur celul F+, ntreaga cultur devine ntr-un timp scurt F+; - prin conjugarea ntre celulele F+ i F- se transmite de obicei numai factorul F+, dar frecvena conjugrii este redus, n timp ce conjugarea ntre bacterii Hfr i F- are loc cu o frecven mare, iar ntre cele dou celule poate avea loc i un transfer total sau parial al cromozomului de la bacteria donatoare; - n urma conjugrii, factorul de fertilitate este cel care se transfer ultimul n celula receptoare, el orientnd direcia de transfer al cromozomului, n funcie de locul unde este integrat.
97

Conjugarea a fost studiat la microscopul electronic, descoperindu-se c bacteriile Hfr i F+ posed un apendice filamentos, denumit F-pilus care este absent n celulele femele (F-). Aceti F-pilus (sau sex-pili) realizeaz legtura dintre dou bacterii de sex opus, fiind un fel de tuburi prin care materialul genetic al unei bacterii (F+ sau Hfr) trece total sau parial n celulele F-. Fenomenul de conjugare a fost studiat i printr-o alt tehnic: procesul de transfer al materialului genetic este ntrerupt prin agitare. Prin aceast metod s-a putut determina poziia linear a genelor pe cromozomul bacterian, precum i corelaia precis ce exist ntre frecvena recombinrilor i timpul ct dureaz conjugarea. F. Jacob i E. L. Wollman (1961) studiind conjugarea la dou sue de E. coli, au determinat timpul necesar pentru transferul fiecrui locus n parte, ajungnd la concluzia c ntregul cromozom bacterian este transferat n 89 minute. Pe aceast cale s-au alctuit la unele bacterii, harta genetic, deoarece lungimea cromozomului poate fi msurat n uniti de timp, n care o unitate este egal cu 1 minut. Fenomenul de conjugare este strns legat de sinteza ADN. Replicarea ADN bacterian ncepe ntr-un anumit locus pentru o anumit su. Dup ce celulele Hfr i F- vin n contact, n celula Hfr ncepe sinteza ADN, astfel c, n celula F- migreaz un ADN dublu catenar, format dup modelul semiconservativ. Ambii cromozomi ai bacteriei donator (Hfr), cel care rmne n celula Hfr i cel care se transfer sunt ataai de membrana bacterian ntr-un punct denumit mezozom. n cursul transferului de material genetic, cromozomul circular de la bacteria Hfr devine linear i migreaz n aceast form. Ruperea cromozomului bacterian n vederea conjugrii se realizeaz ntr-un punct denumit replicator, care de cele mai multe ori este locul unde este inserat factorul de fertilitate F. La bacterii existnd diferite sue Hfr, ruperea cromozomului se realizeaz n diferite puncte, acest lucru constituind un avantaj n alctuirea hrilor genetice, avnd n vedere c genele localizate n jurul factorului F sunt transferate ultimele. Sex-ducia, denumit i F-ducia sau transducia F-mediat, este o alt cale de recombinare genetic la bacterii, descoperit de F. Jacob i E. L. Wollman (1960). Cercetrile care au dus la descoperirea acestui tip de recombinare s-au fcut la E. coli, la o su Hfr, care avea factorul de fertilitate inserat lng gena lac+. n procesul de conjugare dintre o bacterie Hfr lac+ i alta F-lac- ar fi trebuit s apar recombinani pentru gena lac+, foarte trziu, aproape de sfritul transferului de material genetic. S-a constatat c au aprut civa recombinani lac+, foarte devreme. Concluzia a fost urmtoarea: factorul F este eliberat din cromozomul bacterian dar printr-un proces de crossing-over, ntre cromozom i factorul F are un schimb de material genetic, rezultnd un factor de fertilitate recombinat, notat cu F' (figura 3.13). Prin trecerea factorului F' ntr-o celul F-, el poate fi inclus n cromozomul bacterian ntr-o regiune omoloag cu regiunea cromozomic pe care o poart, orientnd procesul de conjugare la fel ca n cazul bacteriei Hfr iniiale.
98

Sex-ducia poate fi definit ca fiind procesul prin care gene ale cromozomului bacterian sunt ncorporate n factorul de fertilitate F i pe care le transfer la celulele F- prin procesul de conjugare.

Fig. 3.13. - Formarea factorului de fertilitate recombinat F'

n factorul F pot fi incluse diferite gene, deoarece factorul F poate fi integrat n diferite regiuni ale cromozomului. Celulele bacteriene ce prezint factorul F' pot fi transformate n celule Hfr, prin inseria factorului F' n cromozomul bacterian. Fenomenul de recombinare prin intermediul sex-duciei s-a realizat i ntre specii diferite de bacterii. Astfel, factorul F este absent la speciile de Salmonella, Shigella, Pasteurella, dar poate fi transferat la acestea de la E. coli. Transducia este procesul prin care bacteriofagii temperai realizeaz transferul de informaie genetic de la o bacterie la alta. Acest fenomen a fost descoperit de N. D. Zinder i J. Lederberg n anul 1952, la bacteria Salmonella typhimurium, cu ajutorul bacteriofagului P32. Experiena efectuat de cei doi cercettori a constat n urmtoarele: ntr-un tub Davis, separat la mijloc printr-un filtru de sticl poroas ce permite trecerea bacteriofagilor, dar nu i a bacteriilor, a introdus n cele dou brae dou sue bacteriene diferite (figura 3.14).

Fig. 3.14. - Evidenierea transduciei bacteriene 99

Sua LA22 este auxotrof, dar cu genotipul fen-tri-met+hia+, deci prezint concomitent dou mutaii biochimice, neputnd sintetiza aminoacizii fenilalanin i triptofan, iar sua LA2 este tot auxotrof, dar cu genotipul fen+tri+met-hispentru alte dou gene, neputnd sintetiza aminoacizii metionin i histidin. Sua LA22 este lizogen, n sensul c, n cromozomul su era integrat profagul P22. Unii bacteriofagi sunt eliberai din cromozomul bacteriei i produc liza acesteia. Bacteriofagii pot trece prin filtrul de sticl, produc liza bacteriei LA2, apoi pot reveni n tubul n care se gsete bacteria LA22 cu care pot stabili din nou relaii lizogene n urma crora pot apare indivizi recombinai prototrofi (de tip slbatic) pentru toate cele patru gene, fen+tri+met+his+. Explicaia acestui fenomen este urmtoarea: bacteriofagul P22 producnd liza bacteriei LA2 include, cu o mic frecven, 1 la 105-107, segmentul de cromozom cu genele fen+tri+ de la aceast su. Stabilind relaii lizogene cu sua LA22, bacteriofagul P22 transfer acest segment n cromozomul acestuia rezultnd recombinani genetici de tip slbatic (fen+tri+met+his+). Cercetrile privind transducia au artat c de obicei se transfer o singur gen, n cazuri rare dou gene i niciodat trei gene. n cazul transferului a dou gene, se demonstreaz c cele dou gene sunt foarte apropiate pe cromozomul bacteriei, servind la stabilirea precis a locilor acestora, deci la alctuirea hrilor genetice cu ajutorul transduciei. Transferul concomitent a dou gene prin fenomenul de transducie a fost denumit cotransducie. Transducia este de dou tipuri: transducie specializat, cnd un bacteriofag transfer numai o anumit gen i generalizat cnd un bacteriofag poate transfera oricare gen dintr-un cromozom bacterian. Transducia specializat a fost observat la bacteriofagul ce infecteaz E. coli. Acest bacteriofag este inclus sub form de profag n cromozomul bacteriei numai alturi de locusul gal (gena ce determin metabolizarea galactozei). Bacteriofagul poate transfera numai gena gal+ de o su bacterian la alta. Dac o cultur lizogen cu bacteriofagul este tratat cu raze UV, bacteriofagul se elibereaz din cromozomul bacterian i produce liza bacteriei, putnd infecta apoi bacterii gal-, care se transform cu o anumit frecven n bacterii gal+. n cazul transduciei generalizate se poate realiza transferul oricrei gene de la o bacterie donor la o bacterie receptor, deci bacteriofagul transductant poate ncorpora oricare gen i o transfer altei bacterii.

3.8.3. Recombinarea genetic la virusuri

Recombinarea genetic la virusuri se realizeaz n cazul unor infecii mixte, cu dou sau mai multe tipuri de bacteriofagi. n urma lizei bacteriei pot apare fagi recombinai. Primele cercetri care au pus n eviden recombinarea genetic la virusuri au fost realizate de A. D. Hershey i R. Rothman (1940) la bacteriofagul T2 de la E. coli.
100

S-au folosit dou caractere ale acestui fag: forma plajelor de liz (r) i irul de gazde (host range) notat cu h. Bacteriofagii de tip slbatic (r+) n momentul n care infecteaz bacteria formeaz zone sau plaje mici ce au un halou difuz. Apariia acestui halou se datoreaz suprainfeciei provocate de generaiile succesive ale bacteriofagului T2, existnd un numr mare de bacterii suprainfectate, dar nelizate, formnd pe marginea plajei un halou difuz. Bacteriofagii mutani r- determin o liz rapid a bacteriilor, fr ca suprainfecia s inhibe sau s ntrzie liza, astfel c, aceste plaje sunt mai mari i fr halou, cu marginile clare. Tipul slbatic h+ poate liza sua B de E.coli, dar nu poate liza sua B2. Dac un amestec de bacterii B i B2 sunt infectate cu bacteriofagi h+ ntreaga cultur apare tulbure din cauz c unele bacterii au fost lizate iar altele nu. Mutanta h- a bacteriofagului T2 lizeaz ambele sue B i B2 ale bacteriei, producnd plaje de liz obinuite, cu halou. Dac se fac infecii mixte cu dou sue ale bacteriofagului T2, cu genotipurile h-r+ i h+r- s-a constatat c n cultur apar i bacteriofagi recombinai h-r- i h+r+ datorit unui schimb de material genetic ntre genomurile fagilor. Dac n experiena respectiv se introduce i o a treia mutant, poate fi stabilit ordinea i distana dintre genele bacteriofagului pe baza procentului de recombinare.

101

CAPITOLUL 4 NOIUNI DE INGINERIE GENETIC

Moto: E adevrat c misterul, nu este comod, te nelinitete. Dar dac misterul ar fi absent, nelinitea metafizic a cunoaterii ar disprea i omul ar deveni mineral. Petre uea

Aprofundarea cunotinelor de genetic molecular, cunoaterea structurii fine a genelor i a cromozomilor, a deschis noi posibiliti de izolare i sintez a genelor, de transfer de la o specie la alta, uneori chiar ndeprtate filogenetic, de cultur in vitro a celulelor i de hibridare a acestora. Ingineria genetic poate fi definit ca un ansamblu de metode i tehnici moderne prin care este posibil manipularea materialului genetic la nivel celular i molecular. La nivel celular, ingineria genetic a nsemnat extinderea hibridrilor celulare n afara granielor determinate de specie, obinndu-se hibrizi celulari ntre diferite specii de procariote i eucariote, ntre celule vegetale i animale. La nivel molecular, ingineria genetic a nsemnat izolarea genei, sinteza artificial a genei, realizarea ADN recombinat i transferul de gene de la o specie la alta. n sens strict, ingineria genetic const n crearea de ADN hibrid sau ADN recombinat, derivat de la dou specii diferite, integrarea i clonarea acestuia ntr-o celul bacterian, unde poate funciona normal, realizndu-se n felul acesta transferul de gene, nu pe cale sexuat, ci pe baza ADN recombinat. n felul acesta se deschide calea transformrii dirijate a ereditii organismelor la nivel molecular, acionndu-se direct asupra bazei moleculare a ereditii. n sens mai larg, tot ingineriei genetice i aparin i tehnicile de modificare a structurii i numrului cromozomilor prin mutaii, putndu-se transfera fie cromozomi ntregi de la o specie la alta, fie segmente de cromozomi, domeniu al ingineriei genetice denumit chirurgie cromozomic. n acest domeniu, de remarcat sunt rezultatele obinute de J. G. O'Mara (1940), care a reuit s combine caracterele a dou specii prin transferul unuia sau a ctorva cromozomi de la diferite specii. S-a reuit transferul unor cromozomi n cadrul unor hibridri intergenerice, gru x secar sau gru x pir, transferndu-se gene ce confer rezistena la rugina galben i neagr de la secar i respectiv pir, la gru. Primul transfer de gene a fost realizat n 1928 de ctre E. Griffith, prin experienele de transformare genetic, urmat de transferul de gene cu ajutorul unui ADN purificat, realizat n 1944 de O. T. Avery i colaboratorii, cu o eficien mult mai mare.
102

Din multitudinea de aspecte ale ingineriei genetice, vor fi prezentate aspecte privind sinteza artificial a genei, hibridarea celular la animale i plante, haploidia prin androgenez, importana cercetrilor de inginerie genetic.

4.1. SINTEZA ARTIFICIAL A GENEI

Sinteza artificial a genelor a fost precedat de o alt mare realizare i anume sinteza artificial a ADN de la virusul x174 de ctre Arthur Kornberg, laureat al premiului Nobel (1959) fiind descris n capitolul anterior. H. G. Khorana, genetician american de origine indian, mpreun cu o echip de cercettori din Massachusetts, a realizat n 1970, prima sintez artificial a unei gene i anume gena ce determin sinteza unui ARNs ce transport aminoacidul alanina la nivelul ribozomilor, la Saccharomyces cerevisiae. Aceast gen este destul de mic, format din 77 nucleotide, iar tehnica folosit a fost urmtoarea: s-au sintetizat pe cale chimic, segmente de ADN formate din 10-14 nucleotide. Cu ajutorul enzimei ligaza s-au asamblat aceste segmente rezultnd segmente bicatenare mai lungi. S-au obinut 3 segmente mai lungi cu ajutorul enzimei polinucleotid-kinaza, care au fost legate ntre ele rezultnd segmentul de ADN, corespunztor genei ARNs ce transport aminoacidul alanina la ribozomi. Aceast gen nu era funcional biologic. n anul 1973, geneticianul D. Agarwal, a sintetizat artificial o gen de la bacteria E.coli, ce determin sinteza ARNs ce transport aminoacidul tirozina la ribozomi. Aceast gen s-a dovedit a fi funcional biologic. n anul 1975 geneticianul A. Efstradiatis i echipa sa de la Universitatea Harvard, au sintetizat artificial genele ce intervin n sinteza hemoglobinei la iepure, fiind prima sintez artificial a unei gene de la mamifere. n anul 1976 H. Kster, a sintetizat gena pentru hormonul angiotensina, care regleaz tensiunea arterial i contracia muscular la om, fiind prima gen uman sintetizat artificial. n ultimii ani s-au sintetizat artificial genele ce determin sinteza hormonului de cretere, somatostatina i a insulinei. n prezent tehnica de sintez artificial a genei utilizeaz ARNm, care cu ajutorul enzimei reverstranscriptaza, determin sinteza de ADN complementar i deci de gene. Sinteza artificial a genelor prezint o importan deosebit. Dac genele sunt inserate n virusuri sau plasmide, acestea le pot transfera n celulele bacteriene. Celulele bacteriene vor putea sintetiza o serie de enzime, hormoni, antibiotice i, deoarece bacteriile se pot crete uor, va fi o cale foarte eficient de producere a acestor substane. Genele sintetizate artificial vor putea fi integrate n cromozomii celulelor, n locul genelor cu defecte, combtndu-se astfel, cauza unor maladii ereditare i nu efectul lor.

103

4.2. IZOLAREA GENEI

A fost efectuat pentru prima dat de J. Beckwith de la Universitatea Harvard din SUA, n anul 1969. Izolarea primei gene s-a realizat la bacteria E.coli, cu ajutorul fenomenelor de transducie specializat i sex-ducie. Mai nti s-a izolat ntregul operon lac. Genele care constituie acest operon sunt: genele structurale (z, a i y), gena reglatoare (i), promotorul (p) i operatorul (o). Prin cartarea acestui operon s-a stabilit c ordinea acestor gene n operon este: a y z o p i. Etapele mai importante ale izolrii genei lac sunt redate n fig.4.1. n prima etap prin transducie specializat fagul s-a detaat de cromozomul bacteriei alturi de gena gal, iar alturi de acesta s-a ataat un factor de fertilitate F ce coninea gene ale operonului lac. n etapa a doua, operonul lac a fost inserat n cromozomul bacteriei, n mijlocul genei gal, iar fagul ntr-o regiune alturat, dar separat printr-un segment din cromozom. n cea de a treia etap s-au separat bacteriile la care s-a pierdut segmentul dintre gena lac i fagul astfel c fagul este plasat adiacent genei lac. Fagul capt mai nti o form circular, avnd inclus i operonul lac (etapa 5), iar n ultima etap prin iradieri cu raze U.V. fagul s-a eliberat de cromozomul bacterian, i-a recptat forma linear avnd inclus n interiorul su operonul lac.

Fig.4.1. Etapele izolrii operonului lac la bacteria Escherichia coli

104

Operaiile descrise mai sus s-au efectuat i cu un alt fag, 80, ce realizeaz transducia specializat. ADN al fiecrui fag are o caten cu o greutate molecular mai mare (caten grea) i o caten cu o greutate molecular mai mic (caten uoar). Prin denaturare, catenele fagilor s-au izolat una de alta, iar prin ultracentrifugare s-au separat catenele grele de cele uoare. Catenele grele s-au pus mpreun i prin procesul de renaturare, ntre ele, se refac legturile de hidrogen, dar numai n zona operonului lac, acolo unde cele dou catene au nucleotide complementare, n rest catenele rmn distanate. Cu ajutorul enzimelor ce hidrolizeaz ADN monocatenar, s-au eliminat catenele libere, rmnnd doar operonul lac, bicatenar. Izolarea genelor a avut o importan deosebit pentru c a deschis calea spre studiul aprofundat al materialului genetic in vitro, dar mai ales spre transferul de gene de la un organism la altul.

4.3.TRANSFERUL DE GENE (TRANSGENEZA)

n natur se realizeaz pe mai multe ci: la organismele superioare, n procesul de fecundare sau prin transducie cu ajutorul virusurilor, iar la organismele inferioare (procariote) transferul de gene se realizeaz prin intermediul fenomenelor de transformare, conjugare, sex-ducie i transducie. Transferul de gene ntre speciile ndeprtate filogenetic are la baz tehnica ADN recombinat, care const n realizarea de hibrizi moleculari ADN, ce provin de la cele dou specii. Perfecionarea tehnicii ADN recombinat nu a fost posibil dect dup descoperirea unor enzime care rup molecula de ADN n anumite puncte, denumite endonucleaze de restricie (restrictaze) i a ADN-ligazelor care resudeaz molecula de ADN, n vederea realizrii de ADN hibrid. Enzimele de restricie se gsesc n numr foarte mare, fiecare fiind specific unei anumite secvene de nucleotide, deci unei gene. Recunoscnd secvena specific, restrictazele determin tieturi la nivelul ambelor catene de ADN, fragmentnd molecula. Restrictazele constituie adevrate bisturie biologice, cu ajutorul crora se poate desprinde din molecula de ADN, o gen ce urmeaz a fi transferat. Genele ce trebuiesc transferate pot fi sintetizate in vitro. n realizarea transferului interspecific al genelor, prima problem ce trebuie rezolvat este izolarea unei gene, prin una din tehnicile descrise i gsirea unui vector sau vehicul. Rolul de vehicul l poate avea att ADN plasmidial, ct i ADN al unor virusuri cum ar fi, , SV40. n general vehiculele sunt molecule de ADN circular. n anul 1973, A. Chang i S. Cohen, au reuit s obin plasmide hibride care conineau genele de la dou bacterii i anume gena pentru rezistena la tetraciclin, de la E. coli i gena pentru rezistena la penicilin de la Staphylococcus aureus.
105

O alt cale prin care se realizeaz transferul de gene este folosirea ca vectori a virusurilor temperate, care la un moment dat se gsesc integrate n cromozomul bacterian, sub form de profagi. La un moment dat, profagii se elibereaz din cromozomul bacterian i produc liza bacteriei. n acest caz, bacteriofagii pot lua o gen din cromozomul bacteriei i la o nou infecie o pot transfera ntr-o alt bacterie. n anul 1971, geneticianul C. Merril a reuit s transfere gena ce rspunde de metabolizarea galactozei de la bacteria E. coli n celulele umane. Pentru realizarea acestui transfer s-a procedat astfel: bacteriile E .coli au fost infectate cu bacteriofagul , care se inser adiacent genei gal din cromozomul bacterian. Se provoac liza bacteriei i se vor elibera fagi care posed gena gal. Aceti fagi recombinai au fost introdui ntr-o cultur de celule umane, ce proveneau de la un individ ce prezenta maladia ereditar galactosemia (lipsa genei ce determin enzima necesar metabolizrii galactozei, n glucoz). Dup un timp s-a constatat c celulele umane au nceput s metabolizeze galactoza. Se poate spune c bacteriofagii se comport n mod similar cu plasmidele, putnd ncorpora n cromozom gene strine, pe care le poate transfera n alte celule pe care le infecteaz. Aceste transferuri de gene deschid mari perspective mai ales n cazul transferului de gene de la plante sau animale n celulele bacteriene, care ar putea s produc pe medii relativ simple, mari cantiti de enzime, hormoni, proteine, de care are nevoie omenirea. n acest sens se poate meniona transferul genei ce determin sinteza ovalbuminei, protein din oul de gin, la E. coli K12 (). S-a izolat mai nti ARNm ce codific ovalbumina din ovocitul ginilor. Folosind fenomenul de complementaritate s-a sintetizat ADN, respectiv gena ovalbuminei care a fost inclus apoi ntr-un plasmid recombinat, care prin fenomenul de conjugare a fost transferat n celula bacterian. n urma acestui transfer, celulele bacteriene au nceput s produc ntre 30000-90000 molecule de ovalbumin, ceea ce reprezint n jur de 0,5-1% din cantitatea total de proteine a bacteriei. A. Riggs (citat de P. Raicu, 1980) a reuit s transfere gena ce determin sinteza insulinei umane n pancreas, la o bacterie care a nceput s sintetizeze insulina. Insulina uman este format din dou catene polipeptidice alctuite din 21 i 30 de aminoacizi. n experiena amintit A. Riggs a folosit o gen sintetizat artificial. n anul 1977 s-a reuit s se transfere gena ce determin sinteza hormonului de cretere somatostatina, produs de hipotalamus, pancreas, stomac i intestine, din celulele umane n celulele bacteriene care au nceput s sintetizeze acest hormon. O alt realizare a ingineriei genetice este transferul genelor ce determin sinteza interferonului din celulele umane n celula bacteriei E.coli. Interferonul este o protein cu rol antiviral i este produs de leucocitele umane din snge. Cercetrile Institutului de Oncologie i Imunogenetic din Villejuif arat c interferonul este capabil s vindece oarecii bolnavi de diferite tipuri de cancer, ce nu preau induse de virusuri, c aceast substan stimuleaz
106

globulele albe, denumite NK (natural killers - celule ucigae), o linie de aprare mpotriva celulelor canceroase. Producerea interferonului prin infectarea leucocitelor cu virusuri, pentru a stimula fabricarea de interferon, era foarte scump i se obineau cantiti infime de substan. La nceputul anului 1980, Charles Weismann de la Institutul de biologie molecular din Zurich, a realizat sinteza interferonului, cu ajutorul bacteriei E. coli. Astzi se tie c interferonul are urmtoarele funcii: inhib creterea celulelor n general, regleaz activitile imunitare, mrete activitatea celulelor albe (ce recunosc i distrug celulele tumorale), stimuleaz celulele macrofage ce distrug virusurile, bacteriile i alte particule. Se poate spune c interferonul este un mediator celular, deoarece acioneaz ca un activator al celulelor specializate n distrugerea virusurilor i a celulelor canceroase i nu un antibiotic antiviral. Transgeneza, transferul de gene sau fragmente de ADN de la un organism (donor) la altul (receptor) se poate realiza fie prin metoda direct (introducerea moleculei de ADN n celule receptor), fie prin metode indirecte (ADN este introdus n receptor printr-un vector). Prin metoda direct, ADN exogen poate fi transferat n celule gazd prin mai multe tehnici: endocitoz, electroporare, microinjecie, macroinjecie i biolistic (Butnaru Gallia, 1999). Endocitoza presupune obinerea mai nti a protoplatilor, celule vegetale crora li s-a ndeprtat peretele celular rigid, pectocelulozic, cu ajutorul enzimelor (pectinaza, celulaza) sau pe cale mecanic. ADN transformant este adsorbit la suprafaa celulelor receptoare, iar apoi este inclus n celule. Aceast metod presupune protejarea moleculei de ADN prin includerea sa n lipozomi, prin tratare cu polietilenglicol i fosfat de calciu i existena a mai multor molecule de ADN transformant pentru ca transferul s se realizeze cu o frecven ct mai mare. Electroporarea const n transferul moleculelor de ADN n protoplati cu ajutorul unor impulsuri electrice de scurt durat sau cu ajutorul razelor laser (porare laser). Se apreciaz c eficiena transformrii genetice este destul de mic fiind dependent de greutatea molecular a ADN, concentraia polietilenglicolului, durata i intensitatea impulsului electric, starea fiziologic a celulei receptor (Butnaru Gallia, 1999). Microinjecia este o metod mult mai precis, deoarece o molecul cunoscut (ADN, ARN, proteine) se introduce cu o microsering din sticl montat pe un micromanipulator, ntr-un receptor (protoplast, celul animal), fixat pe o lam de sticl, n gel de agaroz. Metodele biolistice constau n introducerea unui ADN exogen ntr-un receptor prin intermediul aa numitului tun de particule sau cu ajutorul arcului electric. Cu ajutorul tunului de particule, microparticule de aur sau tungsten asociate cu molecule de ADN donor sunt direcionate ntr-o celul sau grup de
107

celule. Celulele sau esuturile bombardate cu aceste microparticule, crescute pe un mediu de cultur vor regenera plante, transformate genetic. Transgeneza indirect presupune izolarea unui segment de ADN (o gen), clonarea genei respective i transferul ntr-o celul receptor prin intermediul unui vector (Butnaru Gallia, 1999). Gena ce trebuie transferat a primit denumirea de pasager; de obicei pasagerul, ptruns ntr-o celul receptor este degradat de sistemul enzimatic al acesteia. Pentru a evita aceast degradare, gena (pasagerul) se asociaz cu un vector, iar mpreun constituie o macromolecul complex, de ADN recombinant. Izolarea ADN de la diferite organisme procariote sau eucariote se realizeaz prin diferite metode fizico-chimice (centrifugare, tratare cu diferite enzime etc.). Deoarece fragmentul de ADN izolat poate conine mai multe gene este necesar fragmentarea acestuia, pentru izolarea genei (pasagerului) ce trebuie transferat. Pentru izolarea unei gene de interes se folosete ARNm al genei respective, care n prezena reverstranscriptazei se va transforma ntr-o molecul de ADN complementar (ADN-c) monocatenar. n prezena ADN-polimerazei I, ADN-c i va sintetiza catena complementar, devenind ADN bicatenar, care va avea nscris informaia nucleotidic din ARNm. Genele ce urmeaz a fi transferate nu vor fi funcionale dac nu au ataate promotorul, intensificator sau atenuator ai transcripiei informaiei genetice, care intr n structura genelor i regleaz activitatea acestora. n procesul de transgenez sunt absolut necesare enzimele de restricie (endonucleaze de restricie), produse n mod natural de bacterii, cu rol imunitar, respectiv de a distruge moleculele de ADN exogen ce ptrund n acestea. Sunt cunoscute n prezent peste 500 de tipuri de endonucleaze de restricie care acioneaz ca nite bisturie moleculare, secionnd moleculele de ADN, n secvene scurte ntre dou baze azotate adiacente cunoscute (int). Cele mai cunoscute endonucleaze de restricie sunt: EcoR1 (izolat de la Escherichia coli), Hpa I (din Haemophilus parainfluenzae), Alu I (din Arthriobacter luteus) etc. Aceste enzime acioneaz asupra unor secvene de nucleotide constituite din 4, 5 sau 6 nucleotide, fie pe axul de simetrie al acestora sau de o parte i de alta a acestuia. Astfel, EcoR1 secioneaz ADN n secven hexanucleotidic 5GAATTC-3 ntre nucleotidele G i A, pe ambele catene ale moleculei, n timp ce Alu I acioneaz la nivelul tetranucleotidului 5-AGCT-3 ntre nucleotidele A i G (Crlan M., 1996). Fiecare enzim are un mod particular, unic, de aciune, de aceia sunt nelipsite n operaiunile de fragmentare a moleculelor de ADN. Transgeneza necesit folosirea unui alt grup de enzime i anume ADNligazele, care leag fragmentele de ADN ce trebuie transferat, de ADN al unui vector. Trebuie avut n vedere i receptorul n care trebuie transferat ADN exogen, care poate fi o bacterie, o celul vegetal sau animal. ntre receptor i vector trebuie s fie o compatibilitate perfect, aa nct, un vector este funcional numai la un anumit receptor.
108

4.3.1. Principalii vectori utilizai n transgenez

Vectorii sunt molecule mici de ADN ce ncorporeaz genele ce trebuie transferate (pasagerul). Vectorii trebuie s aib capacitatea de a ptrunde ntr-o celul gazd, iar gena ce trebuie transferat s fie marcat genetic cu un marker specific, pentru a putea fi recunoscut. Ingineria genetic folosete un numr mare de vectori, funcie de pasager i de receptor. Plasmidele bacteriene, cromozomi miniaturali, care pot include gene strine sunt utilizate frecvent ca vectori: plasmida pBR322, plasmida pUC, plasmida Ti, plasmida Ri .a. Ca vectori pentru celulele vegetale, n vederea obinerii plantelor transgenice se folosesc plasmidele Ti (tumor inducing) de la Agrobacterium tumefaciens i Ri (root inducing) de la Agrobacterium rhizogenes. Mrimea plasmidelor, exprimat n kilobaze (1000 de perechi de baze) este n jurul a 200 kb i pot include i transfera segmente de ADN de 8-10 kb. Un alt grup de vectori l reprezint bacteriofagii. Fagul , care conine 48500 pb poate transfera secvene de ADN mai mari de 40 kb. Cosmidele sunt vectori hibrizi realizai ntre fagul i plasmide, combinnd nsuirile plasmidelor i a fagului, n sensul c sunt funcionale, exprimndu-se fenotipic, fr s se integreze n cromozomul celulelor gazd. Se folosesc frecvent pentru clonarea i transferul fragmentelor de ADN de la eucariote, fragmente de aproximativ 45 kb, care n mod normal nu pot fi incluse n fagul . Fagii monocatenari au ca material genetic o singur caten de ADN notat convenional cu (+). Aceast caten ptrunde n celula gazd, n momentul infeciei, constituind matricea pentru sinteza unei catene complementare, notat cu (-). mpreun cu catena (+) va forma o molecul bicatenar de ADN, care poate fi izolat i folosit pentru clonarea ADN. Exist i ali vectori, cum ar fi vectorii de expresie, a cror gene pot fi transcrise i translate n proteine, virusul SV 40 (Simian Virus 40), vectorii YAC (Yeast Artificial Chromosome) cromozomi artificiali ai drojdiei de bere, vectorii BAC (Bacterial Artificial Chromosome) etc.

4.3.2. Realizri ale transgenezei la plante

n ultimii ani s-au realizat plante transgenice, denumite i plante modificate genetic. Aa cum s-a specificat anterior, la plantele superioare se folosesc ca vectori ai genelor de interes plasmidele Ti de la Agrobacterium tumefaciens, care n mod natural dau natere la tumori i plasmidele Ri de la Agrobacterium rhizogenes, care dau natere la rdcini filiforme.
109

Plasmidele Ti, datorit regiunii denumite ADN-T funcioneaz ca transpozoni (elemente genetice mobile). Numai aceast regiune se integreaz n cromozomul celulei gazd. Bacteriile din genul Agrobacterium ofer singurul exemplu de inginerie genetic natural, deoarece n urma infeciei, bacteria transfer n nucleul celulei vegetale o mic poriune din ADN al plasmidei, care determin transformarea celulei infectate n celul tumoral. Prin eliminarea genelor tumorale (oncogenelor) i asocierea acestei plasmide dezarmate cu o plasmid ce conine gena de interes, clonat n bacteria Escherichia coli se obine un vector de transformare foarte eficient pentru dicotiledonate (n condiii naturale Agrobacterium nu atac monocotiledonatele). Indiferent de metoda de transfer, frecvena de integrare a genelor n genomul celulei vegetale este destul de redus. Din aceast cauz, genei de interes i este asociat o gen marker, care permite selecia celulelor transformate. Se folosesc frecvent ca gene marker, genele care confer rezisten la un antibiotic sau la un erbicid, care-i va permite celulei transformate s supravieuiasc pe un mediu de cultur ce posed antibioticul sau erbicidul. Cele mai importante plante transgenice aflate deja n cultur sunt soia Roundup Ready, tolerant la erbicidul total Roundup (care are ca principiu activ glifosat) i porumbul Bt, rezistent la atacul sfredelitorului (Ostrinia nubilalis), urmnd a se obine plante tolerante la doi sau mai muli factori (rezisten la un erbicid asociat cu rezistena la o insect, androsterilitate asociat cu rezistena la un erbicid etc.). O alt realizare a ingineriei genetice o constituie tomatele, la care s-a modificat procesul de coacere a fructelor, denumite Flavr Savr, fructele meninndu-i prospeimea timp ndelungat. n acest caz, s-a folosit tehnologia ARN antisens, blocndu-se sinteza uneia din enzimele ce degradeaz pereii celulari ai fructului sau a hormonului etilen (cel care accelereaz procesul de coacere, aceasta fiind ntrziat). O alt direcie a ingineriei genetice este transferul genelor nif de la plantele leguminoase la plantele cerealiere.

4.3.3. Transferul genelor fixatoare de azot

Plantele din familia Leguminoase (mazrea, fasolea, bobul, soia etc.) au capacitatea s fixeze N atmosferic cu ajutorul unor bacterii cu care triesc n simbioz. Bacteriile fixatoare de azot ptrund n esuturile rdcinilor, formnd aa numitele nodoziti, iar din aceast simbioz beneficiaz ambele specii: plantele obin azotul atmosferic iar bacteriile obin de la plante compuii organici de care au nevoie. Exist i alte plante, n afar de cele leguminoase, care triesc n simbioz cu bacterii fixatoare de azot: unele graminee (Digitaria), chiar unii arbori cum ar fi aninul (Alnus).

110

Azotul atmosferic poate fi fixat de unele bacterii din genurile: Rhizobium, Azotobacter, Desulfovibrio, Hydrogenomonas etc. sau de unele alge verzi-albastre. Mecanismul fixrii azotului atmosferic a fost descifrat n 1960, n laboratoarele Du Pont de Nemours (SUA). La bacteria Clostridium pasteurianum s-a izolat enzima nitrogenaza, care catalizeaz fixarea azotului atmosferic. Aceast enzim este format din dou molecule proteice, una cu greutate molecular mare (220.000 daltoni) i cealalt cu greutate molecular mic (55.000 daltoni). Molecula mare conine atomi de fier, sulf i molibden, iar molecula mic doar fier i sulf. Cele dou molecule sunt active mpreun i numai n absena oxigenului atmosferic. Protejarea moleculei de nitrogenaz mpotriva oxigenului atmosferic este asigurat de un pigment denumit leghemoglobin care se combin cu oxigenul i protejeaz astfel enzima. Sinteza enzimei nitrogenaza este determinat de un grup de gene notate cu nif care sunt localizate pe cromozom alturat de gena his, ce determin metabolismul histidinei. Se pare c este vorba de dou gene nif: una ce determin sinteza moleculei mari a nitrogenazei i alta ce determin sinteza moleculei mici. Transferul genelor nif de la bacteriile fixatoare de azot la altele nefixatoare se poate realiza pe cile cunoscute de recombinare la bacterii: transformare, conjugare, sex-ducie i transducie. Geneticianul R. Dixon de la Universitatea din Sussex (Anglia) a transferat genele nif i his de la bacteria F+ de Klebsiella pneumoniae, la bacteria F- de E. coli. Tot Dixon n 1974 a obinut un factor de fertilitate recombinat care includea n el i genele nif, denumite FN 68. Acest factor de fertilitate, introdus n mediul de cultur a unor bacterii incapabile s fixeze azotul atmosferic (ex. E.coli), a produs transformarea acestora n bacterii fixatoare de azot. Pentru transferul genelor nif se pot folosi ca vectori i bacteriofagii n procesul de transducie. S. Stroicher a folosit fagul P1 pentru transferul genelor nif. Transferul genelor nif de la o bacterie la alta a creat premisele realizrii unor simbioze a acestor bacterii nu numai cu leguminoasele, ci i cu alte plante care nu au capacitatea de a fixa azotul atmosferic. n viitor se preconizeaz transferul acestor gene nif n cromozomul plantelor sau n cromozomul cloroplastelor, situaie n care plantele nu ar mai avea nevoie de simbioze cu bacteriile, plantele fixndu-i direct azotul atmosferic.

4.4. HIBRIDAREA CELULAR LA ANIMALE

Hibridarea celular in vitro a fost realizat pentru prima dat n 1960 de cercettorul francez G. Barski. A cultivat pe un mediu artificial celule ce proveneau de la dou specii de oareci i a observat c unele celule au fuzionat rezultnd celule hibride, care nsumeaz cromozomii de la celulele iniiale i au nsuiri morfologice, fiziologice i biochimice diferite de ale celulelor iniiale.
111

Fuzionarea spontan a celulelor se realizeaz cu o frecven foarte mic. Pentru a mri frecvena celulelor hibride s-au cutat o serie de ageni inductori care s favorizeze hibridarea celular. Virusul Sendai inactivat s-a dovedit a fi un bun inductor, capabil s mreasc foarte mult frecvena celulelor hibride. S-au identificat o serie de substane chimice care stimuleaz hibridarea celular: un analog al isoleucinei, polietilenglicolul etc. O alt problem ce a condiionat hibridarea celular a fost modul de separare sau selectare a celulelor hibride de restul celulelor din mediul de cretere. S-au elaborat aa numitele medii selective, n care celulele hibride se nmulesc n timp ce celulele parentale sunt eliminate. Folosind tehnicile prezentate mai sus, s-au reuit hibridri celulare ntre celule de la specii foarte diferite: celule de hamster chinezesc x celule de oarece, celule umane x celule de oarece, celule umane x celule de nar, celule de oarece x celule de gin. Celulele hibride nu pot regenera organisme hibride complet dezvoltate, dar se nmulesc pn la un anumit moment, rezultnd clone celulare hibride. Obinerea acestor clone celulare hibride are un rol foarte important n cercetrile de genetic. Dac ne referim la hibridrile dintre celulele umane x celule de oarece (fig.4.2.), s-a constatat c celulele hibride conin iniial toi cromozomii (46 de la om + 40 de la oarece). n momentul cnd ncep s se divid, celulele hibride pierd cte un cromozom ce aparine unei specii. n cazul hibridrii celule umane x celule de oarece se pierd o parte din cromozomii umani.

Fig.4.2. Hibridarea celular la animale 112

Aceast particularitate a celulelor hibride, a fost folosit n alctuirea hrilor cromozomice, deoarece eliminarea a cte unui cromozom se manifest prin lipsa sau prezena n plus a uneia sau a mai multor enzime, putndu-se localiza unele gene pe cromozomi. Pentru localizarea mai precis a genelor n diferite regiuni ale cromozomului se folosesc pentru hibridare celule umane ce provin de la indivizi ce prezint anumite restructurri cromozomice. S-au realizat hibrizi celulari ntre leucocitele ce produc interferon i celulele tumorale, rezultnd celule de tip hibridoma, ce produc o cantitate mult mai mare de interferon.

4.5. HIBRIDAREA CELULAR LA PLANTE

Hibridarea celular la plante s-a putut realiza numai dup ce s-au obinut aa numiii protoplati, care sunt celule vegetale crora li s-a ndeprtat membrana rigid pecto-celulozic. ndeprtarea membranei pecto-celulozice s-a realizat la nceput pe cale mecanic iar mai trziu, dup anul 1960, prin metode chimice, folosind o serie de enzime cum ar fi: celulaza, pectinaza, macerozima. n anul 1971, francezul J. P. Nitsch a obinut o plant complet dezvoltat, prin regenerarea protoplatilor (fig. 4.3.). n ultimii ani s-au izolat protoplati i s-au regenerat plante ntregi la: soia, morcov, petunia, bob, mazre, gru etc. (Raicu P., 1980).

Fig. 4. 3. Obinerea enzimatic a protoplatilor 113

Fuzionarea protoplatilor ridic aceleai probleme ca i fuzionarea celulelor animale: mrirea frecvenei celulelor hibride i selectarea acestora. Pentru a mri frecvena de fuzionare a protoplatilor se folosesc: polietilenglicolul, nitratul de sodiu, ionii de Ca la un pH ridicat, ser proaspt de iepure etc. Selectarea celulelor fuzionate se realizeaz prin folosirea de medii selective, care elimin celulele nefuzionate pstrndu-le pe cele hibride. La plante s-a constatat c mediile de cultur ce nu posed substane de cretere (citochinin i auxin) elimin celulele parentale, n timp ce celulele hibride se pot dispensa de aceste substane. P. S. Carlson (1972) a obinut plante hibride ntregi, prin fuzionarea protoplatilor de la speciile de tutun, Nicotiana glauca (2n=24) i N. langsdorffii (2n=18). Plantele rezultate erau amfiploizi ce aveau 2n=42 cromozomi, identici cu hibrizii obinui pe cale sexuat (fig.4.4.) Aceast metod de obinere a hibrizilor a permis ns obinerea de hibrizi celulari ntre speciile ndeprtate filogenetic care n mod obinuit nu se pot hibrida sexuat: morcov x tutun, porumb x ovz, porumb x soia, morcov x petunia.

Fig. 4.4. Hibridarea celular la plante 114

Un aspect foarte important este acela c protoplatii pot include molecule de ADN strine, existente n mediu, particule strine(virusuri) i alte molecule. Fenomenul a fost numit transgenoz, iar pe aceast cale se pot transfera gene sau chiar organite citoplasmatice de la un organism la altul. Din punct de vedere genetic, protoplatii prezint o serie de avantaje: - permit nmulirea rapid a unor genotipuri valoroase; - se pot obine hibrizi celulari ntre dou specii ndeprtate din punct de vedere filogenetic, care nu se pot ncrucia sexuat; - se pot obine forme cu grade diferite de poliploidie; - se pot induce mutaii la nivelul protoplatilor haploizi sau diploizi; - se pot transfera gene, cromozomi sau cloroplaste; - protoplatii pot regenera plante libere de viroze. n ultimii ani cercetrile privind hibridarea celular a luat o mare amploare, reuindu-se hibridarea unor celule animale cu celule vegetale. n anul 1976 A. Lima de Faria (Suedia) a reuit fuzionarea unor celule tumorale umane de tip HeLa cu protoplati de morcov, folosind polietilenglicolul ca agent inductor. Aceste hibridri urmresc combinarea unor genotipuri extrem de diferite, depindu-se limitele impuse de reproducerea sexuat.

4.6. HAPLOIDIA PRIN ANDROGENEZ LA PLANTE

Dezvoltarea partenogenetic a unui embrion sau a unei plante dintr-un microspor haploid poart numele de androgenez iar dezvoltarea unui organism haploid dintr-o oosfer sau un nucleu secundar al sacului embrionar se numete ginogenez. n anul 1964 cercettorii indieni S. Guha i S. C. Maheswari au cultivat pe un mediu artificial, antere de Datura innoxia i au obinut numeroi embrioizi. Cu doi ani mai trziu s-au obinut plante haploide complet dezvoltate la tutun (Nicotiana tabacum) (Raicu P., 1980). Androgeneza este de dou tipuri: direct i indirect (fig.4.5.). Androgeneza direct const n faptul c programul normal al microsporului este deviat sub influena unor stimuli externi, avnd loc o evoluie particular a nucleului haploid, care prin diviziuni mitotice devine embrioid i apoi plant matur. n cazul androgenezei indirecte, se formeaz mai nti un esut nedifereniat denumit calus, din care se pot diferenia apoi plante haploide cu diferite grade de poliploidie. Obinerea unor plante haploide prin androgenez este condiionat de numeroi factori, cum ar fi vrsta anterelor, temperatura, lumina, compoziia mediului de cultur, fapt ce a fcut ca numai la unele specii s se poat obine haploizi pe aceast cale. Pentru genetic, haploizii obinui prin androgenez prezint o mare importan. n primul rnd se demonstreaz c n nucleul celulelor vegetale exist toat informaia ereditar a organismului, inclusiv programul embriogenezei, deoarece dintr-o singur celul se regenereaz un organism ntreg.
115

Plantele haploide sunt pure din puncte de vedere genetic, deoarece sunt hemizigote, existnd o coresponden complet ntre genotip i fenotip. Prin dublarea numrului de cromozomi se obin plante diploide, complet homozigote, aa numitele linii izogene, ntr-un timp foarte scurt, de o importan deosebit pentru ameliorare. Dac prin metodele clasice liniile homozigote la plantele alogame se obin n 8-9 generaii de consangvinizare, prin haploidie liniile homozigote se obin ntr-o singur generaie. La plantele haploide se manifest toate genele recesive iar mutaiile se pot detecta foarte uor. Haploizii s-au dovedit utili n studiile de embriogenez experimental, de citologie, citogenetic, de mutagenez, de fiziologie i biochimie, de citodifereniere, datorit faptului c expresivitatea genelor la plantele haploide, care sunt hemizigote, este total, ntr-o singur generaie.

Fig. 4.5. Haploidia prin androgenez direct i indirect

116

CAPITOLUL 5 EREDITATEA MENDELIAN

Moto: "Gregor Mendel, o figur cu care se poate mndri ntreaga omenire C. Sandu Aldea Odat cu Mendel, fenomenele biologiei au dobndit dintr-odat rigoarea matematicienilor. Metodologia, tratarea statistic i reprezentarea simbolic, impun ereditii o ntreag logic intern Francois Jacob

Apariia lucrrii Versuche uber Pflanzenhybriden n 1866, a naturalistului i matematicianului ceh Gregor Johann Mendel (1822-1884), a constituit un moment important n istoria biologiei. Gregor Mendel este considerat unul din fondatorii geneticii, datorit teoriei factorilor ereditari, sintez a celor dou legi ale ereditii: legea segregrii caracterelor (legea puritii gameilor) i legea segregrii independente a perechilor de caractere (legea liberei combinaii a factorilor ereditari). Unui prieten, Gregor Mendel i-a spus: Timpul meu va veni i ntradevr a venit, dup redescoperirea legilor ereditii, la nceputul secolului XX de Hugo de Vries (Olanda), Carl Correns (Germania) i Erich Tschermack (Austria). Redescoperirea legilor lui Mendel a dus la retiprirea lucrrii i traducerea ei n mai multe ri. n limba romn, lucrarea lui Mendel a fost tradus n anul 1945 din iniiativa doctorului A. Piescu.

5.1. TERMINOLOGIA FOLOSIT N GENETICA MENDELIAN

n cercetrile sale, Gr. Mendel a folosit n mod deosebit mazrea, Pisum sativum, plant autogam, care prezint caractere distincte de la o varietate la alta. Caracterele luate n studiu au fost urmtoarele: talia plantelor (nalt sau pitic), culoarea pstilor nemature (galben sau verde), culoarea cotiledoanelor (verde sau galben), suprafaa seminelor (neted sau zbrcit), culoarea tegumentului boabelor (alb sau cenuie), poziia florilor (axial sau terminal), forma pstilor (dreapt sau gtuit ntre semine). Aceste perechi de caractere au fost numite mai trziu alelomorfe (de W. Bateson i E. R. Saunders, 1902), din care a rezultat termenul de alele. Determinanii ereditari au fost numii i factori ereditari (indicai ulterior prin noiunea de gen).
117

nainte de a analiza mecanismul de transmitere a caracterelor n procesul de hibridare este necesar s fie definite cteva noiuni de baz care vor servi pentru nelegerea lui. Hibridarea este ncruciarea dintre doi indivizi care se deosebesc prin una sau mai multe perechi de caractere. Hibridul este rezultatul hibridrii. Prinii (genitorii) se noteaz cu P (lat. parentes = prini) iar urmaii (descendenii) se noteaz cu F (lat. fillii = copii). n funcie de numrul de perechi de caractere prin care se deosebesc prinii, exist mai multe tipuri de hibridare: monohibridarea (o pereche de caractere), dihibridarea (dou perechi de caractere) etc. n concepia lui Gregor Mendel, determinanii genetici au fost numii factori ereditari, n genetica modern fiind nlocuii prin termenul de gene. Gena este unitatea elementar ce deine informaia genetic a unui caracter ereditar, transmis de prini la urmai. Gena ocup un loc precis n cromozom (locus). n celulele somatice, cromozomii omologi, unul de origine matern, cellalt de origine patern, vor avea i loci omologi, ocupai de gene alele. Dac alelele sunt identice (AA sau aa) indivizii se numesc homozigoi pentru aceast pereche de gene, iar cnd alelele sunt diferite (Aa) indivizii sunt considerai heterozigoi. Ereditatea mendelian presupune, n principal, interaciunea dominan-recesivitate ntre genele alele; alela care se manifest fenotipic la hibrizii F1 este dominant, iar perechea sa, care nu se exteriorizeaz prin caracterul respectiv, este recesiv. Hibridrile, de orice nivel, ofer posibilitatea unei duble analize: sub aspect genotipic i sub aspect fenotipic. Genotipul reprezint totalitatea genelor unui individ sau constituia genetic a acestuia. Noiunea de genotip se utilizeaz ns i n sens restrns, numai pentru una sau cteva perechi de gene alele (AA, Aa, aa, AABB, AaBb etc.). Fenotipul reprezint totalitatea caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice i comportamentale ale individului, care rezult din interaciunea genotipului cu mediul.

5.2. LEGILE MENDELIENE ALE EREDITII

n lucrrile i manualele care s-au ocupat de opera lui Mendel, rezultatele la care a ajuns el, au fost prezentate de diferii autori n mod diferit. n legtur cu legile lui Mendel sunt menionate diferite formulri: legea uniformitii hibrizilor n prima generaie, legea dominanei, legea puritii gameilor, legea segregrii caracterelor, legea liberei combinri a caracterelor numit i legea independenei caracterelor. Dup prerea noastr din lectura lucrrii lui Mendel Experiene asupra hibrizilor de plante, se desprind dou legi: 1. Legea segregrii sau a disjunciei caracterelor n generaia a doua hibrid (F2) (datorit separrii sau segregrii n meioza hibridului F1 a
118

alelelor dominante i recesive i unirii ntmpltoare a gameilor pentru formarea generaiei F2). 2. Legea combinrii libere a caracterelor sau a segregrii independente a acestora (apariia la ncruciarea polihibrid, n urma segregrii i combinrii libere a caracterelor, a unor noi combinaii la descendeni).

5.2.1. Legea segregrii caracterelor (legea puritii gameilor)

Gregor Mendel a efectuat un numr impresionant de mono, di i trihibridri la mazre (Pisum sativum L.) i la alte specii din genurile: Phaseolus, Mirabilis, Cirsium, Melandrium, Zea, Antirrhinum, Hieracium etc. Segregarea caracterelor ereditare a fost formulat, n urma analizei fenotipice i genotipice a unor monohibridri, dar poate fi demonstrat i-n cazul celorlalte tipuri de hibridare. Gregor Mendel a ncruciat o varietate de mazre cu semine galbene, cu o varietate cu semine verzi, ambele homozigote (pure din punct de vedere genetic). n generaia F1, au rezultat numai plante cu semine galbene. Caracterul culoare galben a fost numit dominant, iar perechea sa, culoare verde, recesiv (lat. recessere = ascuns). n urma autofecundrii plantelor din generaia F1 a rezultat generaia F2, n care s-au obinut dou grupe fenotipice: (75 %) semine galbene i (25%) semine verzi, prin urmare un raport de segregare fenotipic de 3:1. Notnd caracterul culoare galben cu A, iar verde cu a, n figura 5.1. se pot analiza sub aspect fenotipic i genotipic, prinii, generaiile F1, F2 i F3.

Fig. 5.1. Structura genotipurilor i a fenotipurilor n cazul monohibridrii 119

Gregor Mendel a explicat segregarea factorilor ereditari astfel: n celulele somatice, factorii ereditari se gsesc sub form de pereche (AA, Aa, aa). n urma meiozei, factorii ereditari segreg, astfel c gameii vor avea numai cte un singur reprezentant din fiecare pereche (A sau a), deci sunt puri din punct de vedere genetic. Prinii sunt homozigoi (AA i aa) i vor produce cte un singur tip de gamei (A sau a). n generaia F1 toi indivizii sunt identici fenotipic (semine galbene) i genotipic (Aa). Indivizii generaiei F1, heterozigoi, vor forma dou tipuri de gamei pentru fiecare sex: 50% A i 50% a. Combinarea probabilistic a gameilor de sex diferit face ca n F2 s rezulte trei combinaii genotipice, 1/4 (25%) AA, 2/4 (50%) Aa i 1/4 (25%) aa (raportul de segregare genotipic 1:2:1) i dou grupe fenotipice (75%) semine galbene i (25%) semine verzi (raportul de segregare fenotipic 3:1). R. C. Punnett imagineaz un ah de combinaii a gameilor celor dou sexe, dnd posibilitatea identificrii rapide a tuturor genotipurilor i fenotipurilor din generaia F2:
Gamei 50% A 50% a Gamei 50% A 25% AA 25% Aa 50% a 25%Aa 25% aa

Gregor Mendel a efectuat monohibridri i cu alte perechi de caractere, constatnd acelai lucru: n generaia F1 au rezultat indivizi asemntori unui printe, iar n generaia F2, segregarea s-a realizat ntr-un raport foarte apropiat de 3:1 (tabelul 5.1.). Tabelul 5.1. Rezultatele monohibridrilor la mazre (obinute de Gregor Mendel)
nsuiri Caracterul Forma seminelor Culoarea cotiledoanelor Culoarea tegumentului Consistena pstilor Culoarea pstilor Dispoziia florilor Forma plantei Total Dominante (D) Neted Galben Colorat Tare Verde Axilar nalt Recesive (r) Zbrcit Verde Alb Moale Galben Terminal Pitic 120 Dominante 5.474 6.022 705 862 428 651 187 14.949 Recesive 1.850 2.001 224 299 152 207 277 5010 Raportul D/r 2,98:1,01 3,01:0,99 3,03:0,96 2,98:1,02 2,95:1,05 3,03:0,96 2,95:1,04 2,99:1,01

Monohibridrile efectuate de Gregor Mendel au fost denumite mai trziu monohibridri de tip Pisum. Dup redescoperirea legilor mendeliene, imediat dup anul 1900, s-au realizat monohibridri i la diferite specii de animale. Obinndu-se rezultate asemntoare celor de la plante, s-a demonstrat universalitatea legilor mendeliene. n anul 1901, W. Bateson a ncruciat diferite rase de gini, care se deosebeau prin forma crestei: mazre, trandafir i simpl. Formele de creast mazre i trandafir sunt dominante fa de forma simpl, iar n generaia F2 segregarea s-a produs n raportul de 3:1 (Raicu P., 1980). Zoologul francez L. Cuenot (1902) a ncruciat oareci cu blan de culoare gri cu oareci de culoare alb, obinnd n generaia F1 oareci gri, iar n generaia F2 segregarea s-a produs n raportul de 3:1. Experiene similare s-au fcut apoi la foarte multe specii de animale, ntrind ideea de universalitate a legilor mendeliene.

5.2.2. Legea segregrii independente a perechilor de caractere

Cea mai simpl form de polihibridare este dihibridarea, termen introdus n genetic de ctre Hugo de Vries (1900). n acest caz sunt urmrite dou perechi de caractere. La ncruciarea a dou soiuri de mazre: plante cu semine galbene i netede cu plante cu semine verzi i zbrcite, n F1, G. Mendel a obinut plante cu semine galbene i netede. n F2 perechile de caractere analizate separat au segregat dup raportul 3:1 i anume: 75% semine galbene i 25% semine verzi, i 75% semine netede i 25% semine zbrcite. Analiznd ns modul cum apar mpreun cele dou perechi de caractere, G. Mendel a constatat c raportul dintre ele este: 56,25% semine galbene i netede; 18,75% semine galbene i zbrcite; 18,75% semine verzi i netede; 6,25% semine verzi i zbrcite. Din aceast analiz, ajunge la concluzia c pentru fiecare pereche de caractere segregarea se produce independent, iar raportul fenotipic pentru ambele caractere este de 9:3:3:1. Caracterele s-au separat n timpul formrii gameilor i s-au combinat n timpul fecundrii n toate modurile posibile, formnd cele patru grupe fenotipice. Aceste rezultate i-au permis lui Mendel s emit legea independenei caracterelor sau a liberei combinri a factorilor ereditari. Dup prerea lui, cei doi gamei care particip la fecundare nu-i contopesc caracterele n hibrid, ci ele stau alturate unele de altele, pentru ca apoi s se despart din nou n meioz, producnd prin fecundare, generaia a doua (F2). Pe baza celor artate la monohibridare se poate alctui, n mod analog, un ah de combinaii lund n considerare de data aceasta, dou perechi de caractere care se pot nota dup cum urmeaz:
121

A = neted B = galben a = zbrcit b = verde Mecanismul ahului devine simplu dac se are n vedere faptul c n gamei numrul de cromozomi, respectiv de caractere alele, este pe jumtate dect n celulele somatice. Pentru ncruciarea mazrii cu semine netede i galbene cu mazre cu semine zbrcite i verzi, avnd n vedere c individul este rezultatul fecundrii a doi gamei, formula prinilor va fi: AABB x aabb. Gameii prinilor formai prin reducerea cromatic vor avea formula AB i ab. Din combinarea lor se va nate generaia F1, cu formula AaBb. Hibridul F1 formeaz patru tipuri de gamei: AB, Ab, aB, ab, din combinarea crora, rezult generaia F2. Gameii se formeaz n numr egal att pentru sexul femel, ct i pentru sexul mascul. Din combinarea ntmpltoare a celor patru tipuri de gamei apar 16 combinaii genotipice, 9 genotipuri i 4 fenotipuri (fig. 5.2.). Fenotipurile apar n raportul de 9:3:3:1: 9/16 indivizi neted - galben (AABB, AABb, AaBb, AABb, AaBb, AaBB, AaBb, AaaBb); 3/16 indivizi neted verde - (AAbb, Aabb, Aabb); 3/16 indivizi zbrcit - galben (aaBB, aaBb, aaBb); 1/16 indivizi zbrcit - verde (aabb). Din analiza celor 16 combinaii de caractere rezult c acestea reprezint 9 genotipuri care segreg n raportul: 1/16 AABB : 2/16 AABb : 2/16 AaBB : 4/16 AaBb : 1/16 AAbb : 2/16 Aabb : 1/16 aaBB : 2/16 aaBb : 1/16 aabb (sau 1:2:2:4:1:2:1:2:1). Ceea ce i atrage atenia lui G. Mendel n mod deosebit n aceast experien este apariia combinaiilor noi de caractere AAbb si Aabb (semine netede i verzi), precum i aaBB i aaBb (semine zbrcite i galbene). Acesta este motivul care l conduce la formularea celei de a doua legi, cu privire la independena caracterelor sau combinarea liber a caracterelor. Aceleai constatri se pot face analiznd o trihibridare. Dac se consider c prinii au genotipurile AABBCC i aabbcc, hibridul din F1 cu genotipul AaBbCc va forma 8 tipuri de gamei: ABC, ABc, AbC, Abc, aBC, aBc, abC, abc. Grupnd combinaiile hibride n F2 se constat c cele 64 de combinaii genotipice segreg n opt grupe fenotipice, dup cum urmeaz: 27 posed trei caractere dominante (A, B, C) 9 posed dou caractere dominante i unul recesiv (A, B, c) 9 posed dou caractere dominante i unul recesiv (A, b, C) 9 posed dou caractere dominante i unul recesiv (a, B, C) 3 posed un caracter dominant i dou recesive (A, b, c) 3 posed un caracter dominant i dou recesive (a, B, c) 3 posed un caracter dominant i dou recesive (a, b, C) 1 posed trei caractere recesive (a, b, c).
122

Rezult deci opt fenotipuri, repartizate n raportul 27:9:9:9:3:3:3:1. Rezultatele obinute n urma trihibridrii de tip Pisum confirm legea segregrii independente a caracterelor.

Fig. 5.2. Dihibridare ntre un soi de mazre cu bobul galben-rotund i unul cu bobul verde-zbrcit

5.3. PROBABILITATEA I RAPORTURILE MENDELIENE DE SEGREGARE

Pe baza legilor ereditii descoperite de Gregor Mendel se pot indica rezultatele care se obin ntr-o hibridare. Raporturile mendeliene de segregare depind de numrul perechilor de caractere. Astfel, la monohibridare, raportul fenotipic n F2 este de 3:1; la dihibridare de 9:3:3:1; la trihibridare de 27:9:9:9:3:3:3:1 .a.m.d. ncepnd cu generaia F3, aceste raporturi se calculeaz inndu-se seama de homozigoia i heterozigoia indivizilor, heterozigoii fiind singurii care segreg n descenden. Dac se analizeaz termenii care alctuiesc raporturile de segregare se observ c ei se obin prin ridicarea binomului 3:1 la puterea numrului perechilor de caractere: (3+1)1, (3+1)2, (3+1)3. Pentru n perechi de caractere, binomul se ridic la puterea n, (3+1)n.
123

Rezultatele obinute n diferite tipuri de hibridri pot fi anticipate, dac se aplic o regul simpl de calcul a probabilitilor: ansa apariiei concomitente a dou fenomene este egal cu produsul probabilitilor lor separate [P(A i B) = P(A) x P(B)]. Dac n mai multe monohibridri raporturile mendeliene sunt 3:1, 3/4 (A) x 3/4 (B), deci 9/16 (AB). Calculul poate fi realizat pentru orice combinaie de caractere ce segreg independent. n exemplele analizate s-a urmrit cum se comport n hibridri un numr mic de factori alelomorfi. De exemplu, pentru o pereche de factori, numrul de combinaii n F2, a fost de (21)2=4, pentru dou perechi de factori de (22)2=16, pentru trei perechi de factori de (23)2=64, .a.m.d. Este uor de neles c n cazul n care se analizeaz un numr mare de perechi de caractere, numrul acestor combinaii este enorm. De exemplu, pentru 10 perechi de factori, numrul combinaiilor hibride se ridic la peste un milion. Cu att mai complicat apare i analiza genetic privind formarea i gruparea combinaiilor la un ir de generaii. Tabelul 5.2. d posibilitatea de a calcula numrul combinaiilor obinute, n funcie de numrul perechilor de factori pe care i urmrim. De asemenea, permite a se deduce i numrul tipurilor de gamei i a genotipurilor ce se vor obine. Numrul mare de forme pe care l ntlnim la vieuitoare asigur ntr-o mare msur diversificarea speciilor i procesul de evoluie a acestora. Tabelul 5.2. Segregarea la hibridrile de tip Pisum n funcie de numrul perechilor de alele
Numrul perechilor de caractere Numrul tipurilor de gamei produi n F1 Numrul combinaiilor de gene n F2 Numrul genotipurilor n F2 Numrul genotipurilor homozigote n F2 Numrul grupelor fenotipice i raporturi de segregare n F2

1 2 3 4 5 n

21=2 22=4 23=8 24=16 25=32 2n

41=4 42=16 43=64 44=256 45=1024 4n

31=3 32=9 33=27 34=81 35=243 3n

21=2 22=4 23=8 24=16 25=32 2n

3:1 9:3: 3:1 27:9:9:9:3:3:3:1 (3+1)4 (3+1)5 (3+1)n

n cercetrile pe care le-a efectuat Gregor Mendel cu privire la dihibridare s-au urmrit caracterele neted-zbrcit i galben-verde, iar datele sunt prezentate n tabelul 5.3. Diferenele dintre valorile experimentale i cele teoretice, deduse din calcul, pot fi mai mari sau mai mici. Pentru a stabili dac ele nu depesc pragul segregrii de tip mendelian, dac segregarea are un caracter ntmpltor sau este urmarea unei legi, se calculeaz testul 2 (chi ptrat).
124

Tabelul 5.3. Grupele fenotipice obinute de Mendel ntr-o dihibridare fa de grupele fenotipice rezultate din calcul
Valori Experimentale Calculate teoretic Diferena (d) Netedegalbene 315 312,75 -2,75 Numrul de semine: NetedeZbrciteZbrciteverzi galbene verzi 108 101 32 104,25 104,25 34,75 -3,75 +3,75 +2,75

Total 556 556 0

Testul 2 (chi ptrat) permite compararea distribuiei teoretice a grupelor fenotipice cu rezultatele experimentale el se calculeaz dup formula:
2 =

d
e

, n care:

este semnul nsumrii; d diferena ntre valoarea teoretic i valoarea experimental a fenomenului cercetat; e valoarea teoretic. Aplicnd formula pentru datele din tabelul privind estimarea probabilitilor n cazul diferitelor valori ale lui 2 i diferite grade de liberate se obine:
2,25 2 3,75 2 3,25 2 2,75 2 + + + = 0,47 312,75 104,25 104,25 34,75

Pe baza unor tabele speciale se poate aprecia dac raporturile de segregare se abat semnificativ sau nesemnificativ de la tipul mendelian de segregare. n tabelul 5.4. dup R. A. Fisher, sunt redate datele necesare extinderii probabilitilor n funcie de valorile lui 2 i gradele de libertate. Tabelul 5.4. Valorile de estimare a probabilitii, dup R. A. Fisher
GL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,99 0,0002 0,02 0,12 0,3 0,55 0,87 1,24 1,65 2,09 2,56 0,95 0,0004 0,10 0,35 0,71 1,14 1,63 2,17 2,73 3,32 3,94 0,90 0,016 0,21 0,58 1,06 1,61 2,20 2,83 3,49 4,17 4,87 Valorile P (n %) 0,80 0,70 0,50 0,064 0,15 0,46 0,45 0,71 1,39 1,01 1,42 2,37 1,65 2,20 3,36 2,34 3,00 4,35 3,07 3,83 5,35 3,82 4,67 6,35 4,59 5,53 7,4 5,38 6,39 8,35 6,18 7,27 9,34 0,30 1,1 2,4 3,7 4,9 6,1 7,2 8,4 9,5 10,6 11,8 0,10 2,7 4,6 6,3 7,8 9,2 10,6 12,0 13,4 14,7 16,0 0,05 3,8 6,0 7,8 9,5 11,1 12,6 14,1 15,5 16,9 18,3 0,01 6,6 9,2 11,3 13,3 15,1 16,8 18,5 20,1 21,7 23,2

125

Gradele de libertate (GL) se calculeaz scznd 1 din numrul claselor (grupelor) fenotipice. n exemplul dat, gradele de libertate vor fi 4-1=3. n tabelul 5.4. valoarea 0,47, pentru 3 grade de libertate este situat ntre valorile 0,35 i 0,58. Aceasta corespunde unei probabiliti P, de la 0,95% la 0,90%, adic la repetarea ncrucirii, exist ansa de 90-95% de a se obine raportul de segregare 9:3:3:1. n statistic se consider c probabilitatea este semnificativ cnd fenomenul se repet la cel puin 95% din cazuri, cnd exist diferene mici ntre valorile experimentale i cele teoretice. n exemplul folosit, valoare de 0,47 este destul de apropiat de valoarea 0,35 din dreptul lui P=0,95 pentru 3 grade de libertate.

5.4. MECANISMUL CITOLOGIC AL SEGREGRII CARACTERELOR

Gregor Mendel a cercetat comportarea caracterelor n descendena hibrid, considernd factorii ereditari drept uniti materiale. n celulele somatice, ei se gsesc sub form de perechi, n timp ce n celulele sexuale sub form simpl. Segregarea caracterelor era condiionat de segregarea factorilor, odat cu formarea celulelor sexuale, iar combinarea lor n diferite moduri se baza pe ntlnirea ntmpltoare a gameilor n procesul de fecundare. Cercettorii care urmeaz dup Gregor Mendel caut s explice independena i segregarea caracterelor fcnd uz de cunotinele citologice. Din momentul n care s-a descoperit c factorii ereditari sunt localizai n cromozomi, s-a neles c segregarea caracterelor este determinat de segregarea cromozomilor n meioz i recombinarea lor n procesul de fecundare. W. S. Sutton (1902) a stabilit c o specie conine n fiecare cromozom cte un grup de factori ereditari i c fiecare factor dintr-un grup se comport independent fa de factorii situai n celelalte grupe. Numrul grupelor de caractere corespunde cu numrul perechilor de cromozomi omologi. Se tie c celulele sexuale, nainte de a suferi reducerea cromozomal, au un numr de 2n cromozomi (fiecare cromozom cu omologul su). n urma diviziunii meiotice, cromozomii se despart i se formeaz celule haploide (gameii). n procesul de fecundare se reface numrul normal de cromozomi pereche, aa fel nct n fiecare pereche se repartizeaz un cromozom de la mam i unul de la tat. n cazul cnd mama i tata prezint acelai caracter, n aceti cromozomi exist factori identici (n doz dubl), iar individul este homozigot; n cazul n care prinii prezint caractere diferite, individul rezultat este heterozigot. Cnd individul heterozigot va forma celule sexuale, acestea vor diferi ntre ele, cci ntr-un gamet va trece un cromozom, iar n cellalt, perechea lui, care difer. n acest fel, gametul lund cu sine numai jumtate din cromozomii omologi, pierde caracterul hibrid pe care l avea zigotul i devine pur. Factorul ereditar, care sttea alturi de omologul su, devine independent, iar ntr-o nou
126

fecundare se va ntlni fie cu unul identic, fie cu altul diferit, producnd n cel deal doilea caz segregarea caracterelor. n mod schematic, mecanismul cromozomic al disjunciei se poate vedea n figura 5.3. n cele de mai sus s-a dat o explicaie mecanismului segregrii caracterelor mendeliene. n natur ns, nu ntotdeauna asemenea procese se desfoar exact conform celor artate, iar cercettorii au obinut date care nu se ncadreaz n raporturile stabilite de Gregor Mendel. Explicaia dat mai sus este valabil n cazul n care caracterele cercetate sunt produse de un singur locus (caractere monofactoriale), iar locii implicai sunt situai n cromozomi diferii.

Fig. 5.3. Schema mecanismului cromozomic al disjunciei pentru o pereche de caractere

5.5. NCRUCIAREA ANALIZATOARE

n experienele pe care le-a executat Gregor Mendel la ncruciarea mazrei cu semine de culoare galben cu mazrea cu semine de culoare verde sau obinut n F2, aa cum s-a artat, semine de culoare galben i semine de culoare verde n raportul 3:1. Seminele de culoare galben din F1 au produs, deci, n F2 plante cu semine att de culoare galben, ct i de culoare verde. Aceasta
127

dovedete c ele aveau structur genetic heterozigot. Pentru a analiza structura genetic a descendenilor hibrizi cu fenotip dominant se folosete retroncruciarea sau backcrossarea cu printele recesiv sau cu un tester recesiv, metod care poart numele de testcross. n fond, testcross-ul ajut la descoperirea tipurilor de gamei formai de un individ dominant, precum i dac el este homozigot sau heterozigot pentru anumite caractere. Homozigoii dominani produc o descenden cu fenotipul parental, n timp ce heterozigoii dominani n descendena testcross segreg. n figura 5.4. sunt prezentate schematic rezultatele obinute n urma aplicrii testcross-ului n funcie de genotipul individului dominant testat. n cazul retroncrucirii indivizilor homozigoi dominani (AA) cu printele homozigot recesiv (aa) se obine un singur tip de indivizi cu acelai genotip (Aa) i cu acelai fenotip (culoare galben). Prin retroncruciarea indivizilor heterozigoi (Aa) cu printele homozigot recesiv (aa) rezult dou tipuri de indivizi n proporii egale, 50% cu genotipul Aa de culoare galben i 50% cu genotipul aa de culoare verde. Deci, la retroncruciare se pot obine dou tipuri de rezultate: 1) dac raportul de segregare ntre cele dou caractere este de 1:1, nseamn c ascendentul dominant testat a fost heterozigot, deoarece a produs dou tipuri de gamei; 2) dac toi urmaii sunt la fel, nseamn c ascendentul dominant testat a fost homozigot, deoarece a format un singur tip de gamei.

Fig. 5.4. Schema segregrii n cazul testcross-ului unor descendeni hibrizi cu fenotip dominant (AA sau aa)

Testcross-ul unui hibrid const n ncruciarea descendenilor dominani F1 cu un printe dublu recesiv. Dac hibridul F1 este heterozigot, AaBb, va da natere la patru tipuri de gamei i n consecin prin testare rezult genotipurile AaBb, Aabb, aaBb, aabb, care segreg fenotipic n raport de 1:1:1:1. Testcross-ul este folosit i n lucrrile de ameliorare, atunci cnd se urmrete relevarea alelelor recesive. Prin retroncruciri (backcrossuri) repetate se pot restabili n hibrid caracterele printelui care a fost folosit la ncruciare.
128

Cu fiecare generaie de retroncruciare se reduc heterozigoii i crete numrul homozigoilor pentru caracterele printelui cu care s-a ncruciat. * * * Aa cum a reieit, mendelismul a constituit o important etap n dezvoltarea geneticii. Cercetrile ulterioare, la nivelul celular i molecular, au confirmat deplina valabilitate a rezultatelor i concluziilor lui Gregor Mendel. Legile ereditii descoperite de el constituie fundamentul geneticii clasice, fr de care nu se pot nelege cele mai noi probleme legate de studiul ereditii din punct de vedere teoretic ct i practic. Meritele deosebite pe care le are Mendel n fundamentarea geneticii ca tiin l situeaz, pe drept cuvnt, la rangul de fondator al geneticii.

129

CAPITOLUL 6 INTERACIUNEA GENELOR

Moto: "Variabilitatea este o calitate inseparabil de natura nsi a viului, de structura programului, de modul n care acesta este recopiat la fiecare generaie F. Jacob

Cercetrile hibridologice efectuate dup redescoperirea legilor mendeliene au relevat cazuri n care, ntre genele alele pot exista relaii de dominan incomplet, diferite tipuri de interaciuni dintre gene sau gene i mediu .a. Toate acestea duc la obinerea unor raporturi de segregare care se abat de la cele obinute de G. Mendel.

6.1. ABATERI APARENTE DE LA RAPORTURILE MENDELIENE DE SEGREGARE

Abaterile aparente, au fost astfel numite, deoarece la prima vedere raporturile fenotipice obinute n urma hibridrii nu se ncadreaz n rezultatele obinute de G. Mendel (3:1, 9:3:3:1 etc.). Analiza genotipurilor i fenotipurilor, folosind tabelele de combinaii, explic ns n mod mendelian formarea lor. Abaterile aparente de la raporturile mendeliene de segregare se datoreaz att interaciunilor dintre genele alele (dominana incomplet, supradominana, codominana, genele letale i polialelia), ct i interaciunilor dintre genele nealele (epistazia, poligenia, gene cu interaciune reciproc, gene modificatoare) sau a efectului complex al unei gene (pleiotropia).

6.1.1. Abateri aparente datorate interaciunilor alelice

6.1.1.1. Dominana incomplet n cazul experienelor lui G. Mendel, datorit fenomenului de dominan complet (total), heterozigoii (Aa) prezentau acelai fenotip ca i organismele homozigote (AA). n alte cazuri, ns, fenotipul organismelor heterozigote (Aa) se deosebete de cel al organismelor homozigote (AA). Monohibridarea de tip Zea. C. Correns, n ncruciarea Mirabilis jalapa alba (cu flori albe) cu Mirabilis jalapa rosea (cu flori roii) obine n F1 plante cu flori de culoare intermediar, roz. ncrucind ntre ele, plantele din F1, obine, n F2, 25% plante cu flori de culoare roie, 25% plante cu flori de culoare alb i 50% plante cu flori de culoare roz. n cazul de fa raportul de dezbinare este de 1:2:1. Cultivnd separat, fiecare categorie de indivizi din F2, obine n F3,
130

din cei 25% produi cu flori albe numai generaii cu flori albe, din cei 25% produi cu flori roii numai generaii cu flori roii, iar din cei 50% indivizi cu flori roz, o segregare identic cu cea din F2, n raport de 1:2:1 (fig. 6.1).

Fig. 6.1. Schema monohibridrii de tip Zea

Situaii asemntoare cu aceleai raporturi de segregare se ntlnesc i la ncrucirile care fac la Zea mays (plante cu boabe albastre x plante cu boabe galbene produc n F1 plante cu boabe violete), de unde i numele de ereditatea de tipul Zea. La animale s-au obinut rezultate analoge n experienele cu fluturi de mtase. ncrucindu-se varietatea ce formeaz gogoi albe, cu fluturi ce formeaz gogoi galbene s-au obinut fluturi ce formeaz gogoi galben deschis i care n F2 au produs o segregare a caracterelor de 1:2:1. La gini, prin ncruciarea unor rase cu penajul negru, cu rase cu penajul alb, se obin n F1 psri cu penajul albastru (gini andaluze). n F2 se produce segregarea indivizilor n raport de 25% cu penajul negru, 25% cu penajul alb i 50% cu penajul albastru. Rezultatele se pot interpreta innd cont tot de principiile stabilite de G. Mendel. n acest caz notm cu caracterul culoare roie i cu a caracterul culoare alb a florilor de Mirabilis jalapa. Indivizii cu flori de culoare roie vor avea formula Indivizii cu flori de culoare roz vor avea formula a Indivizii cu flori de culoare alb vor avea formula aa Se formeaz n F2 trei genotipuri corespunztoare cu trei fenotipuri diferite, n proporiile 1:2:1. Segregarea caracterelor se datoreaz separrii factorilor i a n gamei diferii. n cazul monohibridrii de tipul Zea, caracterul intermediar se explic prin relaiile de dominan incomplet a unui caracter fa de perechea lui de pe cromozomul omolog care i manifest numai parial dominana.
131

Indivizii din F1 formeaz gamei i gamei a. Din combinarea lor rezult 25% indivizi homozigoi cu flori de culoare roie (), 50% heterozigoi cu flori de culoare roz (a) i 25% heterozigoi cu flori de culoare alb (aa). Aceste rezultate sunt prezentate n ahul de combinaii de mai jos: Gamei 50% 50% a 50% 25% 25% a Gamei 50% a 25% a 25% aa

Polihibridarea cu dominan incomplet. Fenomenul de dominan incomplet se poate manifesta i n cazul dihibridrii, fie numai la una din perechile de caractere, fie la ambele. Un exemplu de dominan incomplet, la o singur pereche de caractere, l ntlnim la o experien a lui E. Baur. El a ncruciat Antirrhinum majus cu flori de culoare roie i zigomorfe ( R R ZZ) cu alt varietate cu flori de culoare alb i actinomorfe (rrzz). Obine n F1, plante cu flori de culoare roz i zigomorfe ( R rZz). Deci culoarea roie ( R ) este parial dominant fa de culoarea alb (r), iar forma zigomorf (Z) total dominant fa de forma actinomorf (z). n F2 se vor obine urmtoarele posibiliti de combinare, conform ahului din tabelul 6.1. Din cele 16 combinaii posibile apar: 3/16 plante cu flori de culoare roie i zigomorfe ( R R ZZ, R R Zz, R R Zz); 6/16 plante cu flori de culoare roz i zigomorfe ( R rZZ, R rZz, R rZz, R rZz R rZz, R rZz); 1/16 plante cu flori de culoare roie i actinomorfe ( R R zz); 2/16 plante cu flori de culoare roz i actinomorfe ( R rzz, R rzz); 3/16 plante cu flori de culoare alb i zigomorfe (rrZZ, rrZz, rrZz); 1/16 plante cu flori de culoare alb i actinomorfe (rrzz); Tabelul 6.1. ah de combinaii pentru dou perechi de caractere dintre care una prezint dominan incomplet ( R ) i alta (Z) complet
Gamei

RZ R R ZZ R R Zz R rZZ R rZz

Rz R R Zz R R zz R rZz R rzz
132

rZ

rz

RZ Rz
rZ rz

R rZZ R rZz
rrZZ rrZz

R rZz R rzz
rrZz rrzz

Segregarea indivizilor n ase clase fenotipice este o abatere de la raportul de 9:3:3:1 care, n cazul de fa, s-ar putea scrie (3+6):(1+2):3:1.Totalul de 16 ne arat c este vorba de dihibridare. Pentru a explica dominana incomplet pentru ambele perechi de caractere vom recurge la experiena privind ncruciarea dintre Fragaria vesca cu fructe de culoare roie i caliciu normal ( R R N N ) i o varietate cu fructe de culoare alb i caliciu foliar (rrnn). n F1 se obin plante cu fructe roz i caliciu intermediar ( R r N n). Caracterele pariale dominante sunt culoarea roie R i caliciul normal N . n F2 se obine o segregare conform ahului de combinaie din tabelul 6.2. Aceste 16 combinaii se pot separa n urmtoarele grupe de plante: 1/16 plante cu fruct rou i caliciu normal ( R R N N ); 2/16 plante cu fruct roz i caliciu normal ( R r N N , R r N N ); 2/16 plante cu fruct rou i caliciu intermediar ( R R N n, R R N n); 4/16 plante cu fruct roz i caliciu intermediar ( R r N n, R r N n, R r N n, R r N n); 1/16 plante cu fruct rou i caliciu foliar ( R R nn); 2/16 plante cu fruct roz i caliciu foliar ( R rnn, R rnn); 1/16 plante cu fruct alb i caliciu normal (rr N N ); 2/16 plante cu fruct alb i caliciu intermediar (rr N n, rr N n); 1/16 plante cu fruct alb i caliciu foliar (rrnn); Tabelul 6.2. ah de combinaii pentru dou perechi de caractere, ambele prezentnd dominan incomplet
Gamei

R N R R NN R R Nn R rN N R rNn

Rn R R Nn R R nn R rNn R rnn

rN

rn

R N Rn rN
rn

R rN N R rNn rr N N rr N n

R rNn R rnn rr N n
rrnn

n acest exemplu, cele 9 clase fenotipice constituie o abatere de la raportul 9:3:3:1 i care s-ar putea scrie: (1+2+2+4):(1+2):(1+2):1. Totalul de 16 ne arat c este vorba de o dihibridare. Dominana incomplet, ca de astfel i dominana complet, se refer la relaiile alelice ale factorilor i ea produce abaterile de la segregarea mendelian pe care le-am analizat.
133

6.1.1.2. Supradominana Este interaciunea dintre dou gene alele, n urma creia indivizii heterozigoi (Aa) sunt superiori celor homozigoi (AA, aa) n privina unor caractere ereditare, fenomen cunoscut sub numele de heterozis. Teoria supradominanei a fost formulat de G. H. Shull i E. M. East (1908). Ei consider c cele dou gene alele, A i a, au funcii oarecum diferite, iar n stare heterozigot se completeaz una pe alta, ceea ce poate fi redat astfel:

AA<Aa>aa
Cnd starea de heterozigoie este determinat de o singur pereche de gene (Aa) fenomenul se numete heterozigoie monogenic, putnd exista ns i interaciuni poligenice, cnd se numete heterozigoie poligenic (Butnaru Gallia, 1985). Supradominana determin un raport de segregare de 1:2:1 n mod deosebit la unele caractere ale plantelor (numrul de ramificaii ale tulpinii, greutatea inflorescenelor, producia de semine) i animalelor (robustee, vigoare, viabilitate, talie). 6.1.1.3. Codominana Este interaciunea dintre dou gene alele, care ns, n stare heterozigot, ambele sunt funcionale, rezultnd un fenotip nou. Aceast interaciune poate fi considerat un tip particular de dominan incomplet n care genele A i a, sintetizeaz proteine diferite ca structur i funcie, ns la indivizii heterozigoi vor fi prezente ambele proteine. Un exemplu clasic de codominan l ntlnim n cazul determinismului genetic al grupelor sangvine la om i la alte mamifere. Cele patru tipuri de grupe sangvine la om (O, A, B, AB) sunt determinate de trei gene polialele notate LA, LB i 1. Genele LA i LB sunt dominante fa de gena 1, ns cnd se gsesc n acelai genotip, ambele sunt funcionale, rezultnd un nou fenotip, respectiv grupa sangvin AB. Cunoscnd aceste aspecte, putem reprezenta fenotipurile i genotipurile posibile astfel:
Fenotipul (grupa sangvin) A B AB O Genotipurile LALA, LA1 LBLB,LB1 LALB 11

Modificarea raportului mendelian de segregare se poate observa dintr-un exemplu simplu: dac ntr-o familie cei doi prini au grupele sangvine A i respectiv B, homozigoi, segregarea se realizeaz astfel:
134

P(2n) G(n) F1(2n)

LALA x LBLB A LB L A B L L (grupa AB) F2(2n)

LA LB

LA LALA LALB

LB LALB LBLB

n generaia F2 au rezultat: 1/4 (gr. A) : 2/4 (gr. AB) : 1/4 (gr. B). Cunoaterea modului de transmitere a grupelor sangvine la om, prezint o importan deosebit n realizarea transfuziilor sangvine i n stabilirea paternitii. Fenomenul de codominan este ntlnit i la plante, n cazul pigmentrii frunzelor i florilor, n acumularea unor fracii proteice (Crciun T., 1981). 6.1.1.4. Genele letale Alele letale sunt mutante dominante sau recesive care, n stare homozigot, provoac moartea indivizilor. Fenomenul de letalitate schimb proporia n care are loc disjuncia caracterelor n urma hibridrilor. La ncruciarea unor oareci de culoare galben, L. Cunot a obinut n F1, pe lng indivizi de culoare galben i indivizi de culoare neagr. Raportul de segregare a fost de 2:1. Explicaia dat, arat c, fa de raportul genotipic 1:2:1, lipsesc 1/4 din genotipuri, respectiv fenotipuri, a cror zigoi au murit n uterul femelelor nainte de natere. Notnd cu Ay gena mutant letal i cu a gena normal, rezult c genotipul prinilor i ale combinaiilor descendente este: P(2n) G(n) F1(2n) A a AYAY
y

Aya AYa

x AYa

Aya a aa

Genotipurile aa (1/4) produc culoarea neagr i indivizii sunt viabili, normali: genotipurile Aya (2/4) produc culoarea galben i sunt heterozigoi; genotipurile AyAy (1/4) sunt letale. n cazul de fa, genele letale exercit o aciune de dominan parial, manifestndu-se numai n stare homozigot. Aciunea letal a genelor de acest fel s-a mai constatat la descendenii produi prin ncruciarea crapului cu solzi cu crapul fr solzi (crapul galiian); 1/4 din indivizii homozigoi dominani nu sunt viabili, 2/4 sunt heterozigoi, fr solzi i viabili, iar 1/4 homozigoi recesivi, cu solzi i viabili. O problem de letalitate ce preocup pe zootehnicieni se refer la oile brumrii din rasele Karakul i urcan. Din mperecherea ntre ei a indivizilor din oile brumrii, ntotdeauna rezult att miei de culoare brumrie, ct i miei de
135

culoare neagr. Din mieii brumrii o parte mor dup natere, la diferite vrste, pn la un an. Cercetrile au artat c la acetia apar tulburri ale aparatului digestiv. Este vorba de aciunea unei alele mutante letale (S) care, n stare homozigot, duce la producerea acestor fenomene; 2/4 din descendeni sunt heterozigoi (Ss), 1/4 homozigoi recesivi (ss), iar 1/4 homozigoi dominani (SS) care mor (Crlan M., 1996). Alturi de alelele mutante letale dominante pot exista i alele mutante letale recesive care, de asemenea, provoac moartea descendenilor. Acestea se pun n eviden mai greu, deoarece nu au un efect vizibil n stare heterozigot. Ele se pot evidenia dup natere. La plante se cunosc mutaii letale recesive care, n stare homozigot, mpiedic formarea clorofilei, fr de care o plant nu poate supravieui. Seminele acestor plante germineaz i dezvolt o plantul care triete pn n momentul cnd substanele de rezerv din endosperm se epuizeaz. Antirrhinum majus are unele varieti cu frunze de diferite culori. Formele aurea (cu frunzele verde-glbui) nu pot exista dect n stare heterozigot. Aceasta se explic prin faptul c tipul aurea prezint defecte clorofiliene. Letalitatea nu este totdeauna un fenomen absolut; el poate prezenta i aspecte negative asupra organismului, dar nu mortale. Caracterul letal poate depinde i de condiiile de via ale indivizilor. Aceeai gen, care n condiii nefavorabile de via acioneaz ca letal, n condiii bune, poate aciona ca semiletal. ntre caracterul i posibilitatea de a vieui pot exista i trepte intermediare. Letalitatea sau semiletalitatea se manifest la un anumit stadiu de dezvoltare a organismului, fie n funcie numai de aciunea alelei mutante letale, fie n funcie de aciunea ei, combinat cu influena condiiilor de mediu. Alelele letale apar datorit unor mutaii i determin defecte de structura morfofiziologic a organismelor. Din aceast cauz, modificrile mbrac forme variate, variate fiind i cauzele care pot provoca moartea organismelor: defecte n structura anatomic, incapacitatea de a sintetiza sau folosi substanele energetice n procesul de metabolism, lipsa sau slaba dezvoltare a unor structuri celulare cu importan vital .a. 6.1.1.5. Polialelia (Alele multiple) Fenomenul de polialelie apare n cazul cnd trei sau mai multe gene alele sunt plasate n acelai locus pe cromozom, la indivizi diferii i determin variaii ale aceluiai caracter. Acest fenomen se numete i alelomorfism multiplu sau alelism. Genele alele apar prin mutaie din alela originar sau tipul slbatic, cu care ocup acelai locus. Alela de tip slbatic se consider dominant i se noteaz cu A sau cu a+. n funcie de aceast notare, seria de alele care apare prin mutaie se noteaz cu aceleai litere, la care se adaug un indice de ordine numeric sau alfabetic, A1,A2,A3, respectiv a1, a2, a3. Genele alele pot fi notate cu prima liter a caracterului pe care l determin i cu indicele de ordine n care au
136

aprut. S-a constatat c ntr-o serie de alele raportul dominan/recesivitate este determinat de ordinea apariiei lor. Seria de alele pentru culoarea ochilor la Drosophila melanogaster a fost pus n eviden de T. Morgan i colaboratorii si. Drosofila de tip slbatic are ochi de culoare roie determinat de alela normal w+. S-a constatat ns c descendenii homozigoi au ochi de culoare foarte diferit, cu o intensitate care variaz ntre rou i alb. La formele heterozigote, gama culorilor se multiplic prin nuane intermediare care apar ntre culorile formelor parentale. S-a ajuns astfel la concluzia c genei de tip normal w+, i corespund mai multe gene alele care determin culoarea diferit a ochilor. Aceste alele constituie o serie. Fiecare se noteaz cu simbolul genei de origine, la care se adaug ca indice prima sau primele litere ale caracterului pe care l determin: w+ rou nchis (tipul slbatic); ww-rou intens; wsat-rubiniu nchis; wco-rubiniu intens; wbl-galben rubiniu; we-rozglbui; wch-roz puin glbui; wcol-purpuriu; wa-roz apricot; wh-galben de miere; wbf-galben diluat; wt-roz foarte deschis; wp-alb perlat; wi-alb ivoriu; wec-alb ocru; w-alb. Prin ncruciarea indivizilor purttori ai acestor gene, s-a stabilit c gena dominant este cea de tip slbatic (w+), care determin culoarea roie, iar gena recesiv este cea care determin culoarea alb (w). Seria alelelor R la porumb. Aceast serie de alele a fost pus n eviden de L. J. Stadler (1951) observnd c o serie de alele plasate n locusul R de pe cromozomul 10 determin culoarea roie-purpurie (antocianic) a diferitelor pri ale plantei. Efectul fenotipic al genelor din seria polialel se manifest diferit, n diverse organe ale plantei: pericarpul i aleurona seminei, tulpin, frunze i antere. Pentru acest considerent efectul seriei de alele de pe locusul R determin dominana n mozaic sau mozaicismul. n locusul R a fost pus n eviden o serie de peste 20 alele. Cele mai cunoscute sunt acelea care au o putere mai mare de manifestare i concomitent n mai multe organe ale plantei (tabelul 6.3.). Tabelul 6.3. Seria de alele de pe locusul R la porumb i efectele fenotipice
Alela Rr Rg R Rmb Rsc rr rg
st

Expresia fenotipic n: smn Culoare roie nchis, cnd este n 2 sau 3 doze i mozaicat nchis, cnd este ntr-o doz Culoarea roie nchis, cnd este n 2 sau 3 doze i mozaicat ntr-o doz Pestri (stippled) Marmorat (marbled) Autocolor (self-colored) Necolorat Necolorat

plantule roii verzi verzi verzi verzi roii verzi

antere verzi verzi verzi verzi verzi roii verzi

137

Din datele cuprinse n tabelul de mai sus, reiese c, alela rg este recesiv i controleaz culoarea verde a plantelor i anterelor i celelalte alele determin un grad diferit de pigmentaie. Intensitatea cu care este determinat culoarea seminei depinde de doza n care se afl genele Rr sau Rg n endosperm. Endospermul, fiind triploid, poate avea trei doze diferite ale alelei Rr care-i determin culoarea i anume: doz tripl (RrRrRr), cnd se ncrucieaz ntre ele dou linii pure pentru factorul Rr, linia Rr ca mam i linia Rr ca tat; doza dubl (RrRrr),cnd se ncrucieaz o linie Rr ca mam i una r ca tat i doz simpl (Rrrr), cnd se ncrucieaz o linie r ca mam i una Rr ca tat. Dominana va fi gradat, n funcie de numrul de alele care particip la determinarea caracterului. Comportarea diferit a aceleiai alele n diferite organe ale plantelor i-a determinat pe L. J. Stadler i M. H. Emerling (1956) s le considere ca fiind compuse din dou pri cu funcii particulare. De exemplu, alela Rg este dominant n bob, unde determin formarea antocianului, dar este recesiv n plant i antere, deoarece acestea rmn verzi. De fapt, aceasta este explicaia apariiei mozaicului la plante.

6.1.2. Abateri aparente datorate interaciunilor nealelice

6.1.2.1. Epistazia S-a artat c dominana poate s se manifeste ntre alele perechi: A domin pe a, B domin pe b etc. Un tip aparte de relaii de dominan-recesivitate poate exista i ntre gene nealele: AA domin pe Bb, bb domin pe A, aa domin pe B etc. Acest fenomen a fost numit epistazie. Genele care inhib aciunea unor gene nealele se numesc gene epistatice, iar genele inhibate se numesc gene hipostatice. Pot fi epistatice sau hipostatice att alelele dominante, ct i alelele recesive. n funcie de alela epistatic, epistazia poate fi dominant, de recesivitate, de dominan i recesivitate etc. Prin epistazia de dominan att gena epistatic ct i gena hipostatic sunt reprezentate de gene nealele dominante. Se cunosc asemenea exemple att din domeniul vegetal ct i din cel animal. Raportul de segregare n cazul epistaziei de dominan este 12:3:1. Un exemplu l ofer ncruciarea ntre ovzul cu glume negre i ovzul cu glume albe. n F1 se obin indivizi care au glume negre, iar n F2 are loc segregarea astfel: 12/16 indivizi cu glume negre; 3/16 indivizi cu glume cenuii; 1/16 indivizi cu glume albe. Acest raport nu este tipic mendelian, dar amintindu-ne de raportul mendelian 9:3:3:1 se poate deduce c grupa de 12 se compune din 9+3. Deducem, de asemenea, c ovzul cu glume negre conine dou gene dominante, ovzul cenuiu o singur gen dominant, iar cel alb nici una, fiind recesiv. Notnd cu N gena productoare a culorii negre (epistatic), cu C gena productoare a culorii cenuii (hipostatic), cu n i c alelele lor, productoare a culorii albe, se pot scrie genotipurile prinilor, gameilor i ale hibridului din F1:
138

P(2n)..NNCC x nncc Gamei(n)..NC nc F1(2n)...NnCc Gamei(n)NC Nc nC nc Din ahul de combinaii rezult: combinaiile care conin pe N vor da boabe negre, cele ce conin C cu n vor da boabe cenuii, iar cele care conin nncc produc boabe albe. Deci raportul va fi:
(9 + 3) : 3 : 1 12 negre : 3 cenusii : 1 alb

Gena N are deci o aciune epistatic asupra genei C. Epistazia de dominan i recesivitate. Se manifest la ncruciarea ntre rasele de gini albe, Leghorn x Wyandotte. n F1 se obin gini albe (cu unele pete negre), iar n F2 un raport de 13/16 indivizi albi: 3/16 indivizi negri. Totalul de 16 combinaii indic aciunea a dou perechi de gene. Din analiza generaiei F2 s-a dedus c la rasa Leghorn, n genotip, alturi de gena dominant ce determin culoarea, mai exist o gen epistatic care inhib manifestarea acesteia. Rasa Wyandotte posed alela recesiv c, care, la rndul ei este epistatic asupra genei I ce produce culoarea. Culoarea neagr apare numai n prezena genei dominante ce produce culoarea i a genei recesive ii. Notnd cu I gena epistatic i cu C gena hipostatic, rezult: Leghorn x Wayndotte P.IICC iicc F1IiCc (alb) F2.12/16 indivizi de culoare alb determinat de gena epistatic I 3/16 indivizi de culoare neagr Aceste rezultate sunt prezentate n figura 6.2. Gena epistatic I inhib aciunea genei hipostatice C care determin culoarea, iar gena cc inhib aciunea genei ii care produce culoarea. Prin epistazia genei recesive se nelege aciunea unei gene recesive n stare homozigot ce inhib aciunea genelor dominante sau recesive din alte perechi de alele; de exemplu, aa inhib pe B sau aa inhib pe bb. Fenomenul se poate evidenia la ncruciarea unor oareci albi cu oareci negri. Tipul albinotic este genetic de tip slbatic, deoarece posed gena A, care ns nu se manifest din cauza prezenei genei epistatice recesive cc care inhib formarea oricrui pigment: P(2n) oareci albi oareci negri AAcc x aaCC oareci agouti (AaCc) (cu blana de tip slbatic) F1 F2 9/16 indivizi agouti (AC); 3/16 indivizi negri (Caa); 4/16 indivizi albi (Acc i aacc).
139

Deci, n acest caz, epistazia s-a manifestat din partea genei cc asupra genei A. oarecii cu genotipul Acc erau albi, deoarece gena c n stare homozigot a mpiedicat manifestarea genei A, ce produce pigment.

Fig. 6.2. Epistazia genei dominante i a genei recesive asupra culorii penajului.

6.1.2.2. Interaciunea complementar a genelor (Epistazia recesiv reciproc) Const n aciunea unor gene nealele, care, n stare homozigot sau heterozigot dominant, conlucreaz pentru apariia unui caracter nou. Dac una din aceste gene dominante lipsete din genotip caracterul nu se exteriorizeaz fenotipic. Acest tip de interaciune a fost descoperit prima dat la Lathyrus odoratus, plant care are, n general, flori de culoare roie, dar i varieti cu flori albe. ncrucindu-se dou varieti cu flori de culoare alb, s-au obinut n F1 plante cu flori de culoare roie, prin autopolenizarea crora n F2 au rezultat plante ce au segregat n raportul 9:7 (9/16 plante cu flori roii :7/16 plante cu flori albe).
140

Raportul de segregare arat c, este vorba de o dihibridare. Explicaia nu poate fi dect urmtoarea: culoarea roie este condiionat de prezena a dou gene dominante A i B. Dac exist numai o gen din acestea, nu se produce culoarea roie n F1. Prinii vor trebui s aib genotipurile: AAbb i aaBB, iar hibrizii din F1 sunt AaBb. n a doua generaie se produce segregarea genelor nealele, n raport de 9/16 AB; 3/16 Abb; 3/16 aaB; 1/16 aabb. Culoarea se manifest numai n genotipul AB, care determin elaborarea pigmenilor antocianici. Restul indivizilor (7/16), care nu conin aceste dou gene dominante sau conin numai una din ele, au florile de culoare alb. Din acest exemplu se poate constata c genele aa inhib aciunea genelor BB, iar genele bb, pe cea a genelor AA. Genotipurile aa i bb se ajut reciproc pentru realizarea fenotipului comun, corespunztor genotipului aabb. Acest tip de interaciune se mai numete epistazie recesiv reciproc. Un raport de segregare diferit fa de cel mendelian rezult i n cazul ncrucirii unor forme de porumb cu boabe de culoare alb. n F1 se obin plante cu boabe de culoare roie, iar n F2 un raport de segregare de 27/64 plante cu boabe roii; 37/64 plante cu boabe necolorate. n cazul de fa, producerea antocianului se datoreaz interaciunii dintre alelele dominante a trei perechi de gene nealele AACCRR. Boabele necolorate aparin plantelor din al cror genotip lipsete cel puin una din aceste gene dominante (aaCCRR, AaccRR i AACCrr). De exemplu, din ncruciarea plantelor cu boabe necolorate cu genotipul aaCCRR, cu plante tot cu boabe necolorate AAccRR, vor rezulta plante cu boabele colorate, care conin genele AaCcRR. n F2, aceste dou caractere segreg n raportul de 27 colorate : 37 necolorate. Rezultate identice se obin cnd se ncrucieaz plante cu genotipul AAccRR sau plante cu genotipul aaCCRR sau plante cu genotipul aaccRR cu plante cu genotipul AACCrr. Aciunea acestor gene a fost sesizat i n ereditatea culorilor la oareci, la gini .a. La gini, creasta de tip mazre, ca i creasta de tip trandafir, manifest dominana fa de cresta simpl, prezent la rasa Leghorn. La ncruciarea rasei Wyandotte cu creasta tip trandafir (RRbb) cu rasa Brahma cu creasta tip mazre (rrBB), n F1 indivizii aveau un nou tip de creast, nuciform, rezultat din interaciunea complementar ntre cele dou gene dominante (RrBb). ncruciarea indivizilor din F1 a determinat formarea generaiei F2, n care 9/16 dintre indivizi aveau creast nuciform, iar 7/16 alte tipuri de creast (3/16, trandafir Rbb; 3/16 tip mazre rrB i 1/16simpl rrbb) (figura 6.3.). De aici se vede c n prezena genelor dominante n sistemele de gene complementare, acestea funcioneaz producnd un caracter deosebit de cel manifestat la prini. n exemplele de mai sus (culoarea roie a florilor la Lathyrus odoratus, culoarea boabelor la Zea mays, ct i forma crestei de gini), caracterul nou este produs numai prin aciunea comun a tuturor genelor dominante din genotip. Aceste gene nealele, n mod separat, nu pot determina apariia caracterului respectiv.
141

Fig. 6.3. Aciunea complementar a genelor n cazul ncrucirii raselor de gini Wyandotte cu Brahma

Aciunea complementar a genelor a fost pus n eviden i prin experiene efectuate cu amestecuri de extracte de la microorganisme diferite. S-a constatat c folosirea separat a acestor extracte nu produce o activitate enzimatic, ns utilizarea lor n comun manifest activitate enzimatic. 6.1.2.3. Poligenia nc din secolul XVIII, J. Klreuter a remarcat c prin ncruciarea a dou varieti de tutun, una pitic iar cealalt nalt, n generaia F1, hibrizii au o talie intermediar ntre genitori, iar n F2 are loc o segregare a indivizilor, cu o graduare continu a nlimii, de la tipul pitic pn la tipul nalt. Cercetrile lui H. NilssonEhle n Suedia, la gru, i ale lui E. M. East n S.U.A., la porumb, n perioada 1910-1913, au dus la descoperirea fenomenului de poligenie, care explic modul de segregare a caracterelor cantitative. Poligenia (polimerie sau interaciune aditiv) const n conlucrarea mai multor gene nealele, dar echivalente, dominante sau recesive, pentru exteriorizarea fenotipic a unui caracter.
142

n general, se consider c n cazul fenomenului de poligenie, genele individuale au un efect redus asupra unui caracter i ca atare, pot fi greu evideniate. Numai efectul cumulativ sau aditiv al poligenelor produce modificri cantitative evidente. Fenotipul unui caracter cantitativ, determinat de gene aditive, se manifest cu att mai puternic, cu ct este determinat de mai multe gene nealele dominante. Cnd n genotipul unui individ, pentru un anumit caracter cantitativ, vor fi mai multe gene recesive, fenotipul va fi mai puin expresiv. H. NilssonEhle a demonstrat existena fenomenului de poligenie, ncrucind o varietate de gru cu boabe roii (AABB), cu alta cu boabe albe (aabb). n generaia F1 au rezultat indivizi cu boabe de culoare intermediar (AaBb). n generaia F2 segregarea s-a produs n raportul 15/16 boabe de diferite nuane de rou la 1/16 boabe albe. Prin urmare culoarea boabelor de gru este determinat de dou perechi de gene nealele. Cu ct n genotip se vor gsi mai multe alele dominante, cu att expresia fenotipic va fi mai puternic. Un exemplu de efect cumulativ al genelor n motenirea caracterelor cantitative l constituie ereditatea culorii pielii la om, determinat de pigmentul melanin, care variaz cantitativ la diferite rase (C. B. Davenport, dup Raicu P., 1980). Cantitatea de pigment din piele este determinat de efectul cumulativ al genelor P1 i P2, care la negri se afl n stare homozigot (P1P1P2P2), la mulatri nchii exist trei gene pentru pigmentare (P1p1P2P2, sau P1P1P2p2), la mulatri propriu-zii exist dou gene (P1p1P2p2, P1P1p2p2 sau p1p1P2P2), la mulatri deschii o singur gen pentru pigmentare (P1p1p2p2 sau p1p1P2p2), iar la rasa alb exist un genotip homozigot recesiv (p1p1p2p2). Exemple de ereditate poligenic exist la tot pasul, deoarece majoritatea caracterelor cantitative au acest determinism genetic. 6.1.2.4. Pleiotropia Analiza modalitilor de aciune a genelor a scos n eviden i fenomenul prin care una i aceeai gen poate s contribuie la formarea mai multor caractere. Aceste gene au fost denumite pleiotrope, iar fenomenul determinat de ele, pleiotropism. n cercetrile pe care le-a executat G. Mendel la mazre, a observat c acelai factor ereditar a afectat att culoarea florilor ct i culoarea seminelor i a produs pete roii pe nervurile frunzelor. H. NilssonEhle (1909) a dedus c, modificarea formei aristelor, pilozitatea tulpinilor i fragilitatea acestora, sunt datorate unei singure gene. Cercetri numeroase n aceast privin au fost efectuate la Drosophila. Alela mutant vestigial, (vg), care reduce mrimea aripilor, micoreaz n acelai timp fecunditatea, reduce numrul de ou, modific poziia periorilor de pe corp .a. Alela mutant ivory, care rspunde de culoarea deschis a ochilor, are aciune negativ asupra tuburilor lui Malpighi i modific forma spermateciilor.

143

Genele pleiotrope determin, n mare parte, corelaiile dintre diferite caractere i menin aceste corelaii de-a lungul generaiilor. Astfel de corelaii, determinate de gene pleiotrope, poart numele de corelaii genotipice. n afar de efectul lor, uor de evideniat, aciunea lor este multipl i de o mare nsemntate, deoarece majoritatea genelor manifest, ntr-o msur mai mare sau mai mic, influen asupra altor gene. 6.1.2.5. Aciunea modificatoare a genelor Exist gene cu aciune de baz n determinarea unui anumit caracter, altele, interacioneaz cu alte gene, influennd aciunea acestora. Asemenea gene au primit numele de gene modificatoare. Atunci cnd o gen slbete expresia fenotipic a altei gene nealele se numete reductoare, iar cnd ntrete expresia fenotipic a altei gene nealele se numete amplificatoare. Aciunea acestor gene poate fi eviden, uneori, destul de discret; de aceea i studiu lor este anevoios. Dificulti se manifest i la distribuirea indivizilor n clase fenotipice distincte. Ori de cte ori acioneaz, ele modific proporiile mendeliene de segregare. Astfel, exist o gen la Drosophila (tetraptera) care poate s transforme balansierele n aripi de dimensiuni mari. O alt gen, tot la Drosophila, numit erupt, determin dezvoltarea unui tars n ochi. 6.1.2.6. Influena factorilor externi asupra aciunii genelor Manifestarea aciunii genelor poate fi influenat i de condiiile de mediu, care modific proporiile fenotipice fa de cele teoretice. Influenele pot produce modificri foarte variate, att de ordin cantitativ, ct i calitativ. Larvele de Drosophila cu aripi vestigiale, crescute la temperaturi ridicate, produc aripi aproape normale. Temperatura ridicat, nu influeneaz genele respective dect la o anumit vrst a larvelor, care coincide cu perioada sensibil pentru dezvoltarea aripilor. La porumb, exist gene mutante, care determin caracterul plant pitic. Dac unei astfel de plante i se administreaz acid giberelinic, planta se dezvolt asemntor cu cea normal. La iepurele de Himalaia culoarea neagr a extremitilor este realizat de alela ch. Acest tip de iepure crescut la temperaturi de peste 30C este complet alb; crescut la temperaturi n jurul a 25C capt culoarea neagr la extremitatea botului, picioarelor i urechilor. Dac se smulge o poriune din prul alb i iepurele este crescut la temperaturi sub 25C, pe acest loc va aprea pr negru. Culoarea prului n cazul acestor experiene depinde de anumite reacii biochimice care duc la elaborarea pigmentului. Temperatura interfer cu aciunea genei, care, la rndul ei, dirijeaz elaborarea acestor pigmeni. La plante exist, de asemenea, gene a cror aciune asupra culorii florilor poate fi modificat de anumite temperaturi. Astfel, Primula, crescut la temperatura de 30-35C i umiditate mare produce flori albe, iar la temperaturi mai sczute produce flori roii.
144

Intervenia factorilor de mediu poate schimba raporturile de dominan dintre diferite gene, cnd acestea se gsesc n stare heterozigot. La tipul slbatic de Drosophila exist o gen dominant ce determin prezena unor benzi negre la limita dintre segmentele abdomenului. Dac este crescut ntr-un mediu umed, benzile negre dispar. Un tip de interaciune dintre gene i factorii de mediu l constituie fenocopiile. Individul normal, n timpul dezvoltrii lui, supus unui tratament special cu factori fizici sau chimici, d natere la unele anomalii specifice aciunii unor gene. Injectnd insulin, n ou de gin n stare de incubaie, se obin indivizi cu monstruoziti (polidactilism sau absena crupionului). Aceste anomalii pot fi produse i de aciunea genotipului n condiii normale de dezvoltare a indivizilor. Exist gene cu manifestare foarte variabil la influena condiiilor de mediu, dar care afecteaz numai o parte din indivizi, aparent cu acelai genotip. Aa este cazul genelor erupt sau tetraptera, care determin un efect fenotipic numai la maximum 10% din indivizi. La cobai, o gen recesiv determin pn la 27,7% montri cu cap mic, neviabili. Fenomenul poart numele de penetran. Uneori gena afecteaz numai o parte din organism. Gena eyeless care reduce suprafaa ochiului la Drosophila, poate afecta numai un ochi la aceeai musculi. Aceste accidente rmn nc, n mare parte, inexplicabile; alteori, influena mediului se poate resimi n mod diferit, n ceea ce privete intensitatea de manifestare a caracterului. n cazul de fa, fenomenul poart numele de expresivitate. Varietatea factorilor de mediu, intensitatea cu care acioneaz ei i timpul cnd intervin n cursul dezvoltrii organismului, constituie o gam foarte complex de influene asupra aciunii genelor. De la efectul primar al genei i pn la efectul ei aparent exist un lan ntreg de aciuni i interaciuni ntre gene i ntre gene i mediu.

6.2. ABATERI REALE DE LA RAPORTURILE MENDELIENE DE SEGREGARE

Principalele cauze ce determin abaterile reale de la raporturile mendeliene de segregare sunt: segregarea preferenial a cromozomilor n meioz, non-disjuncia cromozomilor n meioz i formarea nerandomizat a zigoilor. 1. Segregarea preferenial a cromozomilor sau genelor n meioz De obicei, n diviziunea meiotic, cromozomii omologi se distribuie n mod ntmpltor n celulele-fiice, n raport de 1:1. Uneori, ns, n ovogenez sau macrosporogenez, un cromozom sau un segment de cromozom trece cu preferin n ovul sau, respectiv, n oosfer, n timp ce omologul lui trece n nucleii polari sau n nucleii din sacul embrionar. Aceti cromozomi nu particip la formarea zigoilor.
145

Un caz de segregare preferenial a fost studiat la porumb, de ctre diferii autori: M. M. Rhoades (1942, 1952), A. E. Longley (1945), G. Y. Kikudome (1959), M. M. Rhoades i M. H. Emerling (1959). S-a constatat c la mai multe soiuri de porumb din America de Sud i sud-estul Statelor Unite, cromozomul 10 se deosebete de omologul su din alte soiuri printr-o poriune terminal n plus, heterocromatic, n care se gsete un knob. Segregarea cromozomilor n meioz are loc n funcie de felul cromozomilor 10. Cnd acetia 10n sunt normali , segregarea are loc n raport de 1:1. Cnd unul din 10n cromozomii 10 este normal, iar omologul su posed knob
10n 10a

megasporogenez are loc o segregare preferenial, n favoarea cromozomului cu knob (aproximativ 70% gamei cu 10 a i 30% gamei cu 10 n). Acest fenomen a fost pus n eviden urmrindu-se cum se transmite la descendeni gena R, care dicteaz formarea pigmentului antocianic la semine i la plante. S-a ncruciat o linie de porumb cu cromozomii 10 a cu knob i purttori al alelelor recesive rr, cu o linie de porumb cu cromozomii 10 n, dar purttori ai alelelor dominante RR. n F1 s-au obinut plante cu boabe de culoare roie, cu genotipul Rr. Prin retroncruciarea hibridului cu printele cu caracterul recesiv (rr) s-au obinut 70,2% indivizi cu boabe necolorate i 29,8% indivizi cu boabe roii. n mod normal ar fi trebuit s se obin indivizi cu boabe necolorate i boabe de culoare roie n proporie de 1:1. Din cauza segregrii prefereniale a cromozomilor cu knob, procentul a fost modificat n favoarea acestuia. Fenomenul de segregare preferenial a cromozomilor n meioz a fost pus n eviden i la Drosophila melanogaster. S-a observat c la unele femele, cromozomii X sau cromozomii perechi a II-a i a III-a nu sunt egali ca mrime. S-a constatat o segregare preferenial a cromozomilor mai scuri, n sensul c din ovule circa 70% dau natere la indivizii care posed cromozomi mai scuri (normali). 2. Nesepararea (non-disjuncia) cromozomilor n meioz De obicei, n meioz toate perechile de cromozomi se despart i se repartizeaz n celule haploide care se formeaz. Uneori, prin nesepararea unor perechi de cromozomi n meioz, la prima diviziune se formeaz o celul cu un cromozom n plus i o celul cu un cromozom n minus. Celulele sexuale care se formeaz din acestea vor produce, n procesul fecundrii, zigoi cu 2n + 1 i 2n - 1 cromozomi. La Drosophila melanogaster non-disjuncia afecteaz mai mult perechile cromozomilor sexului sau perechi a IV-a (punctiformi). Aceste anomalii se ntlnesc mai frecvent la organismele triploide i mai puin la organismele diploide.

146

3. Formarea nerandomizat a zigoilor De regul, n procesul fecundrii, gameii se ntlnesc ntre ei n mod ntmpltor, adic randomizat. Uneori, gameii nu se ntlnesc la ntmplare, ci dup anumite preferine (nerandomizat). Acest fenomen este favorizat de viabilitatea inegal a celulelor sexuale mascule i de capacitatea de formare i de maturizare inegal a stigmatului. La porumb exist gene care controleaz creterea tubului polinic n stil. Polenul care conine alela dominant a genei S dezvolt tubul polinic mai repede i formeaz un numr mare de zigoi cu aceast gen.

147

CAPITOLUL 7 TEORIA CROMOZOMIC A EREDITII

Moto: "Biologia seamn mai mult cu istoria dect cu fizica; accidentele, erorile i ntmplrile fericite din trecut prefigureaz n mare msur prezentul Carl Sagan

7.1. GENE I CROMOZOMI

Elaborarea teoriei celulare de ctre M. J. Schleiden i T. Schwann (1838) a marcat nceputul unor noi descoperiri la nivel celular. Dup descoperirea i descrierea mecanismului mitozei (W. Fleming, 1882) i a meiozei (E. van Beneden, 1883), W. Waldeyer (1888), descoper c n momentul diviziunii nucleului, acesta se mparte ntr-un anumit numr de corpusculi pe care i-a numit cromozomi. Cercetrile efectuate de W. S. Sutton (1902) la cosa (Brachystola magna), aduc dovada localizrii factorilor ereditari mendelieni pe cromozomi, constatnd c fiecare cromozom are o anumit caracteristic, care se pstreaz constant n timpul mitozei i meiozei. Sutton a fost primul citolog care a atras atenia asupra asemnrii dintre disjuncia cromozomilor n meioz i segregarea caracterelor alelomorfe n procesul de formare a gameilor. n 1902, T. Boveri face aceleai constatri la ariciul de mare (Paracentrotus lividus). El studiaz i evoluia ovulelor fecundate concomitent de 2 spermatozoizi din care rezult gamei triploizi (2n=54), constatnd c numai indivizii diploizi (2n=36) sunt normali. Boveri ajunge la concluzia c dezvoltarea normal a indivizilor este condiionat de prezena unor garnituri complete de cromozomi, pe care se afl localizai factorii ereditari. Un alt fenomen descoperit de W. S. Sutton n anul 1903 a fost recombinarea cromozomilor materni i paterni n timpul meiozei, fenomen care d posibilitatea formrii unui numr enorm de combinaii genotipice i determin o mare variabilitate genotipic a indivizilor aceleiai specii. Descoperirile referitoare la mecanismul cromozomic al determinrii sexului au constituit noi dovezi a localizrii factorilor ereditari intuii de Mendel. H. Henking (1891) a identificat la insecta Pirrochoris apterus dou tipuri de gamei, unii care posedau un corpuscul necunoscut ce l-a notat cu X, iar alii lipsii de acest corpuscul, artnd c sexul ar putea fi determinat chiar de aceast difereniere a gameilor. E. B. Wilson (1905) studiind meioza la insectele din genul Protenor, constat c la masculi 2n=13 cromozomi, iar femelele posed n celulele
148

somatice 2n=14 cromozomi. Femelele vor produce gamei identici cu n=7, n timp ce masculii vor avea dou tipuri de gamei, cu n=7 i n=6. Dac un ovul va fi fecundat de un spermatozoid cu 7 cromozomi, va rezulta o femel, iar cnd spermatozoidul are n=6 cromozomi va rezulta un mascul. Aceste constatri au dovedit c sexul organismelor este determinat ereditar, de gene localizate n anumii cromozomi. Explicaiile date de Mendel, pentru segregarea factorilor ereditari constituie nc un argument n sprijinul ipotezei c genele sunt plasate n cromozomi. Mendel arat c, factorii ereditari se gsesc sub form de pereche n celulele somatice i cte unul singur din fiecare pereche, n celulele sexuale. Prin descoperirile lor, W. S. Sutton (1902) i T. Boveri (1902) au stabilit legtura dintre factorii ereditari mendelieni i cromozomi ca purttori ai acestora. Aceti geneticieni formuleaz aproape concomitent ipoteza localizrii genelor pe cromozomi, evideniind faptul c numrul caracterelor distincte ale unui organism este mult mai mare dect numrul de cromozomi, astfel c, pe o pereche de cromozomi sunt mai muli factori ereditari. T. H. Morgan (profesor la Universitatea Columbia din New York) i coala sa a preluat aceast ipotez, dezvoltnd-o i aprofundnd-o, formulnd o teorie unitar denumit teoria cromozomic a ereditii pentru care a fost distins cu premiul Nobel, n anul 1933. T. H. Morgan i colaboratorii si, C. B. Bridges, A. H. Sturtevant i H. J. Mler au folosit ca material biologic, musculia de oet (Drosophila melanogaster), insect la care au descris peste 500 forme mutante. Prin numeroase ncruciri ntre diferite mutante cu tipul slbatic, sau a mutantelor ntre ele, s-a stabilit modul de transmitere a genelor pe parcursul mai multor generaii. n concepia lui Morgan, genele sunt plasate n cromozomi n anumite poziii denumite loci (singular locus), sub form de pereche, determinnd nsuiri contrastante ale aceluiai caracter. Prin mutaia unei gene normale (sau de tip slbatic) a aprut o gen nou, dar care ocup acelai locus n cromozomii omologi. Acest cuplu de gene ce determin nsuirea normal i cea mutant a unui caracter, a primit denumirea de gene alele. Genele ce determin caracterul normal se noteaz cu liter mare sau cu liter mic i cu semnul + (de exemplu A sau a+ ) iar gena alel cu liter mic (a). Gena este considerat unitate ereditar funcional, mutaional i de recombinare genetic. Studiind un numr mare de masculi i femele de Drosophila melanogaster, Morgan a artat c femelele au o pereche de cromozomi identici (XX) iar masculii, un singur cromozom X sub form de bastona i unul neomolog numit cromozom Y sub forma unui bastona frnt. Descoperirea cromozomilor sexului constituie o alt dovad c genele sunt plasate n cromozomi. Tot la Drosophila melanogaster, s-a constatat c la unii indivizi poate lipsi un cromozom sau poate exista un cromozom n plus. Aceasta fiind corelat
149

cu absena unui caracter sau prezena unui caracter, constituie nc un argument c genele sunt plasate n cromozomi (C. B., Bridges, 1921). n urma acestor rezultate experimentale s-au elaborat cele trei teze ale teoriei cromozomice a ereditii: 1. - plasarea liniar a genelor n cromozomi; 2. - transmiterea nlnuit a genelor( linkage); 3. - schimbul reciproc de gene ntre cromozomii omologi (crossing-over).

7.2. PLASAREA LINIAR A GENELOR PE CROMOZOMI

n experienele sale, Mendel a analizat, n mod ntmpltor, caractere ce erau localizate n perechi diferite de cromozomi, fapt ce permite segregarea i combinarea independent a caracterelor. Morgan a urmrit ntr-un numr foarte mare de ncruciri, transmiterea de la o generaie la alta a unor gene localizate n acelai cromozom. S-a constatat c exist un numr mult mai mare de gene dect cromozomi, chiar dac, n unele cazuri, o gen poate determina mai multe caractere. Rezultatele analizelor genetice nu se pot explica dect dac se admite c genele sunt plasate liniar n cromozomi, ocupnd un loc precis denumit locus.

7.3. TRANSMITEREA NLNUIT A GENELOR (LINKAGE)

Segregarea independent a caracterelor i libera combinare a acestora rezult din faptul c, n timpul meiozei, cromozomii omologi se despart i se distribuie ntmpltor, ntr-un gamet sau altul. Potrivit acestor legi, genele alele sunt localizate n perechi diferite de cromozomi. n anul 1906, W. Bateson i R. C. Punnett vrnd s confirme rezultatele mendeliene, au efectuat o dihibridare la planta Lathyrus odoratus (sngele voinicului). Ei au luat n studiu urmtoarele caractere: culoarea florilor i forma polenului. ncrucind plante cu flori purpurii i polen alungit cu plante cu flori roii i polen rotund, n generaia F1 hibrizii erau uniformi, cu flori purpurii i polen alungit, aceste caractere fiind dominante. n generaia F2 segregarea nu s-a produs n raportul de 9:3:3:1, ci au rezultat ntr-o proporie mai mare plantele ce se asemnau cu prinii (flori purpurii polen alungit, flori roii polen rotund), fenomen pe care l-au denumit cuplare i ntr-o mic proporie indivizii recombinai (flori purpurii polen rotund, flori roii polen alungit) fenomen numit repulsie. T. H. Morgan i colaboratorii si au efectuat o experien la Drosophila melanogaster (fig. 7.1). S-a ncruciat o femel cu corp gri i aripi normale (b+vg+/b+vg+) cu un mascul ce prezenta caractere mutante, corp negru i aripi vestigiale (bvg/bvg) n prima generaie au rezultat indivizi cu corp gri i aripi normale. Dac un mascul heterozigot din generaia F1 este retroncruciat cu o femel homozigot dubl mutant, n generaia F2 au rezultat numai dou grupe
150

fenotipice de indivizi, ca n cazul unei monohibridri, n raport de 1:1 i nu patru cte ar fi trebui sa apar, n raport de 1:1:1:1. Rezultatele acestei experiene au artat c genele ce determin culoarea corpului i forma aripilor sunt plasate pe acelai cromozom i se transmit mpreun la descendeni, fenomen pe care n denumete linkage. n acest exemplu se poate vorbi de un linkage complet fenomen rar ntlnit n natur. La Drosophila melanogaster, la mascul, fiind sexul heterogametic (XY), nu are loc recombinarea genetic deoarece cromozomii X i Y nu sunt omologi, iar ntre ceilali cromozomi somatici nu se realizeaz n profaza meiozei chiasme (C. D. Darlington, 1935). Fenomenul acesta se mai ntlnete i la alte specii de diptere la care sexul mascul este heterogametic sau la unele specii de lepidoptere, la care sexul femel este heterogametic.

Fig. 7.1. nlnuirea complet a genelor la Drosophila melanogaster

Cele peste 500 de mutante de la Drosophila, studiate de T. Morgan, manifest tendina de a se grupa n patru grupe: grupa I 141 mutante; grupa II 228 mutante; grupa III 156 mutante i grupa IV 12 mutante.
151

Existena a patru grupe de nlnuire este nc o dovad c genele sunt plasate n cromozomi i n plus, exist o corelaie evident ntre lungimea cromozomilor i numrul de gene pe care le conin. Linkage constituie o tez de baz a teoriei cromozomice a ereditii, conform creia genele localizate pe acelai cromozom se transmit la descendeni n bloc, formnd o singur grup de linkage. Fenomenul linkage se manifest numai pentru genele localizate n acelai cromozom, n timp ce pentru genele ce se gsesc n cromozomi diferii transmiterea lor se face conform legilor mendeliene. Transmiterea nlnuit a genelor are o serie de implicaii teoretice i practice deosebit de importante n alctuirea hrilor cromozomice, ameliorarea plantelor i animalelor, sfaturile genetice i ingineria genetic.

7.4. SCHIMBUL RECIPROC DE GENE NTRE CROMOZOMII OMOLOGI (CROSSING-OVER)

Bateson i Punnett au elaborat teoria cuplrii i repulsiei, prin care cutau s demonstreze c n procesul de hibridare pot avea loc fenomene de cuplare i recombinare a genelor. T. H. Morgan a nlocuit termenul de cuplare cu cel de linkage iar cel de repulsie cu termenul de crossing-over.

Fig.7.2.-Fenomenul crossing-over la Drosophila melanogaster 152

Fenomenul prin care se realizeaz schimbul de gene alele sau segmente cromatidice nesurori ntre cromozomii omologi n timpul meiozei se numete crossing-over. Existena acestui fenomen dovedete c linkage nu este ntotdeauna complet, ca atare, crossing-over-ul este un linkage incomplet. Pentru a demonstra schimbul de gene ntre cromozomii omologi, Morgan a folosit urmtoarea experien: a ncruciat un mascul de culoare neagr i cu aripi vestigiale cu o femel cu corpul de culoare gri i aripi normale (figura 7.2). n generaia F1 a obinut o descenden uniform fenotipic, cu corpul de culoare gri i aripi normale i genotipic heterozigot. Dac se retroncrucieaz o femel din generaia F1 cu un mascul cu ambele caractere mutante, rezult n generaia F2 patru grupe fenotipice: dou grupe fenotipice parentale i dou grupe fenotipice noi, n urmtoarele proporii: corp gri-aripi normale - 41,5%, corp negru-aripi vestigiale - 41,5%, corp gri-aripi vestigiale - 8,5%, i corp negru-aripi normale - 8,5%. Se observ c raportul de segregare nu este cel ateptat n urma unei retroncruciri 1:1:1:1. Formele noi, rezultate n proporie mult mai mic dect cele parentale, sunt determinate de schimbul de gene ntre cromatidele nesurori ale cromozomilor omologi, fiind denumite i forme recombinate. Raportul de segregare, deosebit de cel mendelian, se datoreaz faptului c femela heterozigot formeaz patru tipuri de gamei, dou de tip parental (b+vg+ i bvg)i dou de tip nou (b+vg i bvg+), care se fecundeaz cu unicul tip de gamei ai masculului (bvg). Valoarea crossing-over-ului se exprim n % i ne arat fora de nlnuire a genelor. Cu ct aceasta este mai mic, frecvena crossing-over-ului este mai mare. Valoarea procentual cu care se manifest crossing-over-ul se mai numete i valoare de schimb sau fora nlnuirii.

7.5. MECANISMUL CITOLOGIC AL CROSSING-OVER-ULUI

Morgan a studiat efectele crossing-over-ului n funcie de rezultatele obinute n urma hibridrilor . El a presupus c la nivel citologic, n prima diviziune meiotic, cnd cromozomii omologi se apropie i se nfoar unul n jurul celuilalt, se produc rupturi i sudri ntre diferite segmente cromatidice. Dovezi citologice ale crossing-over-ului au fost aduse de C. Stern n 1931 la Drosophila melanogaster i apoi de H. B. Creighton i Barbara Mc. Clintock, la Zea mays, cnd s-a putut urmri trecerea unor segmente dintr-un cromozom n altul. C. Stern a ncruciat dou linii de Drosophila care aveau structura genetic diferit. El a obinut o femel la care cromozomii X erau difereniai morfologic i genetic: un cromozom X era fragmentat n dou segmente aproximativ egale, din care un segment avea centromer iar al doilea cromozom X avea ataat un segment din cromozomul Y. Pe segmentul fr centromer al
153

primului cromozom X sunt localizate genele c (carnation) i B (bar). Gena c determin culoarea roie a ochilor iar gena B determin reducerea suprafeei ochilor. Pe al doilea cromozom X de la femel se gsesc genele de tip normal, C (carnation), ce determin culoarea roie a ochilor i b (bar), ce determin forma normal a ochilor (figura 7.3). Se observ c cromozomii X de la femel erau foarte diferii morfologic i genetic i puteau fi urmrii uor n timpul diviziunii meiotice.

Fig. 7.3. Explicaia citologic a fenomenului crossing-over (dup C. Stern, 1931)

Stern a ncruciat o femel de tipul descris mai sus cu un mascul pe a crui cromozom X se gseau genele recesive c (ochi roii) i b (ochi de mrime normal). Femela produce dou tipuri normale de gamei (cB i Cb) i dou tipuri noi, recombinate, n procesul de crossing-over, (Cb i cb). Din combinarea acestor patru tipuri de ovule cu spermatozoizi ce conin cromozomul X cu genele cb ce proveneau de la mascul ns cellalt cromozom X difer de la o grup la alta. Apariia indivizilor recombinai se datoreaz schimbului de gene ntre cromozomii X de la femel. Pentru a cunoate mecanismul citologic al crossing-over-ului, este necesar s analizm mai nti cnd i unde se produce el. Studiul diviziunii meiotice uureaz nelegerea modului cum se produce crossing-over-ul.
154

n profaza I a meiozei, n stadiul de zigonema, cromozomii omologi se mperecheaz i formeaz cromozomi bivaleni. n diplonema fiecare cromozom cliveaz longitudinal, rezultnd tetrada cromozomic. ntre cromatidele celor doi cromozomi pot exista unele ntretieri realizndu-se unul sau mai multe puncte de contact denumite chiasmata (pluralul de la chiasm). Cnd centromerii cromozomilor din tetrada cromozomic se ndeprteaz unii de alii, la nivelul chiasmelor se poate realiza un schimb de segmente cromatidice, fenomen denumit crossing-over. Chiasma reprezint modalitatea citologic de producere a crossing-overului. Cercetrile citologice au demonstrat c, chiasmele se realizeaz numai ntre cromatidele nesurori i deci dou din cele patru cromatide i pstreaz structura iniial. Aa se explic faptul c numrul de recombinaii nu depete frecvena de 50% (fig. 7.4.).
Fig. 7.4. Chiasma afecteaz dou din cele patru cromatide. n urma meiozei doi gamei vor fi recombinai iar doi nerecombinai

Pentru explicarea mecanismului citologic al crossing-over-ului s-au elaborat dou teorii: teoria chiasmatipiei i teoria copierii selective a cromatidelor n timpul sintezei materialului cromozomic. Teoria chiasmatipiei a fost elaborat de F. A. Jannsen (1909-1924) i perfecionat de C. D. Darlington i Belling (1931, 1935). Aceast teorie susine c, crossing-over-ul se realizeaz naintea fazei de diplonema, n profaza diviziunii heterotipice, cnd ntre cromozomii omologi are loc un schimb de segmente egale. Acest schimb de segmente cromatidice se realizeaz cu ajutorul chiasmelor. O chiasm nu afecteaz dect dou din cele patru cromatide ale tetradei cromozomice. Acest aspect poate fi pus n eviden la Neurospora crassa, deoarece ascosporii acestei ciuperci pot fi studiai individual. ntre cromatide se pot realiza mai multe chiasme, de aceea, pe lungimea unei perechi de cromozomi, se pot produce mai multe schimburi de segmente cromatidice, existnd din acest punct de vedere mai multe tipuri de crossing-over: crossing-over simplu, crossing-over dublu, crossing-over triplu etc. Teoria chiasmatipiei a fost completat de K. Mather (1937), prin cercetrile citologice efectuate la lcustele din genul Stenobothrus, la care cromozomii sunt foarte diferii ca mrime. El a ajuns la concluzia c exist o corelaie pozitiv ntre lungimea cromozomului i numrul de chiasme ce se formeaz. n ceea ce privete repartizarea chiasmelor de-a lungul cromozomului s-a constatat c ntre centromer i prima chiasm este o distan mai mic la cromozomii scuri i mai mare la cromozomii lungi, aceasta numindu-se distan
155

diferenial. Celelalte chiasme de pe braele cromozomilor sunt separate de distane constante pentru o specie oarecare, denumite distane de interferen. Teoria chiasmatipiei a fost verificat cu ajutorul izotopilor radioactivi, de ctre J. H. Taylor (1957, 1958, 1963) dar rmne nelmurit care este natura forelor care determin ruperea cromatidelor i realizarea schimbului de segmente cromatidice. C. D. Darlington (1932) arat c, n stadiul de zigonema, cromozomii omologi sunt strns rsucii unul n jurul celuilalt, crendu-se o tensiune mai mare la cromatidele externe. Aceste cromatide se rup, se deruleaz i se resudeaz, la nivelul aceleiai cromatide (crossing-over-ul nu se produce) sau la cromatida pereche. M. J. D. White (1942), pentru a explica acelai fenomen, arat c n timp ce are loc sinapsa cromozomilor omologi, ntre cromatidele acestora are loc o atracie. Odat cu clivarea cromozomilor, aceast atracie se transform n repulsie. n stadiul de diachinez, cnd cromozomii omologi se ndeprteaz mult unul de altul, prezint o serie de bucle a cror fisurare este mpiedicat de prezena chiasmelor. De aceea, se pot ntlni zone n care are loc atracia, ce se suprapun cu zone n care are loc repulsia cromatidelor. De data aceasta cromatidele interne sunt supuse unor tensiuni mai mari, se pot rupe i se ataeaz la cromatidele nesurori. Teoria copierii selective a cromatidelor, cunoscut i sub denumirea de copy choice theory susine c, fenomenul de crossing-over are loc n timpul replicrii materialului genetic, n perioada S din ciclul celular. Pentru a nelege mecanismul presupus, este necesar s precizm c procesul de sintez replicativ a macromoleculei de ADN, ct i a cromozomului n ansamblu, se realizeaz dup modelul semiconservativ. Se presupune c n timpul acestui proces, replicaia cromozomului nu se face numai dup propriul model, ci unele cromatide nou sintetizate copie secvena nucleotidic de pe un segment din cromatidele celuilalt cromozom. Aceast teorie nu este acceptat de geneticieni deoarece s-a demonstrat c fenomenul de crossing-over are loc i n afara perioadei S.

7.6. TIPURI DE CROSSING-OVER

Crossing-over-ul este un fenomen ntmpltor ce se produce cu o anumit probabilitate n unul sau mai multe puncte de pe cromozomii omologi. n funcie de numrul segmentelor cromatidice ce se pot schimba ntre cromozomii pereche, crossing-over-ul poate fi: simplu, cnd se realizeaz schimbul unui singur segment sau gene ntre cromozomii omologi; dublu, cnd se produc dou schimburi de segmente sau gene, caz n care trebuie s existe cel puin dou chiasme ntre cromozomii omologi i multiplu, cnd ntre cromozomii omologi se realizeaz mai multe schimburi de gene sau segmente cromatidice (fig. 7.5). ncepnd cu crossing-over-ul dublu, exist mai multe posibiliti de realizare a crossing-over-ului ntre cele patru cromatide ale tetradei cromozomice. Aa cum a fost prezentat fenomenul de crossing-over, se nelege c segmentele ce fac schimb ntre cromozomi omologi, sunt egale. Nu ntotdeauna procesul decurge astfel. Se poate ntmpla ca, cromatidele s se rup n puncte
156

diferite i atunci segmentele ce se schimb s nu mai fie egale ca lungime. Acest fenomen se numete crossing-over inegal i are drept consecin dublarea sau triplarea unei gene pe un cromozom iar la cellalt cromozom lipsa locusurilor respective (deficient). Efectul crossing-over-ului inegal a fost sesizat la Drosophila melanogaster, de ctre Sturtevant i Morgan (1923). Pe cromozomul X n regiunea 16 A este localizat gena Bar, gen mutant care are ca efect reducerea suprafeei ochiului, prin diminuarea numrului de omatidii. Mult vreme s-a crezut c, gena Bar, prin mutaie de reversie poate reveni la forma normal sau s determine un nou fenotip dublu Bar. Dar fiindc mutaia de reversie i apariia fenotipului dublu bar era nsoit de un crossing-over n vecintatea regiunii 16 A s-a tras concluzia c tipul Bar este efectul unei duplicaii a regiunii 16 A, determinat de un crossing-over inegal.
Fig. 7.5. Tipuri de crossing-over: 1-cromozomi normali; 2-crossing-over simplu; 3-crossing-over dublu 4-crossing-over multiplu

Odat cu descoperirea cromozomilor gigantici din glandele salivare ale larvelor de Drosophila s-a constatat, ntr-adevr, de ctre Bridges c micorarea suprafeei ochiului este corelat pozitiv cu dublarea sau triplarea unor poriuni de cromozom ca urmare a unui crossing-over inegal. Crossing-over-ul mitotic. Crossing-over-ul este un fenomen specific diviziunii meiotice. Destul de rar, acest fenomen poate avea loc i n celulele somatice, n profaza mitozei, numindu-se n acest caz crossing-over mitotic sau somatic. Fenomenul apare foarte rar la plantele i animalele superioare, ns destul de frecvent la unele microorganisme, la care hrile cromozomice s-au ntocmit pe baza crossing-over-ului mitotic. Bridges, a observat apariia unor caractere mozaicate la femelele de la Drosophila att pe corp ct i pe ochi. Studiind mai detaliat cauzele acestor mozaicuri de la Drosophila de ctre C. Stern (1936) i la porumb de D. F. Jones (1937) s-a demonstrat c fenomenul se datoreaz unui crossing-over ntre cromatidele cromozomilor omologi n timpul diviziunii mitotice. La Drosophila s-au luat n studiu dou caractere: culoarea galben a corpului, produsa de gena Y i caracterul peri ari determinat de gena Sn.
157

Femelele heterozigote pentru aceste caractere aveau urmtorul genotip: YSn+ / Y+Sn. Cele dou gene se gsesc pe cromozomul X, foarte apropiat una de alta. Petele ce se observ pe corpul insectei pot fi simple sau duble, n funcie de locul de pe cromozom unde se produce crossing-over-ul. Dac crossing-over-ul se produce ntre centromer i gena Sn, apar pete duble, iar dac se produce ntre gena Sn i Y, petele sunt simple. n anafaza mitozei cromozomii cu genele YSn+ vor migra la un pol al celulei, iar cromozomul cu genele Y+Sn la cellalt pol. Din cele dou celule se dezvolt dou esuturi unde genele recesive Y i Sn vor fi homozigote, realizndu-se urmtoarele genotipuri: YSn+ / YSn+ i Y+Sn / Y+Sn determinnd pe corpul cenuiu al Drosophilei cele dou pete: o pat de culoare galben i cu periorii normali i alta de culoare gri i cu peri ari. Crossing-overul ntre genele Y i Sn are loc foarte rar, deoarece cele dou gene sunt localizate foarte aproape una de alta pe cromozomul X, n acest caz aprnd petele simple. Crossing-over-ul somatic poate avea loc att ntre cromozomii sexului ct i ntre cromozomii autozomi. Crossing-over-ul mitotic a fost pus n eviden i la unele microorganisme, cum ar fi la Aspergillus nidulans. La aceast ciuperc hifele sunt haploide ns, uneori hifele a dou sue pot fuziona i dau natere la un heterocarion, iar dup unirea nucleilor rezult spori diploizi care pot fi izolai. Aceti spori diploizi pot fi heterozigoi pentru o anumit gen, i ca urmare, ntre anumite gene se poate produce fenomenul de crossing-over. De exemplu, la aceast ciuperc s-a identificat o mutant care determin rezistena la acriflavin (Acr), substan ce provoac moartea tipului slbatic. (acr+). Indivizii heterozigoi (acr+/Acr) sunt parial rezisteni la acriflavin, deoarece gena mutant Acr este semidominant asupra tipului slbatic (acr+). Dac a avut loc fenomenul de crossing-over mitotic (la indivizii diploizi), pot apare indivizi cu genotipul Acr/Acr, ce sunt rezisteni la acriflavin. n acest mod, dac n mediul de cultur se va aduga acriflavin, se vor ndeprta uor toate celelalte tipuri, selectndu-se numai recombinaii, orict de rar ar aprea. J. H. Taylor (1957) folosind metoda autoradiomicrografiei la planta Bellevalia romana (2n=8) a dovedit citologic existena crossing-over-ului mitotic. Pentru aceasta, a inut rdcinile tinere ale acestei plante timp de 8 ore n soluie nutritiv n care a adugat timidin marcat cu tritiu (H3). Apoi, rdcinile au fost scoase i puse ntr-un mediu fr timidin marcat, adugndu-se colchicin, care blocheaz diviziunea celulelor, dar nu i a cromozomilor. n felul acesta s-au determinat cte diviziuni ale cromozomilor au avut loc. J. H. Taylor a constatat c n prima metafaz dup scoaterea rdcinilor din mediul marcat, ambii cromozomi ai unei perechi erau radioactivi. n a doua diviziune unul era marcat, iar perechea sa nu. La unii cromozomi care erau n ntregime radioactivi erau segmente terminale neradioactive, dovedind un schimb de segmente ntre cromozomi. Crossing-over-ul intragenic. n concepia geneticii clasice, genele sunt uniti elementare ale ereditii, care sunt, n acelai timp, uniti funcionale i de
158

recombinare. n acest caz, nu se poate pune problema subunitilor de gen care s poat fi schimbate prin crossing-over. Cercetrile ulterioare, efectuate dup anul 1950, au evideniat cazuri n care genele se comport ca i cum ar fi alctuite din mai multe subdiviziuni denumite subgene. La microorganisme s-a demonstrat c crossing-over-ul poate avea loc i n interiorul genei, n diferii subloci ai acesteia, numindu-se, n acest caz, crossing-over intragenic. Avantajul utilizrii n diferite cercetri a microorganismelor, deriv din faptul c, se pot studia ntr-un timp scurt un numr enorm de indivizi, de ordinul milioanelor. Un caz bine studiat este bacteriofagul T4, fag ce paraziteaz unele sue ale bacteriei Escherichia coli (S. Benzer, 1955). La acest bacteriofag, genele mutante, adiacente, r II A i r II B, determin un ciclu de via mai scurt al acestuia determinnd plaje mai mari de liz (zone cu bacterii distruse) dect tipul slbatic. Notarea cu r, arat c genele respective determin liza rapid a celulei gazd. Bacteriofagul T4 de tip normal, poate parazita att pe sua B ct i pe sua K.12 () de E. coli. Bacteriofagii cu genele mutante r II nu pot crete dect pe sua B. n cazul unor infecii simultane ale suei K.12 () cu ambele mutante ale genei r II, numai tipul slbatic provenit din recombinarea celor dou gene, poate infecta bacteria. n acest caz, chiar dac frecvena indivizilor recombinai este de 1/10.000.000 ei pot fi uor identificai. La genele r II A i r II B s-au identificat peste 3000 de mutante, folosite pentru evidenierea crossing-over-ului intragenic. Pentru a determina existena crossing-over-ului intragenic se procedeaz astfel: cu dou mutante r II A ale fagului T4 se infecteaz simultan sua B de E. coli, iar ntre ele se produce crossing-over-ul intragenic. Bacteriofagii rezultai se folosesc pentru infectarea suei K.12 (). n urma acestei infecii se vor putea identifica bacteriofagii cu gene de tip normal, deoarece numai ei pot crete pe sua K.12 (). Identificarea a 1000-1500 de recombinaii a demonstrat existena crossing-over-ului intragenic, putndu-se alctui i harta genetic a regiunii r II. Se pune ntrebarea: de ce se consider c genele r II A i r II B sunt diferite? Acest lucru poate fi dedus din urmtoarea experien: dac se infecteaz sua K.12 () simultan cu T4 r II A i T4 r II B, rezult descendeni, n timp ce, dac aceast su este infectat separat cu dou mutante T4 r II A sau T4 r II B, nu se produc descendeni, din cauza frecvenei foarte mici a recombinrilor intragenice. n concluzie, genele r II A i r II B determin funcii diferite, ambele ns necesare pentru reproducerea bacteriofagului T4 pe sua K.12 (). Testul prin care se dovedete c dou mutante aparin aceleiai gene sau unor gene diferite, se numete test de complementaie. Crossing-over-ul intragenic s-a pus n eviden i la organismele superioare: la Drosophila melanogaster s-a descoperit c locii white, forked i lozenge din cromozomul X, locusul star din cromozomul II, sunt compleci, fiind
159

alctuii din mai multe subgene. De asemenea, loci compleci au fost identificai la porumb, bumbac, oarece, om i la alte specii.

7.7. FACTORII CARE INFLUENEAZ CROSSING-OVER-UL

Stabilitatea structural a cromozomilor i a locilor ce ocup poziii bine definite fac ca linkage i crossing-over-ul s se manifeste ca fenomene constante de la o generaie la alta, putndu-se afirma c cele dou fenomene sunt controlate genetic. Ca orice proces genetic, crossing-over-ul este supus influenei a dou categorii de factori: interni i externi. Dintre factorii interni studiai pn acum sunt: sexul, structura cromozomilor, aberaiile cromozomice i numerice, vrsta organismului, iar dintre factorii externi: temperatura, nutriia. Sexul. Cercetrile efectuate de C. B. Bridges (1933) la Drosophila melanogaster, au evideniat faptul c la masculi, fenomenul de crossing-over nu se produce sau este foarte rar. Lipsa crossing-over-ului a fost semnalat i la Bombyx mori, la sexul femel, care este heterogametic XY. Absena crossing-over-ului la sexul heterogametic al unor specii se datoreaz faptului c, n procesul de gametogenez (spermatogenez i ovogenez), dei cromozomii omologi fac sinaps formnd bivaleni, ntre cele patru cromatide nu se formeaz chiasme i deci nu se poate realiza nici crossingover-ul. La alte specii, la care sexul se realizeaz cu ajutorul heterozomilor (la mamifere), s-a constatat c cromozomii se asociaz cap-la-cap, n timp ce autozomii se asociaz normal, latur-pe-latur. n acest caz ntre cromozomii somatici are loc crossing-over-ul, dar nu i ntre cromozomii sexului. Chiar la organismele la care crossing-over-ul se produce la ambele sexe, s-au observat diferene privind frecven crossing-over-ului de la un sex la altul. n aceste organisme, de obicei, la sexul heterogametic, frecvena crossing-overului este mai mic. La unele plante monoice sau dioice s-au observat diferene ntre sexe, n ceea ce privete frecvena crossing-over-ului. Astfel, la porumb, frecvena acestuia este mai mare la gameii masculi. n ceea ce privete structura cromozomilor, frecvena crossing-overului este influenat de poziia centromerului i localizarea heterocromatinei. n regiunea centromerului frecvena crossing-over-ului este redus, datorit interferenei manifestate de centromer asupra genelor din vecintatea sa i datorit faptului c genele sunt foarte apropiate una de alta. Tot n zona centromerului sunt prezente zonele heterocromatice ale cromozomului, care reduc schimbul de gene ntre cromozomii omologi. Aberaiile cromozomice i n special inversia i translocaia, precum i unele tipuri de poliploidie, determin o modificare a frecvenei crossing-over-ului. Procentul de crossing-over depinde i de vrsta organismului. Astfel, la Drosophila, dup ce femelele au atins maturitatea sexual, n urmtoarele dou
160

zile, frecvena crossing-over-ului a atins valoarea maxim, iar dup 10-11 zile, frecvena acestuia este minim. Dintre factorii externi, un rol important n modificarea frecvenei crossing-over-ului l are temperatura. Efectundu-se diferite hibridri ntre diferite mutante la Drosophila i crescndu-se descendenii n condiii diferite de temperatur, s-a putut constata c la unii cromozomi sau chiar la unele segmente cromozomice frecvena crossing-over-ului se modific. Astfel, dup Grubard (1932) (citat de T. Crciun, 1978), unele regiuni ale cromozomului II de la Drosophila formeaz mai multe recombinri la temperatura 14-160C, iar n alte regiuni, la temperatura de 25-300C.

7.8. HRILE CROMOZOMICE

Tezele teoriei cromozomice a ereditii au constituit baza teoretic i practic pentru elaborarea hrilor cromozomice sau genetice. Hrile cromozomice constituie reprezentarea grafic a cromozomilor i a genelor care alctuiesc diferite grupe de linkage, genele fiind plasate pe cromozomi la distane relative exprimate n procente de crossing-over. Alctuirea hrilor cromozomice presupune trei etape de lucru: - obinerea mutantelor de la caracterul normal sau slbatic; - stabilirea grupelor de linkage; - determinarea ordinii i distanelor dintre gene n cadrul fiecrei grupe de linkage. Dup ce s-au realizat un numr ct mai mare de forme mutante, genele respective se repartizeaz n grupe de nlnuire. Pentru a stabili aceste grupe se efectueaz un numr mare de ncruciri i retroncruciri ntre indivizi normali i mutani sau ntre indivizi mutani. Dac segregarea se realizeaz dup raporturile mendeliene, se trage concluzia c genele respective se gsesc n grupe diferite de nlnuire, iar dac n urma retroncrucirilor se obin n proporie mai mare fenotipurile parentale, ntre genele respective se manifest linkage, complet sau incomplet, deci ele sunt plasate n acelai cromozom. Pentru determinarea ordinii i distanei dintre gene s-a plecat de la constatarea c frecvena crossing-over-ului este o funcie direct proporional cu distana dintre gene. Distanele dintre gene se exprim n uniti de recombinare, denumite uniti Morgan sau morganide. Fiecare unitate de recombinare corespunde cu 1% crossing-over, iar 1% crossing-over este egal cu 1 unitate de pe harta cromozomic. De exemplu, dac la Drosophila melanogaster se consider trei gene mutante recesive, b - corp negru, vg aripi vestigiale i c aripi ndoite, pentru a stabili distana dintre ele i ordinea lor pe cromozom, se fac urmtoarele ncruciri: indivizii normali cu indivizi ce prezint mutaiile b i c, rezultnd un procent de 27% crossing-over, indivizi normali cu indivizi ce prezint mutaiile c i vg n urma creia au rezultat 8,5% indivizi recombinai. Se poate afirma c distana dintre locii b i c este de 27 uniti iar ntre locii c i vg distana este de
161

8,5 uniti. Pentru a determina poziia genei vg fa de celelalte gene este obligatorie i a treia ncruciare, ntre indivizi normali i indivizi cu genele b i vg, caz n care frecvena crossing-over-ului a fost de 18,5%, deci distana dintre aceti loci este de 18,5 uniti pe harta genetic, ca n schema de mai jos:

n acest caz, gena vg este plasat ntre genele b i c, deoarece dac ar fi fost plasat dincolo de gena c ar fi trebuit s se obin un procent de crossing-over de 35,5%. Cnd dou gene de pe acelai cromozom sunt situate al distan mai mare, ntre ele poate apare crossing-over-ul dublu, care reduce frecvena crossingover-elor simple. Atunci cnd ntr-un punct al cromozomului are loc un crossingover, n vecintatea sa, probabilitatea ca s se produc un alt crossing-over se reduce, iar fenomenul a primit denumirea de interferen. S-a constatat c dac distana dintre dou gene este de minimum 12 uniti de recombinare (morganide), n acest segment de cromozom nu mai are loc un alt crossing-over. n alctuirea hrilor cromozomice s-a constat c exist o diferen ntre valoarea real a crossing-over-ului i cea calculat statistic. Aceast diferen se apreciaz cu ajutorul coeficientului de coinciden, care este raportul dintre valoarea experimental a crossing-over-ului i cea teoretic. Coeficientul de coinciden are valori cuprinse ntre 0 i 1 i este o valoare invers interferenei: are valoarea maxim (1) cnd interferena este absolut i valoarea minim (0) cnd interferena este mare. Prima hart cromozomic s-a ntocmit la Drosophila melanogaster iar apoi la Zea mays, Antirrhinum majus, Lathyrus odoratus, Hordeum vulgare etc. n figura 7.6. sunt redate parial hrile cromozomice la Drosophila melanogaster i Zea mays. Frecvena crossing-over-ului nu poate depi valoarea maxim de 50%. Dac se observ cele dou hri cromozomice, se constat c pe hart apar i distane mai mari de 50 uniti. Acest lucru se explic astfel: ntre genele ndeprtate apar crossing-overe duble i n acest caz distanele mari se calculeaz prin nsumarea distanelor mai mici dintre genele intermediare. n concluzie, distana dintre gene figurat pe harta cromozomic nu corespunde cu procentul de crossing-over dect n cazul genelor apropiate ntre care nu pot avea loc crossing-overe duble.

162

Fig. 7.6. Hri cromozomice: a-la Drosophila melanogaster (dup Bridges); b-la Zea mays (dup Rhoades)

7.9. HRILE CITOLOGICE

Localizarea genelor pe cromozomi s-a putut stabili prin determinarea procentului de crossing-over, alctuindu-se hrile cromozomice. Se pune ntrebarea dac nu se pot localiza genele pe cromozom, folosind elementele de structur ale acestuia, mai precis, diferenele de structur ce apar de-a lungul lui i care s corespund genelor. Acest lucru a devenit posibil prin descoperirea i studierea cromozomilor gigantici din celulele glandelor salivare ale larvelor de Drosophila melanogaster, deoarece au dimensiuni mari i pot fi studiai uor n interfaz. La aceti cromozomi, s-au evideniat microscopic o serie de benzi transversale, unele heterocromatice (dense) i altele eucromatice (clare). La nivel molecular, cromozomii gigantici pot fi privii ca o multiplicare de cteva sute sau mii de ori a macromoleculei de ADN, locii suprapunndu-se n paralel i deci, un locus de pe aceti cromozomi reprezint o amplificare a unicului locus de pe fibra de ADN din cromozomii somatici. Acest lucru a permis studierea amnunit a
163

cromozomilor gigantici, la care s-au identificat peste 5000 de benzi transversale, iar fiecare fiind alctuit din 16 puncte. Localizarea acestor benzi este constant pe cei patru cromozomi, fapt ce a permis identificarea i numerotarea lor. Lungimea total a cromozomilor gigantici (1180 ) a fost mprit n 100 de diviziuni, repartizate astfel: cromozomul I, 0 20 diviziuni; cromozomul II, 20 60 diviziuni; cromozomul III, 60 100 diviziuni. Cromozomul IV fiind foarte mic nu a intrat n aceast mprire. Fiecare diviziune a fost mprit n ase subdiviziuni notate cu literele: A, B, C, D, E, F. Fiecare subdiviziune cuprinde un anumit numr de benzi transversale. C. B. Bridges (1944) a stabilit o coresponden ntre genele localizate pe cromozomii obinuii i benzile transversale de pe cromozomii gigantici (figura 7.7.). Distana dintre genele de pe harta cromozomic i cea citologic nu coincide ntotdeauna, mai ales n regiunile centromerice. Hrile genetice au o importan deosebit din punct de vedere teoretic i practic. Elaborarea hrilor genetice a permis s se cunoasc o serie de aspecte cum ar fi: neomogenitatea funcional liniar a cromozomilor, explicarea unor aberaii cromozomice, importana genetic a fiecrui cromozom, n funcie de tipul genelor i numrul lor. Cunoaterea precis a locilor genelor pe cromozomi deschide perspective mari n cunoaterea modului de transmitere a unor caractere i n modificarea constelaiei genetice a organismelor pin metode de manipulare a materialului genetic.

Fig. 7.7. Segment din harta citologic a cromozomului x la Drosophila melanogaster

164

CAPITOLUL 8 DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI

Moto: "Cei doi prini divoreaz n celulele sexuale ale copilului" Carl Sagan

8.1. GENERALITI
Sexualitatea a aprut pe o anumit treapt a evoluiei plantelor i animalelor, prezentnd o serie de avantaje: asigur reproducerea organismelor, recombinarea genetic, vigoarea hibrid a descendenei i trecerea de la starea haploid la cea diploid. Aspectele pe care le ridic acest domeniu al biologiei sunt pe ct de variate, pe att de complexe. Este vorba de biologia, de transmiterea i diferenierea sexului, precum i de posibilitatea de dirijare a raportului dintre sexe. Determinarea i dirijarea sexelor prezint un interes deosebit pentru practic. Dei s-a lucrat mult n direcia gsirii unor posibiliti pentru a putea dirija raportul dintre sexe, s-au fcut puine progrese. Ct de important ar fi pentru noi s putem dirija raportul dintre sexe la plante sau animale, dup necesiti de ordin economic? S putem, de exemplu, reduce la animale numrul de masculi, mrind numrul de femele n scopul nmulirii mai rapide a acestui sex (pentru producia de lapte, ou .a.). Pentru plantele de cultur ar prezenta importan, de exemplu, transformarea unor plante dioice n plante monoice sau invers. Diferenierea sexelor, att n regnul vegetal ct i animal este strns legat de complementul cromozomic, existnd i excepii. Din punct de vedere al modului de reproducere, organismele se pot clasifica n: - organisme unisexuate, cu diferene exclusiv masculin i feminin; - organisme bisexuate (hermafrodite) cu difereniere ambigen, care produc att gamei masculi ct i femeli; - organisme pseudohermafrodite cu difereniere ambigen, care, dei posed organe pentru reproducerea gameilor de ambele sexe, produc gamei numai de un sex. Sub aspectul diferenierii sexuale, lumea vie este att de variat, nct o ncercare de clasificare a lor nu este chiar att de uoar. Deosebirea dintre sexe se numete gonochorism, fiind implicate dou categorii de caractere: caracterele sexuale primare i caracterele sexuale secundare. Primele sunt datorate prezenei gonadelor, care produc un anumit tip de celule sexuale, diferite la mascul fa de femel i anexele glandelor sexuale (caractere legate de sex). Caracterele sexuale secundare sunt diferenierile morfologice i fiziologice dintre sexe; sunt determinate de hormonii secretai de
165

glandele sexuale i nu asigur direct procesul gametogenezei, dar au un anumit rol n reproducerea sexuat. Caracterele sexuale secundare, spre deosebire de cele primare, apar ntro anumit perioad, n cursul dezvoltrii individuale. Totalitatea caracterelor sexuale care genereaz deosebirile dintre cele dou sexe, poart numele de dimorfism sexual. Dimorfismul sexual este mai accentuat la organismele inferioare dect la cele superioare. Un caz interesant este viermele marin Bonellia viridis: femela are corpul de forma unui sac, cu o prelungire sub form de tromp i o lungime de aproximativ 30 cm; masculul are forma unui filament de 1-2 mm i triete ca parazit n esofagul sau oviductul femelei. n general, la speciile inferioare i la unele insecte, femela este mai bine dezvoltat dect masculul. La peti i reptile, dimorfismul sexual este aproape imperceptibil. El se accentueaz n favoarea masculului la vertebratele superioare. La psri, deosebirile sunt determinate de culoare, form, mrime etc.; la mamifere aceste deosebiri se refer la mrime, pr, coarne etc.

8.2. TEORIA GENETIC A DETERMINRII SEXULUI

Determinismul genetic al sexelor are loc n cursul ontogeniei organismului, n diferite faze ale ciclului de nmulire. Se cunosc trei tipuri de determinism: progamic, singamic i epigamic. Tipul progamic are loc n organismul matern odat cu procesul de maturare a ovulului. La unele animale, cum ar fi, de exemplu, Rotataria, Philoxera vastatrix i Dinophylus, din ovule mari se dezvolt femele, iar din cele mici masculi. Mai rspndit este tipul singamic la care determinarea sexului are loc n momentul fecundrii (peti, psri, mamifere .a.). La tipul epigamic determinarea sexului are loc dup procesul de fecundare, n timpul dezvoltrii individuale a organismelor (Bonellia viridis .a.).

8.2.1. Determinismul cromozomic al sexelor

Observaiile cu privire la proporia dintre sexe, att la plante ct i la animale, au dus la acumularea de date, din care s-a dedus c n natur indivizii masculi i femeli sunt n numr aproximativ egal. Chiar din perioada mendelian s-a ncercat stabilirea unei legturi ntre segregarea caracterelor i segregarea indivizilor dup sex. S-a constatat c segregarea indivizilor dup sex, care este aproape 1:1, corespunde cu segregarea de tip Zea, cnd se ncrucieaz o form homozigot recesiv aa cu o form heterozigot Aa. ntr-adevr, n experiena lui C. Correns, cu plante din genul Mirabilis sau obinut urmtoarele rezultate: Mirabilis jalapa cu flori albe ncruciat cu Mirabilis jalapa cu flori roii au dat n F1 plante cu flori de culoare roz, care posed cuplul de gene Aa. Aceste plante produc la rndul lor gamei de tipul A i
166

a, n mod egal pentru ambele sexe. n F2 se obin indivizi homozigoi pentru culoarea roie i alb i indivizi heterozigoi pentru culoarea roz n proporie de 1 AA : 2 Aa: 1 aa. La ncruciarea dintre indivizii heterozigoi Aa din F2 cu indivizii homozigoi aa se obin 50% plante cu flori roze i 50% plante cu flori albe. Segregarea se face deci dup raportul de 1 Aa : 1 aa. Conform legilor mendeliene, genele A i a trebuie s se afle n aceeai pereche de cromozomi, pentru ca s aib loc o astfel de segregare. Prin analogie, s-a dedus c i la segregarea indivizilor dup sex, unul este heterogametic, iar altul homogametic. Cercetrile lui C. Correns (1907) cu plante din genul Brionia i ale lui D. Dankaster (1906) cu fluturele Abraxas grossulariata au confirmat aceast presupunere. La sfritul secolului trecut, cercetndu-se meioza la unele insecte, s-a constatat c exist o distribuire neuniform a cromozomilor (spermatozoizii aveau un numr inegal de cromozomi). Aceast repartiie inegal a substanei cromatice n unele celule germinale a fost sesizat de Henking (1891), Mac Clung (1901), Castle (1903) i Wilson (1905-1940). Ei i-au exprimat totodat prerea c cromozomul impar, deosebit ca form i mrime, este implicat n determinarea sexelor. Repartiia inegal a substanei cromatice duce la stabilirea raportului de 1:1 ntre sexe, iar mecanismul de distribuire inegal a cromozomilor este o problem ereditar. Din cauza distribuirii inegale a cromozomilor, n meioz nu toi au pereche sinaptic. Cromozomul unic migreaz singur la unul din polii celulei fr ca la cellalt pol s mearg omologul su. Din aceast cauz se nasc celule sexuale cu un numr par sau impar de cromozomi. Cromozomii sexului pot alctui n celulele somatice perechi n care unul s fie diferit sau la fel cu cellalt: la Drosophila unul este drept, iar cellalt puin curbat. Cromozomii normali au fost notai cu litera X, iar cei curbai cu Y (figura 8.1).
Fig. 8.1. Cariotipul la Drosophila melanogaster pentru ambele sexe

Sexul care are cei doi cromozomi sexuali identici s-a notat cu XX, iar cellalt, la care ei sunt inegali, cu XY sau XO cnd Y lipsete. n procesul de gametogenez sexul XX formeaz un singur tip de gamei (cu cromozomul X) i este denumit sex homogametic, iar sexul XY sau XO formeaz dou tipuri de gamei (cu cromozomul X sau Y sau cu cromozomul X i fr cromozomul sexual Y) i este denumit heterogametic. Se cunosc dou tipuri principale de determinare cromozomic a sexelor: tipul Drosophila i tipul Abraxas. Tipul Drosophila. Aa cum arat i numele, acest tip cromozomic de determinare a sexului a fost studiat mai nti la Drosophila. El se ntlnete ns i la alte insecte, viermi, molute, echinoderme, peti, batracieni, mamifere i la unele plante.
167

La organismele ce se ncadreaz n acest tip de determinare a sexului, cnd are loc reducerea cromatic n timpul maturaiei celulelor sexuale, toate ovulele primesc un cromozom X, pe cnd spermatozoizii, 50% primesc cromozomul X, iar 50% cromozomul Y. Oul ce va rezulta din fecundare cu un spermatozoid ce posed cromozomul X va fi femel (XX), pe cnd din ovulul fecundat de un spermatozoid cu cromozomul Y va rezulta un mascul (XY). Schematic, aceasta se poate reprezenta n felul urmtor: XX X XY P1 Gamei X X i Y XX i XY F1 Tipul Drosophila cuprinde trei subtipuri: - Subtipul Lygaeus, la care femela posed doi cromozomi XX, iar masculul, unul X i altul Y. Este de fapt tipul clasic, cunoscut sub numele de tipul Drosophila; - Subtipul Protenor, la care femela posed cei doi cromozomi XX, iar masculul un singur X. Se ntlnete la ortoptere, miriapode, la viermii nematozi .a.; - Subtipul Ascaris, la care femelele posed doi cromozomi XX, iar masculii un singur X care nu este independent ci ataat autozomilor. Tipul Abraxas - numele vine de la genul de fluturi la care s-a descoperit i studiat acest tip de determinare a sexului. n acest caz, sexul femel este heterogametic XY, iar cel mascul homogametic XX. Femelele (XY) formeaz ovule cu X i ovule cu Y, n timp ce masculii un singur fel de spermatozoizi care primesc cte un cromozom X. Dup cum spermatozoidul, care posed un cromozom X, va ntlni un ovul cu X sau Y va lua natere un mascul (XX) sau o femel (XY). Determinarea schematic a sexului se poate nota astfel: XY X XX P1 Gamei X i Y X XY i XX F1 Tipul Abraxas cuprinde i el dou subtipuri: - Subtipul clasic descris mai sus, la care femelele sunt heterogametice XY i masculii homogametici XX; - Subtipul deficiens la sexul femel lipsete cromozomul Y i rmne un singur X; masculii posed cromozomii XX; Acest tip de determinare al sexului l ntlnim la psri, fluturi, frag .a. i este mult mai rar dect primul. Se mai numete i tipul pasre. Aceste dou tipuri de determinare cromozomic a sexului au fost studiate mai bine. n afar de ele au mai fost descrise i alte tipuri ntlnite mai rar. Astfel, la unele insecte au fost descrise pn n prezent un numr mare de subtipuri.

8.3. SEXUL N CAZUL NMULIRII PARTENOGENETICE

S-a artat anterior ce se nelege prin partenogenez: dezvoltarea din ovul a unui individ, fr o fecundare prealabil. S-a artat, de asemenea, c la
168

albin, din ovulele nefecundate rezult masculi, iar din cele fecundate regine (mtci) i albine lucrtoare. Determinarea sexului n cazul de fa se face prin ntreaga serie de cromozomi autozomi: n = , 2n = . n procesul de formare a celulelor sexuale, reducerea numrului de cromozomi se face numai la femele, de la 32 la 16. Pentru partenogenez, determinarea sexului pentru femele s-a numit diplogenotipic, iar pentru masculi haplogenotipic.

8.4. DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI LA PLANTE

Majoritatea plantelor superioare sunt hermafrodite, iar formarea elementelor sexuale este dictat de genele care se gsesc pe cromozomii autozomi. La Zea mays, plant tipic unisexuat monoic, s-au identificat mai multe gene care determin sexul. W. R. Singleton i D. F. Jones (1930) au identificat gena ms1 situat pe cromozomul 6, ce determin androsterilitatea. Studiile ulterioare de genetic a porumbului au avut ca rezultat descoperirea altor gene implicate n determinarea sexului: - gena normal Ts determin formarea paniculului normal n timp ce gena recesiv mutant ts n stare homozigot (tsts), inhib formarea florilor mascule, paniculul transformndu-se ntr-o inflorescen cu flori femele; - gena Sk, controleaz formarea pistilului, alela sk n stare homozigot (sksk) inhib formarea acestuia; - gena Ba rspunde de formarea tiuletelui, iar alela sa, ba, n stare homozigot (baba) supreseaz formarea tiuletelui. Prin combinarea acestor gene pot rezulta o serie de genotipuri i fenotipuri, unele avnd importan deosebit n procesul de ameliorare a porumbului. De exemplu, genotipul Ts2ts2sksk produce plant mascul cu panicul normal, tiulete steril, fr pistile; genotipul Ts2Ts2baba, plant mascul cu panicul normal dar fr tiulete; ts2ts2sksk, plant femel cu pistile n panicul i tiulete fr pistile; ts2ts2baba plant femel cu pistile n panicul i fr tiulete. Dioicizarea plantelor monoice poate avea o importan teoretic i practic deosebit. La plantele dioice ns, mecanismul care asigur determinarea sexelor, separate pe indivizi, deosebii, este asemntor animalelor. La baza acestuia st prezena cromozomilor sexului, descoperii pentru prima dat de C. E. Allen (1917) la specia de muchi dioic Sphaerocarpus donelli. Indivizii femeli posed n celulele somatice 14 cromozomi autozomi i cromozomii sexului XX, n timp ce masculii 14 cromozomi autozomi i cromozomii sexului XY. Mai trziu, cromozomii sexului au fost pui n eviden i la plantele superioare, cum sunt: Melandrium album, Humulus lupulus, Elodea gigantea, Rumex acetosella .a. n ceea ce privete repartizarea cromozomilor sexului la cele dou sexe, plantele se pot clasifica n mai multe categorii. Dup Westergaard (1958) mecanismele determinrii sexelor se pot ncadra n urmtoarele tipuri:
169

- Plante cu sexul mascul heterogametic (XY) i sexul femel homogametic (XX), situaie ntlnit la tipul Drosophila. Din acest tip fac parte specii ca: Melandrium album, Cannabis sativa, Humulus lupulus .a.; - Plante cu sexul mascul heterogametic (XO) i sexul femel homogametic (XX) ntlnit la speciile Discorea sinuata, Vallisneria spiralis .a.; - Plante cu sexul mascul heterogametic, cu un cromozom n plus fa de cel femel, ntlnit la speciile Phoradendron villosum, Phoradendron flavescens .a.; - Plante cu sexul femel heterogametic (XY) i sexul mascul homogametic (XX) aparinnd speciei Fragaria elatior. - Plante cu sexul mascul heterogametic i sexul femel homogametic cu un cromozom sexual compus din mai muli cromozomi legai sub form de lan cu formula XY1Y2 i XX, ntlnit la speciile Humulus japonicus, Rumex hastatulus .a.. Fa de cele artate mai sus, trebuie menionat c unisexualitatea plantelor superioare nu este absolut. O analiz n acest sens a fost fcut de C. Correns (1907) folosind dou specii de Bryonia: B. dioica cu sexul femel XX i sexul mascul XY i B. alba, hermafrodit, cu formula XX. Din ncruciarea intraspecific a plantelor femele de Bryonia dioica cu plantele mascule de Bryonia dioica a obinut raportul de 1:1 (plante femele : plante mascule). Aceasta a dus la concluzia c la Bryonia dioica un sex este homogametic i altul heterogametic. ncrucind Bryonia alba (hermafrodit) ca form matern cu Bryonia dioica, ca form patern, a obinut n descenden plante dioice n raport de 50% plante femele i 50% plante mascule. Din ncruciarea invers, folosind Bryonia dioica ca form matern i Bryonia alba ca form patern, au rezultat aproape exclusiv numai plante femele. Rezultatele acestor ncruciri demonstreaz c la Bryonia dioica sexul femel este homogametic, iar cel mascul heterogametic. Spre deosebire de animale, i n special la animalele superioare, unde exist o strict determinare a sexelor, la plantele superioare exist specii dioice la care raportul de segregare ntre sexe variaz n limite relativ mari. Aa de exemplu, la Humulus japonicus sau la Humulus lupulus predomin indivizii femeli. La cnep, n anumite condiii, apare fenomenul de dubl sexualitate. Raportul dintre sexe poate fi favorabil unuia sau altuia dintre ele. Analizndu-se inflorescenele la cnep s-a constatat c plantele mascule pot forma i flori femele sau diferite forme tranzitorii ntre cele dou sexe.

8.5. DETERMINISMUL GENETIC AL SEXULUI LA ORGANISMELE INFERIOARE

Organismele inferioare, vegetale sau animale, sunt supuse unor mecanisme diferite de determinare a sexelor, fie subordonate reproducerii sexuate sau asexuate, fie ambelor. Ca urmare, exist diverse tipuri de sexualitate, ceea ce atest faptul c la aceste organisme mecanismul este mai puin specializat.
170

La Paramecium aurelia coexist reproducerea asexuat cu cea sexuat. Conjugarea are loc prin formarea unei puni de citoplasm ntre doi parameci, prin care se face schimbul de nuclei. La Paramecium bursaria exist mai multe tipuri care se pot ncrucia ntre ele prin conjugare, sexualitatea n cazul de fa fiind numit sexualitate multipl. La alga Chlamydomonas eugametos, ntre gameii care sunt morfologic identici, exist diferene din punct de vedere sexual. Aceste diferene sunt determinate de substana chimic dimetilcrocetina, care are izomeri n diferite concentraii. Aceste concentraii duc la formarea a opt tipuri de gamei care se pot fecunda ntre ei, fenomen numit sexualitate relativ. Tot la genul Chlamydomonas exist i specii la care gameii sunt difereniai morfologic, cei masculi mobili i cei femeli imobili. La plantele i animalele inferioare exist o ntreag gam de forme de sexualitate cu diferite forme de tranziie ntre nmulirea sexuat i asexuat. La bacterii, fenomenul de conjugare care are loc ntre indivizi "masculi" notai cu F+ i indivizii femele notate cu F-, F reprezint factorul de fertilitate i pentru conjugare trebuie s fie prezent n mod obligatoriu n celulele mascule. Cromozomii sexului pot ndeplini urmtoarele funcii genetice: - cromozomul X poate avea gene care se gsesc localizate numai n zonele heterologe i care nu conjug cu cromozomul Y. Aceste gene pot fi considerate total nlnuite cu sexul. - cromozomul Y posed gene care sunt localizate numai n poriunile sale heterologe i care nu conjug cu cromozomul X. Aceste gene sunt total nlnuite cu sexul mascul i se numesc holandrice, motenindu-se numai pe linie mascul. - cromozomii X i Y pot avea gene care se gsesc localizate n zonele lor omogene, zone care pot realiza sinapsa cromozomic putnd fi parial nlnuite cu sexul.

8.6. TEORIA CANTITATIV A DETERMINRII SEXULUI

Cercetrile au artat c n determinarea sexului un rol important l pot avea i autozomii. C. B. Bridges (1925) a descoperit ntmpltor o femel triploid de Drosophila melanogaster. ncrucind-o cu un mascul normal obine n descenden o gam de indivizi cu diferite raporturi ntre numrul de autozomi (A) i heterozomi (X). n tabelul 8.1. sunt redate aceste rezultate. Analiznd acest tabel, se constat lipsa de importan a cromozomului Y n determinarea sexului la Drosophila melanogaster i faptul c raportul X/A constituie factorul ce determin sexul. Femelele sunt determinate de raportul 1,0 iar masculii de raportul 0,5. ntre raportul de 1,0 i 0,5 apar intersexe (indivizi cu caractere de mascul i femel). Valorile mai mici de 0,5 (0,33) determin apariia supermasculilor, iar raportul mai mare (1,5), apariia superfemelelor (indivizi cu organele de reproducere foarte dezvoltate). Concluzia care se poate trage din aceste cercetri este c la Drosophila melanogaster sexul este determinat de raportul dintre cromozomii sexului X i autozomi.
171

Tabelul 8.1. Raportul X/A la Drosophila melanogaster i determinarea sexului

Sexul Superfemel Femel Femel Femel Femel Intersex Intersex Intersex Mascul Mascul Mascul Mascul Supermascul Cromozomi sexuali XXX XX XXY XXX XXXX XXX XX XXY X XY XYY XX X Cromozomi autozomi 2A 2A 2A 3A 4A 4A 3A 3A 2A 2A 2A 4A 3A Raportul X/A 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 0,75 0,67 0,67 0,5 0,5 0,5 0,5 0,33

La Melandrium album, specie dioic, raportul dintre cromozomii X i Y are importan pentru determinarea sexului. Plantele femele au formula 22A + XX, iar cele mascule 22A + XY. n cazul de fa, genele pentru determinarea sexului femel sunt plasate pe cromozomul X, iar cele pentru sexul mascul, pe cromozomul Y. Prin tratarea plantelor de Melandrium album cu colchicin, pentru multiplicarea cromozomilor, s-au obinut diferite tipuri de plante din punct de vedere al sexului. n tabelul 8.2. sunt redate aceste tipuri de plante. Tabelul 8.2. Raportul X/Y la Melandrium album i determinarea sexului
Sexul Femel Mascul Mascul Mascul Masculi ocazionali cu flori i Masculi ocazionali cu flori i Plante i ocazional cu flori i Cromozomi autozomi 2A 2A 2A 3A 4A 4A 2A 3A 4A 4A 3A 4A 4A Cromozomi X XX X X X X XXX XX XX XX XXXX XXX XXX XXXX Cromozomi Y YY Y Y Y YY Y Y Y YY Y Y Y Raportul X/Y 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

3,0 4,0

n cazul de fa, sexul este determinat de prezena cromozomului Y care este aproximativ egal cu patru cromozomi X.
172

8.7. ANOMALII N EREDITATEA SEXULUI 8.7.1. Ginandromorfismul

Prin ginandromorfism se nelege nsumarea unor caractere de mascul i femel la acelai individ. Fenomenul se manifest destul de rar i este sesizabil cnd prinii prezint un pronunat dimorfism sexual. Dup repartiia spaial a caracterelor celor dou sexe, ginandromorfismul se poate clasifica n mai multe tipuri: - lateral, cnd o jumtate lateral a corpului conine nsuirile externe i organele de reproducere ale sexului femel, iar cealalt jumtate, nsuirile externe i organele de reproducere a sexului mascul; - antero-posterior, caracterizat prin aceea c partea anterioar a corpului prezint caracterele unui sex, iar partea posterioar, caracterele celuilalt sex; - mozaicat, pe o mare parte din corp organismul prezint nsuirile unuia dintre sexe, i pe mici poriuni, nsuirile celuilalt sex. Aceast repartizare asimetric poate avea loc n toate prile corpului: cap, aripi, trunchi etc. Ginandromorfismul se ntlnete mai frecvent la Bombyx mori, piigoi, fazani, oareci .a. Poate s apar i n unele ncruciri artificiale la diferite specii. Astfel, din ncruciarea unor masculi de Drosophila cu ochi albi cu femele cu ochi roii poate s apar, n rare cazuri, ginandromorfismul lateral; indivizi ce posed jumtate de corp cu caractere de femel i cu ochiul rou, iar cealalt jumtate de corp cu caractere de mascul i cu ochiul alb (figura 8.2). Cercetrile citologice la aceti indivizi dovedesc c o jumtate de corp posed cromozomii XX, iar cealalt jumtate numai un singur X (XO). De aceea, pe o jumtate de corp se gsesc caractere de femel, iar pe cealalt caractere mascule (prezena unui singur cromozom X produce fenotip de mascul). Repartiia inegal de substan cromatic are loc dup fecundare, n primele faze de diviziune ale oului. Datorit unor condiii deosebite unul din cromozomii sexului X care poart gena culorii roii se pierde n una din celulele fiice. Ca urmare, se nate o celul cu un singur X, iar cea de a doua cu XX. Dac eliminarea unuia dintre cromozomii sexului are loc n una din cele patru celule ale embrionului, atunci numai din corpul femelei va avea caractere de mascul. n procesul de diviziune al oului, cu ct aceast pierdere se produce mai trziu, cu att mai puin va fi neprezentat partea cu caractere mascule.

Fig. 8.2. Ginandromorfismul lateral la Drosophila melanogaster 173

n afar de pierderea cromozomilor sexuali, mai exist i alte cauze ce pot determina apariia ginandromorfismului. Un exemplu a fost descris la fluturele Bombyx mori. Oul poate conine doi pronuclei, unul cu cromozomul X, iar cellalt cu cromozomul Y. Prin fecundarea lor cu spermatozoizi purttori ai cromozomului X, pot rezulta ginandromorfi laterali (XX/XY)

8.7.2. Intersexualismul
Prin intersexualism se nelege repartiia mozaicat a caracterelor sexuale primare, n descendena unor hibrizi. n unele cazuri, variaiunile merg att de departe nct femelele seamn foarte mult cu masculii i invers. La Drosophila se cunosc asemenea forme intersexuale, care sunt triploide. Spre deosebire de ginandromorfism, intersexualismul se caracterizeaz prin nsumarea caracterului mozaicat i nu n mod distinct sau simetric. Ginandromorfii alctuiesc un mozaic sexual dezvoltat n suprafa, caracterele sunt alturate, pe cnd intersexualii alctuiesc mozaicuri sexuale dezvoltate n timp. Organismul i ncepe dezvoltarea avnd caracterele unui sex dominant, dup care, pe parcursul dezvoltrii, i-o continu dobndind caracterul celuilalt sex. Observaiile care s-au acumulat cu privire la cauzele care duc la apariia intersexelor au dus la presupunerea c sexul organismelor poate fi determinat de mai multe gene ce se afl att n cromozomii sexului ct i n autozomi i dezvoltarea lui poate fi influenat de condiiile de mediu. De asemenea, s-a ntrit i ideea c zigotul are o bisexualitate potenial care poate evolua ntr-una din direciile celor dou sexe. Intersexualitatea este explicat prin dou teorii: teoria cantitativ (sau a echilibrului genetic), formulat de C. B. Bridges i teoria fiziologic fundamentat de R. Goldschmidt. Teoria cantitativ a determinrii sexului explic apariia diferitelor forme sexuale la Drosophila. Intersexele se dezvolt atunci cnd raportul X/A are valoare de 0,67, intermediar raporturilor ce duc la formarea de masculi (0,5) i de femele (1,0). Teoria fiziologic a determinrii sexului a fost formulat de R. Goldschmidt. Punctul de plecare a fost ipoteza c organismele, la nceputul dezvoltrii lor, din punct de vedere genetic sunt bisexuate, posednd factorii ambelor sexe: M pentru sexul mascul i F pentru sexul femel. Aceti factori ar aparine unor perechi de cromozomi diferii. Cercetrile n aceast direcie s-au bazat pe unele forme intersexuate obinute n urma unor ncruciri reciproce ntre dou specii de fluturi, ndeprtate geografic: Lymantria dispar (european) i Lymantria japonica (japonez). S-a folosit pe rnd ca mam i ca tat cele dou specii: 1. P1 Lymantria dispar F1 intersexuate raport 1 X :
174

Lymantria japonica normali 1

2. P2 Lymantria japonica X F1 normale raport 1 :

Lymantria dispar normali 1

Rezultatele obinute depind de modul n care cele dou specii sunt folosite ca mam i ca tat. Concluzia este c specia european este considerat slab, iar cea japonica puternic. Aceasta se bazeaz pe faptul c femelele speciei europene cnd sunt ncruciate cu masculii speciei japoneze, n F1 se dezvolt indivizi intersexuai de tip femel.

8.8. EREDITATEA CARACTERELOR LEGATE DE SEX

La hibridri, n general, nu are importan dac un caracter homozigot urmrit se gsete n autozomii mamei sau tatlui. Autozomii nu afecteaz ntr-un anumit mod segregarea caracterelor n descenden. n cazul n care aceste caractere (gene) se gsesc n cromozomii sexului, caracterul ereditii i al segregrii este condiionat de modul de comportare al cromozomilor sexului n meioz i, mai apoi, n procesul fecundrii. Deoarece cromozomul Y este aproape inert nu conine gene genele care se gsesc n cromozomul X nu au pereche alelic. Ca urmare, distribuirea lor este legat de distribuirea acestor cromozomi. Motenirea caracterelor care sunt localizate n cromozomii sexului se mai numete i ereditate legat de sex i ea se comport diferit dup cum organismele se ncadreaz n diferite tipuri de determinare a sexelor: Drosophila sau Abraxas.

8.8.1. Ereditatea legat de sex n cazul heterogamiei sexului mascul (Drosophila)

Pentru a ilustra n ce const la organismele care au sexul mascul heterogametic i sexul femel homogametic, mecanismul de transmitere a caracterelor legate de sex, ne vom folosi de o experien efectuat de Morgan la Drosophila. El ncrucieaz masculi cu ochi albi (o form mutant) cu femele cu ochi roii (de tip slbatic) i obine n prima generaie n proporii egale, masculi i femele cu ochi roii, caracter dominant, culoarea alb fiind recesiv. ncruciai ntre ei, indivizii din F1 produc n F2 o segregare, dup sex, 50% femele i 50% masculi, iar dup caracterul studiat, la 3/4 indivizi cu ochi roii se obine 1/4 masculi cu ochi albi (raportul 3:1). Notnd cu w+ culoarea roie a ochilor, cu w culoarea alb a ochilor, iar cu linii verticale cromozomii sexului, rezultatele sunt redate n urmtoarea schem (figura 8.3 A). Faptul c n aceast experien apar masculi att cu ochi roii ct i cu ochi albi, dovedete c ei sunt heterogametici i formeaz dou tipuri de gamei.
175

S vedem ce se ntmpl cnd se ncrucieaz femelele cu ochi albi, cu masculii cu ochi roii. Segregarea are loc deja n F1, unde se produc toate combinaiile posibile. Raportul ntre sexe pentru culoarea ochilor a fost de 1:1. Prin ncruciarea ntre ei a indivizilor din F1, apar n F2 femele i masculi, 50% cu ochi roii i 50% cu ochi albi (figura 8.3 B). n experienele descrise se poate sesiza c genele care determin culoarea ochilor sunt situate n cromozomii X.

A B Fig. 8.3. Ereditatea caracterelor cuplate cu sexul (culoarea ochilor) n cazul heterogamiei sexului mascul (A-ncruciarea direct; B-ncruciarea reciproc)

Din schemele prezentate reiese c dac femela este homozigot pentru gena dominant a ochilor roii aflat n cromozomul X, atunci culoarea roie a ochilor se transmite n F1 i masculilor. Femelele din F1 primesc cromozomul X cu gena recesiv a culorii albe a ochilor de la tat, iar de la mam al doilea cromozom ce conine gena dominant a culorii roii. Sub influena genei ce produce culoarea roie a ochilor toate femelele au ochii roii. n F2 prin combinarea diferit a gameilor apar combinaiile artate la prima experien. n cazul celei de-a doua experiene (ncruciare reciproc), femelele primesc de la tat un cromozom cu gena dominant a culorii roii a ochilor i de la mam un cromozom cu gena recesiv a culorii albe a ochilor. Din aceast cauz femelele din F1 au ochii roii. Masculii din F1 au ochii albi, deoarece primesc de la tat cromozomul Y care este inert, iar de la mam un cromozom ce conine gena recesiv a culorii albe a ochilor. Gena, dei este recesiv, se exteriorizeaz, nefiind dominat de alela sa. Ea se gsete ntr-o singur doz, stare numit hemizigot. Motenirea caracterelor legate de sex, de la mam la fiu i de la tat la fiic, poart denumirea de criss-cross. Schemele pentru ereditatea culorii
176

ochilor cuplate cu sexul la Drosophila, sunt valabile i pentru alte caractere, i la alte specii, a cror gene sunt situate pe cromozomul X, la organismele la care sexul heterogametic este masculul. Au fost studiate asemenea cazuri la insecte, peti, psri, mamifere. La om se cunosc unele nsuiri cuplate cu sexul: daltonismul, hemofilia .a. Deoarece sexul mascul la om este heterogametic, aceste boli se manifest frecvent la acest sex. S considerm cazul hemofiliei, boal dat de caracterul recesiv (h) situat pe cromozomul X. Femelele normale vor avea caracterul NN (normal), iar masculii hemofili, caracterul h n stare hemizigot.

8.8.2. Ereditatea n cazul nondisjunciei cromozomilor sexului n meioz

n cea de-a doua experien cu Drosophila, cnd s-au ncruciat femelele cu ochi albi cu masculii cu ochi roii raporturile din F2 de 50% femele cu ochi roii i 50% masculi cu ochi albi nu sunt perfecte. n experiena lui C. B. Bridges (1913) la Drosophila, prin ncruciarea dintre femele cu ochi albi i masculi cu ochi roii., el obine: 47,5% ochi roii i 2,5% ochi albi 47,5% ochi albi i 2,5% ochi roii Raportul dintre sexe rmne neschimbat, de 1:1, dar apar unele forme neateptate: 2,5% femele cu ochi albi i 2,5% masculi cu ochi roii. Care este explicaia dat de C.B. Bridges? n timpul meiozei, la unele femele cromozomii X nu se separ. Ca urmare a acestui fenomen se formeaz dou tipuri de gamei: unii cu XX, iar alii fr cromozomii sexului. Nesepararea aceasta a fost denumit de Bridges nondisjuncie primar, iar rezultatul este apariia acelor procente de 2,5% femele cu ochi albi i 2,5% masculi cu ochii roii (figura 8.4.).

Fig. 8.4. Ereditatea caracterelor cuplate cu sexul la Drosophila melanogaster n cazul non-disjunciei cromozomilor x 177

Se constat c cromozomii X de origine patern conin gena pentru culoarea roie a ochilor iar cromozomii X de origine matern gena pentru culoarea alb a ochilor. Se mai constat de asemenea, c indivizii ce conin XXX sau numai Y, mor datorit homozigotrii genelor. Se mai constat c, n cazul de fa, nu numai prezena cromozomului Y este aceea care determin sexul mascul ci i numrul cromozomilor X. n cazul a doi cromozomi X, sexul este femel, n cazul unui singur cromozom X, sexul este mascul i steril. Dac se continu experiena citat mai sus i se ncrucieaz o femel cu ochi albi XXY (obinut prin nondisjuncie primar) cu un mascul cu ochi roii, descendenele din F1, segreg n ceea ce privete sexul i culoarea ochilor, n raport de 1:1. Apar ns i forme neateptate, mascul cu ochi roii, asemenea tatlui i fiice cu ochi albi, asemenea mamei. Femela poate forma gamei n dou moduri: - prin disjuncia celor doi cromozomi XX care duce la formarea unor ovule cu formula XX sau XY, fenomen numit homeosinapsis. - prin segregarea cromozomilor XX sau a cromozomilor XY care duce la formarea a patru tipuri de ovule X, XX, XY sau Y, fenomen numit heterosinapsis. Apariia formelor neateptate se datoreaz, dup Bridges, fenomenului numit de el nondisjuncie secundar.

8.8.3. Ereditatea legat de sex n cazul heterogamiei sexului femel

Este cazul tipului Abraxas, femelele fiind heterogametice (XY) i masculii homogametici (XX). Primii cercettori care s-au ocupat cu aceast problem au fost Dancaster i Rayner. Ei au plecat de la unele observaii asupra fluturelui Abraxas. La acest fluture exist foarte rar n natur o varietate de culoare alb, lacticolor, iar atunci cnd se ntlnete, toi indivizii sunt femele. Mai frecvent, se ntlnete varietatea Abraxas grossulariata de culoare alb-cenuie, cu pete brune. n laborator se pot obine att masculi ct i femele de tipul lacticolor. S-au fcut ncruciri ntre aceste dou varieti urmrind raportul dintre sexe i culoarea corpului n descenden. Rezultatele sunt prezentate schematic n figura 8.5. A. Din experiena de mai sus reiese c grossulariata este dominant, iar lacticolor recesiv. n F1 s-au obinut 50% femele de tip lacticolor i 50% masculi de tip grossulariata, iar prin ncruciare ntre ei s-a obinut n F2 o segregare ntre sexe i culori de 1:1. Se constat totodat, c tipul lacticolor este un caracter linkat cu sexul femel. Dac se ncrucieaz reciproc aceste dou tipuri, se obin rezultatele din figura 8.5. B.
178

Indivizii din F1, de ambele sexe, au fost de tipul grossulariata. ncruciai ntre ei, n F2 raportul de segregare a fost de indivizi de tipul grossulariata i indivizi de tipul lacticolor, numai de sex femel. Caracterul de culoare este cuplat cu sexul femel.

A B Fig. 8.5. Ereditatea caracterelor cuplate cu sexul (culoarea aripilor) la fluturele Abraxas (A-ncruciarea direct; B-ncruciarea reciproc)

Experiene analoge s-au fcut cu rase de gini, ce au culoarea penajului diferit. Peral i Surface ncrucieaz gini negre din rasa Indian-Same cu gini pestrie din rasa Plymouth-Rock; Morgan i Goodale ncrucieaz gini cu penaj negru din rasa Langsham cu gini pestrie din rasa Plymouth-Rock. La ncrucirile dintre femele cu penajul negru cu masculii homozigoi cu penaj pestri (dominant) s-a obinut ntotdeauna generaia F1 cu penaj pestri. Din ncrucirile lor cu printele cu caracter recesiv (culoare neagr) se obine raportul de segregare de 50% gini cu penaj negru i 50% cocoi cu penaj pestri. De aici se observ c femelele pestrie sunt heterozigote i formeaz dou tipuri de ovule (ca la Abraxas), att pentru caracterul culoare, ct i pentru sex. Masculii sunt homozigoi pentru ambele caractere. Importana practic a ereditii legate de sex. Problema ereditii legat de sex prezint importan pentru practic, deoarece caracterele cuplate cu sexul pot s ne dea indicaii privind separarea indivizilor dup sex, la o vrst tnr. Trebuie ns bine precizat mecanismul corelaiilor dintre sex i caracter, la specia unde vrem s aplicm asemenea procedee. n avicultur se folosete procedeul separrii celor dou sexe dup unele caractere exterioare ale puilor de gin abia eclozai. La fluturele Bombyx mori, se pot separa cele dou sexe chiar din stadiul de ou, dup culoarea lui.

179

8.9. CARACTERELE INFLUENATE DE SEX

Caracterele influenate de sex sunt caractere determinate de gene prezente la ambele sexe, dar care se manifest n funcie de sex. La oi i capre, dimorfismul sexual se manifest i prin prezena coarnelor la masculi i absena lor la femele. Rasa de oi Dorset prezint coarne att la masculi ct i la femele; n schimb la rasa de oi Suffolk, ambele sexe sunt fr coarne. S-a considerat c rasa Dorset posed o gen dominant C, n timp ce rasa Suffolk deine gena recesiv c. Din ncruciarea celor dou rase CC x cc, la indivizii din prima generaie, masculii au coarne, iar femelele nu. Prin ncruciarea ntre ei a heterozigoilor din prima generaie, se obin n F2 att masculi ct i femele cu coarne i fr coarne i anume: masculi cu coarne (25% CC + 50% Cc) i fr coarne (25% cc) i femele cu coarne (25% CC) i fr coarne (50% Cc + 25% cc). Din analiza acestor ncruciri se poate trage concluzia c gena C se manifest n mod diferit la mascul i femel: la masculi ea este dominant, iar la femele recesiv. Aceast constatare reiese din faptul c heterozigoii Cc din F1, toi cu aceeai formul genetic, formeaz coarne numai la mascul. Gena C este influenat n aciunea ei de hormonii secretai de glandele sexuale. Masculii heterozigoi castrai nu au coarne.

8.10. CARACTERELE LIMITATE DE SEX

Unele trsturi care determin dimorfismul sexual pot s se manifeste numai la unul dintre sexe. Fenomenul poart numele de sex-limitare. De exemplu, producia de lapte sau de ou privete numai sexul femel. Dei aceste caractere se manifest numai la un sex, ele sunt purtate i transmise de ambele sexe. Producia de lapte este o nsuire ereditar pe care o transmite i taurul provenit din vaci cu producie mare de lapte. Aceste caractere i nsuiri se realizeaz prin genele situate pe cromozomii autozomi, dar se manifest numai la un sex.

8.11. INVERSIUNEA SEXULUI

Prin inversiunea sexului se nelege schimbarea sexului n cursul ontogeniei. Aceasta este o confirmare n plus asupra strii de bisexualitate a organismului n primele stadii de dezvoltare. Cazuri de inversiune sexual se ntlnesc att n lumea plantelor ct i a animalelor. Ele pot fi naturale ct i artificiale, iar cauzele pot fi multiple: condiiile de via (n special hrana), activitatea hormonal (legat de sex), vrsta .a. Spre btrnee sexele tind s capete unele caractere ale sexului opus. Femelele de fazan nceteaz a mai oua, penajul are caracterele masculului. Sunt peti care la tineree sunt masculi, iar la btrnee produc icre. Petele sabie (Xiphophorus crescut n acvarii) are dimorfismul sexual distinct: masculul are o
180

prelungire a nottoarei codale n form de sabie, care la femel lipsete. Uneori femelele btrne se transform n masculi i le crete aripa codal n form de sabie. Unii batracieni, imediat dup metamorfoz sunt femele, iar mai trziu, la unele, ovarul se transform n testicule, devenind masculi. S-a vorbit mai nainte de un caz evident de dimorfism sexual, la viermele marin Bonellia viridis. Baltzer a studiat ndeaproape viaa acestui vierme. El triete n Mediterana, pe fundul apei, printre pietre. Masculii triesc ca parazii n esofagul i oviductul femelei. Cnd larvele acestui vierme triesc libere n ap, ele devin femele. Dac ele se fixeaz pe trompa unei femele adulte, n timp de cteva zile se transform n masculi. n cazul fixrii, ele primesc de la femel substane chimice capabile s diferenieze larvele n masculi. Aceasta a dovedit-o W. Nowinski (1934), innd larvele de Bonellia viridis libere, n extract de tromp sau intestin de femel. Ele au devenit masculi. Fenomenul de inversiune poate apare la gemenii uterini, la animale care nasc de obicei un singur pui. Cercetrile pe care le face F. R. Lillie (1916) la taurine au artat c n cazul gemenilor uterini de sexe diferite, sexul mascul este normal, iar cel femel este steril. Femelele capt tuburi seminale sterile i n plus i canale deferente proprii organelor de reproducere a masculilor. Restul organelor genitale propriu-zise mpreun cu glandele mamare sunt normale. Aceste rudimente ale sexului mascul exist n mod normal la femele, dar ele nu se dezvolt cnd exist o sarcin cu un singur embrion. n cazul gemenilor uterini de sexe opuse, dezvoltarea embrionar a masculului decurge mai repede. Prin sistemul vascular ce leag cei doi gemeni, secreiile hormonale ale masculului stimuleaz dezvoltarea rudimentelor de la organul genital mascul i oprete n acelai timp dezvoltarea unor pri ale organului genital propriu. Cazurile de inversiune sexual se ntlnesc rar n natur, ceva mai frecvent la organismele inferioare. Experimental ele se pot obine, dar nu n toate cazurile. De multe ori, dup ncetarea aciunii factorului pentru inversarea sexului, organismul revine la sexul iniial. Inversiunea sexului poate s aib loc i la plante. S-au fcut unele cercetri cu hormoni vegetali din grupa auxinelor sau chiar cu hormoni animali. V. Preda (1968) i C. Panfil (1972) au reuit s feminizeze plantele de porumb, care produceau fructe n inflorescena mascul, prin tratarea plantelor cu hormon animal gonadotrop corial.

8.12. RAPORTUL DINTRE SEXE

n general, n natur, raportul dintre sexe este de 1:1. Segregarea dup sex este asigurat de mecanismul cromozomic de determinare a sexului i se mai numete i raport primar. Acest raport poate fi schimbat ntr-o msur mai mare sau mai mic n timpul ontogeniei, datorit influenei mai multor factori, numindu-se raport secundar. n general, raportul secundar se schimb mai frecvent n favoarea sexului femel, care este mai dotat cu caliti de rezisten fa de condiiile nefavorabile de via.
181

Dup datele statistice ale populaiei umane, n diferite ri s-a constatat c raportul ntre femei i brbai scade n favoarea femeilor pe msur ce crete vrsta: la vrsta colar 103/100, la pubertate 100/100, la 50 de ani 100/85, iar la 85 de ani 100/50. Cauzele sunt att biologice ct i sociale. La unele specii de Drosophila s-au descoperit femele monosexuate, care dau n descenden numai femele. Monosexualitatea n cazul de fa se datoreaz incompatibilitii dintre citoplasma ovulelor i genele cromozomului Y. Mor astfel 50% dintre zigoii de sex masculin. Schimbarea raportului ntre sexe poate s survin i n cazul cnd apar, prin mutaii, gene letale n cromozomii sexului. Aceste mutaii sunt legate de sex i au permis elaborarea unor metode de detectare a mutaiilor. n problema determinrii sexelor s-au obinut unele rezultate i la plante. A. A. Avachian constat c unele soiuri de pepene galben, cultivat n condiii de zi lung, formeaz numai flori brbteti, florile femeieti se scutur i se usuc. De asemenea, el constat c dac porumbul imediat dup ce a rsrit este pus n condiii de zi scurt, formeaz inflorescene femele n locul celor mascule. Alte experiene au artat c numrul de flori femele poate fi mrit la castravei prin afumarea plantelor sau tratarea lor cu oxid de carbon. La noi n ar, P. Raicu i T. Crciun au fcut observaii privitoare la modificarea inflorescenei de porumb n raport cu intensitatea luminozitii. V. Preda i A. Ghia au efectuat experiene de dirijarea sexului la Urtica dioica prin administrarea de hormon gonadotrop corial. S-a mrit procentul de plante cu inflorescene femele. Schimbarea raportului dintre sexe nu se bazeaz pe schimbarea mecanismului cromozomic sau a genelor care rspund de determinarea sexului. Factorii interni sau externi despre care s-a vorbit modific raportul, favoriznd ntr-un anumit mod ntlnirea lor n momentul fecundrii. n cazul n care cromozomii sexuali lipsesc, influena factorilor interni sau externi se manifest asupra anumitor gene de pe autozomi, care intervin n determinarea sexului.

182

CAPITOLUL 9 EREDITATEA EXTRANUCLEAR

Moto: "Oul fecundat este cea mai specializat celul de sub soare. Ea conine toat informaia necesar pentru a produce viaa uman Jerme Lejeune

nc din secolul XIX, cercetrile au artat c alturi de nucleu i citoplasma prezint un rol important n transmiterea caracterelor ereditare. O serie de geneticieni ca: E. Baur i C. Correns (1909), A. Winkler (1934), E. Wettstein (1937), J. M. Sirks (1938), T. M. Sonneborn (1950), P. Michaelis (1954), R. Hagemann (1959) .a. au ntreprins cercetri n acest domeniu, evideniind multe aspecte legate de ereditatea citoplasmatic sau extranuclear. Prin fenomenul de ereditate extranuclear se nelege motenirea caracterelor i nsuirilor organismului prin elementele citoplasmatice. Pentru a pune n eviden rolul citoplasmei n ereditate, trebuie s artm ce structuri posed aceste nsuiri, dac au sau nu proprietatea de a se reproduce, de a se modifica i transmite aceste modificri la generaia urmtoare i care sunt metodele de cercetare. S-a artat ntr-un capitol anterior, c n citoplasma celulei se gsesc diferite structuri care au rol genetic, fr a analiza n ce const acest rol i cum poate fi pus n eviden. Vom cuta s lmurim aceste probleme n capitolul de fa.

9.1. METODE DE EVIDENIERE A EREDITII EXTRANUCLEARE

Ereditatea extranuclear se evideniaz prin mai multe metode: - fecundarea unui ovul anucleat de la o specie, cu un spermatozoid de la alt specie (merogonie); - hibridarea reciproc; - prin intermediul incluziunilor i organitelor citoplasmatice; - testul heterocarion; - segregarea nemendelian;

183

9.1.1. Fenomenul merogoniei

Prin merogonie se nelege formarea unui embrion prin fecundarea unui ovul anucleat cu un spermatozoid normal. Din fecundarea unui ovul anucleat cu un nucleu strin, rezult un zigot haploid, deoarece posed nucleul patern, haploid i citoplasm matern. n astfel de cazuri, nu se obin organisme mature deoarece zigoii, din cauza perturbrii raportului dintre nucleu i citoplasm, mor ntr-un stadiu timpuriu. Primele indicaii asupra existenei acestui fenomen au fost experienele embriologului T. Boveri (1899). El a folosit ovule de arici de mare pe care le-a centrifugat puternic, astfel nct membrana lor s-a rupt, nucleul fiind expulzat. Aceste ovule anucleate au fost fecundate cu spermatozoizi de la o specie nrudit crinul de mare. Larvele obinute erau haploide i conineau pe lng caracterele tatlui i caracterele materne, transmise prin intermediul citoplasmei ovulului. n afar de metoda centrifugrii, nucleii din ovul pot fi ndeprtai i cu ajutorul micromanipulatorului, prin operaii de microdisecie, sau cu ajutorul unei micropipete, prin aspirare. O alt metod folosit este distrugerea nucleilor din celul cu ajutorul ocurilor de temperatur, a radiaiilor ionizante, a razelor ultraviolete sau a unor substane chimice. Folosind unele din aceste metode I. Danielli i colab. (1957) au nlocuit nucleii de la Amoeba discoides, cu nucleii de la Amoeba proteus. Nucleii transplantai au suferit influena citoplasmei strine, modificndu-i forma n sensul nucleilor de la Amoeba discoides. Cercetri interesante de acest gen s-au efectuat i cu specii din genul Triton (Triton palmatus i Triton cristatus) de ctre Paula Hertwig (1936, 1942), V. Curry (1931) .a., n care nucleii din ovule au fost distrui prin iradiere. Ereditatea citoplasmatic a fost pus n eviden la embrionii provenii prin fecundarea acestor ovule cu nucleii de la alt specie. Embrionii ns se dezvoltau numai pn n faza de blastul, apoi mureau. Elveianul E. Hadorn (1955) a reuit s nlture acest neajuns procednd n felul urmtor: fecundeaz ovule anucleate de Triton palmatus cu spermatozoizi de la specia Triton cristatus. Din embrionii rezultai a desprins o poriune de epiderm i a transplantat-o pe embrionii speciei Triton alpestris. Indivizii rezultai aveau poriunea de epiderm transplantat asemntoare ca aspect i culoare cu cea de la Triton palmatus. Citoplasma ovulului de Triton palmatus i-a imprimat deci caracterele epidermei transplantate, la embrionul nou format.

9.1.2. Ereditatea extranuclear n hibridarea reciproc

n ncrucirile formelor ndeprtate (interspecifice i intergenerice), apare foarte frecvent fenomenul de matroclinie, prin care se nelege transmiterea evident a unor caractere materne. De aceea, la astfel de hibridri nu este indiferent care dintre cele dou specii constituie forma matern sau patern.
184

Practica a demonstrat c la hibridarea dintre Equus caballus i Equus asinus se obin hibrizi a cror mrime i constituie este asemntoare formei materne. Din hibridarea dintre Equus caballus i Equus asinus rezult catrul (Equus mullus), de mrimea i conformaia lui Equus caballus, iar din hibridarea dintre Equus asinus i Equus caballus rezult bardoul (Equus hinnus) de mrimea i conformaia lui Equus asinus. Cei doi hibrizi se deosebesc foarte mult ca mrime, culoare, for .a., dei, n celulele somatice au acelai numr de cromozomi, (2n = 63).

9.1.3. Testul heterocarion

Prin heterocarion se nelege o celul n care, pe lng nucleul propriu, mai exist inclus un nucleu strin. n urma includerii unui nucleu strin se formeaz un dicarion, o celul cu doi nuclei. Fenomenul a fost pus n eviden la ciupercile inferioare, care se nmulesc asexuat. Realizri n aceast direcie au fost obinute de ctre R.E. Wright i J. Lederberg (1957) la drojdia de bere, Saccharomyces cerevisiae. Dac notm, la o prim celul nucleul cu A i citoplasma cu , iar la a doua celul nucleul cu B i citoplasma cu , dicarionul, format prin transferul nucleului B n celula va deveni AB. n descendena acestuia vor rezulta celulele cu A i B . Cu aceast ocazie se constat c celulele B manifest caracteristici ale celulei A. Rezult c, aceste caracteristici sunt transmise prin citoplasma i nu de nucleu (figura 9.1).

Fig. 9.1. Schema formrii celulelor heterocarion

9.1.4. Segregarea nemendelian

Exist la drojdia de bere, Saccharomyces cerevisiae, o mutant determinat de o gen recesiv homozigot petite i care determin formarea unor colonii mici autosterile. Prin fuzionarea unor celule haploide mutante cu celule haploide normale se formeaz celule heterocarion, fertile, ce se nmulesc prin nmugurire i formeaz colonii normale. n anumite condiii celulele haploide mutante i normale pot fuziona pe cale sexuat dnd natere unei asce cu patru ascospori haploizi, doi cu gene normale i doi cu gene mutante. Cu toate acestea, toi cei patru ascospori, prin nmulire sexuat, au dat natere la colonii normale. Lipsa de segregare care ar fi trebuit s se produc n raport de 1:1 dovedete c expresia fenotipic a celor patru ascospori este de natur citoplasmatic.
185

Tot la drojdia de bere B. Ephrussi, H. Hottingner i H. Roman (1955) au studiat o alt mutant denumit suppressive petite. Din fuzionarea unei celule mutante cu o celul normal s-au obinut n descenden asce cu ascospori normali i mutani n proporie egal, dei ambele conin acelai genotip. Aceasta dovedete c segregarea nemendelian a fost influenat de ctre citoplasm. Segregarea somatic se manifest n cazul nmulirii vegetative i se explic prin distribuirea inegal a structurilor citoplasmatice implicate n determinarea unor caractere. Aceast situaie imprim la organisme un aspect de pestri sau vrgat. Un exemplu ni-l ofer segregarea plastidelor n cazul plantei Mirabilis jalapa var. albomaculatus la care, plante pestrie conin plastide verzi i albe. Acestea se repartizeaz prin mitoz n mod ntmpltor n citoplasma celulelor fiice. Cnd din astfel de celule se formeaz celulele mam ale megasporilor i n continuare celule sexuale, acestea vor conine proplastide verzi, albe sau de ambele tipuri. n urma fecundrii se vor dezvolta plante verzi, albe sau pestrie.

9.2. MANIFESTAREA EREDITII EXTRANUCLEARE

Tipurile de manifestare a ereditii extranucleare mbrac diferite forme i ele depind de structurile din citoplasm care poart i transmit anumite caractere.

9.2.1. Ereditatea prin plastide

Primii cercettori care au pus n eviden ereditatea prin plastide au fost C. Correns (1909) i E. Baur (1910). E. Baur a studiat ereditatea culorilor mozaicate, la Pelargonium zonale. Aceast plant posed frunze pestrie (alb-glbui cu verde). Observnd la microscop seciuni din aceste frunze, se constat existena unor grupe de celule cu plastide necolorate n epiderma i sub epiderma frunzei, n timp ce n partea central a ei se gsesc plastide verzi (cloroplaste). La aceast plant pot s apar, uneori, att ramuri cu frunzele pestrie, ct i ramuri cu frunze verzi sau albe. Executnd hibridri ntre flori de pe ramuri cu frunze diferite, el obine semine care produc n majoritatea cazurilor plante ce au caracterele frunzelor de la forma mam. Aceste ncruciri ne arat c transmiterea cloroplastelor la urmai se realizeaz prin citoplasma celulei ou i ntr-o mic msur de ctre spermatie, care are o cantitate mic de citoplasm. C. Correns, descrie un caz de ereditate citoplasmatic la Mirabilis jalapa. Aceast plant are ramuri cu frunze verzi, albe i mozaicate. El a efectuat polenizarea florilor de pe ramurile verzi, albe i pestrie, cu polenul de la florile acestor trei tipuri. Plantele pe care le-a obinut din semine au avut caracterul mamei n ceea ce privete culoarea frunzelor. Fenomene asemntoare au fost observate la Anthirrinum sp., Plantago sp., Humulus sp. .a.
186

O dovad cert c ntr-adevr cloroplastele se transmit numai pe cale citoplasmatic este faptul c ele posed un mecanism de autoreproducere i continuitate celular. Plantele la care au fost distruse plastidele dau urmai fr plastide, nefiind capabile de a le sintetiza de novo.

9.2.2. Ereditatea prin intermediul incluziunilor citoplasmatice

n afar de mitocondrii sau plastide, prin citoplasm se transmit i particule submicroscopice ce au proprietatea de a se reproduce odat cu diviziunea celulei. Aceste particule nu sunt deocamdat elemente separabile ale celulei vii, dar pot fi responsabile pentru transmiterea unor nsuiri pe linie matern. Un exemplu de acest fel este transmiterea din generaie n generaie a sensibilitii Drosophilei la CO2. Cercettorul francez Ph. L'Hritier i colaboratorii (1937), au descoperit linii de Drosophila sensibile la CO2. De obicei, Drosophila care triete n atmosfera de CO2 rezultat n urma fermentaiilor (de fructe, struguri etc.) este rezistent la acest gaz. Pentru a verifica ipoteza c sensibilitatea la CO2 se transmite prin citoplasm, autorii au nlocuit cromozomii de la aceste linii cu cromozomii normali de la mutele normale. Pentru aceasta, au efectuat ncruciri ntre femelele sensibile la CO2, cu masculi rezisteni la CO2. Au realizat indivizi sensibili la CO2. n cazul cnd s-au ncruciat masculi sensibili la CO2 cu femele rezistente la CO2 au realizat indivizi normali. Femelele hibride sensibile la CO2 au fost din nou ncruciate cu masculi normali. Descendenii femeli au fost din nou ncruciai cu masculi normali. Dup mai multe retroncruciri au rezultat forme materne cu nucleul de la forma patern. Cu toate acestea, descendenele prezentau sensibilitate la CO2. nsuirea de sensibilitate la CO2 s-a transmis prin citoplasm. Concluzia acesta a fost verificat prin metoda injectrii de hemoglobin de la Drosophila sensibil la CO2 la femelele de Drosophila normale. Acestea au produs indivizi sensibili la CO2. Toate acestea demonstreaz c sensibilitatea la CO2 se transmite prin particule din citoplasm care au fost denumite sigma. Alte experiene efectuate de T. Sonneborn i colaboratorii (1944, 1959) au pus n eviden aciunea unor particule citoplasmatice la Paramecium aurelia. Exist dou tipuri de indivizi n aceast specie; unul secret o substan specific n jurul lui, denumit paramecin (tipul Killer). Paramecii ce produc aceast substan nu sufer de pe urma ei, dar paramecii din cellalt tip, n contact cu aceast substan, mor (tipul non-killer). Capacitatea de a produce paramecin se datoreaz unor particule din citoplasm denumite Kappa, prezente numai la tipul ce produce paramecin i care conine n nucleu gena dominant K. Tipul nou-killer conine gena homozigot kk. La un individ se gsesc circa 400 particule Kappa vizibile la microscop, deoarece au diametrul de 0,2 0,8 . Aceste particule conin ADN.
187

Prin diviziunea direct a infuzorilor ce produc paramecin apar ntotdeauna indivizi ce produc paramecin. Prin aplicarea unei tehnici specifice, pot fi ncruciate cele dou tipuri de infuzori (conjugare). Dac conjugarea dureaz un timp scurt, se produce schimbul numai ntre nucleii celor dou tipuri i prin nmulire asexuat fiecare vor reproduce tipul iniial. Dac conjugarea dureaz mai mult, se realizeaz n plus i un schimb de citoplasm ntre cei doi indivizi, astfel c ambii vor conine particule Kappa. Prin nmulirea asexuat se produce n descenden o segregare de 50% indivizi ce conin particule Kappa i 50% care nu conin aceste particule (figura 9.2).

Fig. 9.2. Ereditatea citoplasmatic la Paramecium aurelia: a-2 tipuri de Paramecium dintre care numai A produce paramecin; b-conjugarea fr schimb de citoplasm; c-conjugarea cu schimb de citoplasm

Cercetrile acestea arat c un element citoplasmatic poate transmite o anumit nsuire. Particulele Kappa conin ADN, care asigur autoreproducerea lor i transmiterea n generaiile ulterioare.

9.2.3. Ereditatea mitocondrial

Primele dovezi asupra localizrii unor structuri ereditare la nivelul mitocondriilor de la Neurospora crassa aparin lui Mitchell (1952), iar la Saccharomyces cerevisiae lui Ephrussi (1953) i Slonimski (1953). Ulterior s-au descoperit i alte mutante, cum ar fi cele ce confer rezisten la antibiotice la Saccharomyces cerevisiae. Au fost studiate mai bine dou mutante i anume: petite la Saccharomyces i poky la Neurospora. Aceste mutante se caracterizeaz printro cretere insuficient a coloniilor, din cauza unor alterri ale enzimelor din mitocondrii, implicate n procesul de respiraie. Analiza genetic a mutantelor de tip petite a dus la constatarea c n cazul de fa acioneaz un factor citoplasmatic R (normal) sau r (deficien respiratorie) i un factor nuclear P (normal) sau p (deficien respiratorie). Aceti
188

factori acioneaz mpreun. n stare normal o celul haploid va conine RP. Dup constituia lor genetic, coloniile petite pot fi de dou tipuri: petite vegetative (rP) i "petite segregante" (Rp, rp). Primele, n stare diploid nu formeaz ascospori dar hibrizii formai din ncruciarea haploizilor normali i haploizi de tipul petite vegetative se comport normal i dau ascospori fr a da prin segregare tipul petite. S-a explicat acest rezultat presupunndu-se c n citoplasma celulelor normale se gsesc factori ce lipsesc din citoplasma celulelor cu deficiena respiratorie. Hibridul haploid primete aceti factori de la tipul normal; al doilea tip de colonii se numete petite segregante. n acest caz coloniile au fenotip identic cu acelea vegetative, dar ele s-au format prin mutaiile genei nucleare P i au genotipul Rp sau rp. Prin ncruciarea unui haploid normal cu un haploid mutant petite prin formarea sporilor se produce o segregare de dou celule normale la dou celule petite. Fenomenul poate fi explicat presupunnd c factorul Rp din citoplasma celulei respective n prezena genei nucleare p este nefuncional, iar n prezena genei dominante P devine funcional. O gen nuclear influeneaz deci genele extranucleare.

9.2.4. Androsterilitatea citoplasmatic i nucleo-plasmatic

Androsterilitatea (sterilitatea mascul) este nsuirea plantelor de a nu produce polen, sau de a produce polen steril. Fenomenul acesta a fost studiat foarte mult la porumb i are importan pentru producerea hibrizilor simpli i dubli, obinui din ncruciarea liniilor consangvinizate. Se cunosc trei tipuri de androsterilitate: nuclear, citoplasmatic i nucleo-plasmatic. Prima se cunoate de mult vreme i a fost sesizat la multe plante. La porumb, Emerson, Beadle i Frase (1935) comunicau existena a mai mult de 25 gene ce produc androsterilitatea. Aceast sterilitate nu a putut fi folosit n lucrrile de ameliorare deoarece din cauza segregrii, n descenden, apar i plante fertile. Androsterilitatea ce se motenete pe calea citoplasmei se transmite n descenden de ctre partenerul femel i ea se folosete n lucrrile de ameliorare. A fost descoperit la o plant steril de porumb de Peru de ctre Rhoades (1931, 1933). ncrucind descendenele cu aceeai form patern, nu s-a modificat n descenden caracterul de androsterilitate. S-a ajuns la concluzia c n acest caz, androsterilitatea este determinat exclusiv de citoplasm. Totui, Rhoades d unele date care ne arat c n unele cazuri, n urma polenizrii libere la porumb, pot aprea n descenden i plante fertile sau parial fertile. Deci acest caracter depinde i de genele nucleare care intr n aciune cu genele din citoplasm (ereditatea nucleo-plasmatic). Numeroase linii care posed polen fertil, prin ncruciare produc forme cu polen steril. n aceste cazuri, genotipul nu influeneaz caracterul de androsterilitate, motenirea realizndu-se pe cale citoplasmatic. Au fost totui gsite linii cu factori genotipici capabili de a restabili fertilitatea polenului n urma ncrucirii cu forme androsterile citoplasmatic.
189

Tipurile de androsterilitate se deosebesc dup gradul de sterilitate i dup comportarea lor la ncruciarea cu diferite linii fertile. Se pot obine descendene fertile, parial fertile sau sterile. Dintre numeroasele tipuri descrise de diferii autori, citm cteva mai importante: tipul 5 descris de Jenkins (1948); tipul F (jalap) descris de Rhoades (1950); tipul brazilian descris de Jones, Strinson i Khoo (1957); tipul Kya descris de Schwartz (1951); tipul Vg descris de Edwardson (1956) i Briggle (1957); tipul T (Texas) descris de Rogers i Edwardson (1952); tipul M (moldovenesc) descris de staiunea experimental din Kuban .a. Dintre toate aceste tipuri mai bine studiate sunt tipurile T i M. Restaurarea fertilitii. Se ntlnesc rare cazuri cnd androsterilitatea la porumb se motenete numai prin citoplasm, n mod independent fa de genotip. Exist cazuri cnd genotipul inhib aciunea citoplasmei ce produce sterilitatea polenului, precum i cazuri cnd din contra, citoplasma poate influena genotipul provocnd androsterilitatea nuclear. Caracterul de androsterilitate este condiionat deci de interaciunea dintre genotip i citoplasm. Aceast interaciune este studiat cel mai bine la tipul T (Texas). Cercettorii Jones (1950), Rogers (1954), Eckardt (1954), Thomas i Johnson (1956), au emis ipoteza c restabilirea fertilitii polenului la timpul Texas se datoreaz prezenei a dou gene dominante existente la linia care restabilete fertilitatea.

Fig. 9.3. Cele trei tipuri de androsterilitate: nuclear (I), citoplasmatic (II) i nucleo-citoplasmatic (III) 190

Dup comportarea lor fa de liniile sterile, liniile consangvinizate pot fi clasificate: 1. linii fixatoare de sterilitate; 2. linii restauratoare de fertilitate; 3. linii semirestauratoare de fertilitate (semifixatoare de sterilitate). Trebuie menionat c liniile consangvinizate de porumb se comport n mod deosebit fa de diferite tipuri de sterilitate. Uneori, aceeai linie poate fi restauratoare pentru un tip de androsterilitate i fixatoare pentru alt tip. Pentru a urmri comportarea plantelor fa de androsterilitate n funcie de aciunea genelor din citoplasm i nucleu vom nota cu S gena ce produce sterilitatea, cu F gena ce asigur fertilitatea i cu R gena restauratoare de fertilitate (figura 9.3). n aceast figur se poate urmri modul de aciune a genelor la cele trei tipuri de androsterilitate. Folosirea androsterilitii n producerea de hibrizi reduce lucrrile de castrare a plantelor i cheltuielile de producie. Pentru producie se lucreaz la obinerea de linii consangvine, acestea se ncrucieaz i formeaz hibrizi simpli, iar acetia din urm ncruciai produc hibrizi dubli cultivai n producie. n figura 9.4. este redat schema pentru obinerea de hibrizi dubli pe baz de androsterilitate.

Fig. 9.4. Schema pentru obinerea de hibrizi dubli pe baz de androsterilitate

191

9.3. APARATUL GENETIC AL EREDITII EXTRANUCLEARE

Existena unui aparat al ereditii extranucleare a fost dovedit n primul rnd prin prezena, rolul i funciile acizilor nucleici n organitele citoplasmatice, cloroplaste i mitocondrii. S-a admis, n general, c n citoplasm se gsesc plasmagene spre deosebire de genele nucleare numite cromogene. ADN din citoplasm prezint unele caracteristici care-i confer proprietatea de a nmagazina i transmite o informaie ereditar. Pe lng ADN, organitele celulare conin i ribozomi, enzime, ARNr i ARNs. Acestea constituie un aparat genetic care poate funciona relativ independent fa de cel nuclear. ADN din organite are o structur bicatenar ca i cel nuclear, dar difer prin greutate molecular (60-70 x 106 dal cel din mitocondrii) i este de 100 ori mai mult n cloroplaste. Diferene se constat i n ceea ce privete raportul de baze, timpul de denaturare i renaturare. Din aceast cauz nu se pot obine hibrizi moleculari ntre ADN citoplasmatic i cel nuclear. ADN din organite se replic independent de ADN nuclear. O alt deosebire const n faptul c n cloroplaste i mitocondrii ADN are form circular, se replic dup tipul semiconservativ, independent de ADN nuclear. Deosebirile ADN din cloroplaste i mitocondrii fa de acel nuclear i asemnarea lui cu ADN ntlnit la bacterii, alge albastre .a., au dus la presupunerea c aceste organite, cndva, au dus o via independent ca procariote i cu timpul, ptrunznd n celule, au realizat o simbioz. Ele au stabilit unele relaii cu celula, n afara creia nu mai pot exista. Descoperirile din acest domeniu au dus la formularea unei teorii privind originea exogen a organitelor citoplasmatice. Tot n celul se mai gsesc i alte structuri cu rol genetic, cum ar fi particulele Kappa, sigma i alte plasmagene, nc nelocalizate. La unele din ele a fost pus n eviden prezena ADN. i pentru aceste structuri exist prerea c ar avea o origine exogen, dar cercetrile care s-au ntreprins nu au lmurit complet structura i funcia unui aparat genetic propriu.

9.4. FENOMENE CU CARE SE POATE CONFUNDA EREDITATEA EXTRANUCLEAR

Pentru studiul cazurilor de ereditate extranuclear este necesar s se aib n vedere diferite situaii care mimeaz unele manifestri a acestui tip de ereditate.

9.4.1. Predeterminarea
Acest fenomen a fost pus n eviden la melcul de ap dulce, Limnaea peregra. Acesta este hermafrodit i se poate nmuli att prin fecundare strin ct i prin autofecundare.
192

Cuprinde dou tipuri: unul care are cochilia rsucit spre dreapta (dextral) i alta care are cochilia rsucit spre stnga (senestral). Caracterul dextral (D) este dominant, iar caracterul senestral (d) este recesiv. La ncruciarea: DD x dd hibridul F1 motenete caracterul matern al cochiliei (dextral). La ncruciarea dd x DD hibridul motenete tot caracterul matern al cochiliei (senestral) (fig. 9.5). nmulite pe cale asexuat, ambele categorii de indivizi din F1 reproduc n continuare i n F2 i F3 caracterele materne. Cercetndu-se cauzele acestor fenomene s-a explicat c rsucirea cochiliei se datoreaz rsucirii fusului nuclear n prima diviziune a zigotului care, la rndul su, determin distribuirea blastomerelor n spiral la stnga sau la dreapta.

Fig. 9.5. ncruciarea ntre Limnaea peregra tipul dextral cu Limnaea peregra tipul senestral (dup Plagge, 1938, modificat)

9.4.2. Modificrile de durat

Prin modificri de durat nelegem modificarea unor caractere sub influena unui anumit agent, care se menin un numr de generaii pn cnd organismul recapt caracterul iniial. Jollos (1932, 1935) descrie un asemenea caz la Drosophila. Larvele crescute la temperaturi ridicate au avut dimensiuni foarte mici (nanism). ncruciate ntre ele modificarea se menine pn n F5.
193

Hoffmann trateaz seminele de fasole cu cloral hidrat i obine modificarea frunzelor. Aceast modificare s-a meninut numai ase generaii dup care forma frunzei a revenit la cea iniial. Explicaia modificrilor de durat se refer la adaptarea enzimatic, acestea fiind sintetizate n prezena unui anumit substrat care are rol de inductor. Dup dispariia inductorului sinteza enzimei nceteaz sau se mai prelungete un timp.

9.4.3. Ereditatea aparent

n citoplasma celulelor unui organism se gsesc diferii simbioni sau parazii care produc modificri ale unor caractere sau nsuiri. La oareci, n descendena unor indivizi, s-a constatat apariia cancerului mamar i transmiterea lui pe cale matern. S-a crezut la nceput c este vorba de o nsuire transmis prin citoplasm. Bittner (1938) a descoperit c este vorba de un virus oncogen transmis prin laptele femelelor.

9.4.4. Alte surse de erori

n afar de aceste cazuri, erori n interpretarea ereditii citoplasmatice mai pot surveni i n reproducerea partenogenetic la care ereditatea este de tip matern, n cazul ereditii legat de sexul femel sau n cazul nmulirii asexuate.

9.5. RAPORTURILE GENETICE DINTRE GENOM I PLASMON

Nucleul i citoplasma constituie un sistem genetic organizat, ntre ele existnd o foarte strns legtur. Este greu de stabilit care este partea de contribuie a fiecreia. De multe ori acelai caracter este determinat att de genele cromozomice, ct i de genele citoplasmatice. Genele cromozomice pot influena aciunea unor componeni citoplasmatici. Aa de exemplu, gena iojap din cromozomul VII al porumbului, n stare homozigot recesiv produce caracterul dungat al frunzelor. Prin polenizarea unor plante cu frunze verzi, cu polen de la astfel de plante toi descendenii au avut frunze de culoare verde. n cazul n care plante mam de tip iojap au fost polenizate cu polen de la plante normale, n F1 au rezultat plante cu frunze de culoare verde, alb-verzuie i dungate dei genotipul a fost acelai. n concluzie, gena iojap este o mutant ce produce o modificare ireversibil n citoplasm. Un alt tip de relaii dintre genom i plasmon se refer la aciunea inhibitoare a mutaiilor genice asupra unor caractere motenite pe cale citoplasmatic. S-au dat exemple n acest sens cnd s-a analizat androsterilitatea nucleo-plasmatic.

194

Aciunea citoplasmei asupra caracterului nucleului este o dovad n plus a relaiilor ntre cele dou componente. Nucleul de form sferic de la Amoeba proteus, introdus n citoplasma unei amoebe din specia discoides capt forma de disc. Dar att genele din nucleu ct i cele din citoplasm pot aciona pentru producerea acelorai caractere (cazul aspectului pestri al frunzelor, al androsterilitii .a. Aceste relaii dintre nucleu i citoplasm atest interdependena genetic care exist ntre cele dou componente celulare la eucariote. Elementul comun care dicteaz aceast interdependen o constituie acizii nucleici purttori de informaie genetic, prezeni att n nucleu, ct i n citoplasm.

9.6. CARACTERELE I NSUIRILE INFLUENATE DE PLASMOTIP

Din cercetrile multiple i ndelungate s-a constatat c aproape toate caracterele sufer o influen mai mare sau mai mic din partea genelor din citoplasm. Dup Hagemann (1964), aproape toate caracterele organismelor sunt determinate i influenate n timpul ontogeniei (dezvoltrii individuale) att de genom ct i de plasmon. O influen mare exercit genele citoplasmatice asupra urmtoarelor caractere: germinaia seminelor, creterea tubului polinic, creterea embrionului i a plantei, ramificarea tulpinilor, perozitatea tulpinii i a frunzei, forma i nervaiunea frunzei, forma, mrimea i culoarea florilor, formarea i vitalitatea celulelor sexuale, formarea i structura plastidelor .a. La animale citoplasma influeneaz puternic greutatea corporal, rezistena la unele boli (cum ar fi leucoza) .a. n legtur cu problemele mari ale evoluiei lumii organice exist ipoteza c genele nucleare ar fi determinat, n mare msur, variabilitatea intraspecific, iar cele citoplasmatice, caracterele legate de gen i specie.

195

CAPITOLUL 10 SISTEME GENETICE PENTRU CONTROLUL REPRODUCERII ORGANISMELOR

Moto: "Natura nu face nimic incorect. Orice form, frumoas sau urt, i are cauza ei: i din cte fiine exist, nici una mcar nu e aa cum n-ar trebui s fie D. Diderot

Comportarea i transmiterea caracterelor ereditare la eucariote depind foarte mult de modul de reproducere al organismelor. Exist dou moduri, principale de reproducere: reproducerea asexuat, n care se poate include i nmulirea vegetativ i reproducerea sexuat.

10.1. EREDITATEA N CAZUL REPRODUCERII ASEXUATE I SEXUATE

n cazul nmulirii asexuate, n general, toate caracterele organismelor se transmit ca atare la descendeni. Descendenele poart numele de clone sau sue. n rare cazuri, se pot produce i modificri ereditare prin mutaii de gen, genom sau restructurrii cromozomale, care se transmit la urmai. Acest mod de nmulire, prezint unele avantaje pentru producie, deoarece, pot perpetua la urmai, caractere constante (pomi, vi de vie, cartof .a.). Ereditatea n cazul reproducerii sexuate mbrac forme mai complexe, deoarece indivizii rezultai pe aceast cale, reprezint organisme n care au loc, att o continuitate genetic ct i o recombinare de caractere. Reproducerea sexuat se realizeaz cu ajutorul gameilor, produi de un singur organism (hermafrodite sau monoice), sau de organisme de sex diferit (bisexuate sau dioice). Hibridarea sexuat constituie o important metod de analiz genetic. Cu ajutorul acesteia, se evideniaz modul de transmitere a caracterelor de la o generaie la alta. Pentru ameliorarea plantelor i animalelor, constituie o important metod de ameliorare deoarece se pot ntruni ntr-un organism nou (hibrid), caracteristici ereditare, de la doi prini cu erediti diferite. Hibridarea ca metod de nmulire i creare de forme noi, se practic de mult timp. Cercetri n aceast direcie, din partea oamenilor de tiin, se fac de abia de la sfritul secolului al XVII-lea. ncepnd cu a doua jumtate a secolului
196

al XIX-lea, n urma descoperirii unor legi cu privire la modul de transmitere a caracterelor, hibridrile ncep s se aplice n mod tiinific, ntocmindu-se totodat, o eviden genealogic a ascendenilor i descendenilor. Exist multe criterii de clasificare a hibridrilor; cele mai importante, fiind urmtoarele: 1. innd seama de factorii care contribuie la realizarea hibridrii, deosebim: hibridarea natural i hibridarea artificial. 2. Din punct de vedere al gradului de nrudire a formelor parentale, deosebim: hibridarea apropiat, n care prinii aparin unor soiuri sau varieti botanice apropiate i hibridarea ndeprtat, n care ele aparin unor specii sau chiar genuri diferite. 3. Dup numrul formelor parentale care particip la ncruciare, deosebim o hibridare simpl (A x B), dubl (A x B) x (B x C), tripl (A x B) x C sau complex etc. n cele ce urmeaz ne vom referi la diferite forme de hibridare, precum i la unele forme de interes teoretic i practic.

10.2. EREDITATEA N CAZUL UNOR FORME PARTICULARE DE REPRODUCERE

La unele plante i animale embrionul nu este rezultatul unui proces de fecundare la care particip cei doi gamei, ci el poate lua natere din elementele nefecundate ale sacului embrionar sau din celulele nucelei sau integumentelor, fenomen numit apomixie. Dintre formele apomictice fac parte partenogeneza i apogamia. Partenogeneza poate fi accidental sau permanent, haploid, cu n cromozomi sau diploid atunci cnd celula din care ia natere embrionul este diploid. Embrionul poate s se formeze dintr-un ovul nefecundat (ginogenez) sau dintr-o celul mascul (androgenez). Partenogeneza duce la motenirea caracterelor numai de la printele din care a luat natere. Starea haploid prezint unele avantaje n cercetrile de genetic deoarece genele nu au pereche alelic, sunt hemizigote, ceea ce permite analiza lor i, totodat, prin diploidizare se pot obine organisme perfect homozigote. Asemenea caracteristici prezint i reproducerea apogamic cnd embrionul se formeaz dintr-o sinergid sau antipod. Polispermia este fenomenul prin care o celul sexual femel este fecundat de mai muli gemei masculi. Gameii pot fecunda celula sexual femel sau se pot resorbi n citoplasm. Individul care se nate poart caracterele mai multor forme paterne. Poliembrionia ia natere prin dezvoltarea unor embrioni suplimentari, fie din celulele terminale ale proembrionului sau din sinergide i antipode n interiorul sacului embrionar (poliembrionia de gamei), fie din celulele nucelei i integumentelor care ptrund n sacul embrionar (poliembrionie de metamorfoz). Fenomenul este mai frecvent la citrice, rosacee, trifoi .a. Ereditatea lor depinde
197

att de forma matern ct i de forma patern, care au participat la formarea zigoilor. Xenia este fenomenul prin care nucleul spermatic care fecundeaz nucleul secundar al sacului embrionar imprim unele caractere ale formei paterne. Un exemplu l constituie formarea pe tiuletele de porumb a unor boabe de alt culoare dect cea a soiului matern.

10.3. SISTEME GENETICE PENTRU CONTROLUL REPRODUCERII

Plante autogame se polenizeaz cu polen propriu, fenomen care nu afecteaz vitalitatea plantelor i determin un grad avansat de homozigoie. Procentul de polenizare ntre plantele autogame, n mod natural, este foarte mic. Artificial, ele pot fi hibridate prin intervenia omului. Plantele alogame i unele plante sau animale hermafrodite pretind o polenizare sau fecundare strin. Modul de reproducere alogam asigur vigoarea descendenei. La microorganisme, cum ar fi la ciuperci, contopirea hifelor haploide genetic diferite are loc numai atunci cnd exist ntre ele diferene notate cu + i (sistem heterotalic). Diferenele sunt condiionate de o pereche de alele ce ocup un singur locus (J.L. Brewbaker, 1964). La bacterii conjugarea nu poate s aib loc dect atunci cnd una din ele, conine un factor de fertilitate (F+) i care lipsete la cea de a doua (F-). La plantele superioare exist mai multe sisteme de incompatibilitate ce mpiedic autofecundarea: - Incompatibilitatea heteromorfic depinde de structura florii (staminele ies mult n afar corolei sau rmn mult n interior, n timp ce, stilul se gsete la distan mare). O alt cale const n nflorirea nesincron a inflorescenelor mascule i femele: protandrie cnd nfloresc mai nti inflorescenele mascule (porumb) sau protoginie cnd inflorescenele femele nfloresc primele. Alturi de aceste ci mai exist diferite complexe, cum ar fi complexul entomofil (culoarea florii i prezena parfumului i a nectarului pentru a atrage insectele ce transport polenul) sau complexul anemofil (prezena unor saci cu aer n polen, pentru a putea pluti n aer). - Incompatibilitatea genetic este dictat de o serie de gene alele care mpiedic autofecundarea (genele autosterilitii). Acesta poate fi gametofitic sau sporofitic. - Incompatibilitatea gametofitic - n acest caz polenul nu poate germina dac n el i n esuturile ovarului, stilului i stigmatului se gsesc aceleai alele, de exemplu S1S2 (figura 10.1.a). Cnd incompatibilitatea se refer numai la unii grunciori de polen czui pe stigmat n timp ce alii, de pe acelai stigmat, germineaz, ea poart numele de semi-incompatibilitate. De exemplu, polenul are constituia S1S3 iar ovarul, stilul i stigmatul S1S2. n acest caz, numai polenul S3
198

germineaz i nucleul su spermatic produce fecundarea unindu-se cu S2 (figura 10.1.b). A treia situaie o formeaz alelele compatibile care fiind heterozigote S1S2 n ovar i S3S4 n polen, fecundarea este posibil (figura 10.1.c). Sistemele genetice de incompatibilitate au fost studiate la Trifolium, Oenothera, Prunus, Gramineae, Solanaceae .a - Incompatibilitatea sporofitic. Acest sistem este mai puin rspndit la plante, la circa 1/3 din ele. i n acest caz este implicat locusul S cu o serie de alele. Comportarea polenului nu depinde de constituia genetic a polenului ci de genotipul diploid al plantei care l produce. ntre alelele din polen i stil exist relaii de dominan i recesivitate. De exemplu, dac n polen S1 manifest dominan fa de S2, polenul va avea reacia alelei S1 i va fi capabil s germineze i s strbat stilul cu reacia S2. Acest sistem a fost studiat la tutun, varz .a.

Fig. 10.1. Reprezentarea grafic a reaciei autoincompatibilitate-compatibilitate n sistemul gametofitic pentru controlul polenizrii: a-polenizare autoincompatibil; b-polenizare semicompatibil c-polenizare compatibil

Sistemele de alele ale incompatibilitii prezint importan pentru crearea unor noi genotipuri. La plantele alogame, ce se reproduc prin semine nu se urmrete obinerea unor forme autocompatibile deoarece consangvinizarea reduce vigoarea plantelor. La speciile pomicole, care se nmulesc vegetativ se urmrete crearea unor forme autocompatibile pentru a nu mai fi nevoie s introducem n apropiere alte soiuri bune polenizatoare. Obinerea formelor autocompatibile se poate realiza prin mutaii n locusul S, deleia (ndeprtarea) acestui locus i poliploidie (multiplicarea garniturilor de cromozomi).

199

10.4. VIGOAREA HIBRIZILOR (HETEROZIS)

Fenomenul vigorii hibride a fost observat i descris nc din secolul al XVIII-lea i prima jumtate a secolului al XIX-lea. Iosef Gottlieb Klreuter (1763) a executat printre primele hibridri artificiale la plante. ncrucind diferite specii de Nicotiana semnaleaz vigoarea sporit a descendenilor fa de formele parentale. Andrew Knight (1787) constat c hibrizii obinui la diferite specii pomicole, soiuri de mazre i cartof, se caracterizeaz prin vigoare, care ntrece pe aceea a prinilor i c ea scade treptat n generaiile urmtoare. Charles Darwin studiaz peste 10 ani autofecundarea i fecundarea ncruciat la diferite soiuri de plante (Brassica, Dianthus, Pisum, Primula, Zea .a) i ajunge la concluzia c fecundarea strin duce la o constituie mai viguroas (constitutional vigour). Observaiile i rezultatele le-a publicat n lucrarea Efectele ncrucirii i autofecundrii la plante (1876). Fenomenul de vigoare la hibrizi a fost sesizat i la animale. Se cunoate din practic c hibrizii obinui ntre diferite rase se deosebesc prin unele caliti fa de prini. Darwin arat c animalele obinute prin ncruciare sunt mai viguroase, au talie i greutate mai mari. n perioada 19081914 cercettorii americani G. H. Shull, E. M. East i H. K. Hayes ntreprind studii asupra consangvinizrii (autopolenizrii) i hibridrii la porumb i elaboreaz metodele de consangvinizare i hibridare la plantele agricole. Termenul de heterozis a fost introdus de G. H. Shull n 1914, nelegnd prin el dezvoltarea luxuriant a hibrizilor din F1. Heterozisul se ntlnete att la plante autogame ct i la plantele alogame. La plantele alogame vigoarea este mult mai puternic dect la cele autogame. Acest fenomen difer i de la plant la plant i este mai pronunat la hibridrile n interiorul speciei dect ntre specii sau genuri. Exist ns i excepii, cum ar fi de exemplu hibrizii ntre genurile Raphanus Brassica, Triticum Secale sau speciile Triticum dicoccum Triticum aestivum. Dup clasificarea fcut de A. Gustafsson (1951) se deosebesc trei categorii de heterozis: a) heterozisul somatic, care se refer la creterea evident a prilor vegetative ale plantelor; b) heterozisul reproductiv, ce determin o dezvoltare sporit a organelor de reproducere, a fructelor i a seminelor; c) heterozisul adaptiv, caracterizat prin vitalitate mai mare i rezisten mai bun la condiiile nefavorabile de via. Pentru producie, importan are aa numitul transheterozis, care duce la un excedent de producie. Fenomenul de heterozis prezint o deosebit importan att pentru cercetrile de genetic ct i pentru lucrrile de ameliorare la plante sau animale. O preocupare importan a geneticii este explicarea mecanismelor intime care stau la baza lui, n scopul fixrii heterozisul din F1, pentru generaiile urmtoare. S-au
200

lmurit multe aspecte n legtur cu aceast problem, dar multe din ele constituie nc probleme de viitor.

10.4.1. Teorii care explic fenomenul heterozis

Teoria dominanei. n anul 1910, n perioada de nflorire a mendelismului, A.B. Bruce emite o teorie asupra naturii heterozisului, bazat pe calculele matematice, Teoria factorilor dominani. Conform acestei teorii, numrul total de caractere dominante, cu aciuni favorabile, n populaiile hibride este mai mare dect la formele parentale. Teoria demonstreaz existena unei corelaii pozitive, ntre numrul de factori dominani din genotip i gradul de manifestare a heterozisului fenotipic. Dac de exemplu, cei doi prini ar conine cte trei perechi de factori dominani, AABBCCddeeff x aabbccDDEEFF, hibridul rezultat va deine ase loci cu gene dominante AaBbCcDdEeFf. Ipoteza lui Bruce a fost mprtit i de ali cercettori. Genele ce acioneaz favorabil sub influena seleciei naturale devin dominante, iar genele nefavorabile, recesive. Prin autofecundare, genele recesive trec n stare homozigot. Prin ncruciare ele devin heterozigote i inhibate de alelele dominante favorabile. Aceast ipotez explic consecinele nefavorabile ale consangvinizrii i restabilirea vigorii prin ncruciare, ns nu i efectul heterozis n general. Nu toate nsuirile recesive sunt duntoare. Uneori se gsesc i forme homozigote dominante, inferioare prinilor. Aceast teorie nu poate explica fenomenul de heterozis n cazul poligeniei (polimeriei), care se caracterizeaz prin lipsa de dominan. Teoria heterozigoiei. G. H. Shull (1909 1914) elaboreaz o teorie a heterozisului, care se bazeaz pe corelaia pozitiv dintre vigoarea hibridului i gradul de difereniere ntre gameii ce iau parte la fecundare. Diferenierea gameilor ar fi un stimulent pentru o cretere mai intens. Din aceast cauz, teoria lui a mai fost numit ipoteza stimulrii fiziologice. Ideile lui Shull au fost dezvoltate n lucrrile altor cercettori: E. M. East i H. K. Hayes (1912) au admis prerea lui Shull. Ei artau c vigoarea hibrizilor F1, se datoreaz revenirii organismelor la starea heterozigot. Prin ncruciarea formelor homozigote se obine hibridul F1 n care se acumuleaz gene dominante ce anihileaz aciunea duntoare a alelelor recesive. n F2 vigoarea scade n urma segregrii genelor. ncruciarea creeaz heterozigoia iar consangvinizarea duce la homozigoie i descreterea vitalitii. Sunt ns i cazuri cnd n F1 nu se manifest fenomenul de heterozis sau micorarea heterozigoiei nu este nsoit totdeauna de scderea productivitii. Hibrizii simpli pot depi uneori hibrizii compleci, dei sunt mai puini heterozigoi. S-a mai constatat c, la autogame, de foarte multe ori, hibrizii
201

nu depesc formele parentale, homozigote. Toate aceste fenomene nu pot fi explicate cu aceast teorie. Urmtoarea etap a dezvoltrii ideilor lui Shull, East i Hayes a fost apariia lucrrii lui Castle (1926), care susine c ncruciarea duce la creterea metabolismului, iar heterozisul, ar fi urmarea diferenierii chimice din gamei. Teoria nlnuirii (factorilor dominani), a fost elaborat de D.F. Jones, urmare a dezvoltrii teoriei dominanei. Dup aceast teorie, heterozisul s-ar datora nlnuirii genelor dominante (grupe de gene nlnuite), localizate pe diferii cromozomi. Este ns greu de admis rmnerea n stare cuplat a factorilor dominani, care presupune un schimb foarte mare de gene. De asemenea, deoarece genele dominante sunt nlnuite cu cele recesive, nefavorabile, este imposibil eliminarea acestora fr ca, n acelai timp, s nu se elimine i genele dominante. Teoria alelomorfismului multiplu. A fost elaborat de E. M. East n anul 1936. Aceast teorie susine c heterozisul s-ar datora influenei unor alele multiple ce determin funcii fiziologice favorabile. O alel normal A1 poate da natere prin mutaii alelelor A2, A3, A4Cu ct o asemenea alel este mai ndeprtat de alela normal, cu att i efectul ei ar fi mai mare. Dar i aceast teorie prezint dificultatea c nu poate admite aciunea genelor normale i neag dominana i recesivitatea. Teoria supradominanei a fost elaborat de G. H. Shull (1945 1946). Aceast teorie este o dezvoltare a teoriei privind efectul stimulator al heterozigoiei. Din cauza aceasta, a mai fost numit i teoria heterozigoiei propriu-zise. Autorul afirm c, n unele combinaii, interaciunea ntre membrii aceleai perechi de alele poate duce la faptul c heterozigotul Aa va depi ca vigoare ambii homozigoi AA i aa. Se presupune c amndou alelele heterozigote execut funciuni ntructva diferite, completndu-se una pe alta. Heterozigoia este determinat de o singur pereche de alele spre deosebire de vechea teorie a heterozigoiei (a stimulrii de azi) unde heterozigoia este determinat de mai multe alele. Teoria heterozigoiei structurale a fost elaborat de Dobzhansky. Autorul susine c aciunea alelelor dominante favorabile asupra alelelor recesive nefavorabile poate fi nlocuit de inversiuni. Drept argument se aduce existena a 70,3% de indivizi ce prezint inversii heterozigote la Drosophila tropicalis, ce triete n America Central. Efectul de heterozis produs de aceast restructurare a fost denumit euheterozis balansat n sensul c echilibreaz polimorfismul biologic al populaiei. Teoria homoplasmiei este susinut de N.H. Nilson (1937). Depresiunea la linii consangvinizate s-ar datora omogenitii citoplasmei. Prin ncruciare se produce o difereniere biochimic i funcional a ei. Aceast teorie nu are adepi deoarece este greu de susinut c numai citoplasma s rspund de fenomenul de heterozis. Teoria echilibrului genetic. Ipoteza a fost elaborat de C. Bridges (1922), K. Mather (1943) i N. V. Turbin (1961), ncercnd o sintez a celorlalte teorii.
202

Prin echilibru genetic se nelege complexitatea de legturi ntre factori ereditari i mediu. Dezvoltarea fiecrui caracter ar fi determinat de influena corelativ asupra lui a numeroi factori cu aciune diferit: unii acioneaz n mod stimulator, alii n mod inhibitor. Caracterul apare ca o rezultant a unor tendine opuse. Dup aceast ipotez, dezvoltarea caracterelor ar fi deci rezultatele echilibrului genetic realizat. n cadrul acestei ipoteze diferite forme de interaciune a factorilor ereditari menionai n ipotezele artate mai nainte sunt termenii componeni ai acestui echilibru. Realizarea echilibrului genetic difer la plantele autogame de cele alogame. n cadrul plantelor autogame echilibrul se stabilete n cadrul fiecrui sortiment haploid de cromozomi. Gameii sunt echilibrai, fapt care asigur vitalitatea la descendeni. La speciile alogame echilibrul se stabilete n relaiile dintre organisme, a genotipurilor diferite. La aceste plante, n cazul consangvinizrii, descendena nu menine echilibrul genetic, iar vitalitatea i prolificitatea scade. Heterozisul este un fenomen opus consangvinizrii i el apare la organisme ca rezultat al unui echilibru genotipic optim ntre frecvenele alelelor homo i heterozigote. Cercetarea fenomenului de heterozis n cadrul concepiei de echilibru genetic nu exclude posibilitatea studierii n mod izolat a diferitelor tipuri de interaciuni a factorilor ereditari ce constituie componeni ai echilibrului genetic i care determin heterozisul. n afar de aceste componente ale bilanului genetic ce determin mrimea heterozisului, trebuie adugat i interaciunea dintre nucleu i citoplasm i ntre gene i mediu. Pentru a nelege cum acioneaz diferitele cauze care duc la dezvoltarea caracterelor concrete ce manifest heterozisul este nevoie clarificarea componentele echilibrului genetic de care depinde mrimea acestor caractere. Teoria mitocondrial. A fost formulat de D. F. Jones (1952) i J. B. Hanson i colab. (1960), (dup Butnaru Gallia, 1985). Cercetrile efectuate la porumb au evideniat o corelare pozitiv ntre intensitatea heterozisului i activitatea mitocondrial. Aceste corelaii au fost sesizate i la alte plante: sorg, gru, secar, triticale, mazre, bumbac etc. Mitocondriile sunt implicate n meninerea homeostaziei intracelulare, n felul acesta explicndu-se marea stabilitate fenotipic a hibrizilor, n condiii foarte diferite de mediu. Nu se cunoate prea bine care este evoluia populaiilor mixte de mitocondrii, n celulele organismelor hibride. Micorarea diversitii mitocondriilor, dup prerea specialitilor, ar explica declinul multor soiuri obinute prin hibridare dup un anumit numr de generaii. Dac aruncm o privire de ansamblu teoriilor expuse putem, desprinde urmtoarele concluzii: - heterozisul este un fenomen complex, la realizarea lui contribuind, n primul rnd genotipul organismului, iar n al doilea rnd, condiiile de via; - diferitele teorii explic numai unele laturi ale fenomenului de heterozis fr s descopere toate cauzele;
203

- merit s ne oprim atenia, n primul rnd, asupra teoriei stimulrii (heterozigoiei) i a teoriei dominanei, teorii care, de fapt, se pot completa una pe alta; cercetri multiple, confirm prin date, cele susinute de aceste teorii. Nu trebuie neglijate nici celelalte teorii care explic n parte sau n cazuri speciale manifestarea heterozisului. Importana practic a heterozisului impune o intensificare a cercetrilor teoretice i practice n acest domeniu.

10.4.2. Manifestarea heterozisului

Sesizarea fenomenului heterozis a plecat de la constatarea c, n majoritatea cazurilor indivizii obinui din ncruciri, se caracterizau printr-o vigoare sporit fa de prinii din care au provenit. Faptul c aceast vigoare este nsoit de o cretere a capacitii de producie la plantele agricole sau animalele domestice, a fcut ca fenomenul s fie amplu cercetat, att n ceea ce privete cauzele lui ct i a efectelor ce le produce. Din cercetrile de morfofiziologie s-a desprins concluzia c hibrizii se deosebesc de formele parentale prin urmtoarele nsuiri: au embrionii de dimensiuni mai mari; au o cretere a organelor vegetative mult mai rapid; posed o activitate mai intens a esuturilor meristematice; au o fotosintez mai intens; posibiliti mai bune de a absorbi substanele nutritive; capacitate mai mare de a sintetiza stimulatori de cretere. Manifestarea vigorii hibride depinde de ereditatea celor doi prini: este mai pronunat la hibrizii intraspecifici, la hibrizii obinui din linii consangvinizate (homozigote), dect la hibrizii dintre soiuri sau rase. Heterozisul se manifest i la animale, folosindu-se n producie unii hibrizi, fie ntre rase, fie ntre linii consangvinizate (fluturele de mtase, psri, porci .a.). Produii dovedesc o mai mare capacitate de producie (lapte, carne, ou etc.). Fenomenul de heterozis mbrac manifestri foarte variate, el prezint o importan covritoare pentru producie, iar aspectele privind tehnica producerii lui vor fi tratate n cursul de ameliorarea plantelor.

10.4.3. Consangvinizarea i folosirea ei n crearea liniilor destinate ncrucirii

Organismele alogame, fie monoice, dioice sau hermafrodite se reproduc n mod natural prin fecundare strin. Artificial, noi putem fora aceast categorie de organisme s se autofecundeze prin polenizare cu polen propriu, fenomen numit consangvinizare. La animale, consangvinizarea are loc prin ncruciarea ntre indivizi cu grad de rudenie apropiat. Consangvinizarea nu este tot una cu autofecundarea de la plantele autogame, unde constituie un mod normal de reproducere. Asupra plantelor alogame, consangvinizarea are urmtoarele efecte:
204

1. Scderea vitalitii organismelor. n urma consangvinizrii, plantele alogame i micoreaz capacitatea de cretere. Dimensiunile lor se micoreaz att n ceea ce privete nlimea, lungimea i limea frunzelor, diametrul tulpinii, ct i mrimea i greutatea fructelor; de asemeni, prezint i o fertilitate sczut. La porumb, majoritatea liniilor consangvinizate dau o producie cu mult sub cea a soiurilor din care au fost extrase. Aceast depresiune biologic se manifest foarte intens n prima generaie consangvin, pentru ca n generaiile urmtoare s scad i s se opreasc la o anumit limit de stabilitate numit i minimum de consangvinizare. Nu toate plantele rspund n acelai mod la scderea vigorii n procesul de consangvinizare; fa de porumb la care este foarte accentuat, la secar, lucern, floarea-soarelui este numai accentuat, iar la dovleac i mai puin. Depresiunea biologic i gsete explicaia n faptul c, n populaia supus consangvinizrii crete procentul de genotipuri homozigote n defavoarea celor heterozigote. n stare homozigot, genele nefavorabile organismului i evideniaz aciunea. Aceste urmri pot fi explicate ntr-o oarecare msur de teoria dominanei sau supradominanei. Gradul de homozigotare a indivizilor crete odat cu repetarea consangvinizrii la descendeni i el se poate afla calculndu-se coeficientul de consangvinizare (Cn); m 2 n 1 Cn = n , n care: 2

n reprezint generaiile de consangvinizare, iar m numrul perechilor de alele care se homozigoteaz.

gg
Fig. 10.2. Reducerea heterozigoiei i creterea homozigoiei

prin efectul consangvinizrii

205

Fig. 10.3. Efectul consangvinizrii asupra heterozigoiei i homozigoiei n funcie de numrul perechilor de alele n diferite generaii de consangvinizare

n figura 10.2 este redat creterea homozigoiei i scderea heterozigoiei n funcie de numrul de generaii n care s-a aplicat consangvinizarea i gradul de homo i heterozigoie, n procente. n figura 10.3. curbele redau procentul de homo i heterozigoie n funcie de numrul perechilor de alele i numrul de generaii de consangvinizare. Numrul perechilor de alele homozigote sunt invers proporionale cu numrul generaiilor consangvinizate. 2. Desfacerea populaiei n biotipuri. Plante alogame au o structur ereditar heterozigot. Caracterele i nsuirile lor se gsesc n diferite raporturi, de dominan i recesivitate. Multe din defecte sau caliti nu se pot manifesta prezentndu-se sub forma recesiv. Prin consangvinizare, acestea devin homozigote i se manifest producnd o desfacere a populaiei n biotipurile (liniile) componente. Dintre nsuirile recesive, ce se manifest fenotipic, unele constituie defecte, altele din contra, sunt valoroase pentru practic (unii indivizi posed rezisten la boli, la ger, precocitate, un coninut ridicat n protein, grsimi .a). n afar de caracterele homozigote recesive favorabile sau defavorabile apar i caractere homozigote dominante pozitive, care se pot folosi cu succes n ameliorare. 3. Scderea variabilitii. n prima generaie consangvin variabilitatea formelor aprute este foarte mare. Reproducndu-le prin autofecundare, fiecare form n parte, mai multe generaii, variabilitatea lor n cadrul descendenilor scade pn se ajunge la linii consangvinizate, care nu mai segreg, fiind foarte uniforme i stabile. Acestea sunt liniile homozigote. La porumb se obin astfel de linii n generaiile 7 8 de consangvinizare. Nu se poate afirma ns c s-a ajuns la o homozigoie absolut. Liniile consangvinizate obinute, sunt difereniate genetic i destul de difereniate din punct de vedere fenotipic. Ele nu se utilizeaz ca atare deoarece dau producii mici. Prin ncruciarea lor se obin ns hibrizi, foarte valoroi, cu producii mari fa de formele iniiale din care au fost extrase. La porumb, astfel de hibrizi, aduc sporuri de 50 70%.
206

10.4.4. Consangvinizarea la animale

Prin consangvinizare la animale se nelege mperecherea ntre indivizi cu grad de rudenie apropiat. Gradul de rudenie poate fi mai apropiat sau mai ndeprtat, dup cum strmoii comuni sunt mai apropiai sau mai ndeprtai. La animale, consangvinizarea este o veche metod de reproducie care s-a practicat i se practic pentru ameliorarea raselor. Dup gradul de nrudire a indivizilor, consangvinizarea poate fi: - incest, n cazul n care la mperechere iau parte frai cu surori, prini cu copii, bunici cu nepoi; - consangvinizare strns, n care se mperecheaz rude ceva mai ndeprtate: strnepoi cu strnepoi, veri cu veri; - consangvinizare moderat, cnd are loc mperecherea ntre rude i mai ndeprtate, pn la limita cnd ea nceteaz. n figura 10.4 se pot observa efectele consangvinizrii la animale n funcie de generaia de consangvinizare i gradul de nrudire. Ca i la plante, consangvinizarea la animale se folosete cu scopul de uniformizare a raselor, pentru reconstituirea caracterelor homozigote, mai ales a celor dominante, pentru fixarea unor caliti dorite sau pentru fixarea mutaiilor valoroase.

Fig. 10. 4. Efectul consangvinizrii la animale n funcie de generaia de consangvinizare i gradul de nrudire a prinilor

i la animale consangvinizrile au urmri depresive: degenerare, slbirea rezistenei la boli, infecunditate, albinism, anomalii .a. Cauzele ce determin aceste neajunsuri sunt n general aceleai ca i la plante. Pentru nlturarea lor se folosesc: metoda mperecherii cu reproductori strini, de aceeai ras, creterea animalelor nrudite care urmeaz a se ncrucia n condiii ct mai diferite de mediu pentru a le provoca diferenieri biologice, asigurarea unor condiii optime de hran i ngrijire a produilor obinui, aplicarea unei selecii att pentru reproductori ct i n cadrul descendenei.
207

Prin ncruciarea liniilor consangvinizate la diferite rase de animale se pot obine hibrizi cu productivitate sporit fa de cea a prinilor. Se aplic acest sistem, cu succes, la gini, porci i la alte animale domestice.

10.5. HIBRIDAREA SEXUAT NDEPRTAT

Hibridarea ndeprtat are loc ntre specii sau chiar genuri diferite. Din cauza unor dificulti care nsoesc aceast form de hibridare, folosirea ei este mult mai restrns fa de hibridarea n interiorul speciei. Mai poart numele de hibridare interspecific. Hibridarea sexuat ndeprtat se cunoate, de sute de ani, fie ca fenomen natural, fie ca metod practic folosit de om pentru obinerea de forme noi de plante i animale. J. Klreuter, la nceputul sec. XVIII, vorbea despre astfel de hibrizi la plante i i numea catri vegetali dup denumirea noiunii de catr, hibrid animal obinut pe cale artificial nainte de a se obine astfel de hibrizi la plante. Hibridarea ndeprtat este i un criteriu pentru determinarea speciilor. n cazul cnd nu se pot obine indivizi n urma unei asemenea hibridri sau, dei se obin sunt sterili, se afirm c cei doi prini care au luat parte la hibridare aparin unor specii diferite. Nu trebuie ns s considerm c hibridarea ndeprtat este singurul criteriu pentru determinarea speciilor. Ch. Darwin a observat c n obinerea hibrizilor ndeprtai se ntmpin greuti i a cutat s analizeze amnunit unele condiii de care depinde uurina ncrucirii ntre formele ndeprtate. El descrie urmtoarele situaii: - apropierea sistematic este ntr-adevr un factor determinant n reuita ncrucirii, dar nu singurul; - sunt cazuri cnd dou varieti aparinnd aceleai specii nu se pot ncrucia i din contra, n alte cazuri cnd dou specii diferite, se pot ncrucia ntre ele. n cazul cnd nu se pot ncrucia, Darwin arat c: fecundarea nu poate avea loc n cazurile cnd tuburile polinice nu pot ajunge pn la ovul din cauza stilului prea lung; tuburile polinice nu pot strbate stigmatul de la plantele altei specii; gametul mascul ajunge la oosfer, dar dezvoltarea embrionului nu are loc; fecundarea poate avea loc, embrionul ncepe s se formeze, dar piere n scurt timp. Observaiile lui Darwin sunt juste, dar nivelul cunotinelor din vremea lui nu i-au permis s cerceteze i din punct de vedere genetic cauzele ce ngreuiaz realizarea hibrizilor interspecifici. Aceasta a fost posibil mai trziu, odat cu dezvoltarea geneticii.

10.5.1. Obinerea i comportarea primei generaii hibride

n general, hibrizii interspecifici se obin cu greutate, iar reuita depinde n mare msur i de speciile pe care le folosim. Exist totui anumite specii de plante care, ncruciate, posed facultatea de a produce hibrizi fertili. n schimb, la animale, aplicarea hibridrii ndeprtate ntmpin mai multe dificulti.
208

Delimitarea speciilor cu diferenieri de la una la alta, att din punct de vedere genetic, ct i fenotipic a determinat izolarea lor sistematic i genetic i a creat dificulti la ncruciarea dintre ele. Aceste dificulti sunt datorate incompatibilitii de ordin genetic sau morfologic, privind structura florii, a incompatibilitii dintre embrion i endosperm i perturbri n formarea celulelor sexuate. La animale, atunci cnd se obin hibrizi, defectele se manifest de obicei la unul din sexe, n special la sexul heterogametic. La ncruciarea dintre femele de Drosophila pseudoobscura cu masculi de Drosophila miranda, n F1, se obin femele sterile. n cazul cnd se inverseaz prini, n F2 se obin ambele sexe, dar masculii sunt anormali. La ncruciarea dintre o femel de Bos taurus i un mascul de Bizon americanus, numai hibrizii femeli ajung la maturitate. Mecanismul genetic care duce la dezvoltarea numai a indivizilor de un singur sex este mai uor de explicat dac ne gndim la diferenele de ordin genetic ce se ntlnesc la cele dou sexe. Dei genotipul celor dou specii conine genele corespunztoare, dispoziia acestor gene poate fi pe cromozomi diferii: la una din specii ele pot s fie situate pe autozomi, la cealalt pe cromozomii sexuali. n afar de aceasta se pot ivi i diferene n structura cromozomilor autozomi omologi sau ai sexului. Cnd se obin totui hibrizi interspecifici, aspectul lor fenotipic este n general intermediar ntre cei doi prini i numai n unele cazuri se manifest o dominan din partea unuia din prini. Fenomenul obinuit de vigoare, constatat la hibrizii intraspecifici caracterizeaz uneori i hibrizii interspecifici (hibridul ntre Raphanus sativum x Brassica oleracea sau hibridul Equus caballus x Equus asinus catrul). Adesea, o anumit grupare a genelor pe cromozomii omologi favorizeaz aciunea genelor letale sau semiletale i atunci hibrizii sunt letali, sau prezint fenomene de debilitate. Unii hibrizi interspecifici, prezint i anomalii sexuale (intersexuali). Acetia, au aspectul exterior al unui sex dar posed organe sexuale, ale celuilalt sex. De obicei ei sunt sterili. Fenotipul hibrizilor interspecifici depinde i de modul n care se folosesc ca mam sau ca tat, cele dou specii, la care exist diferenele morfologice tranante ntre femele i masculi. Catrul are conformaia foarte apropiat de cea a mamei, Equus caballus, n timp ce bardoul (hibridul reciproc) are conformaia mamei de Equus asinus, Equus caballus fiind n acest caz tat. Este cazul influenei citoplasmei materne, a fenomenului de matroclinie. O caracteristic principal, destul de frecvent a hibrizilor interspecifici este sterilitatea lor. Ea se manifest de obicei la sexul heterogametic, cu diferite intensiti i se mparte n mai multe tipuri: - gonadele, n cazul animalelor sau florile plantelor nu se dezvolt sau avorteaz, la hibrid. Aceast situaie este mai frecvent la animale; - dezvoltarea gonadelor i a florilor este normal dar, perturbrile ncep odat cu meioza. Cele dou garnituri de cromozomi difer prin structur sau prin numr. Aceste anomalii fac ca meioza s nu se poat desfura normal sau
209

nceteaz ntr-un stadiu timpuriu, iar n cazul n care se formeaz gamei, ei sunt improprii pentru fecundare. Cnd ambii prini dein genomuri omoloage, dar difer prin numrul de cromozomi, conjugarea cromozomilor n meioz decurge normal, dar n loc de bivaleni se formeaz polivaleni. n alte cazuri, prinii dein o parte din genomuri omoloage, dar restul sunt omoloage numai parial. Cromozomii parial omologi rmn ca univaleni. n acest caz, celulele sexuale sunt sterile. Cnd prinii dein genomuri neomoloage, cromozomii nu fac sinaps, repartiia la cei doi poli ai celulei este neregulat i ca atare, apar gamei sterili. Pentru nlturarea sterilitii pot fi folosite mai multe metode: retroncruciarea individului F1, cu unul din prini; multiplicarea numrului de cromozomi prin tratamente cu colchicin etc. Aceste metode asigur genomuri care dau posibilitatea de conjugare a cromozomilor n meioz. Dificultile de obinere a hibrizilor ndeprtai, pot fi de ordin cantitativ i calitativ. Diferenele cantitative se refer la numrul de cromozomi ai celor doi prini. Atunci cnd ele depind de germinarea polenului i creterea tubului polinic, hibridarea decurge mai bine, cnd forma matern are un numr mai mare de cromozomi dect forma patern (de exemplu ntre speciile genului Datura, Galeopsis, Nicotiana). La o alt categorie de plante, creterea tubului polinic decurge mai bine cnd forma matern are un numr mai mic de cromozomi dect forma patern (de exemplu ntre speciile genului Helianthus, Triticum, Rosa). A treia categorie o reprezint plantele indiferente privind raportul cromozomic (de exemplu, ntre speciile genului Brassica). Perturbri pot s apar i odat cu formarea seminelor. La plantele angiosperme diploide, dezvoltarea normal a embrionului are loc cnd n embrion exist 2n cromozomi, n endosperm 3n cromozomi, iar n ovar 2n cromozomi. Cnd raportul acesta se schimb din cauza numrului modificat de cromozomi, perturbrile apar mai nti n endosperm, n care are loc o sistare a fluxului de hran care duce la sufocarea lui. Este vorba de o sterilitate somatoplastic care duce la moartea embrionului. Acest fenomen poate fi evitat dac n primele stadii de dezvoltare a embrionilor ei sunt detaai i cultivai pe medii nutritive. ntr-un stadiu mai trziu, perturbrile pot aprea n procesul de dezvoltare a seminelor, afectnd capacitatea lor de germinare. Diferenele calitative a genomurilor celor doi prini constituie cazuri mai frecvente. Ele se pot produce n cazul unui numr egal de cromozomi i genomuri omoloage (A x A sau AB x AB) sau un numr diferit de cromozomi i genomuri parial omoloage (A x AB). n sfrit, se mai pot ntlni situaii n care numrul de cromozomi a formelor parentale s fie egal, dar genomurile neomoloage (A x B). Toate aceste diferene de ordin cantitativ i calitativ dintre formele parentale, produc perturbri n procesul de fecundare sau de formare a seminelor, de dezvoltare sau de formare a celulelor sexuale.
210

n meioz, n asemenea cazuri, conjugarea i segregarea cromozomilor nu decurge normal i nu se formeaz celule sexuale sau acestea sunt sterile.

10.5.2. Comportarea celei de a doua generaii hibride

Se poate obine a doua generaie la hibridarea ndeprtat numai atunci cnd hibridul F1 este cel puin parial fertil. Cnd numai unul din sexe este steril, cel fertil poate fi ncruciat cu printele de sex opus. Descendena hibrizilor ndeprtai se caracterizeaz printr-o puternic segregare, care n general nu se ncadreaz n normele mendeliene. Pot s apar forme asemntoare tatlui , mamei, intermediare sau aberante. n unele cazuri, n urma segregrii toi indivizii seamn numai cu unul din prini. n generaiile urmtoare, la hibrizii parial fertili se mrete procentul de fertilitate. Prin repetarea unui backcross se observ o revenire evident la formele parentale.

10.5.3. Rolul hibridrii ndeprtate n evoluia speciilor

Hibridarea ndeprtat prezint importan, pentru apariia de specii noi de plante i posibil, i de animale inferioare. Se observ n natur, existena unor forme ce au caractere comune pentru dou genuri sau specii diferite, cum este hibridul dintre Sorbus sibirica i Cotoneaster melanocarpa. Acesta a motenit gustul i coloraia fructelor, forma frunzelor, culoarea argintie a frunzelor, forma mugurilor de la Sorbus sibirica, iar structura fructului, forma inflorescenei, caracterul pubescenei, de la Cotoneaster melanocarpa. Ca urmare a hibridrii ndeprtate, apar uneori organisme amfidiploide (ce nsumeaz numrul de cromozomi somatici ai prinilor), cu genotipuri echilibrate, constante i care prin ncruciare pot reproduce tipul din care fac parte. Dac noua form se dovedete adaptat ea se rspndete. O condiie pentru meninerea ei o constituie izolarea reproductiv de speciile nrudite. Orice individ obinut prin hibridarea ndeprtat este nceputul unei specii noi. Pe de o parte, trebuie s inem seama de unele trsturi eseniale ce caracterizeaz specia autentic: specificul morfologic, lipsa indivizilor intermediari speciilor parentale, capacitatea de a se reproduce, fertilitatea deplin n cazul ncrucirii i izolarea reproductiv total de alte specii. Pe de alt parte, acestor forme le lipsesc unele trsturi eseniale ce sunt caracteristice speciilor naturale: arealul geografic, locul ocupat n relaiile biocenotice, numrul de indivizi .a. Aa c, asemenea hibrizi nu pot fi considerai specii noi, ci mai degrab forme specifice. O specie nou se formeaz ntr-un proces ndelungat, pe baza seleciei naturale. Prin metoda hibridrii ndeprtate au fost sintetizate multe forme, foarte asemntoare cu speciile rspndite n natur. Mntzing (1930) a realizat prin hibridri ndeprtate sinteza unei forme asemntoare speciei Galeopsis tetrahit
211

(2n = 32 cromozomi). A ncruciat Galeopsis pubescens cu Galeopsis speciosa. Hibridul, ncruciat cu una din formele parentale, Galeopsis pubescens, era greu de deosebit de Galeopsis tetrahit. La plante, posibilitatea de o obine hibrizi ndeprtai difer de la un gen la altul. Exist genuri ale cror specii se hibrideaz destul de uor (Dianthus, Triticum, Prunus, Pirus etc.) dar i genuri a cror specii nu se hibrideaz, chiar dac sunt destul de nrudite (Liliacee, Umbelifere, Leguminoase etc.). Exist i genuri care se hibrideaz cu destul uurin, cum ar fi: Triticum x Secale, Triticum x Aegilops, Raphanus x Brassica etc. Studiul citogenetic al hibrizilor ndeprtai, ofer posibilitatea stabilirii cauzelor ce determin sterilitatea total sau parial a acestora. n ameliorarea plantelor, hibridrile ndeprtate, chiar dac necesit condiii de lucru deosebite, s-au extins, deoarece ofer posibilitatea obinerii de hibrizi cu cromozomi de adiie (Triticale) sau cu cromozomi de substituie, aceste recombinri genetice, permind o diversificare mai mare a materialului biologic.

212

CAPITOLUL 11 MUTAIILE I MECANISMUL LOR MOLECULAR

Moto: Pentru producerea unui mare salt evolutiv sunt necesare ndeplinirea a trei exigene minimale: evenimentul, ireversibilitatea i coerena Ilya Prigogine

Noiunea de mutaie a fost introdus de Hugo de Vries (1901), nelegnd prin aceasta, o schimbare brusc a nsuirilor ereditare. E. Baur (1919) o definete drept o modificare ereditar care a aprut n afara hibridrii, iar E. Guyenot, o variaie brusc i ereditar ce poate apare spontan sau sub influena unor factori experimentali. Mutaia este o nsuire a materialului genetic i este tot att de important ca i stabilitatea lui. Ea apare la toate organismele i alturi de recombinarea genetic este principala surs de variabilitate. Omul poate obine mutaii, acionnd asupra organismelor cu diferii factori mutageni. Modificrile obinute afecteaz diferite caractere morfologice sau nsuiri fiziologice i biochimice. Mutaia este una din metodele principale folosit n ameliorare, pentru obinerea de soiuri sau linii noi. Apariia spontan a mutaiilor a fost sesizat de mult, iar concepia care s-a format asupra lor a avut un rol important n explicarea evoluiei. Evoluia, n concepia de astzi, nu este altceva dect o rezultat a procesului de modificare ereditar a organismelor i aciunea selectiv a mediului. Mutaia poate determina direcii de evoluie atunci cnd modificarea este util organismului, reprezentnd un avantaj n perpetuarea speciei la care a aprut.

11.1. CLASIFICAREA MUTAIILOR

Mutaiile se pot clasifica n mai multe tipuri, fiecare avnd un anumit criteriu. 1. Dup modul de apariie, ele se mpart n mutaii naturale i mutaii artificiale: - mutaiile naturale numite i spontane apar n condiiile din natur fr intervenia omului. Datorit faptului c mediul totalizeaz o mare complexitate de factori ce influeneaz organismul este foarte greu de precizat care sunt cauzele ce determin apariia acestor mutaii; - mutaiile artificiale, numite i induse, sunt provocate de om cu ajutorul diferiilor ageni mutageni.
213

2. Dup capacitatea de expresie fenotipic ele pot fi: mutaii mari (macromutaii) ce se deosebesc prin caracterul lor net vizibil, uor sesizabile; mutaii mici (micromutaii), care spre deosebire de primele, sunt greu perceptibile, dar mai frecvente i cu rol important n evoluie. 3. Dup aciunea genei mutante, mutaiile pot fi: morfologice, fiziologice sau biochimice; mutaiile morfologice afecteaz caracterele morfologice ale organismelor (form, mrime, culoare etc.) i sunt uor detectabile; mutaiile fiziologice produc schimbri n procesele fiziologice, (ritmul de cretere, perioada de vegetaie, rezistena la boli .a.); mutaiile biochimice determin modificarea cantitativ sau calitativ a componenilor chimici din organism, (substane de rezerv, principii activi, enzime etc.). 4. Dup natura substratului material al ereditii mutaiile sunt: genice, cromozomice, de genom, citoplasmatice; mutaiile genice (punctiforme) provoac modificarea genei fr a produce o schimbare n morfologia cromozomului. Ele se refer la schimbrile de structur chimic. O alel se transform n alta, fr a-i schimba locus-ul n cromozom. Cea mai mic unitate mutaional, este perechea de nucleotide, mutaie denumit punctiform, fiind o mutaie intragenic. Mutaiile cromozomice se refer la restructurrile ce pot avea loc n cromozom (deficien, deleie, inversie, translocaie, translaie). Mutaiile de genom afecteaz ntregul genom sau numai un anumit numr de cromozomi (poliploidia i aneuploidia). Mutaiile citoplasmatice se refer la modificrile pe care le pot suferi cloroplastele i mitocondriile i odat cu ele i caracterele de care rspund. 5. Dup originea lor mutaiile pot fi: germinale i somatice. Mutaiile germinale apar n celulele sexuale i se manifest n zigoii la a cror formare particip. Mutaiile somatice apar n celulele somatice. Cu ct apar mai devreme n ontogenez, vor afecta o poriune mai mare din organism. La organismele cu nmulire vegetativ ele se pot menine pe cale vegetativ i pe cale sexuat cnd din esuturile somatice afectate se dezvolt celule sexuale. 6. Dup direcia de manifestare a mutaiilor: mutaia direct (forward mutation) i de reversie (back-mutation). Cnd o gen normal (de tip slbatic) se transform ntr-o alel diferit, mutaia este direct, iar cnd o gen se retransform n tipul iniial, mutaia este de reversie. Frecvena acestor mutaii este diferit, mai mare pentru cele directe, comparativ cu mutaiile de reversie. 7. n funcie de locul de plasare a genelor, mutaiile pot fi: mutaii autozomale plasate pe autozomi, mutaii heterozomale plasate n cromozomii sexuali (manifestnd sex-linkage) i mutaii extranucleare, ale genelor din citoplasm. 8. Dup modul de manifestare a genelor mutante, mutaiile pot fi dominante, codominante, semidominante sau recesive. La organismele diploide, mutageneza a creat relaii de alelism ntre gene, exprimndu-se fenotipic cele dominante, n timp ce la organismele haploide orice mutaie se exteriorizeaz fenotipic.
214

9. Funcie de modul de reacie a indivizilor purttori ai unei mutaii, mutaiile pot fi viabile, subletale i letale. 10. Un tip special de gene mutante, sunt genele mutatoare, care mresc frecvena mutaiilor altor gene.

11.2. DETECTAREA MUTAIILOR

Mutaiile pot fi identificate, dup modificrile fenotipice ereditare sau dup schimbrile suferite n structura sau numrul cromozomilor, indiferent dac acestea sunt sau nu nsoite momentan de modificri fenotipice. Cel mai uor pot fi descoperite mutaiile somatice sau cele germinale, dominante, vizibile, care dei n stare heterozigot, apar chiar n prima generaie. Mutaiile recesive se pot evidenia mai greu i este nevoie de o analiz genetic efectuat n mai multe generaii. Numai n cazul cnd este homozigot, mutaia recesiv se evideniaz n prima generaie. Majoritatea mutaiilor sunt recesive i pentru determinarea lor se fac hibridri i autofecundri. Pentru Drosophila se folosesc cromozomi marcai prin gene dominante i purttori ai inversiilor ce mpiedic crossing-over-ul. Mutaiile fiziologice se pot sesiza uor atunci cnd sunt letale sau semiletale, deoarece organismele ce posed astfel de mutaii se dezvolt slab sau pier. Exist ns multe mutaii ce manifest mici schimbri n procesele fiziologice sau biochimice i sunt foarte greu de sesizat. Este imposibil de sesizat apariia tuturor mutaiilor naturale sau artificiale orict de minuios s-ar lucra. La organismele diploide mutaiile dominante, foarte rare, se manifest imediat i pot fi detectate. Mutaiile recesive se menin n genotip mai multe generaii (perioad de lag) pn devin homozigote, moment cnd, se manifest fenotipic. Cea mai eficient metod pentru depistarea lor este autofecundarea urmat de depistarea lor, dup un numr de generaii (M1, M2, M3). Mutaiile care se produc n endosperm, cum ar fi cele care-i afecteaz culoarea sau alte aspecte, se identific uor, prin polenizarea plantelor cu polen ce posed mutanta respectiv i care, datorit dublei fecundri, o va manifesta. Mutaiile recesive se pot menine numai prin autogamie i consangvinizare. La plantele haploide, starea de hemizigoie face posibil detectarea mutaiilor chiar din momentul apariiei lor. Aceste mutaii pot fi meninute i prin nmulire vegetativ. Cercetri multiple s-au efectuat la microorganisme, la care mutaiile pot fi detectate analizndu-se diferite caracteristici ale aspectului i mrimii plajelor, cerinele fa de factorii de cretere .a. Metodele de detectare au fost elaborate de mai muli biochimiti, printre care mai importani sunt: S. W. Beadle i E. L. Tatum (1941, 1945) pentru Neurospora crassa i J. Lederberg (1952) pentru bacterii. Se folosesc metode de inducere a mutaiilor care perturb sinteza unor anumii metabolii la bacterii, ciuperci inferioare i alte microorganisme haploide. Formele parentale sunt supuse aciunii unui agent mutagen, sunt crescute apoi pe
215

medii minimale sau complete i prin separarea indivizilor se obin descendene (clone), dintre care unele mutante. La bacteriofagi, mutantele afecteaz morfologia plajelor din culturile de bacterii pe suportul crora se reproduc. Mutaiile cu efect letal n stare homozigot pot fi detectate foarte uor. Din ncruciarea a doi indivizi heterozigoi, ce posed o gen letal recesiv raportul genetic de segregare nu va fi 1:2:1 ci, 2:1 deoarece din indivizii homozigoi pentru aceast gen mor, fie n stadiul embrionar sau post embrionar. Pentru depistarea genelor mutante letale de pe cromozomii sexuali au fost elaborate diferite metode numite i teste. Aa este metoda ClB elaborat de H. J. Mller care permite recunoaterea mutaiilor letale localizate pe cromozomul X la Drosophila melanogaster. Femelele ClB au un cromozom X normal i unul la care regiunea central a suferit o inversie care oprete un eventual crossingover pe aceast poriune. Pe acest cromozom se gsete o alel mutant l i o alel dominant B (ochi bar). Alela B ndeplinete rolul de marker (identificator). Femelele ClB au fost ncruciate cu masculi de tip normal. Dac la mascul a aprut o mutaie letal recesiv, atunci femelele cu ochi bar vor prelua de la mam i tat cte un factor letal. n generaia urmtoare toi masculii vor muri fie c au motenit factorul letal ClB, fie mutaia care a aprut la cromozomul X (figura 11.1). O alt metod pentru determinarea mutaiilor letale la Drosophila melanogaster este i metoda Mller 5, n care se folosesc femele la care cromozomul X este marcat cu o alel recesiv pentru culoarea apricot a ochilor. Pentru tipul Abraxas aceast metod se poate folosi, dar n cazul de fa letalitatea se manifest la sexul femel.

Fig. 11.1. Testul ClB de detectare a mutaiilor letale ce afecteaz gene localizate n cromozomul sexului X la Drosophila melanogaster 216

11.3. MUTAIILE SPONTANE

Apariia spontan a unor indivizi deosebii n cadrul unei populaii, cu posibiliti de a transmite modificarea lor la urmai, a fost sesizat de foarte mult timp. Unele mutaii mai deosebite au fost descrise n diferite lucrri. O mutaie descoperit n sec. XVI, de ctre farmacistul german Sprenger, din Heidelberg, la planta Chelidonium majus avea frunzele i petalele laciniate (spintecate); caracterul a aprut spontan i s-a transmis ca atare la descendeni. Noua form a fost denumit Chelidonium laciniatum i a fost meninut prin autofecundare. La frag, exist o mutaie descoperit de Duchesne (1763) care are frunza compus dintr-o singur foliol, numit fragul monofil. Darwin, n lucrarea sa Variaia animalelor i plantelor sub influena domesticirii (1868), descrie diferite mutaii pe care le-a denumit sporturi. A descris piersicul cu fructe netede, prunul cu fructe de culoare galben .a. La animale, citeaz numeroase mutaii: rasa de vite Niatos, cu maxilarul superior mai scurt dect cel inferior, asemntor cinilor buldogi, rasa de oi Ancona cu picioare foarte scurte, punul cu umeri, cu pene de culoare neagr .a. n afara acestor mutaii, exist foarte multe exemple acumulate n literatura de specialitate: cinii bassei, cunoscui cu 3000 de ani naintea erei noastre, merinosul de Machamp cu lna puin ondulat, dispariia coarnelor la oi, taurine i capre, porcii solipezi, care au o singur copit i nu se mbolnvesc de febr aftoas, rasa de oi chinez Yang-ti, fr urechi, porumbeii rotai, gulerai, moai, fluturi de culoare neagr .a. Un studiu sistematic al mutaiilor spontane l-a realizat Hugo de Vries (1848 1936). El a pus bazele teoriei mutaioniste. Teoria lui ncearc s explice c evoluia se face exclusiv pe baza mutaiilor. Lucrarea sa de baz este Teoria mutaiilor (1901 1903). Dup De Vries, n viaa speciilor sunt anumite perioade sensibile, care fac s apar aceste mutaii. El precizeaz ns c, nu mediul provoac propriu-zis apariia acestor mutaii. Mutaiile sunt determinate de cauze interne, iar mediul nu face altceva dect s declaneze apariia perioadei sensibile a speciei. Mutaiile nu substituie speciile vechi din care au aprut, ci continu s triasc, mai departe, alturi de ele. Transformrile acestea, spune De Vries, nu au o direcie bine definit fa de organism. Ele pot fi folositoare organismului dup cum pot fi i nefolositoare, putnd chiar periclita existena speciei nou aprute. De Vries a studiat amnunit speciile genului Oenothera, plant caracterizat printr-un polimorfism accentuat, originar din America i care fusese introdus de curnd n Olanda, unde lucra De Vries. El a remarcat c numeroase forme noi, erau ereditare. Unele experiene preau s demonstreze c Oenothera lamarckiana, la origine provine din ncruciarea a dou forme deosebite. Mai trziu, s-a demonstrat c anumite specii, cum ar fi Oenothera gigas, sunt poliploide.
217

Teoria mutaiilor s-a dezvoltat prin lucrrile lui T. H. Morgan. Mecanismele cromozomice descoperite de acesta privind transmiterea caracterelor, cuplarea i recombinarea genelor, mecanismul de apariie a aberaiilor cromozomice, au constituit o baz tiinific pentru fundamentarea procesului mutaional. Procesul mutaional se caracterizeaz printr-o anumit frecven a mutaiilor. Este rar, atunci cnd lum n considerare o singur gen i mult mai frecvent atunci cnd se iau n considerare toate genele i toate mutaiile posibile de la un anumit organism. n primul caz raritatea se explic prin aceea c din perechile de alele muteaz de obicei numai una singur, iar n al doilea rnd ele sunt n majoritate recesive i nu se exteriorizeaz dect n stare homozigot. Exist factori ce influeneaz frecvena mutaiilor spontane. n primul rnd, frecvena mutaiilor genice, depinde de specie i de gena respectiv. Exist unele aprecieri privind frecvena lor, calculat n raport cu numrul de gamei studiai. Dup Wagner i Mitchell (1955) mutaiile spontane la diferii loci la porumb, sunt cuprinse ntre 0,001 i 0,110 la 10000 gamei, iar la Drosophila ntre 0,29 i 1,5 la 10000 gamei. Dup alte date ale unor autori, reiese c una i aceeai gen de la diferite linii de porumb muteaz diferit. Aa de exemplu gena Rr formeaz mutante rr cu frecvene diferite la aceste linii: la una de 6,2 la 10000 gamei, la cealalt de 18,2 la 10000 gamei. Se presupune c aceste diferene se datoreaz existenei unor gene speciale, care influeneaz frecvena mutaiilor altor gene (gene mutatoare). Numrul de mutaii ce se acumuleaz n celule este proporional cu vrsta lor. n seminele plantelor care sunt depozitate un numr mai mare de ani, crete numrul de mutaii fa de seminele de curnd recoltate. H. Stubbe a constatat la seminele de Antirrhinum majus o cretere a procentului de mutaii de la 1,5% la 14% pentru o perioad de la 5 la 10 ani. Astfel de observaii s-au fcut i asupra mutaiilor letale spontane, nlnuite cu sexul, n spermatozoizii precoci i tardivi de la Drosophila melanogaster. Aceste constatri au dus la formularea unei preri generale c, numrul de mutaii este proporional cu vrsta celulei dei exist i excepii. Descoperirea mutaiilor naturale cu ajutorul unora dintre metodele i tehnicile cunoscute face posibil calculul procentului de mutante n snul unei populaii de indivizi. Este ns foarte greu de stabilit prin acest calcul n mod exact proporia mutaiilor, din mai multe motive: - n primul rnd, mutaiile au aprut n decursul timpului, odat cu formarea populaiilor i multe din ele pot fi considerate caractere normale; - multiplicarea celulelor mutante poate fi mai lent sau mai rapid dect acea a celulelor nemodificate; - aciunea genelor sau a genotipurilor mutante poate fi favorabil sau letal organismelor; - toate acestea fac ca numrul de mutaii s sufere mereu modificri. Numrul de mutaii, fiind foarte mare, este greu de determinat frecvena fiecreia n parte. De aceea, se poate face o apreciere cantitativ a lor dup numrul de gamei care posed mutaii. Aceast apreciere global se refer de fapt
218

numai la frecvena unei singure gene mutante sau a unei clase oarecare de mutaii. Mai trebuie adugat c mutaia germinal nu se produce ntotdeauna n gamei, ci i n gonii, care n urma diviziunilor celulare produce gamei mutani. Dac folosim metoda unei clase de mutaii trebuie s subliniem c mutaiile letale nu reprezint o clas omogen; ele pot s apar sub influena a mai multor cauze: mutaii genice, cromozomice, efecte de poziie etc. n afar de factorii analizai mai sus, frecvena mutaiilor este influenat i de hibridare; la organismele hibride, fa de cele homozigote, pentru acelai locus frecvena mutaiilor este mai mare. De asemenea, procesul mutaional spontan este influenat i de starea fiziologic i biochimic a organismului.

11.4. MUTAIILE ARTIFICIALE

Odat cu descoperirea unor factori ce pot fi folosii de om n obinerea de mutaii, interesul oamenilor de tiin pentru studiul acestora i a efectelor pe care le produc asupra organismelor a crescut foarte mult. Paralel cu aceste studii s-au elaborat i s-au perfecionat metodele pentru producerea de mutaii artificiale, denumite i induse. Dintre factorii mutageni folosii de om pentru prima dat, au fost razele X. n anul 1925, G. A. Nadson iradiind ciupercile inferioare cu raze X a obinut mutaii morfo-fiziologice. Aciunea mutagen a razelor X a fost demonstrat de H. J. Mller n 1927 i 1928 la Drosophila. Rezultatele le public n lucrarea Transmutaia artificial a genei, (laureat Nobel n 1946). Tot n aceast perioad, L. J. Stadler ntre 1927 i 1929, obine cu ajutorul radiaiilor, mutaii la orz, porumb i tutun.

Fig. 11.2. Indivizi normali de Drosophila melanogaster (a) i diferite mutante (b, c, d)

219

Descoperirea efectului mutagen al radiaiilor a deschis calea unor ample cercetri tiinifice, importante att din punct de vedere teoretic, ct i practic. T. H. Morgan i coala sa, au obinut la Drosophila peste 500 de forme mutante (figura 11.2). Ulterior, metodele producerii experimentale a mutaiilor la plante, au fost folosite din plin de A. Gustafsson (1954), J. MacKey (1956), H. Stubbe (1959), C. F. Konzak (1957) .a. Dintre agenii mutageni folosii de om i mai bine studiai fac parte: radiaiile, temperatura i unele substane chimice.

11.4.1. Radiaiile mutagene

Radiaiile electromagnetice au o gam de lungimi de und foarte ntins, care variaz de la 10-3 m ct au razele gamma pn la peste 1 m, cazul undelor hertziene. ntre aceste limite se gsesc razele X, razele ultraviolete, razele infraroii. Radiaiile mutagene sunt radiaiile care produc mutaii i din ele fac parte: 1) radiaii ionizante electromagnetice (raze X i gamma); 2) radiaii ionizante corpusculare (radiaii , protoni, neutroni, raze , diferite particule grele); 3) radiaii neionizante (raze ultraviolete). Razele X i gamma, prin energia absorbit, provoac ionizri n esuturile plantei i modific metabolismul celular. Razele X sunt foarte mult folosite, deoarece aparatele Roentgen sunt uor utilizabile. Pentru iradierea cu raze gamma se folosete cobaltul radioactiv. Razele gamma sunt mai penetrante dect razele X. Razele Beta () sunt formate din electroni eliberai de radioizotopii de P32 i S35. Cu acetia se realizeaz soluii radioactive, n care se introduc semine uscate sau germinate. Neutronii sunt particule neutre din punct de vedere electric, rezultai din dezintegrarea atomilor. Ei acioneaz prin curentul dens i ionizant de protoni de hidrogen. Efectul iradierii cu neutroni este mai puternic, cu ct elementele celulei au o structur mai dens (plastide, nuclei i cromozomi). Razele ultraviolete fac parte din spectrul solar invizibil, sunt constituite din fotoni, cu o lungime de und ntre 136 i 4.000 . Absorbite n organism, transform energia lor n reacii chimice, provocnd diferite efecte genetice. Ele au o mai mic putere de ptrundere i sunt absorbite la suprafaa esuturilor. n lucrrile de genetic se folosete mai frecvent aciunea mutagen a razelor X, gamma i a neutronilor termici. Studiul i folosirea radiaiilor n genetic a dus la fundamentarea unei noi ramuri a biologiei radiogenetica care n ultimul timp a cptat o amploare foarte mare. Efectele iradierii asupra plantelor. Efectele produse de radiaii sunt directe i imediate. Seminele tratate cu doze maxime, de obicei nu supravieuiesc, iar embrionii lor, cercetai la microscop conin numeroase zone de esut necrotic. Tratamentele cu doze mai mici duc la apariia de mutaii.
220

Unele substane au o aciune de protecie a organismelor, diminund efectul distructiv al razelor X, cum sunt, de exemplu, substanele reductoare din grupul sulfhidrelor. Seminele uscate, iradiate cu raze X, ntr-un mediu de hidrogen sulfurat, nu manifest perturbri n celulele lor, ntruct acest mediu anihileaz ntr-o msur oarecare, aciunea radicalilor oxidani produi de radiaii. Spre deosebire de aciunea razelor X, iradierea cu neutroni provoac tulburri mai evidente i o sterilitate pronunat a indivizilor n descenden. S-a emis ipoteza conform creia, neutronii ar aciona direct asupra nucleului, iar razele X asupra celorlalte elemente din celul. Dei plantele provenite din iradierea seminelor cu neutroni manifest tulburri profunde, dnd natere la poriuni de esuturi necrotice, rsritul lor este mai uniform, cu un procent ridicat de plante, deoarece n urma iradierii cu neutroni, celulele seminelor rmn viabile ntr-o proporie mai mare i au o turgescen normal. Razele ionizante au o influen duntoare asupra organismelor deoarece ele descompun apa din esuturi n radicali liberi. n organismele care conin o cantitate apreciabil de ap, supuse tratamentului cu radiaii, apa este descompus n elemente componente. Acestea intr n aciune cu restul substanelor biologice din celule i provoac modificri oxidante pronunate. Bacteriile ce atac plantele i animalele, supuse iradierii ntr-un mediu cu o concentraie mai redus de oxigen, devin mai rezistente dup aciunea razelor ionizante. Perturbrile din celulele iradiate sunt datorate i sistrii, ntr-o oarecare msur a activitii enzimelor, care sufer o puternic oxidare. Aciunea razelor ionizante modific i structura nucleo-proteinelor din organism. Vom vedea mai departe c acizii nucleici, att ADN ct i ARN sufer modificri structurale importante i determin modificri fenotipice. Studiile citogenetice arat c n organismele iradiate, celulele i modific mersul diviziunii. Se produc ruperi la nivelul centromerilor, cromozomilor i cromatidelor, perturbri n formarea fusului sau aglutinarea cromozomilor. Ruperile cromozomice duc la restructurri cromozomice, iar frecvena acestora este proporional cu doza de radiaii. Acest lucru este valabil numai n cazul unei singure rupturi. n cazul a dou rupturi frecvena lor este proporional cu ptratul dozei. Ruperile cromozomice depind de faza n care se gsete celula. n ultimele stadii ale mitozei, cromozomii nu par s sufere asemenea rupturi. n interfaz i nceputul profazei ruptura se produce la nivelul ambelor cromatide. n profaz, fiecare cromatid poate s sufere n mod independent aciunea radiaiilor. Numrul de rupturi este proporional cu lungimea cromozomului. Regiunile heterocromatice sunt cele mai sensibile la rupturi. n urma tratamentului cu radiaii sufer nu numai cromozomii ci i citoplasma celulei. Nucleul izolat de citoplasm prin microdisecie i supus unei doze maxime de iradiere (25.000 - 65.000 r), prezint aceleai proprieti chimice i fizice ca i nucleul extras dintr-o celul neiradiat. Nucleul izolat de citoplasm
221

devine radiorezistent. Dac un nucleu neiradiat este inclus ntr-un mediu citoplasmic iradiat vor apare toate radioleziunile caracteristice, fapt ce justific legtura dintre citoplasm i nucleu. Seminele uscate sau umectate, se supun diferitelor doze de iradiere cu raze X, n aparate speciale. Iradierea materialului biologic cu neutroni se face n reactori, ciclotroni i betatroni nucleari. Iradierea plantelor n cursul vegetaiei se face n cmpuri special amenajate n acest scop. Plantele sunt aezate n cercuri concentrice i dup distana fa de sursa de iradiere primesc diferite doze. Doza de iradiere exprim numrul perechilor de ioni ce se formeaz ntr-un anumit volum de aer. Unitatea de iradiere, denumit Roentgen (r) corespunde formrii ntr-un cm3 de aer uscat, la o temperatur de 0oC i la presiunea de 760 mm coloan mercur, a unui numr de 2,1 x 109 perechi de ioni sau ntr-un gram de aer a unui numr de 1,6 x 1012 perechi de ioni. Exist deja stabilit doza critic de iradiere pentru seminele unor plante de cultur. Prin doza critic (DL 50%), se nelege doza la care supravieuiesc 50% din indivizii tratai (tabelul 11.1). Sensibilitatea organismelor fa de aciunea mutagen a radiaiilor depinde de mai muli factori: starea fiziologic a celulei, vrsta esutului, temperatura mediului extern, specie, varietate, soi sau individ .a. Deoarece sensibilitatea plantelor este diferit de la specie la specie s-au stabilit pentru seminele diferitelor plante cultivate i tratate cu raze X doza critic de iradiere. Sau gsit de exemplu 5.000 r pentru seminele de floarea soarelui, 9.000 r pentru seminele de mac i mutar, 15.000 20.000 r pentru gru i ovz, 8.000 pentru fasole etc. Tabelul 11.1. Doza critic pentru diferite specii de plante
Specia de plante Triticum aestivum Helianthus annuus Cannabis sativa Phaseolus vulgaris Hordeum vulgare Secale cereale Avena sativa Brassica napus Solanum lycopersicum Linum usitatissimum Sinapis alba Doza n r 15.000 20.000 2.000 5.000 7.000 8.000 10.000 15.000 10.000 15.000 15.000 20.000 25.000 35.000 30.000 40.000 40.000 50.000 100.000

Frecvena mutaiilor induse este mai mare n cazul tratrii seminelor vechi, pstrate un interval de ani, dect la cele proaspete. Plantele tinere sunt mai sensibile dect cele mature, celulele n diviziunea meiotic sunt mai sensibile
222

dect celulele n diviziunea mitotic, iar cele mai sensibile stadii din cursul meiozei sunt profaza avansat i metafaza. Poliploizii sunt mai rezisteni la iradiere comparativ cu formele diploide nrudite. Astfel, apariia mutailor clorofiliene este mai mic la speciile de gru i orz cu un numr mai mare de cromozomi. Organismele care au o structur ereditar heterozigot tratat cu radiaii produc un numr mai mare de mutaii dect cele homozigote. Mutaia este urmarea unor complicate procese morfofiziologice i biochimice n organism, pentru care i dau concursul o diversitate de factori interni i externi. Pentru studiul complex al acestor factori s-au ntreprins multiple cercetri, dintre care vom meniona pe cele care prezint mai mult interes. S-a studiat aciunea radiaiilor ionizante, n funcie de anumite temperaturi la care au fost inute organismele nainte, n timpul i dup tratament. Aa de exemplu, scderea temperaturii de la 20 30oC la 4oC n perioada tratamentului cu radiaii crete frecvena mutaiilor (aberaiilor cromozomice) la Tradescantia i a translocaiilor i mutaiilor letale la Drosophila. Aplicarea unei temperaturi ridicate (37oC) la o or dup iradiere, de asemeni crete frecvena mutaiilor letale la Drosophila. Lipsa oxigenului sau diminuarea procentului de oxigen din aer n timpul expunerii organismului la iradiaii reduce frecvena mutaiilor letale i a translocaiilor la Drosophila, a mutaiilor la bacterii i diferite aberaii cromozomice la diferite plante (porumb, ricin .a.). Tratamentul combinat al razelor X cu raze ultraviolete sau cu raze infraroii sau a substanei etilamina, duce la o cretere efectiv a mutaiilor. Prin aciunea n complex a factorilor mutageni i a factorilor de mediu, se poate dirija ntr-o msur oarecare obinerea de mutaii artificiale, cu valoare pentru practic. W.R. Kaplon (1953) a descoperit c prin tratarea seminelor de orz cu bioxid de carbon i amoniac nainte de iradiere s-a redus procentul de plante sterile. Se tie c aplicarea colchicinei nainte de iradiere, sporete frecvena de mutaii. F. D. Amato i A. Gustafsson (1948) au tratat semine de orz cu colchicin, dup care le-au supus tratamentului cu raze X. Prin acest procedeu au reuit s modifice frecvena unor mutaii clorofiliene. A sczut frecvena mutaiilor de tip albino-viridis i a crescut procentul mutaiilor de tip xantha alboviridis. Dei s-a cercetat aciunea multipl a factorilor mutageni i a celor externi, foarte multe rezultate rmn nc disparate fr prea multe posibiliti de generalizare. Aceasta se datoreaz necunoaterii n suficient msur a tuturor manifestrilor care stau la baza procesului de apariie a mutaiilor. Pe lng semine, se pot iradia polen, muguri, tuberculi, rizomi, butai etc. n toate aceste cazuri, se aplic doze mai mici de iradiere, n funcie de natura speciei de plante supuse iradierii. Prin experiene s-a stabilit c, n medie, dintr-o 1000 spice de gru, apar 3-7 mai rezistente la cdere, la boli sau mai precoce. n lucrrile de genetic i selecie, prima generaie i generaiile urmtoare se noteaz cu litera iniial a sursei de iradiere, indicnd anul respectiv de studiu. Astfel, generaiile seminelor iradiate cu raze X se noteaz X1, X2, X3
223

etc.; cele iradiate cu neutroni n1, n2, n3, etc.; n ultimul timp s-a admis notarea general a generaiilor cu litera M, care reprezint aciunea oricrei surse a factorilor mutageni (M1, M2, M3 etc.). Plantele din prima generaie, provenite din seminele iradiate prezint uneori modificri teratologice, sunt sterile i au o fertilitate redus. Modificrile morfologice din prima generaie nu se motenesc i poart denumirea de radiomorfoze. Variaiile ereditare se observ foarte rar n prima generaie, deoarece mutaiile sunt n cea mai mare parte recesive i se manifest numai n generaiile ulterioare. Plantele primei generaii iradiate au un pronunat caracter de himere, deoarece se dezvolt din grupe de celule n care apar diferite leziuni i modificri provocate de radiaii. Experienele ntreprinse pentru obinerea unor mutante au dus la crearea de forme cu valoare agronomic superioar la orz, ovz, mazre, soia, in, mutar alb, rapi i altele. Radiaiile ultraviolete sunt mai puin folosite n radiogenetic, deoarece i modificrile genetice pe care le produc sunt mai puin importante. Ele produc mai ales mutaii genice i foarte rar restructurri cromozomice. Provoac toate tipurile de mutaii. Acioneaz mai eficace atunci cnd lungimea lor de und este n jur de 2.600 . Razele cu aceast lungime de und au o aciune mai mare asupra structurii moleculei de ADN, alternd structura normal a bazelor azotate. S-a constatat c bazele pirimidinice sunt mai sensibile fa de aciunea UV dect bazele purinice. Cu ct ne ndeprtm spre stnga sau spre dreapta acestei lungimi de und eficacitatea lor scade. Eficacitatea razelor ultraviolete, n funcie de lungimea de und de 2.600 , coincide de fapt cu spectrul de absorbie al ADN. Razele ultraviolete au o aciune germicid i de aceea n doze mari, aplicate la microorganisme omoar o parte din germeni. Microorganismele sunt ns destul de sensibile la UV. Uneori numai simpla iradiere a mediului de cultur nainte ca el s fie nsmnat, provoac mutaii.

11.4.2. Temperatura
Temperatura este un agent mutagen slab. Aciunea ei a fost sesizat n special la Drosophila. Odat cu ridicarea temperaturii la care sunt meninute mutele, frecvena mutaiilor crete. Creterea sau scderea treptat a temperaturii determin o cretere nesemnificativ a frecvenei mutaiilor. Mult mai eficace sunt ocurile de temperatur, aplicate pentru o perioad scurt de timp. Prin tratarea larvelor de Drosophila cu temperaturi de 36380C, timp de 12 14 ore, frecvena mutaiilor letale crete de dou ori fa de cea a larvelor crescute la temperaturi normale. Dac ocul termic este de 6oC timp de 25' - 40', frecvena mutaiilor crete de trei ori fa de cea a larvelor crescute la temperaturi normale. S-au fcut ncercri pentru a pune n eviden efectul variaiilor de temperatur asupra mutabilitii diferitelor specii de plante i animale, dar nu s-au putut formula concluzii generale.
224

11.4.3. Substanele chimice mutagene

Aciunea mutagen a unor substane a fost pus n eviden mai ales n ultimele decenii. Oehlkers, n 1943 (dup Serra A. J., 1968) descoper aciunea de dezintegrare a cromozomilor de Oenothera prin tratarea acesteia cu uretan. Cercetri sistematice fuseser iniiate nc din 1940 de ctre C. Auerbach i J. M. Robson Primele rezultate s-au obinut prin tratarea Drosophilei cu iperit (gaz mutar), obinndu-se peste 24% mutaii letale sex-linkate. Ulterior s-au obinut rezultate i la plantele superioare, la ciuperci i microorganisme. n prezent, se cunosc un numr foarte mare de substane chimice cu efect mutagen. Dat fiind structura lor, de la cea mai simpl, la cea mai complex, este greu de clasificat dup un anumit criteriu. Modificrile produse de ele sunt asemntoare cu cele ale mutaiilor spontane. Nici una nu posed specificitate pentru inducerea unui anumit tip de mutaie (tabelul 11.2.). Tabelul 11.2. Substane mutagene i eficacitatea lor la cteva specii
Nr crt

Substana mutagen Iperita Apa oxigenat Oxizi organici Formaldehid Diazometan Propiolacton Cazein Uretan Fenoli Etilenimin Ceton Epoxizi i diepoxizi Penicilin Carcinogene Dezoxicolat de Na Acriflavin Clorur de fier Clorur de mangan Clorur de aluminiu

Drosophila + ? + + + ? ? + + + + + ? ? ? ? ? ?

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Cromozomi plante + + + + + + + + ? + + ? ? + ? ? +

Bacterie + + ? + ? ? + + + ? ? ? ? + + + + + ?

Neurospora + + + + + + + + + ? ? ? ? ?

Substanele chimice se administreaz n raport cu specia de plant sau animal. De exemplu, la Drosophila s-a acionat asupra larvelor prin soluii administrate sub form de aerosoli. Substanele ptrund n trahee i de aici ajung n gonade. Substanele se pot introduce direct, n cile genitale a femelei. Prin contact direct cu soluia se pot trata sporii de ciuperci, polenul, meristemele vegetale.

225

Aciunea acestor substane provoac n organismul n care au ptruns modificri biochimice i fiziologice. La nivelul cromozomilor, se produc ruperi cromozomice i ca urmare reconstrucii de diferite tipuri, corelate cu modificri fenotipice. La nivelul genei se produc mutaii genice. ntreaga aciune a substanelor depinde de foarte muli factori pe care-i vom analiza n cele ce urmeaz. n primul rnd, o anumit substan poate avea o influen mutagen asupra unei specii, iar asupra alteia s nu exercite nici un fel de influen. Aa de exemplu, apa oxigenat exercit o influen mutagen la bacterii sau Neurospora, dar nu are nici un efect asupra plantelor. Penicilina constituie factor mutagen numai pentru plante. Tabelul 11.3. Factorii mutageni care blocheaz sinteza bazelor azotate (dup Freese, 1963)
Factorii mutageni 5 aminouracil azaserina benzimidazol cofeina 8 etoxicofeina etiluretan 6 merkaptopurina 5 nitroxinoxalina paraxantina acid tetrametiluric teobromina teofilina insuficiena timinei excesul de uracil Bazele azotate a cror sintez este blocat timina adenina guanina adenina guanina adenina guanina timina adenina guanina adenina guanina adenina guanina adenina guanina adenina guanina adenina guanina adenina guanina Speciile la care s-a observat efectul mutagen Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Drosophila melanogaster Oenothera lamarckiana Drosophila melanogaster Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli

Aciunea mutagen a substanelor depinde i de stadiul de dezvoltare a celulelor sexuate sau embrionare. De exemplu, uretanul are aciune numai asupra celulelor sexuate mascule de Drosophila deja formate i nu influeneaz spermatogoniile.
226

Formaldehida acioneaz numai asupra gameilor masculi, cnd ei se gsesc n stadiu timpuriu de dezvoltare. Asupra femelelor, indiferent de stadiul n care se gsesc, aceast substan nu are nici o influen asupra genelor din ovule. n afar de factorii menionai mai sus, pot exista i diferii factori exteriori, care n combinaie cu agenii mutageni pot mri sau diminua eficacitatea lor. Substanele chimice mutagene care provoac modificri n structura acizilor nucleici sunt foarte variate. Variat este i aciunea lor. Ne vom opri asupra unora dintre ele. Exist o gam de substane, precursori ai ADN, care au o structur analog bazelor azotate, care blocheaz formarea nucleotidelor i n consecin sinteza ADN. n tabelul 11.3 sunt menionate cteva cu aceast nsuire. Dintre ele, azaserina s-a dovedit eficient n blocarea bazelor purinice. Adenina induce aberaii cromozomice att la plante ct i la animale, producnd rupturi i schimburi cromatidice. Unii analogi ai bazelor purinice i pirimidinice pot fi ncorporai n molecula acizilor nucleici n locul bazelor azotate normale. Ei au constituia nucleilor purinici sau pirimidinici la care s-a adugat sau substituit anumite grupri funcionale sau atomi. Cei mai frecvent folosii sunt derivaii halogenai ai uracilului (5-bromuracil, 5-cloruracil, 5-floruracil, 5-ioduracil) sau derivai aminai ai purinei (2 amino-purina i 2,6 diamino-purina). Derivaii halogenai ai uracilului nlocuiesc timina, un analog al acestuia. Aceasta se vede i din constituia lor (figura 11.3.).

Fig. 11.3. Formula structural a timinei i a unui derivat halogenat al uracilului

Bacteria Escherichi coli, fiind cultivat pe un mediu ce conine 5-bromuracil a produs mutante, la care perechea de baze adenina-timina a fost nlocuit cu perechea guanina-citozina, n felul urmtor: adenina-timina-adenina5-bromuracil-guanina-5-bromuracil-guanina-citozina. Mai nti, adenina se leag de 5-bromuracil n loc de timin, dintr-o eroare 5-bromuracil se leag de guanin n locul adeninei, iar, n final, guanina se leag n mod normal de citozin. n mod analog, 2 amino-purina nlocuiete adenina n ncorporare, prin mperechere cu timina: adenina-timina-2-amono-purina-timina-aminopurinacitozina-guanina-citozina. ncorporarea analogilor bazici a fost studiat la fagi i bacterii demonstrndu-se c ncorporarea analogilor are loc numai ntr-o singur caten. O alt categorie de substane (acidul nitros, hidroxilamina, hidrazina .a.) au o aciune primar asupra acizilor nucleici acionnd fie numai asupra
227

bazelor azotate fr a modifica lanul glucido-fosforic, sau modific att bazele azotate ct i lanul glucido-fosforic (alkilanii, peroxizii organici, clorura feroas .a.). Agenii alkilani, dintre care face parte i iperita (gaz mutar) se numesc astfel, deoarece conin un radical numit alkil (metil, etil, propil), care poate fi transferat nucleotidelor. Majoritatea lor opresc diviziunea mitotic, de aceea sunt folosii i n tratamentul cancerului. Ei intr n reacie cu molecula de ADN unde pot produce modificrile urmtoare: ruperea coloanei glucidofosforice, alkilarea bazelor purinice i pirimidinice, depurinizarea moleculei de ADN, blocarea mitozei prin formarea unei legturi transverse intercatenare. Efectul mutagen al agenilor alkilani a fost pus n eviden la bacterii, Drosophila melanogaster, Neurospora crassa, Vicia faba .a. Substanele alkilante acioneaz n perioada S a ciclului mitotic. Acidul nitros (HNO2) este un agent mutagen care acioneaz asupra bazelor purinice i pirimidinice, dezaminndu-le. Prin tratarea ARN din virusul mozaicului tutunului cu acid nitros, se produce dezaminarea bazelor azotate i adenina a trecut n hipoxantin, guanina n xantin iar citozina n uracil (figura 11.4.). Aceste treceri au repercusiuni asupra blocrii biosintezei unei enzime i n consecin asupra unei proteine. Acidul nitros produce mutaii i la fagii T4, la Escherichia coli, la stafilococi .a. Hidroxilamina (NH2OH) acioneaz n special asupra citozinei care face parte din bazele pirimidinice. Ea provoac o dezaminare a citozinei i transformarea ei n uracil. A fost experimentat asupra virusului mozaicului tutunului, asupra fagului T4. Acridinele sunt colorani bazici care produc mutaii, acionnd asupra moleculelor de ADN, dar ale cror mecanisme nu sunt ns bine elucidate. n afar de substanele artate mai sus se mai cunosc i altele cu aciune mutagen: hidrazina, formaldehida, clorura de mangan, peroxizi organici, ap oxigenat, clorur feroas .a.
Fig. 11.4. Dezaminarea bazelor azotate prin aciunea acidului nitros

228

11.4.4. Factorii mutageni biologici

Cercetrile care s-au efectuat n ultimii ani la microorganisme au scos n eviden c virusurile i micoplasmele produc mutaii la plante i animale. Se cunosc ribovirusurile care produc sarcomul la gini i leucemia la psri i mamifere. Dintre dezoxiribovirusuri pot fi menionate: virusul poliomei sau virusul oncogen. Teoria virotic a cancerului uman ctig tot mai mult teren. Este vorba de ribovirusuri defective care se integreaz n cromozomii umani. Dar ptrunderea virusurilor n celul determin restructurri cromozomice, pulverizri cromozomice. Sunt citate chiar i apariii de mutaii genice. Micoplasmele, cele mai mici organisme, de dimensiuni cuprinse ntre cele mai mici virusuri i cele mai mici bacterii, capabile i de via independent, introduse n culturi de celule produc restructurri i pulverizri cromozomice. La nivel molecular, sinteza ADN micoplasmic oprete sinteza ADN n celula gazd.

11.4.5. Mecanismul molecular al mutaiilor

Deoarece un anumit tip de secven nucleotidic este purttoarea unei anumite informaii ereditare, orice schimbare a acesteia schimb i coninutul informaiei. n procesul de diviziune celular, aceast schimbare se va transmite i celulelor fiice. Se cunosc astzi unele substane chimice, care venind n contact cu organismele sau numai cu acizii nucleici extrai din ele, modific structura acestora i fac s apar mutaii. Schimbrile se produc n anumite regiuni ale moleculei i nu au nimic comun cu restructurrile cromozomice ce se produc n cromozomi. Schimbarea secvenei nucleotidelor se refer de fapt la schimbarea bazelor azotate, acestea constituind elementul mobil. Exist mai multe modaliti de schimbare a lor: substituia, deleia, adiia i inversia. Prin substituie, se nelege nlocuirea unei baze purinice sau pirimidinice printr-o alt baz purinic sau pirimidinic. Dac aceast nlocuire are loc numai ntr-o caten, odat cu replicarea moleculei, nlocuirea se va transmite i n catena complementar. nlocuirea este i ea de dou tipuri: a) cnd o baz purinic este nlocuit cu o baz purinic, iar una pirimidinic tot cu una pirimidinic, ea poart numele de tranziie (de exemplu se nlocuiete adenina cu guanina sau timina cu citozina); b) cnd o baz purinic este nlocuit cu o baz pirimidinic sau invers, poart numele de transversie. Deleia este pierderea uneia sau mai multor nucleotide, modificnd mesajul genetic. Adiia este adugirea uneia sau mai multor nucleotide n cadrul secvenei iniiale. Inversia este schimbarea ordinii unui numr de baze ntr-un segment al catenei din molecula ADN.
229

Schematic, cele patru tipuri de schimbri a secvenei bazelor din molecula de ADN se pot prezenta astfel (figura 11.5.).

Fig. 11.5. Diferite tipuri de schimbri ale bazelor azotate din ADN

Pentru a da o explicaie diferitelor tipuri de modificri structurale a ADN, Watson i Crick au emis teoria copierii greite n procesul de replicaie a ADN. Schimbarea de secven a unei baze va comanda n procesul de sintez baza corespunztoare cu care se va lega catena nou, complementar. Aceast nou ordine va fi copiat i la o nou replicaie a moleculei de ADN. Mutaii ale acizilor nucleici s-au obinut prin aciunea cu diferii ageni mutageni, fie asupra organismului, fie direct asupra acizilor nucleici. n cazul radiaiilor ionizante, mecanismul de obinere a mutaiilor la nivel molecular nu este nc complet elucidat. Exist ipoteze, care susin c acestea produc ruperi ale moleculei de ADN, urmate de realipirea fragmentelor n diferite poziii. Razele ultraviolete cu lungimea de und de 2600 acioneaz asupra bazelor purinice i pirimidinice. S-a demonstrat acest lucru acionndu-se direct asupra acestor baze. S-a constatat c acestea sunt sensibile la tratamentul cu raze ultraviolete i se descompun n mod difereniat. Temperaturi anormale pot produce alterri n molecule de ADN: disocierea catenelor i depurinizarea catenelor de ADN.

230

11.5. MECANISME DE REPARARE A ADN

Molecula de ADN are o mare stabilitate datorit modului su de replicare i a sistemului enzimatic, care repar eventualele erori de ncatenare a nucleotidelor. Prin reparaie genetic, se refac unele leziuni la nivelul moleculei de ADN, integritatea materialului genetic fiind protejat. Sistemele de reparare a ADN, sunt destul de diverse, grupndu-se n dou categorii: reparare prereplicativ i reparare postreplicativ. Repararea prereplicativ are loc naintea replicrii macromoleculei de ADN realizndu-se fie pe cale fotoenzimatic, fie prin excizie (Butnaru Gallia, 1999). Repararea fotoenzimatic se realizeaz n prezena unei fotoenzime care poate desface dimerii pirimidinici, formai n urma iradierii cu raze U.V., fr eliminarea de nucleotide. Aceast enzim acioneaz la ntuneric, atandu-se de molecula de ADN, n jurul dimerului timin, iar energia necesar pentru catalizarea clivrii ambelor legturi ale dimerului provine de la radiaia albastr, din spectrul vizibil. De aceea, cnd se utilizeaz radiaiile U.V. ca agent mutagen, frecvena mutaiilor se reduce, datorit procesului reparator. Repararea prin excizie const n nlturarea unor nucleotide lezate i sintetizarea unui nou segment de ADN, proces care are loc att la ntuneric ct i la lumin i presupune participarea mai multor enzime, ce acioneaz succesiv. Endonucleaza, recunoate leziunile existente i hidrolizeaz legturile fosfodiesterice 5' -3'. Repararea ADN se realizeaz cu ajutorul enzimelor de tipul polimerazelor care nlocuiesc nucleotidele excizate i a ligazelor care sudeaz lanul glucido fosforic. Acest proces a fost descris att la procariote, ct i la eucariote. Repartiia postreplicativ, are loc dup replicarea macromoleculei de ADN , afectat de radiaiile UV. La bacterii, cnd n furca de replicare se ntlnete un dimer neexcizat, se formeaz o lacun n molecula de ADN la una dintre catene, iar cealalt cuprinde dimerul. Aceste lacune sunt completate postreplicativ printr-un proces de recombinare genetic, prin care, ntre catenele nou sintetizate se pot produce schimburi reciproce de nucleotide. Pentru repararea postreplicativ prin recombinare este necesar prezena a cel puin dou molecule de ADN identice, pentru ca repararea s se fac cu mare fidelitate (Raicu P., 1997). Un alt sistem de reparare este cunoscut sub numele de sistem SOS. Acest sistem intr n funcie, atunci cnd n molecula de ADN s-au format un numr mare de leziuni, care nu pot fi reparate prin celelalte mecanisme. n acest caz, are loc sinteza unei ADN polimeraze speciale, care tolereaz leziunile i permite replicarea ADN modificat. De aceea, numeroi ageni carcinogeni fizici i chimici, sunt i mutageni datorit inducerii sistemului de reparare SOS.
231

Procesele de reparare a ADN sunt foarte complexe i ele au aprut foarte timpuriu n procesul de evoluie a speciilor, atunci cnd organismele erau supuse unor doze mari de radiaii UV. Se afirm c aceste procese reparatorii au aprut chiar n cursul trecerii de la genele de tip ARN la cele de tip ADN, fapt ce a permis creterea dimensiunilor moleculei de ADN, implicit a cantitii de informaie genetic.

11.6. IMPORTANA MUTAIILOR

n natur, supravieuiesc formele mutante care favorizeaz individul i deci i specia creia i aparine. Ele pot constitui puncte de plecare pentru formarea de noi specii. Mutaia are, deci, rol n evoluie. Mutaiile artificiale se obin cu ajutorul unor metode ce depind de specie, factorul cu care se acioneaz, momentul n care se aplic tratamentul .a. Dat fiind efectul foarte variat, puine mutaii prezint interes pentru amelioratorul de plante sau animale. De aceea, este necesar pentru obinerea de mutaii valoroase la plantele de cultur s se foloseasc un numr foarte mare de indivizi. De multe ori se opresc drept genitori, mutante care posed multe caractere i nsuiri defectuoase, dar care conin una, dou nsuiri valoroase. Prin hibridare i selecie, aceste caliti pot fi transmise la descendeni, realizndu-se noi soiuri. La animalele de producie, s-au folosit i se folosesc puin mutaiile artificiale deoarece formele mutante, cu defecte letale cer cheltuieli care ntrec beneficiile. n general, foarte rar s-a reuit s se obin mutante valoroase. O importan deosebit o constituie obinerea de mutaii la microorganisme. Mutaia i recombinarea, dup prerea unor microbiologi, sunt singurele mecanisme prin care bacteriile pot deveni rezistente sau sensibile la antibiotice. Microorganismele ofer multiple posibiliti de studiu al procesului mutaional, la diferite niveluri de organizare a materiei vii, de la individ pn la molecul. Una din direciile actuale de cercetare a mutaiilor este de a gsi posibilitile de a induce mutaii dup dorina omului. Problema nu va putea fi rezolvat prin studierea mutaiilor cromozomice, care nseamn schimbarea unor segmente mari, de cele mai multe ori cu caracter letal, ci prin mutaiile punctiforme ce se produc n structura moleculelor de acizi nucleici. Aceste schimbri modific biosinteza proteinei i n consecin fenotipul.

232

CAPITOLUL 12 MUTAII N STRUCTURA CROMOZOMILOR

Moto: A manipula natura este privilegiul nostru i va fi poate sfritul nostru. Dar dac noi nu suntem produsul unei mutaii letale, gloria noastr va rmne prin substituirea hazardului cu raiunea. Pn n prezent, evoluia noastr a fost dominat de hazard. Cristian de Duve

Modificrile de structur, restructurrile sau aberaiile cromozomice constituie obiectul unor importante cercetri citogenetice, ele fiind strns legate de modificrile ereditii. La nceput, existena lor a fost numai presupus. C. B. Bridges a bnuit c la Drosophila ar exista o gen recesiv legat de sex, care s-a manifestat numai n momentul cnd poriunea din cromozomul omolog ce coninea alela dominant a fost ndeprtat. Acest fenomen, alturi de alte rearanjamente ale poriunilor din interiorul cromozomilor sau ntre cromozomi diferii au fost considerate de ctre Bridges i A. H. Sturtevant, drept ipoteze pentru a explica diferite manifestri genetice. Prima dovad a unor astfel de restructurri cromozomice a fost adus n anul 1930 prin cercetrile Barbarei Mc. Clintock asupra cromozomilor de porumb n stadiul de pachiten. Cromozomii de la aceast plant au avantajul c prezint n lungul lor nite noduli ce se coloreaz foarte intens (cromozomi heteropicnotici). Cu ajutorul lor au putut fi identificate poriunile de cromozomi restructurate. Autoarea a demonstrat existena a patru feluri de modificri: deficien, dedublare, inversiune i translocaie. O confirmare a existenei restructurrilor cromozomice s-a putut face i prin cercetarea cromozomilor gigantici din glandele salivare de la Drosophila. Starea n care se gsesc aceti cromozomi, n perechi i continu sinaps somatic, face posibil sesizarea modificrilor suferite de un membru al unei perechi. Diferenele de structur pe lungimea acestor cromozomi sunt figurate prin prezena unor discuri (benzi) corespunztoare ntr-o oarecare msur localizrii genelor. Restructurrile cromozomice apar sub influena radiaiilor ionizante, substanelor chimice mutagene i a unor factori de mediu, fie c acioneaz liber n natur, fie c sunt dirijai de om. Ele au fost descoperite mai nti la Drosophila, Zea mays, Datura, psri, obolani. Mecanismul lor de formare pare s fie universal.
233

12.1. TIPURI DE RESTRUCTURRI CROMOZOMICE I COMPORTAREA LOR N MITOZ

Restructurrile cromozomice pot avea loc n dou etape: - declanarea uneia sau mai multor rupturi cromozomice; - pierderea sau realipirea fragmentelor rupte, fie la locul unde s-a produs, fie ntr-un alt loc, care schimb ordinea locilor de pe cromozomi. n primul caz fenomenul trece neobservat, deoarece realipirea realizeaz integritatea iniial a cromozomului; n cel de al doilea caz se produce o restructurare a cromozomului, cu un nou aranjament de gene. Posibilitile de restructurare a cromozomilor ce au suferit una sau mai multe rupturi se pot clasifica n diferite tipuri pe care urmeaz s le descriem: Deficiena este pierderea sau inactivitatea unei poriuni terminale (apicale) din cromozom. Unii geneticieni o mai numesc i deleie terminal. Partea de cromozom rmas, care posed centromerul, poate participa la mitoz ca un cromozom normal, centromerul fiind elementul activ n migrarea lui spre unul din cei doi poli ai fusului. El devine n acest caz un cromozom stabil i se comport ca atare i n mitozele urmtoare. n alte cazuri, la captul cromozomului unde s-a produs ruptura, cele dou cromatide se pot uni formnd un izocromozom cu doi centromeri. n anafaz, centromerii se ndeprteaz spre polii fusului, iar cromozomul este ntins formnd o aa zis punte cromatic. Aceast punte poate mpiedica formarea celor doi nuclei i n consecin celula moare. Adesea, puntea se rupe i anafaza i urmeaz cursul normal. Aceti cromozomi repet acest fenomen i n diviziunile urmtoare. Dar cu ct crete numrul de diviziuni, cu att aceti cromozomi devin din ce n ce mai anormali. n alte cazuri extremitile rupte i pierd puterea de adeziune, iar cromozomul se comport normal. Ruptura poate s se produc n diferite puncte ale izocromozomului. n figura 12.1. a, b, c, d, se pot vedea diferite tipuri de deficiene. Fenomenul de rupere a izocromozomului a fost observat n celulele din albumenul bobului de porumb. Interpretarea definitiv a procesului de realipire a cromatidelor la nivelul la care s-a produs ruptura, s-a observat la unii cromozomi ce au suferit un numr de asemenea cicluri n gametofit, dup care, n urma fecundaiei intr n componena nucleului diploid a sporofitului. O astfel de structur devine deci stabil i se transmite ca atare de-a lungul mitozelor. Fragmentele de cromozomi fr centromeri, cnd nu se realipesc unui cromozom oarecare, rmn dezorientate n placa ecuatorial i nu pot fi incluse n nici unul din cei doi nuclei ce se formeaz spre sfritul mitozei. Ele rmn n citoplasm unde, prin dezagregare, dispar.

234

Fig. 12.1. Diferite tipuri de deficiene

Pierderi de fragmente terminale se pot produce la ambele capete ale cromozomului. Foarte adesea, n aceste cazuri, capetele cromozomului se pot suda ntre ele, formnd n timpul mitozei un cromozom inelar. Dup mrimea fragmentului pierdut, deficienele se clasific n mari i mici. Deficienele mici se pot sesiza numai n cromozomii gigantici. Ele se pstreaz de obicei n stare homozigot i produc efecte asemntoare mutaiei genelor. Deficienele mari acioneaz ca letale dominante atunci cnd se gsesc n stare heterozigot. n aceast stare se pot pstra. Cromozomii cu deficiene care posed centromeri, i pstreaz proprietatea de autoreproducere. Deficiene mari au fost puse n eviden, att pe cale citologic, ct i prin metode de analiz genetic. Ele au fost constatate pentru prima dat la Drosophila de ctre Bridges (1916). El ncrucieaz un mascul cu ochi albi i de form bar cu femele cu ochi roii i de form normal. Culoarea alb a ochilor i forma normal sunt nsuiri recesive. n F1 obine indivizi ce posedau nsuirile dominante, ochi roii si de form bar, dar i un individ cu ochi roii i de form normal. Autorul consider c forma normal s-a motenit fenotipic n lipsa sau inactivitatea unei poriuni ce coninea alela dominant a genei bar. O astfel de manifestare poart numele de pseudodominan. Tot la Drosophila se mai cunoate un caz analog, n care s-a urmrit aciunea de trei perechi alele: culoarea galben sau cenuie a corpului produs de gena Y i Y+, culoarea alb sau roie a ochilor, produs de gena w i w+ i prezena sau absena perilor bifurcai produi de gena f sau f+. Prin ncruciarea femelelor de tip slbatic cu mascul ce poart cele trei gene menionate mai sus au aprut n F1 indivizi la care, pe lng caracterele dominante, a aprut culoarea alb a ochilor i caracterul pr bifurcat. Explicaia este c gena w i gena din imediata apropiere a ei, care produc bifurcarea prului, se gseau pe un segment din cromozomul omolog ce a fost suprimat. S-au evidenia n acest caz, alelele recesive. Exist o gen (rv) la oarece care, n stare homozigot, produce micri de rotire n jurul unui picior posterior (oareci dansatori sau valseuri). Prin
235

ncruciarea unei femele purttoare a acestei gene n stare homozigot cu un mascul normal, se obin indivizi normali, dar i unii care valseaz. Analiza citologic la aceti indivizi a artat c este vorba de o deficien cromozomic. Deleia este tot o deficien, dar a unui fragment cromozomic din interiorul lui. Ea se mai numete i deficien intercalar. (fig. 12.1. e). Pentru producerea ei sunt necesare dou rupturi n cromozom. Eliminarea fragmentului atrage dup sine scurtarea cromozomului. Dac cromozomul nu pierde i centromerul, poate deveni stabil i se multiplic ca un cromozom normal. Fragmentul fr centromer i sudeaz capetele lund forma unui inel, care n cele din urm dispare. Dac fragmentul posed centromer, el ia forma unui inel cu posibiliti de perpetuare a acestui fenomen n cursul mitozelor urmtoare. n diviziune, cele dou cromatide ale inelului se pot uni. Cei doi centromeri, avnd tendina de a se ndeprta la poli, n anafaz formeaz o punte ce mpiedic formarea celor doi nuclei. Dac ea se rupe, cromatidele surori vor reconstitui inelele n diviziunea urmtoare i fenomenul se va repeta fie pn la moartea celulei, fie pn la dispariia total a cromozomului. Dac asemenea rupturi se produc la doi cromozomi diferii restructurarea ce poate s apar are loc prin schimbul de fragmente ntre cei doi cromozomi. Cnd sunt implicai trei cromozomi, combinaiile care pot s apar prin schimb sunt din ce n ce mai complexe. Duplicaia este dublarea unei poriuni din cromozom cu un stoc de gene identice fig. (12.1. f.). Odat cu pierderea unui fragment dintr-un cromozom poate apare prin alipirea acestuia la omologul su, o duplicaie. Fenomenul provoac schimbri fenotipice oarecum uor de sesizat, dar greu de pus n eviden din punct de vedere cariologic. Duplicaia poate s apar i n urma unui crossing-over inegal. Bridges (1919) a obinut asemenea restructurri prin tratarea drosofilei cu raze X. Reducerea suprafeei ochilor la Drosophila (forma bar) este urmarea multiplicrii poriunii de cromozomi care rspunde de numrul de omatidii ale ochiului. Exist o relaie cantitativ ntre mrimea ochiului i multiplicarea segmentului 16A din cromozomul gigantic. Cnd este n cantitate dubl produce fenotipul bar, iar cnd este n cantitate tripl, fenomenul ultrabar (fig. 12.2.). Apariia de aripi proase la Drosophila este urmarea dublrii poriunii terminale a celui de-al doilea cromozom. Inversia const n ruperea unui segment netelomeric din cromozom i realipirea fragmentului dup o rotaie de 1800. Fragmentul aparine unei poriuni din interiorul cromozomului, separat prin dou rupturi. Inversii terminale nu pot s apar deoarece partea terminal a cromozomului nu are proprietatea de a se suda la nivelul unei rupturi. Inversiile pot fi homozigote i heterozigote (fig. 12.3.). Cnd sunt homozigote i au un caracter recesiv letal nu se pstreaz i de aceea pot fi descoperite numai n stare heterozigot. Pot fi de asemenea observate n cromozomii gigantici sau n studiul de pachiten al meiozei. Se ntlnesc la plantele i animalele din natur i se pot obine artificial prin tratamente cu radiaii ionizante sau substana chimice.
236

Fig. 12.2. Diferite tipuri de ochi la Drosophila n funcie de multiplicarea segmentului 16A din cromozomul X

Fig. 12.3. Inversia: a)-cromozomi omologi normali b)-inversie heterozigot c)-inversie homozigot

Inversia poate constitui un criteriu de determinare a varietilor din interiorul speciilor. De exemplu la Drosophila pseudoobscura varietile se pot deosebi dup o inversie. Geneticienii consider c fenomenul inversiei are un rol important n geneza speciilor. La porumb, inversia prezint importan pentru crearea de linii cu polen steril. Sterilitatea este urmarea perturbrilor ce apar n meioz datorit unor restructurri i despre acest fenomen vom vorbi cnd se va descrie comportarea cromozomilor restructurai n meioz.
237

Translocaia este fenomenul de transferare a unor segmente cromozomice ntre cromozomi neomologi. Acest tip de restructurare este destul de frecvent i cuprinde mai multe tipuri: - translocaia simpl, cnd segmentul detaat de la un cromozom se intercaleaz n ruptura unui cromozom neomolog, - translocaia reciproc este prezena a dou rupturi n doi cromozomi diferii i schimbul de segmente lipsite de centromeri. Dac cele dou rupturi se produc la doi cromozomi omologi, n puncte omoloage, atunci schimbul de segmente este echivalent cu schimbul produs prin crossing over. Cnd unul din cele dou segmente posed centromer iar cellalt nu, se formeaz doi cromozomi, unul cu doi centromeri, iar cellalt lipsit de centromer. Acesta din urm nu este viabil i se pierde, cellalt n schimb poate s participe la un numr oarecare de mitoze, formnd puni cromatice ca i n cazurile descrise anterior. n figura 12.4. se poate vedea o translocaie heterozigot i alta homozigot ntre dou perechi de cromozomi.

Fig. 12.4. Translocaia: a)-cromozomi omologi normali b)-translocaia heterozigot c)-translocaia homozigot

Translocaia are drept urmare schimbarea ordinii genelor n grupele de linkage. Aceast particularitate ne ajut la descoperirea fenomenului. Se fac ncruciri ntre indivizi care au bine precizate grupele de gene cuplate i pe care noi le putem identifica prin anumite gene. Prima dovad citologic a translocaiei a fost adus de C. Stern (1931) care a urmrit n paralel aspectul genetic i citologic al translocaiei reciproce la Drosophila. Este vorba de o translocaie ntre cromozomii sexului X i Y. Translocaia este nsoit de modificri fenotipice i de aceea prezint un rol important n evoluia natural a speciilor. O putem induce i pe cale artificial, cu ajutorul factorilor mutageni. Prin selecie, putem separa i nmuli formele de plante i animale utile. Exist genuri de plante n care, translocaia are loc foarte frecvent: Oenothera, Datura, Campanula . a.
238

Translaia (transpoziia) este transferul unui segment dislocat, ntr-o alt poziie (fisur), a aceluiai cromozom. Segmentul translat, se poate intercala, n poziie normal sau inversat. Aceast restructurare nu modific numrul genelor/genom, modificndu-se ns, ordinea (poziia) genelor. n mitoz, citogenetic, este dificil de evideniat.

12. 2. RESTUCTURRILE CROMOZOMICE I MECANISMUL MEIOZEI

Restructurrile, numite i aberaii cromozomice apar n anumite celule, se pot multiplica odat cu multiplicarea acestora, prin mitoz. n general, numai unul din cromozomii omologi ai celulelor somatice este afectat i ca urmare, ele au o structur heterozigot. Important de tiut este comportarea acestor cromozomi n procesul de formare a celulelor sexuale. Studiind comportarea cromozomilor n meioz, putem identifica diferite tipuri de restructurri. Absena unui fragment (deficien sau deleie) atunci cnd este homozigot nu mpiedic conjugarea cromozomilor n meioz, dar organismele cu astfel de deficiene nu sunt viabile dect dac segmentele respective aveau un numr mic de gene i de mic importan pentru viaa individului. Deficiena sau deleia sunt fenomene greu de sesizat. Numai n cazul n care, fragmentul pierdut este destul de mare, se poate determina prin msurtori. Cromozomii gigantici din glandele salivare de la Drosophila constituie un material propice pentru studiul citologic al acestora. Se tie c aceti cromozomi omologi sunt conjugai n celulele somatice (conjugare somatic). Sa observat la ei prezena unor deleii care oblig cromozomul complet s descrie un fel de bucl n dreptul unde partenerul este lipsit de un fragment (figura 12.5.). Aceasta are loc numai n cazul strii heterozigote, cnd poriunea cromozomilor normali nu are poriune omoloag corespunztoare. Fenomenul dovedete n plus exactitatea sinapsei omologilor n zigonema.

Fig. 12.5. Conjugarea a doi cromozomi omologi n meioz cnd unul dintre ei a suferit o deleie

239

Deleia heterozigot, chiar dac sufer sau nu un crossingover n timpul meiozei, va duce la formarea a dou tipuri de gamei n proporii egale: unii cu cromozomi normali i alii purttori ai deleiei. La organismele autogame, prin autofecundare se obin homozigoi normali, heterozigoi i homozigoi pentru deleie, dar care nu sunt viabili. Spre deosebire de deleie, duplicaia homozigot produce modificri, care ns nu afecteaz dect n unele cazuri viaa individului. Ea se transmite la urmai fr a produce perturbri n meioz. Duplicaia heterozigot duce ns la perturbri n conjugarea cromozomilor n meioz, iar gameii formai pot deveni sterili. Inversia heterozigot n zigonema face ca ambii omologi s formeze cte o bucl n care cromozomii parcurg sensuri diferite pentru asigurarea omologiei genelor alele. S urmrim cum decurge meioza n cazul cnd chiasma este situat n interiorul buclei de inversie. Se pot ivi dou situaii: bucla conine sau nu centromerul. n prima situaie, cnd bucla include centromerul, n meioz se formeaz patru tipuri de gamei: doi dintre ei conin cromozomi normali, iar ceilali doi cu structuri modificate i neviabili (fig. 12.6.).

Fig. 12.6. Conjugarea cromozomilor n cazul unei inversii heterozigote cnd centromerul este situat n interiorul buclei

n cea de-a doua situaie, crossing-over-ul produs n interiorul buclei duce la formarea a dou cromatide aberante, dintre care una posed doi centromeri, iar cealalt nici unul (figura 12.7.). i n cazul acesta singurii gamei viabili sunt cei cu cromozomi nerecombinai. Se poate trage concluzia c inversia heterozigot poate avea ca urmare blocarea crossing-over-ului la fragmentul respectiv i nu i la cellalt bra al cromozomului. Nu trebuie ns s considerm c inversia este singura cauz a blocrii crossing-over-ului. Mai pot exista i mutaii genice ce pot mpiedica crossing-over-ul.

240

Fig. 12.7. Conjugarea cromozomilor n cazul unei inversii heterozigote cnd centromerul se gsete n afara buclei

La inversiile homozigote viabile, meioza decurge normal deoarece i conjugarea cromozomilor este normal. De asemenea i crossing-over-ul, n acest caz, decurge normal. n funcie de lungimea segmentului inversat i de numrul de crossingovere ce au loc, apar direct proporional mai muli sau mai puini gamei neviabili. Translocaiile complic i mai mult mersul meiozei. S urmrim cum decurge meioza la un organism heterozigot pentru o translocaie reciproc dintre doi cromozomi neomologi. Conjugarea segmentelor omoloage n profaza meiozei duce la aranjamentul cromozomilor n form de cruce (fig. 12.8.). Evoluia mai departe a cromozomilor va depinde de localizarea chiasmelor n diferite pri ale cromozomului: - dac cele dou segmente translocate vor fi foarte scurte, ntre perechile omoloage ale acestora nu se vor forma chiasme, iar n metafaz cei patru cromozomi vor segrega i vor forma grupe de cte doi. Ei vor conduce la formarea a patru tipuri de gamei, din care doi sunt dezechilibrai, posednd cromozomi cu poriuni translocate (fig. 12.8. a i b), zigoii rezultai din astfel de gamei nefiind viabili. - dac cele dou segmente translocate vor fi lungi, ntre perechile omoloage ale acestora se vor forma chiasme care, deplasndu-se spre capetele cromozomului, vor forma n metafaz o figur n form de inel (fig. 12.8. b), care poate lua i forma de 8 (opt), aa cum reiese din figur.

241

Fig. 12.8. Conjugarea i comportarea ulterioar a cromozomilor n meioz, n cazul unei translocaii heterozigote: a). poriunile translocate sunt scurte; b). poriunile translocate sunt lungi.

n primul caz, n anafaz, cromozomii se despart, migrnd la fiecare pol cte un cromozom normal i unul translocat. Gameii care se vor forma vor fi dezechilibrai, neviabili, deoarece prezint duplicaii sau deficiene. n cel de-al doilea caz, cnd cromozomii se dispun n form de 8, jumtate dintre ei cei normali migreaz ctre un pol, iar cealalt jumtate cei translocai ctre cellalt pol. Dup cum este firesc, n primul caz se vor forma gamei fertili, iar n cel de-al doilea caz, gamei sterili. Forma de inel sau de 8 depinde de lungimea segmentelor translocate, de poziia centromerului, precum i de dispoziia chiasmelor. Unele translocaii heterozigote au devenit stabile i constituie elemente ce difereniaz structural cromozomii speciilor apropiate. Ele constituie o stare normal n genotip la genurile Oenothera, Datura, Campanula . a. Dup numrul perechilor de cromozomi ce au suferit translocaie, se formeaz: inele din patru elemente - cnd exist o translocaie reciproc, inele cu ase elemente cnd exist o translocaie ntre trei perechi de cromozomi. Asemenea formaii perturb combinaia liber a cromozomilor i segregarea genelor. Analiza cromozomilor n meioz ne ajut la identificarea translocaiilor. Cnd se observ dispoziia n cercuri a patru cromozomi vom ti c este vorba de o translocaie homozigot. Ea se obine ncrucind indivizi heterozigoi i homozigoi prin translocaie i analiznd apoi meioza la hibrizii obinui. Prin ncruciarea ntre ei a indivizilor heterozigoi prin translocaie se va produce trei
242

categorii de indivizi: homozigoi normali, heterozigoi prin translocaie, homozigoi prin translocaie reciproc. Indivizii heterozigoi prin translocaie reciproc la plante se mai pot identifica analiznd viabilitatea polenului. Exist o translocaie cnd numai 50% din polen este viabil. S analizm acum influena pe care o are translaia asupra mersului meiozei. Vom considera o pereche de cromozomi la care unul din ei a suferit o translaie. mperecherea locilor omologi face ca cei doi cromozomi s fac dou bucle situate la niveluri diferite. Dup poziia centromerilor se pot ivi dou situaii. (figura 12.9.). S considerm c n una din situaii centromerii se gsesc n poriunea dintre dou bucle, aa cum arat fig. 12.9. a. n meioz vor aprea patru tipuri de cromozomi. Dac nu se produce nici un crossing-over n regiunea cuprins ntre bucle, apar dou tipuri de cromozomi normali. Dac crossing-over-ul are loc n aceast regiune, apar dou tipuri de cromozomi, dintre care unul poart o duplicaie i altul o deleie. A doua situaie corespunde prezenei centromerilor n interiorul celor dou bucle(fig. 12.9. b). Un crossing-over, ce s-ar produce n regiunea dintre bucle va da natere la cromozomi nefuncionali, deoarece unul va conine doi centromeri, iar cellalt nici unul. n caz contrar vor aprea cromozomi funcionali. O translaie poate mpiedica crossing-over-ul ntr-un segment ce a suferit aceast deplasare.

Fig. 12.9. Conjugarea cromozomilor cu structur heterozigot n cazul unei translocaii: a- centromerul se gsete ntre cele dou bucle; b- centromerul se gsete n interiorul buclei. 243

12.3. EFECTUL DE POZIIE

n cursul aciunii lor, genele se influeneaz una pe alta. ntr-un capitol anterior s-a studiat tocmai aceast interaciune dintre gene. Este logic s admitem c schimbarea ordinii de cuplare a genelor, datorit restructurrilor cromozomice modific aciunea genelor i, n consecin, i fenotipul. Efectul pe care-l produce o gen n funcie de poziia ei pe cromozom s-a numit efect de poziie. Termenul a fost introdus de A. Sturtevant (1925) i tot el a fost cel care l-a demonstrat. Este vorba de o form mutant de Drosophila ce prezint o reducere a numrului de omatidii (faete), nsuire numit bar. nsuirea bar este legat de o gen semidominant B, localizat pe cromozomul X. Cercetrile de astzi pun la ndoial prezena, n cazul de fa, a unui efect de poziie. Efectul bar este datorat unor duplicaii a regiunii 16A, notat astfel pentru cromozomii uriai din glandele salivare la Drosophila. Un crossing-over n aceast regiune produce o triplare a segmentului, iar efectul de reducere ochiului este i mai puternic i se numete ultrabar. S-ar prea c numrul de doze a genei pot s mreasc intensitatea fenomenului. Dar la acelai numr de doze, cteodat, efectul nu este exact acelai. Diferenele sunt puse pe seama efectului de poziie a genei. Dac exemplul de mai sus a pus unele semne de ntrebare, fiind greu s se delimiteze efectul duplicrii de efectul de poziie al genei, exista la Drosophila alte exemple, unde efectul de poziie este mai sigur: efectul mpestririi (panaurii). La Drosophila, prin ncruciarea dintre femele homozigote pentru gena white (ochi albi) cu masculi ce posed alela normal w+ (ochi roii), dar supui unui tratament cu raze X, se obin indivizi cu ochi normali (roii). Generaiile ce se obin din acetia prezint ns omatidii ce au diferite nuane de rou. nsuirea aceasta este nsoit ntotdeauna de restructurri cromozomice n apropierea locusului genei white. Explicaia fenomenului s-a fcut cu ajutorul a dou ipoteze: a) odat cu restructurarea cromozomului s-a produs o mutaie genic; b) poziia genei white i pstreaz locusul, dar este influenat de genele din apropiere, nou venite odat cu restructurarea cromozomului. A doua ipotez pare mai verosimil. O dovad i mai convingtoare l ofer exemplul clasic ce privete aciunea genei recesive hairy (h), localizat n braul stng al cromozomului 3 la Drosophila. n stare homozigot, aceast gen determin apariia periorilor numai pe unele pri ale corpului, mai ales pe scutelum. Ea acioneaz n stare heterozigot numai cnd are loc o translocaie ntre cromozomii III i IV. n cazul revenirii n cromozomul III, unde este localizat normal, ea i restabilete aciunea iniial. Aceast constatare a evideniat, n plus, faptul c efectul de poziie poate fi reversibil.
244

Efectul de poziie este mai bine cunoscut pentru aciunea unor gene la Drosophila i mai puin cunoscut pentru alte organisme. Fenomenul mpestririi (panaurii) la Oenothera blandina (obinut de De Vries prin mutaie din O. lamarckiana) sau Zea mays se pare c nu este strin de efectul de poziie a genei ce rspunde de aceast nsuire. La Zea mays, efectul de poziie a fost semnalat de Barbara Mc Clintock (1950-1955), identificnd doi loci care pot dirija efectul unor gene. Locusul Ac este activator i se comport dominant, locusul Ds de disociere este recesiv, nefiind funcional. n absena lui Ac, B. Mc Clintock a demonstrat experimental c activitatea genelor depinde de tipul de cromatin a cromozomului. La porumb multe gene cu expresie fenotipic diferit sunt limitate de aciunea genelor Ac i Ds, schimbndu-i penetrana i expresivitatea. Genele Ac i Ds, dar i altele, i pot schimba locusul n interiorul cromozomului, dar i ntre cromozomi neomologi, fenomen denumit transpoziie, iar genele respective, gene transpozabile sau transpozoni. Lumea tiinific a privit cu nencredere existena elementelor transpozabile (mobile) n genom, dar timpul a demonstrat realitatea, B. Mc Clintock fiind laureat a Premiului Nobel n anul 1983.

12.4. RESTRUCTURRILE CROMOZOMICE I IMPORTANA LOR PENTRU EVOLUIE

Restructurrile cromozomice sunt determinate n majoritatea cazurilor de influena agenilor externi, fizici sau chimici, precum i de o anumit stare fiziologic a organismelor. Ele se produc n dou etape: ruperea unor fragmente din cromozomi i reunirea lor ntr-un anumit mod, la acelai sau la ali cromozomi. Atunci cnd au loc n interfaz, se numesc cromozomice, iar cnd au loc n timpul diviziunii, n stadiul de dou cromatide ale cromozomului, cromatidice. Dup modul de fragmentare i alipire, exist mai multe tipuri de restructurri (aberaii) pe care le-am descris anterior. Oricare ar fi tipul de restructurri, ele stau la baza schimbrii ordinii genelor n grupele de cupare, modific transmiterea normal a genelor la urmai i modific fenotipul organismelor. Restructurrile cromozomice, avnd rol n mecanismele de recombinare a genelor, contribuie la evoluia speciilor n natur i la formarea unor forme de plante i animale cu nsuiri valoroase. Selecia natural, n lupt pentru existen, i selecia artificial, de interes economic, va alege i va perpetua indivizii care poseda reconstrucii cromozomice, fie n interesul individului din natur, fie n interesul omului. Reconstruciile cromozomice produc variaii n cadrul speciei. Noua succesiune a genelor n grupele de linkage aduce modificri n aciunea lor, iar imposibilitatea conjugrii cromozomilor n meioz, asigur izolarea noilor forme.
245

Bineneles c nu toate aceste forme supravieuiesc i c este vorba numai de cele viabile i adaptabile la condiiile de existen. Se tie c, spre deosebire de autozomi, cromozomii sexului nu sunt omologi, dect n unele mici poriuni. Cromozomul Y este de obicei mai mic i aproape inert din punct de vedere genetic. Neomologia acestor cromozomi este atribuit astzi restructurrilor cromozomice, care au avut loc n interiorul genomului pe parcursul evoluiei. Concluzia logic ar fi c, prin translocaie au fost transportate poriuni din autozomi n cromozomii sexului. De aceea, la unele specii, numrul cromozomilor sexului se mrete. Cromozomii sexului mpiedic ncruciarea indivizilor din specii sau varieti strine.

246

CAPITOLUL 13 MUTAIILE DE GENOM

Moto: "Natura nu are nici un respect pentru via. Natura trateaz viaa ca i cum ar fi lucrul cel mai nensemnat din lume. Produs de milioane de ori, ea este n cea mai mare parte anihilat rapid sau aruncat ca o prad, pentru ca o alt via s se poat hrni. <S nu chinui, s nu pedepseti>. Natura ignor aceast porunc. Fpturile sale depind de torturile pe care i le aplic reciproc n lupta etern" Erwin Schrdinger

Speciile de plante i animale posed n mod obinuit un numr constant de cromozomi, n celulele somatice 2n, iar n cele sexuale, n. Numrul de cromozomi a speciilor eucariote variaz n limite foarte mari: Ascaris megalocephala var. univalens are 2n = 2, n timp ce radiolarul Aulacantha 2n = 1600. n cadrul unor genuri, s-a constatat c unele specii au un numr de cromozomi ce reprezint un multiplu al unui numr de cromozomi de baz sau genom, care se noteaz cu x. De exemplu, n cadrul genului Triticum, exist specii ce posed 14, 21 i 42 de cromozomi, deci, un multiplu al genomului x = 7; n cadrul genului Rosa, speciile pot avea 14, 21, 28, 35, 42, 56 cromozomi, genomul n acest caz fiind x = 7 .a. Celulele sexuale, coninnd cte un set cromozomic, sunt haploide. Numrul haploid de cromozomi (n) nu corespunde ntotdeauna cu numrul de cromozomi de baz (x). De exemplu, la Triticum monococcum x = 7 i n = 7, pe cnd la Triticum aestivum, x = 7 dar n = 21. Cnd numrul haploid de cromozomi corespunde cu numrul de cromozomi de baz (genomul sau numrul monoploid), numrul cromozomilor din celulele somatice corespunde cu starea diploid a organismului, iar cnd n celulele somatice exist un multiplu al numrului monoploid, determin starea poliploid. Fenomenul de multiplicare a numrului de genomuri se numete poliploidie. Poliploidia este considerat o mutaie de genom. Exist cazuri cnd variaia numrului de cromozomi se manifest chiar la nivelul unor esuturi diferite ale aceluiai individ. Astfel, n cazul spanacului (Spinacea oleracea) care are 2n = 12, n celulele meristematice ale rdcinilor sau identificat n celule cu 2n = 24, 48 i 96 cromozomi, iar la mamifere, n ficat, sunt celule cu numr dublu sau quadruplu de cromozomi.

247

13.1. CLASIFICAREA VARIAIILOR NUMERIC CROMOZOMICE

innd seama de multitudinea de tipuri de variaii numeric cromozomiale, este necesar clasificarea acestora, folosindu-se nomenclatura din literatura de specialitate. Aceast clasificare este redat n figura 13.1. Euploidia se mparte n: monoploidie, cnd celulele somatice ce posed un numr de cromozomi egal cu cel al genomului (x) i poliploidie, cnd celulele somatice au un multiplu al numrului de genomuri. monoploidia Euploidia poliploidia alopoliploidia (amphiploidia) Variaii numeric cromozomice nulisomia (2n-2) hipoploidia monosomia (2n-1) Aneuploidia trisomia (2n+1) hiperploidia tetrasomia (2n+2)
Fig.13.1 Clasificarea variaiilor numeric cromozomice

perisoploidia autopoliploidia artioploidia

n funcie de numrul garniturilor cromozomice poliploizii pot fi triploizi (3x), tetraploizi (4x), pentaploizi (5x), hexaploizi (6x) etc., observndu-se c unii conin un numr par de genomuri i se numesc artioploizi (4x, 6x, 8x etc.), iar alii un numr impar de genomuri, denumii perisoploizi (3x, 5x, 7x, 9x etc.). n funcie de originea garniturilor cromozomice poliploidia poate fi de mai multe tipuri: autopoliploidia, cnd organismele posed mai multe garnituri omoloage, rezultate prin multiplicarea genomului propriu; alopoliploidia, cnd organismul are mai multe garnituri cromozomice, dar de origine diferit, rezultate n urma hibridrilor interspecifice. Organismele care nglobeaz genomurile a dou sau mai multe specii, urmat de o dublare a numrului de cromozomi, se numesc amphiploide. Poliploidia este urmat de o mrire a cantitii de ADN per nucleu. Exist specii la care, dei are loc o multiplicare a numrului de genomuri, cantitatea de ADN nu se modific acestea fiind denumite pseudopoliploide. Modificarea numrului de cromozomi dintr-o garnitur cromozomic, prin absena unuia sau a mai multor cromozomi sau prezena n plus a unuia sau
248

mai multor cromozomi, se numete aneuploidie. Mrirea numrului de cromozomi n cadrul genomului se numete hiperploidie, iar micorarea numrului de cromozomi, hipoploidie. Aneuploidia este nsoit de modificarea cantitii de ADN per nucleu, exist ns i fenomenul de pseudoaneuploidie, cnd numrul de cromozomi din genom variaz, ns cantitatea de ADN rmne constant.

13.2. EUPLOIDIA 13.2.1. Monoploidia

Denumit i haploidia adevrat sau euhaploidie, const n faptul c organismele posed n celulele somatice un numr de cromozomi egal cu numrul de cromozomi de baz sau un genom (2n = x). Avnd un singur genom n celulele somatice, monoploizii au o serie de caracteristici morfologice i biologice, cum ar fi: sunt aproape complet sterili, ceea ce i face inutilizabili n practic. Avantajul monoploizilor const n faptul c, n urma studiilor genetice, dac prezint caracteristici avantajoase, numrul cromozomilor poate fi dublat, obinndu-se linii complet homozigote. Dup testarea capacitii combinative a liniilor respective, unele pot fi folosite ca genitori n obinerea de hibrizi. Utilizarea monoploizilor scurteaz foarte mult timpul de obinere a liniilor total homozigote, de la 6-8 ani dup metoda clasic, la numai doi ani. n mod natural, monoploizii apar cu o frecven redus, de la 0,01% pn la 6%, pe urmtoarele ci: a) ginogenez, cnd embrionii se dezvolt din oosfere nefecundate; b) androgenez, cnd embrionii rezult din celule mascule (fr fecundare); c) apogamie, cnd embrionii rezult din sinergide sau antipode. Avnd n vedere importana monoploizilor, monoploidia a fost indus prin iradierea polenului cu raze X sau UV, pentru a distruge unul din cei doi nuclei spermatici i n felul acesta, reducndu-se posibilitatea fecundrii oosferei, crete ansa apariiei monoploizilor sau inactivarea ambilor nuclei spermatici cu diferite substane chimice, caz n care, oosfera nefecundat poate forma un embrion monoploid. Din punct de vedere morfo-fiziologic, monoploizii, comparativ cu formele normale din care au provenit, au o vigoare redus, cretere lent, grad ridicat de sterilitate. Diviziunea mitotic la organismele monoploide prezint mari modificri, dar mai ales meioza, pe parcursul creia, nerealizndu-se sinapsa cromozomilor, deoarece nu exist omologie ntre cromozomi, nu se formeaz celule sexuale sau cele ce se formeaz sunt neechilibrate genetic, ceea ce determin sterilitatea monoploizilor. Haploidia este fenomenul de reducere la jumtate a numrului de cromozomi n celulele somatice. Dup modul cum rezult din diploizi, tetraploizi,
249

hexaploizi etc., haploizii pot fi: monoploizi, diploizi, triploizi etc. Haploidia corespunde numai ntr-un singur caz cu monoploidia, atunci cnd reducerea la jumtate a numrului de cromozomi are loc la organismele diploide (2n = 2x). Haploidia poate fi ntlnit ca fenomen natural, la unele Bryophitae i Talophitae, la masculii unor insecte (albine, viespi, termite), la unele metazoare i ciuperci (Aspergillus, Fusarium etc.) i n gametofitul plantelor superioare. Cnd haploidia este util, este provocat prin androgenez sau prin eliminarea de cromozomi. Haploizii i monoploizii au o deosebit importan teoretic i practic: - avnd un singur set de cromozomi, studiul fiecrui cromozom a furnizat informaii asupra valorii genetice a unui genom; - din punct de vedere citologic, monoploizii ofer posibilitatea cunoaterii modului de segregare a cromozomilor neperechi, n meioz, realizarea sau nu a sinapsei, arat gradul de nrudire dintre specii; - diploidizarea monoploizilor duce la realizarea liniilor complet homozigote, ntr-un timp scurt; - monoploizii androgeni ofer posibilitatea studiului efectului citoplasmei strine asupra genotipului, transformarea ntr-un timp scurt a liniilor consangvine normale n linii androsterile. n ultimul timp, studiul acestor forme preocup colective mari de geneticieni i amelioratori, deoarece obinerea de hibrizi pe calea monoploidiei este simplificat i de scurt durat.

13.2.2. Poliploidia
Primele cercetri referitoare la fenomenul de poliploidie au fost efectuate de I. I. Gherasimov (1889) care a dublat numrul de cromozomi la alga Spyrogira, prin scderea temperaturii n timpul metafazei. Denumirea de poliploidie a fost introdus de G. Winkler (1916), pentru a desemna plantele ce posedau un numr multiplicat de genomuri. n funcie de originea garniturilor cromozomice, poliploidia poate fi de dou feluri: autopoliploidia (autoploidia) i alopoliploidia (aloploidia). 13.2.2.1. Autopoliploidia este multiplicarea garniturilor de cromozomi pe seama aceluiai numr de baz al unei specii. Multiplicarea este cauzat de tulburri n procesele de diviziune mitotic sau meiotic i anume: - n diviziunea meiotic, din cauza nereducerii cromatice se formeaz gamei cu acelai numr de cromozomi, egal cu cel din celulele somatice. Un asemenea gamet diploid, n procesul de fecundare cu un al doilea gamet, normal, haploid, va forma un zigot, respectiv un organism triploid (2n = 3x). Dac ambii gamei sunt diploizi se va forma un organism tetraploid (2n = 4x). - n diviziunea mitotic pot interveni cauze care s opreasc formarea fusului nuclear, migrarea cromozomilor spre cei doi poli ai celulei ne mai avnd loc. Ca urmare, nu se mai formeaz celulele fiice, cromozomii, n numr dublu, rmn n aceeai celul. Dac fenomenul are loc la nceputul formrii zigotului,
250

organismul devine tetraploid iar gameii pe care i va forma vor fi diploizi. Acetia vor menine mai departe autotetraploidia. - n diviziunea mitotic ntr-un singur organ, de exemplu al unei plante, se va produce la o celul fenomenul de dublare a numrului de cromozomi. Dintr-o astfel de celul, cu un numr dublu de cromozomi, poate lua natere o formaiune vegetativ, o ramur, care va forma n flori gamei diploizi. Prin autofecundare vor aprea forme tetraploide. Mai recent J. A. Serra (1968) consider ca prim factor al formrii autopoliploizilor endomitoza, n care nu se formeaz fusul de diviziune, membrana nuclear nu se fragmenteaz, astfel c un nucleu diploid devine 4n, 8n, 16n etc. Se ntlnesc dou tipuri de plante autopoliploide: Perisoploide, cu un numr impar de garnituri cromozomice (3x, 5x, 7x). Din cauza numrului impar de genomuri repartiia echilibrat a cromozomilor n gamei nu este posibil, astfel de plante vor produce gamei sterili, supravieuind numai prin reproducerea vegetativ. Artioploide, cu un numr par de garnituri cromozomice (2x, 4x, 6x). La aceste plante meioza decurge normal. Cu toate acestea, cromozomii omologi, n profaza meiozei, se asociaz n mod diferit, formnd univaleni. Dac polivalenii au un numr impar de cromozomi, repartiia regulat a cromozomilor la cei doi poli ai celulei devine imposibil i, ca urmare, gameii formai sunt sterili. Prezena sterilitii la un numr mare de plante autopoliploide a determinat pe unii autori s considere c exist o corelaie ntre autopoliploide, sterilitate i nmulirea vegetativ a plantelor. La genurile Chrysanthemum, Polygonum i Discorea, formele diploide nu au rizomi, n timp ce cele tetraploide, hexaploide i octoploide au. Din cauza sterilitii ele s-au meninut pe cale vegetativ. Meioza la autotetraploizi este variabil, putnd decurge normal, dar existnd i posibilitatea apariiei multor anomalii. Aceste anomalii se datoreaz prezenei n profaza I a cte patru cromozomi omologi, deci n stadiul de zigonem vor forma sinaps patru monovaleni, nu doi (bivaleni). n zigonema pot rezulta urmtoarele asocieri: tetravaleni, trivaleni + univalent, bivaleni + doi univaleni, patru univaleni. n meioza autotetraploizilor, datorit asocierii ntmpltoare a cromozomilor, are loc o segregare fenotipic i genotipic, diferit de cea a diploizilor. La un diploid heterozigot Aa, n F2 segregarea genotipic este 1/4 AA : 2/4 Aa : 1/4 aa, iar cea fenotipic, dominant, recesiv. n descendena autogam a unui tetraploid AAaa, n funcie de repartiia alelelor n cei patru cromozomi, pentru acelai locus pot apare cinci genotipuri: AAAA (quadruplex), AAAa (triplex), AAaa (duplex), Aaaa (simplex), aaaa (nulliplex). Gameii produi de un autotetraploid duplex AAaa (n lipsa crossingover-ului), pot avea urmtoarea structur genotipic i frecven: 1 AA : 4 Aa : 1 aa. ntlnirea ntmpltoare a acestor gamei, n cazul autopolenizrii, n F2 segregarea genotipic va fi: 1 AAAA : 8 AAAa : 18 AAaa : 8 aaaA : 1 aaaa, iar cea fenotipic, 35 A : 1 a.
251

Din cauza deficienelor ce apar n meioz, autopoliploizii nu au, n general, anse de a supravieui, aa c rolul lor n evoluie este mai puin important. Exist specii ale unor genuri care au aprut totui pe calea autopoliploidiei: n genul Chrysanthemum, specii ce au 18, 36, 54, 72, i 90 de cromozomi, n genul Solanum, specii ce au 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108, 120 i 144 cromozomi precum i alte specii ale genurilor Medicago, Arachis, Phleum, Festuca, Poa .a. 13.2.2.2. Alopoliploidia (amphipoliploidia) este tipul de poliploidie care apare n urma hibridrii ntre specii, prin adiia de garnituri cromozomice strine. Diferena dintre genomuri face ca ntre garniturile de cromozomi a alopoliploizilor s nu existe omologie. Acestea sunt diferite att ca numr de cromozomi ct i ca tip de gene. Cnd alopoliploidul nsumeaz cele dou garnituri cromozomice somatice ale prinilor, el se numete amphidiploid. Alopoliploizii sunt n majoritatea cazurilor sterili. Din cauza neomologiei dintre cromozomi, n profaza meiozei fiecare cromozom se comport independent, ca univalent. n anafaza meiozei, ei se distribuie n mod neregulat la cei doi poli, aa nct n gamei va aprea un numr diferit de cromozomi. Gameii vor fi sterili, n afar de cazul unei omologii pariale, cnd fertilitatea lor va fi sczut. Alopoliploizii care nsumeaz cele dou garnituri diploide de cromozomi a celor dou specii parentale se numesc amphidiploizi. Ei sunt fertili deoarece fiecare cromozom avnd omologul su, are cu cine s se conjuge n meioz i formeaz bivaleni pentru cromozomii fiecrei specii n parte.

Fig. 13.2. Fructul i cromozomii de la Raphanus sativum (A) i Brassica oleracea (B) i a ctorva poliploizi (C,D,E,F,G) obinui prin ncruciarea dintre A i B. 252

Dac din gameii care particip la fecundare unul este haploid iar cellalt diploid, se va forma un alotriploid. Acesta este steril deoarece cromozomii unei specii va forma bivaleni, dar a celeilalte vor rmne univaleni i se vor distribui neuniform n meioz la polii celulei. Amphidiploidia prezint importan att pentru meninerea ei n natur ct i pentru activitatea practic a omului. Sunt citate n literatura de specialitate numeroase exemple privind apariia spontan sau dirijat de om a amphidiploizilor. L. Dicby (1912) descrie apariia unui amphidiploid, Primula kevensis (cu 2n = 36) prin ncruciarea dintre Primula floribunda (2n = 18) cu Primula verticillata (2n = 18). G. D. Karpecenko (1927) obine un amphidiploid Raphanobrassica (2n = 36) prin ncruciarea dintre Raphanus sativus (2n = 18) cu Brassica oleracea (2n = 18) (figura 13.2.). J. Gregar i F. Sansome (1930) obin un amphidiploid Phleum pratense hexaploidum (2n = 42) ncrucind Phleum pratense (2n = 14) cu Phleum alpinum (2n = 28). A. Mntzing (1932) obine amphiploidul Galeopsis tetrahit (2n = 32) din ncruciarea lui Galeopsis pubescens (2n = 16) cu Galeopsis speciosa (2n = 16). H. A. Jones i A. E. Clarke (1942) ncrucind Allium cepa (2n = 16) cu Allium fistulosum (2n = 16) au obinut amphidiploidul cu 2n = 32 (fig. 13.3.).

Fig. 13.3. Amphiploidia la Allium cepa: A-cromozomii la Allium cepa; B-cromozomii la amphiploid; C-cromozomii la Allium fistulosum (dup Jones i Clarke, 1942)

Acestea constituie cteva exemple prin care omul, folosind amphidiploidia poate obine forme noi de plante. Dac formele noi prezint avantaje pentru producie, ele pot fi utilizate ca soiuri. Amphidiploidia natural poate constitui puncte de plecare n geneza unor specii noi, dar numai n cazul n care ea modific ereditatea n avantajul perpeturii lor. n caz contrar, dispar fr a lsa urme. Alopoliploizii se pot obine din ncruciarea a dou, dar i a mai multor specii de plante. De obicei, hibrizii dintre dou specii sunt sterili, numai cei amphidiploizi sunt fertili. Acetia, ncruciai cu o alt specie diploid produc un hibrid alotriploid, care de asemenea este steril. Hibridul alotriploid poate deveni
253

fertil n cazul n care reuim s-i dublm garnitura de cromozomi prin autopoliploidie. n funcie de modul cum ia natere, amphidiploidia poate fi de trei tipuri: amphidiploidie genomic, amphidiploidie segmental, autoalopoliploidia. Amphiploidia genomic sau clasic este rezultatul hibridrii ntre specii cu genomuri diferite (ex. AA x BB) i ca urmare, cromozomii uneia nu realizeaz sinapse cu cromozomii celeilalte, planta fiind steril. Prin dublarea numrului de cromozomi a hibridului din generaia F1 se obin amphidiploizi fertili. Amphidiploidia segmental este tipul de amphidiploidie care provine din hibridarea unor specii cu genomuri parial sau complet omoloage, astfel c, dup ce se realizeaz dublarea numrului de cromozomi, n meioz cromozomii nu se mperecheaz normal, ci formeaz tetravaleni, trivaleni i univaleni, determinnd un anumit grad de sterilitate. Autoalopoliploidia este fenomenul prin care se dubleaz numrul de cromozomi la un amphidiploid. De exemplu, amphidiploidul AABB poate deveni un autoalooctoploid, AAAABBBB. Alopoliploidia poate determina diferite grade de sterilitate, deoarece tipurile de abateri de la mersul normal al meiozei sunt foarte variate. Pentru a putea nelege mai bine cum decurge meioza la alopoliploizi este necesar s descriem dou fenomene: autosindeza i alosindeza. Prin autosindez sau autoconjugare se nelege procesul de conjugare, ntre ei, a cromozomilor de la fiecare printe n parte. S presupunem c un aloploid ar poseda un genom format din garniturile celor doi prini, AA i BB. La o autosindez A se conjug cu A i B cu B. Prin alosindez se nelege conjugarea cromozomilor care provin de la prini deosebii. Folosindu-ne de genomul notat mai sus AABB, o parte din cromozomii speciei A se conjug cu cromozomii speciei B.

13.3. MODIFICRILE MORFOLOGICE I FIZIOLOGICE ALE POLIPLOIZILOR

Poliploidia atrage modificri fenotipice foarte variate. Variate ca proporie, ncepnd cu unele foarte discrete, greu de sesizat i terminnd cu altele foarte vizibile, pn la gigantism; variate ca efect vital, producnd debilitatea organismului sau vigoarea lui sporit. Modificrile pot afecta ntregul organism sau numai o parte din el. La plante, tetraploizii prezint foarte frecvent organe vegetative i de reproducere mult mai mari n comparaie cu diploizii din care sau format. n unele cazuri efectul este ns invers aa cum este la tomate unde tetraploizii sunt de dimensiuni mai mici dect plantele diploide. O caracteristic general a poliploizilor este creterea n dimensiune a celulelor. Este un caracter dup care se poate pune n eviden gradul de poliploidie al plantelor. Stomatele, n general, sunt mai mari la plantele tetraploide dect la cele diploide. La Crepis capilaris (2n = 6) exist o corelaie direct ntre
254

mrimea celulelor i numrul de garnituri cromozomice ce se gsesc n nucleul acestora. Creterea n dimensiune a celulelor atrage dup sine, n unele cazuri, scderea numrului de celule din esutul respectiv. Acest fapt s-a observat, de exemplu, n frunzele muchiului Funaria. Mrirea volumului celulelor atrage dup sine i modificarea raportului dintre substanele care se gsesc n celule i de aici i modificri de ordin fiziologic. Frunzele plantelor poliploide pot prezenta modificri vizibile n ceea ce privete forma lor, mrimea sau culoarea. La tetraploizi, n general, frunzele sunt mai groase, mai late i de o culoare mai nchis. Creterea n dimensiuni a frunzei este nsoit foarte adesea de scderea numrului de frunze pe plant. Creterea n mrime a ligulei la graminee, face posibil distingerea plantelor poliploide de cele diploide normale. Exist de asemenea, o corelaie direct ntre gradul de poliploidie a plantei i dimensiunea grunciorilor de polen i a numrului porilor germinativi ai polenului. Pe aceast constatare se bazeaz i una din metodele de determinare a gradului de poliploidie la plante. Tulpinile plantelor poliploide prezint de asemenea n numeroase cazuri dimensiuni mai mari i o ramificare mai abundent. O alt caracteristic, poate cea mai des ntlnit a plantelor poliploide, este creterea dimensiunilor florilor i seminelor. Paralel cu aceasta, scade numrul lor pe plant. Toate modificrile morfologice observate la poliploizi sunt corelate de modificri fiziologice i genetice. Faptul c poliploizii apar n natur n condiii neobinuite, la limitele de rspndire a arealului ocupat de diferite genuri, ei sunt dotai cu anumite nsuiri de rezisten la factorii nefavorabili.

13.4. POLIPLOIDIA NATURAL I ROLUL EI N EVOLUIE

Hugo de Vries (1901) a studiat ndeaproape specia Oenothera lamarckiana i a constatat c ea se caracterizeaz printr-un polimorfism accentuat. Una dintre aceste forme, cu dimensiuni foarte mari a denumit-o Oenothera gigas. Gates, n 1909 a constatat c aceast form avea un numr dublu de cromozomi (28) fa de specia iniial. H. Nilsson Ehle (1935) descoper un plop gigantic, care un an mai trziu este determinat de Mntzing ca triploid. Scherz a observat un caz de poliploidie la via de vie, Riesling de Mosela cu 4n = 76 cromozomi fa de soiul Riesling, ce avea 2n = 38 cromozomi. Noul soi se prezint ca o mutant cu struguri cu boabe mari, cu coacere mai timpurie i cu procent de zahr mai mare. Navasin (1929) face o legtur ntre fenomenul de poliploidie i arealul ocupat de anumite specii i ajunge la concluzia c poliploizii apar mai frecvent la
255

indivizii care au depit arealul speciei. Unii autori au cutat s stabileasc cu aproximaie procentul de plante poliploide, rspndite n natur. Astfel, Tischler susine c formele poliploide sunt foarte rspndite n natur. Studiind aproape 90% din flora Europei centrale, constat c, din 652 de genuri, erau diploide 35,8% iar 64,2% genuri erau poliploide. Tot Tischler ajunge la concluzia c poliploizii au o rspndire geografic mai frecvent n regiunile nordice, regiunile arctice, deerturi, regiuni alpine. Socolovscaia i Strecova, cercetnd flora alpin a Pamirului i Arcticei observ c 85% din plante sunt forme poliploide pentru zona alpin a Pamirului i 92,4% pentru condiiile din Arctica. Prin determinarea numrului de cromozomi, s-a constatat c diferite specii ale unor genuri, nu sunt altceva dect serii poliploide care au aprut n mod natural. La genul Triticum, se observ c speciile au ca numr de cromozomi un multiplu de 7: Triticum monococcum 2n = 14 cromozomi Triticum durum 2n = 28 cromozomi Triticum aestivum 2n = 42 cromozomi La genul Rumex, speciile au un multiplu de 10 cromozomi: Rumex alpinus 2n = 10 cromozomi Rumex domesticus 2n = 20 cromozomi Rumex patientia 2n = 30 cromozomi Rumex cardifolius 2n = 40 cromozomi Rumex hymenosepalus 2n = 50 cromozomi. La genul Aegilops i Hordeum gsim specii cu un numr de 7, 14, 21 cromozomi, la genul Agropyron 7, 14, 21, 28, 35, la genul Solanum 12, 24, 36, 48, 60, 72 etc. Poliploidia este deci foarte frecvent n natur. Totui plantele de cultur prezint mai des cazuri de poliploidie dect cele slbatice. Aceast constatare i-a fcut pe unii cercettori s trag concluzia c evoluia plantelor de cultur de la formele slbatice s-a fcut prin multiplicarea numrului de cromozomi. Apariia procesului sexual a fcut ca primul zigot s constituie prima celul poliploid (diploid), iar endospermul angiospermelor este un triploid. A. Mntzing arat c, n general, la speciile perene exist un numr mai mare de cromozomi dect la speciile anuale ale aceluiai gen. De aici, trage concluzia c un numr mare de specii au provenit din forme anuale, cu un numr mai mic de cromozomi. De asemenea, el trage concluzia c exist o corelaie pozitiv ntre numrul de cromozomi i durata vieii unei plante. De exemplu, porumbul autotetraploid obinut pe cale experimental este peren, n timp ce formele anuale sunt diploide. Sorgul anual (Sorgum sudanensis) are n = 10 cromozomi, pe cnd sorgul peren (Sorgum hallepense) are n = 20 cromozomi. Formele anuale de Taraxacum sunt diploide, n timp ce formele perene sunt
256

poliploide. Sunt ns i excepii, cnd la speciile perene numrul de cromozomi este egal sau chiar mai mic dect la speciile anuale. n evoluia plantelor autogame i a animalelor care se nmulesc asexuat, un rol important l-a jucat autopoliploidia. La plantele alogame sau la animalele ce se reproduc sexuat, acest rol l-a jucat alopoliploidia. Tranziiile ntre auto i alopoliploidie sunt continui i de aceea este greu s le descoperim originea. Numai autopoliploidia poate fi absolut, n timp ce la alopoliploidie genomurile nu pot fi ntotdeauna complet diferite. Indicaii pentru descoperirea lor le poate da analiza meiozei: dac la o specie tetraploid exist quadrivaleni n meioz, este vorba de autopoliploidie, dac exist numai bivaleni, este prezent alopoliploidia. Alopoliploidia a jucat n evoluie un rol mult mai mare dect autopoliploidia. O dovad c ntr-adevr unele specii noi i au originea n alopoliploidizarea unor specii vechi sunt resintezele de specii, pe care omul le poate face pe cale artificial. A. Mntzing (1932) a resintetizat, pe cale artificial, specia Galeopsis tetrahit (2n = 32), ncrucind Galeopsis pubescens (2n = 16), cu Galeopsis speciosa (2n = 16). Hibridul a fost numit Galeopsis pseudotetrahit i este un alotetraploid. E. S. Mac Fadden i E. R. Sears (1944) ncrucind Triticum dicoccoides (2n = 28) cu Aegylops squarrosa (2n = 14) au resintetizat specia Triticum spelta (2n = 42). H. Kihara i F. Lilienfeld (1949) au resintetizat specia Triticum aestivum (2n = 42), ncrucind speciile Triticum persicum (2n = 28) cu Aegylops squarrosa (2n = 14). n literatura de specialitate se ntlnesc numeroase exemple de acest fel.

13.5. POLIPLOIDIA ARTIFICIAL

Cunoaterea fenomenului de poliploidie a contribuit la elaborarea unor metode speciale pentru obinerea pe cale artificial a poliploizilor. Oricare ar fi metoda, scopul este de a aciona asupra diviziunii celulelor sau prin procesul de hibridare, pentru a provoca multiplicarea garniturilor de cromozomi. Nu toate plantele se comport la fel la poliploidizare. Acesta depinde de metod, specie, soi sau chiar individ. Dau rezultate mai bune: - plantele cu un numr mic de cromozomi; - plantele alogame; - plantele folosite mai mult pentru mas verde, dect pentru fructe; - plantele ce se nmulesc pe cale vegetativ; Poliploizii obinui pe cale experimental prezint inconvenientul de a nu putea fi folosii imediat n producie. De obicei, au o fertilitate sczut, produc fructe puine. Muli nu sunt rezisteni la condiiile adverse ale mediului, la atacul duntorilor sau au un ritm de cretere lent. Unii, din contra, prezint modificri valoroase i utile pentru practica agricol i horticol, cum ar fi de exemplu un procent ridicat de morfin la mac, de mentol la ment, un procent mai mare de mas verde la trifoiul rou tetraploid sau un procent ridicat de zahr la sfecla triploid.
257

Metode de inducere a poliploidiei. Exist astzi diferite metode pentru producerea poliploizilor: metode chimice, fizice i biologice. - Metoda altoirii, cost n altoirea a dou plante din genuri sau specii deosebite i apoi secionarea locului de concretere. Din seciune apar muguri i apoi lstari, din care unii sunt tetraploizi. Metoda a fost elaborat de H. Winkler (1916), W. A. Greenleaf (1938) la genul Nicotiana i E.W. Lindstrom i K. Koos (1931) la tomate (dup Raicu P., 1980). - Metoda centrifugrii plantelor a fost elaborat de D. Kostoff (1937). Ea se bazeaz pe aciunea forei de centrifugare asupra celulelor n diviziune, fiind mpiedicai cromozomii s migreze la polii celulei. Se aplic pe cale restrns deoarece este greoaie i d rezultate slabe. - Metoda acionrii cu unele insecte parazite asupra vrfurilor de cretere a plantelor. Se folosesc diferite insecte care se hrnesc prin neparea vrfurilor vegetative a plantelor. Aciunea mecanic, nepturile, produc perturbri n diviziunea celulelor din esuturi. Metoda se aplic pe cale restrns. - Metoda ocurilor de temperatur se folosete cu scopul de a influena zigotul plantelor n primele stadii ale diviziunii. A fost elaborat de L. F. Randolph (1932) i aplicat la porumb. Imediat dup fecundare, planta de porumb a fost inut circa 24 ore la temperaturi de 440 C. Nici aceast metod nu se folosete pe scar larg. Folosirea substanelor chimice (alcaloizi, narcotice etc.) a dus la elaborarea metodelor chimice folosite i astzi intens la obinerea poliploizilor. Acestea i manifest aciunea, fie blocnd cromozomii n metafaz, fie oprind formarea membranelor ce ar trebui s separe celulele aflate n diviziune. Din prima categorie fac parte n primul rnd colchicina, acenaftenul, monobromnaftenul .a.; din a doua categorie fac parte, paradiclorbenzen, monoclorbenzen .a. Dintre toate, cea mai folosit este colchicina. A. F. Blakeslee i A. S. Avery (1937) au elaborat diferite tehnici de aplicare a tratamentului cu colchicin la plante i au obinut rezultate remarcabile la genurile Nicotiana, Mirabilis, Trifolium .a. n general se folosesc soluii foarte slabe de colchicin, administrate la diferite organe sau pri din acestea. Se pot trata semine, prin mbibarea lor n soluii de colchicin 0,02% 0,05%, timp de 24-48 ore. Soluia de diferite concentraii poate fi administrat pe vrfurile vegetative de tulpin sau rdcin. Cu soluie de colchicin, se pot trata i plante mici, tuberculi, butai etc. Cu ajutorul metodelor chimice, n diferite ri, s-au obinut forme foarte valoroase care se folosesc n cultur; n Suedia s-au obinut dou soiuri de trifoi. n Germania au fost create linii poliploide la Galega i Seradela (plante de nutre). n Japonia se cultiv un pepene verde triploid; n diferite ri, i la noi, se cultiv sfecl pentru zahr triploid; de asemenea, exist n cultur forme valoroase poliploide de secar, hric, bumbac; la plante horticole rezultate bune s-au obinut la plante ornamentale (narcise, stnjenei, dalii, cyclamen .a), pomi (mr, pr, lmi .a) i vi de vie.
258

13.6. POLIPLOIDIA LA ANIMALE

Spre deosebire de regnul vegetal, n regnul animal poliploidia e mai puin rspndit. Ea se observ mai ales la animale ce se nmulesc pe cale partenogenetic sau asexuat. La animalele cu nmulire sexuat, poliploizii care apar prin ncruciare cu formele diploide revin la forma diploid. Analizndu-se numrul de cromozomi la speciile unor genuri de animale s-a demonstrat evoluia lor prin poliploidie. La mamifere (oareci sau iepuri de cas), cu ajutorul ocurilor de temperatur se pot obine ovule diploide. Zigoii ce se formeaz sunt triploizi, se dezvolt pn n stadiul de blastul, dup care mor. La hrciog, speciile Cricetus i Cricetulus griseus au 2n = 22 cromozomi, iar Mezocricetus euratus 2n = 44. Aceasta din urm nu este altceva dect un tetraploid care a aprut pe cale natural din primele. La crustacee, exist la aceeai specie Daphnia pulex forme sexuate cu 2n = 8 cromozomi i forme partenogenetice cu 2n = 24 cromozomi. La Philopode, Artemia salina prezint forme partenogenetice facultative cu 42 i 48 cromozomi i alt form numai partenogenetic cu 2n = 168 cromozomi. La fluturi, s-au obinut amphidiploizi la genul Bombyx prin ncruciarea speciilor Bombyx mori cu Bombyx mandarina. Mai nti s-au obinut autopoliploizi partenogenetici femeli la Bombyx mori care au fost apoi ncruciai cu masculi din specia Bombyx mandarina. La genul Ascaris exist specii diploide univalens i tetraploide bivalens: Ascaria megalocephala univalens are 2n = 2, iar specia bivalens 2n = 4; specia Ascaris lumbricoides univalens are 2n = 24, iar specia bivalens 2n = 48. n prezent, cercetrile privind poliploidia la animale ocup o extindere mare. Se lucreaz la elaborarea unor tehnici corespunztoare pentru obinerea poliploizilor. Muli cercettori se ocup de animale inferioare cum sunt de exemplu infuzorii .a.

13.7. ANEUPLOIDIA
Aneuploidia numit i heteroploidie sau polisomie este modificarea numrului diploid de cromozomi prin adugarea sau lipsa unuia sau a mai muli cromozomi. Dup numrul de cromozomi n plus sau n minus, ea se clasific astfel: - nulisomie - monosomie - trisomie - tetrasomie - dubl trisomie
259

2n-2 2n-1 2n+1 2n+2 2n+1+1

Apariia de celule aneuploide se explic prin abateri de la segregarea normal a perechilor de cromozomi n timpul diviziunii. Ele apar att n celulele somatice ct i n cele sexuale, de aceea aneuploidia poate fi att mitotic ct i meiotic. Mai frecvent este aceea meiotic, bivalenii putnd fi repartizai numai ntr-o celul, iar n alta lipsind. Cnd garnitura diploid are un cromozom n plus, aneuploidul va avea formula 2n+1, cnd va avea un cromozom n minus va avea formula 2n-1. n alte cazuri aneuploidul 2n+1 (trisom) mai poate primi un cromozom suplimentar i atunci va avea formula 2n+2 (tetrasomi). Dac adugarea de cromozomi suplimentari se face n dou perechi de cromozomi atunci se formeaz un dublu trisom 2n+1+1. Cnd se pierde o pereche de cromozomi omologi se formeaz un nulisom 2n-2. Primul studiu de aneuploidie la plante a fost fcut n 1924 de ctre Blakeslee i Belling la Datura stramonium. Aceast plant are 2n = 24 cromozomi, deci un trisom, cu 24 + 1 cromozomi. Spre deosebire de plantele obinuite, avea capsulele mai mici, i epi mai mici. Executnd diferite ncruciri au obinut 12 tipuri de trisomi, adugnd pe rnd cte un trisom pentru fiecare pereche de cromozomi. Toate aveau fenotipuri bine distincte. La animale, aneuploidia a fost descoperit la Drosophila de ctre Bridges. Cazul a fost citat la capitolul referitor la ereditatea sexului, unde s-a prezentat un caz de aneuploidie datorat nondisjunciei primare n meioz a cromozomilor sexului. Din ncruciarea drosofilei femele cu ochi albi cu masculi cu ochi roii, au aprut forme neateptate, femele cu ochi roii i masculi cu ochi albi. Aceasta din cauz c n urma nondisjunciei cromozomilor X au aprut ovule ce aveau XX i altele nici unul. Primele, fecundate cu spermatozoizi normali, au produs trisomi XXX i XXY. Zigoii cu autosomi normali dar cu un singur X sau Y au fost monosomi, primii, masculi sterili, ultimii neviabili. n aceste cercetri, Bridges a artat c se pot aduga cromozomi suplimentari i la cromozomii autosomi. Lipsa cromozomilor mari II i III determin letalitatea, a celor din perechea a IV-a, foarte mici, influeneaz n sens negativ insecta, fr a provoca neaprat moartea. Dup cum se adaug un cromozom la autosomii IV sau lipsesc, aneuploidul se numete triplo IV sau haplo IV. Modificrile acestea atrag modificri fenotipice: Drosophila haplo IV este de dimensiuni mai mici dect tipul slbatec i cu fertilitate sczut; Drosophila triplo IV, din contra, are dimensiunile corpului mai mari. Astfel de forme aneuploide au fost studiate i la alte organisme, n special la plante: ciumfaie, tutun, porumb, tomate, cereale. Foarte multe forme aneuploide nu sunt viabile sau, unele viabile sunt mai greu de sesizat. Cercetrile din domeniul aneuploidiei au o mare importan teoretic i deschid perspective largi pentru ameliorarea plantelor. nlocuirea unor cromozomi duce la cunoaterea importanei lor ereditare i a genelor ce le conin. Prin aneuploidie se schimb numrul de cromozomi dar nu i grupele de nlnuire. Modificarea genomului, corelat cu modificrile fenotipice constituie o cale de obinere a unor noi soiuri.
260

Aneuploidia ajut i la nlocuirea sau adugarea unor cromozomi de la unele soiuri de plante de cultur, cu cromozomi de la alte soiuri ce conin gene valoroase. S-au obinut n acest sens diferite forme de cereale superioare unora existente n cultur. La gru, s-au transmutat cromozomi de la alte specii ce conineau gene rspunztoare de anumite nsuiri (rezisten la boli, secet .a.) de la secar, Aegilops .a. La tutun s-au transferat cromozomi de la alte specii apropiate pentru a imprima rezistena la viroza tutunului. n general, se folosesc forme monosomice sau nulisomice care se ncrucieaz cu formele ce dein calitile ce ne intereseaz din punct de vedere economic. Pseudoaneuploidia. Este o variaie a numrului de cromozomi ce se realizeaz cu ajutorul unui mecanism de fuzionare-fisionare a cromozomilor nsoit de un proces de translocaie reciproc, fr s se modifice cantitatea de ADN per nucleu. Prin fisionarea centromerului unui cromozom metacentric, submetacentric sau subtelocentric se formeaz cromozomi acrocentrici. Prin fuzionarea a doi cromozomi acrocentrici rezult cromozomi metacentrici, submetacentrici sau subtelocentrici. Fenomenul a fost pus n eviden de W.R. Robertson n anul 1916. Speciile nrudite, care au un numr variat de cromozomi, dar acelai numr fundamental (NF) de brae cromozomice formeaz o serie robertsonian. Un exemplu bine studiat este n cadrul genului Drosophila, la care cariotipul primar de la Drosophila virilis (2n=12) s-a transformat prin translocaia i fuzionarea centromerilor, dnd natere la mai multe specii: D. texana (2n=10) la care au fuzionat perechile 2 i 3 de cromozomi, D. littoralis (2n=10) la care au fuzionat perechile 3 i 4, D. americana (2n=10) la care au fuzionat perechile 2 i 3 i cromozomii X cu perechea a IV-a. Fenomenul aneuploidiei se poate manifesta chiar n cadrul aceleai specii, ducnd la apariia aa-numitului polimorfism cromozomial. Acest fenomen a fost semnalat la Spalax leucodon (orbetele), specie cu posibiliti reduse de migrare. La indivizii rspndii n Caucaz, 2n=48, cei din Bulgaria au 2n=54, iar la noi n ar, n Transilvania au 2n=50, iar cei din Dobrogea i Moldova 2n=56. Aceste serii robertsoniene sugereaz existena unui proces de evoluie a cariotipului, proces favorizat de posibilitile reduse de migrare i deci formarea de populaii distincte.

13.8. PSEUDOPOLIPLOIDIA
Fenomenul de pseudopoliploidie este descoperit relativ recent, iar denumirea lui propus pentru prima dat de E. Bataglia n anul 1956. Este vorba de o multiplicare a numrului de genomuri fr dublarea cantitii de cromatinrespectiv ADN. Fenomenul de pseudopoliploidie a fost sesizat la unele specii care posed cromozomi ce au mai muli centromeri sau acetia sunt localizai difuz, pe toat lungimea lor. Apariia pseudopoliploizilor se datoreaz regruprii substanei
261

cromatice ntr-un alt numr de cromozomi fr o multiplicare a ei, din punct de vedere cantitativ. Exist specii pseudopoliploidie la genul plantei Luzula: Luzula purpurea cu 2n=6, Luzula glabrata cu 2n=12, Luzula campestris cu 2n=12, Luzula parviflora cu 2n=24, Luzula sudetica cu 2n=48; la genul Tatera: Tatera brantsii draco cu 2n=26, Tatera indica ceylonica cu 2n=72. Mai ntlnim pseudopoliploizi i la genurile de plante Spirogyra, Carex, .a. sau la cele de animale Ascaris, Thyanta (hemipter) .a. Identificarea pseudopoliploizilor se poate face folosindu-se mai multe ci: - ncrucindu-se speciile pseudopoliploide ale aceluiai gen se pot urmri la hibrizii F1 cromozomii att n diviziunea somatic ct i n cea meiotic: n diviziunea somatic apare un numr de cromozomi 2n + 2n fiecare garnitur pstrndu-i mrimea i forma cromozomilor respectivi. De exemplu, ncrucind Luzula sudetica cu 2n = 48 cromozomi, mici, cu Luzula campestris cu n = 12 cromozomi, obinem n F1 un hibrid cu 2n = 30 cromozomi dintre care 24 cromozomi sunt mici i 6 mari. n meioza plantelor din F1 cei 30 de cromozomi se conjug n felul urmtor: la cromozomii mari se asociaz cei 24 cromozomi mici formnd 6 cromozomi mari. - Lungimea total a cromozomilor de la speciile diploide trebuie s fie egal cu cea a speciilor pseudopoliploide, deoarece cromozomii formelor pseudopoliploide s-au format prin fragmentarea cromozomilor speciilor diploide. Cea mai sigur metod pentru identificarea pseudopoliploizilor este determinarea cantitii de ADN din celulele acestora. Multiplicarea numrului de cromozomi trebuie s fie corespunztoare multiplicrii cantitii de ADN. n figura 13.4. este reprezentat schematic lungimea cromozomilor unor specii diploide (a) i lungimea cromozomilor de la dou specii pseudopoliploide (b i c), provenite prin fragmentarea cromozomilor speciei diploide (a).

Fig. 13.4. Pseudopoliploidia: a-specie diploid cu 6 cromozomi; b-specie pseudopoliploid cu 12 cromozomi; c-specie pseudopoliploid cu 24 cromozomi (Specia b a provenit din specia a i specia c a provenit din specia b) 262

CAPITOLUL 14 ELEMENTE DE GENETICA POPULAIILOR

Moto: Natura nu poate fi nvins dect supunndu-ne ei F. Bacon

14.1. NOIUNEA DE POPULAIE

n ncercrile sale, Mendel i cei care au urmat imediat dup el au urmrit repartiia i transmiterea genelor alele pe generaii, referindu-se la grupe mici de indivizi. Dup expresia fenotipic a genelor i structura genotipurilor au stabilit diferite rapoarte de segregare genotipic i fenotipic. Cnd vrem s analizm structura genetic la grupe mari de indivizi, la care nmulirea indivizilor are loc nedirijat i unde pot s apar factori care modific mereu tipul i frecvena genelor i a genotipurilor metodele de studiu sunt altele. Acestea constituie obiectul unui domeniu aparte al geneticii, genetica populaiilor. n primul rnd este necesar s se precizeze ce se nelege prin noiunea de populaie. Termenul de populaie a fost introdus de W. Johannsen n 1903. n lucrarea sa Uber Erblichkeit in Populationem und in reinen Linien el analizeaz structura genetic la o populaie de fasole lund n considerare mrimea seminelor. Separnd dup mrime trei categorii de semine, reproducndu-le generaiei de generaie, ajunge la aa-numitele linii pure cu boabe uniforme i care n descenden i pstreaz acest caracter. A descompus deci populaia iniial, heterogen, n componentele sale. Populaiile aparin, din punct de vedere sistematic, diferitelor specii de plante sau animale. Noiunea de specie nu trebuie confundat cu cea de populaie. Specia este o noiune abstract i ea nsumeaz trsturile generale n care trebuie s se ncadreze diferite grupe de indivizi, populaiile. n natur nu exist specii ci indivizi. Populaia este forma concret de existen a speciei. Este o unitate natural a structurii ecologice a speciei. Populaiile rspndite n natura spontan sunt formate din grupe de indivizi heterogeni din punct de vedere ereditar, care au aceeai origine, se aseamn i se nmulesc ntre ei fr amestecul altor indivizi i ocup un areal cu condiii ecologice comune. n condiiile de cultur a plantelor i de cretere a animalelor, soiurile de plante i rasele de animale sunt considerate tot populaii. Pentru genetic, au importan populaiile mendeliene sau panmictice. Acestea sunt populaii care se nmulesc sexuat, fiecare individ avnd posibilitatea s se ncrucieze cu oricare altul din populaia respectiv. n felul acesta, se realizeaz o circulaie a informaiilor genetice ntre indivizi i se menine un
263

oarecare echilibru n genofondul populaiei. Nu acelai lucru se ntmpl n populaiile care se reproduc asexuat sau partenogenetic, unde nu este posibil circulaia informaiei genetice, chiar dac descendenii cu ascenden comun sau apropiat, evolueaz paralel. Populaiile pot s aib dimensiuni foarte variabile. Cele care conin sub 100 de indivizi se numesc populaii mici, cu cteva sute de indivizi, populaii mijlocii, cu cteva mii, populaii mari, iar peste 10.000 de indivizi, populaii foarte mari. Numrul de indivizi al unei populaii are o deosebit importan pentru cercetrile de genetic, deoarece datele folosite n asemenea cercetri au un caracter probabilistic. Cu ct numrul lor este mai mare i datele obinute prin calcule sunt mai exacte. Dup fenotipul i genotipul indivizilor, populaiile se pot clasifica n: - populaii polimorfe, n care, pe lng trsturile comune, indivizii manifest diferene vizibile fenotipic (ex. specia uman, specii de ortoptere); - populaii criptopolimorfe, alctuite din indivizi cu diferene fenotipice foarte mici, dar cu diferene n ceea ce privete coninutul genelor (ex. populaiile de Drosophila melanogaster). Aceasta se explic prin structura lor heterozigot i cu un genofond mare de gene recesive; - populaii aparent uniforme, n care indivizii prezint mici deosebiri fenotipice i genotipice, aa cum sunt rasele de animale i unele soiuri de plante.

14.2. METODELE FOLOSITE N STUDIUL GENETICII POPULAIILOR

n studiul populaiilor genetice se folosesc dou metode: metoda descriptiv i metoda genetic. Metoda descriptiv const n caracterizarea fenotipic a indivizilor din cadrul unei populaii i stabilete raporturile care exist ntre diferitele clase de indivizi. Pentru a cunoate structura genetic a indivizilor este necesar s urmrim la descendenii lor modul cum se transmit caracterele. Aceasta se poate realiza prin urmrirea unui numr mic de indivizi, ceea ce contravine celor artate mai sus. Un al doilea aspect negativ al metodei este faptul c n populaie exist muli indivizi ce manifest aceleai caractere, dei structura lor genetic poate fi diferit. Aceast metod nu satisface dect n parte cercetrile de acest gen. Metoda genetic se bazeaz pe cunoaterea fondului genetic al populaiei. Ea se sprijin pe marile descoperiri ale lui Gr. Mendel cu privire la legile ereditii. Primul om de tiin care a fcut un studiu tiinific asupra populaiilor, folosind metode statistice a fost W. Johannsen (1903). Cercetrile care au fost efectuate de ctre matematicianul G. Hardy n Anglia (1908) i de medicul W. Weinberg n Germania, pe baza calculelor statistice, au deschis un drum nou n acest domeniu. La acestea s-au adugat i cercetrile lui R. A. Fischer (1918), J. B. Haldane (1924 1932) i S. Wright (1921). Pe baza unor metode de calcul se poate aprecia astzi structura genetic a unei populaii, precum i modificarea acesteia n urma aciunii unor factori.
264

Aceasta are o importan enorm pentru explicarea unor aspecte legate de genetica populaiilor i evoluia lor n timp. Foarte important este studiul populaiilor n activitatea de ameliorare a plantelor i animalelor, n urma cruia putem crea sau ameliora soiuri de plante i rase de animale.

14.3. STRUCTURA GENETIC A UNEI POPULAII

O populaie de indivizi nsumeaz un numr enorm de gene care constituie genofondul ei. Dac ne referim la indivizi, la coninutul de gene a fiecreia n parte, deosebim diferite genotipuri. Ele s-au format prin ntlnirea genelor din populaie n procesul de fecundare. A analiza structura genetic a populaiei nseamn a determina tipul i frecvena genelor precum i tipul i frecvena genotipurilor. De exemplu, pentru un cuplu de alele Aa, se pot forma trei genotipuri (31): AA, Aa, aa; pentru dou cupluri, nou genotipuri (32); pentru zece cupluri 60.000 genotipuri (310) .a.m.d. Dar aceste cifre sunt foarte mici fa de numrul de cupluri de alele existente n populaii i o analiz a tuturor este imposibil de realizat. n afar de aceasta, trebuie s artm c sub influena unor factori, frecvena lor se modific nencetat. n cercetrile care se fac, se iau de obicei un numr mic de gene i se calculeaz frecvena celor dou alele pentru fiecare locus. n ceea ce privete tipul i frecvena genotipurilor dintr-o populaie, ele depind de tipul i frecvena genelor, de modul cum segreg n gamei i de modul cum se ntlnesc n procesul de fecundare. n consecin i numrul i tipul lor sunt enorm de mari. n cazul genelor i a genotipurilor pot interveni factori care s modifice frecvena lor.

14.4. PANMIXIA I STRUCTURA GENETIC A POPULAIILOR LEGEA HARDY WEINBERG

Se poate considera, n mod teoretic, c n procesul reproducerii fiecare individ formeaz acelai numr de gamei, iar ntlnirea dintre ei s se fac n mod ntmpltor. Cu alte cuvinte, n acest caz, fiecare individ ar participa n mod egal la procrearea descendenilor n generaiile urmtoare. Acestui mod de reproducere i s-a dat numele de panmixie, iar populaiei respective, populaie panmictic. Desigur c aceast situaie nu este n natur, dar ea se poate apropia n anumite limite de cazurile reale. Aa este cazul populaiilor care ocup o arie geografic restrns i izolat, cum ar fi de exemplu o populaie de psri sau insecte de pe o insul oceanic. Panmixia nu poate fi perfect deoarece este afectat de numeroi factori care vor fi tratai ulterior. S analizm structura genetic a unei populaii panmictice. Mai nti ne vom referi la cazul simplu al unei populaii homozigote pentru dou alele (A, a) ale unei gene. Aceast populaie va produce un numr egal de gamei masculi i femeli cu alelele respective: 0,5% A i 0,5% a.
265

Indivizii purttori ai acestor alele ncrucindu-se la ntmplare vor produce n F1 combinaiile (figura 14.1):
0,5% A 0,5% a 0,5% A 0,25% AA 0,25% aA 0,5% a 0,25% Aa 0,25% aa

Fig.14.1 Frecvena genelor ntr-o populaie panmictic

n cadrul acestor combinaii din F1 remarcm c homozigoii dominani AA apar cu o frecven de 0,25%, homozigoii recesivi aa cu frecven de 0,25%, iar heterozigoii Aa cu o frecven de 0,5%. Considernd n generaia urmtoare acelai mod de formare a gameilor i ntlnirea lor liber, se obine frecvena genotipurilor prezentat n ahul de combinaie urmtor (figura 14.2). n acest tablou frecvenele genotipurilor sunt urmtoarele: Genotipul AA nsumeaz 8/32; Genotipul Aa nsumeaz 16/32; Genotipul aa nsumeaz 8/32. Aceste cifre reprezint de fapt aceeai proporie ntre frecvena genelor pe care am ntlnit-o mai sus: 0,25% AA, 0,50% Aa, 0,25% aa. ntr-o populaie panmictic frecvena genotipurilor este proporional cu aceea a gameilor care particip la formarea lor. Gameii, n cazul de fa se produc n mod egal, pentru fiecare sex, att pentru alela A ct i pentru alela a. Aceast situaie face s presupunem c, de la o generaie la alta, structura genetic a populaiei nu se schimb att timp ct nu intervin factori ce pot modifica frecvena genelor, S notm cu p frecvena alelei A i q frecvena alelei a. Frecvenele p i q reprezint n mod egal, proporiile homozigoilor i heterozigoilor aa cum urmeaz n tabelul din figura 14.3. Structura genotipic a populaiilor de fa se mai poate scrie: AA p2 Aa 2pq aa q2

Nu este greu de observat c frecvenele n cazul de fa, se obin prin dezvoltarea binomului (p+q)2. Aceast distribuie privind frecvena genelor i a genotipurilor ntr-o populaie panmictic este cunoscut sub denumirea de legea Hardy Weinberg, dup numele celor doi cercettori, G. Hardy din Anglia i W. Weinberg din Germania, care n anul 1908, independent unul de altul, au ajuns la aceeai concluzie.

266

 0,25 AA 0,25 Aa 0,25 aA 0,25 aa

0,25 AA AA AA Aa AA aA AA aa AA aa

0,25 Aa AA Aa Aa Aa aA Aa aa Aa

0,25 aA AA aA Aa aA aA aA aa aA aA Aa

0,25 aa AA aa aa aa aa

Fig. 14.2. Frecvena genotipurilor ntr-o populaie panmictic

alela Gamei femeli A a

Gamei masculi alela A frecvena p AA p p2 Aa q pq

a q Aa pq aa q2

Fig. 14.3. Frecvena genelor (p i q) ntr-o populaie panmictic

Proporia p2, 2pq, q2, n cazul unei populaii panmictice, se menine constant de-a lungul generaiilor i reprezint aa numita stare de echilibru a ei. Un astfel de calcul exist numai ca ipotez teoretic i se folosete cu succes ca punct de orientare la aprecierea structurii genetice a populaiilor n care indivizii se nmulesc sexuat, alogam. Conform legii Hardy Weinberg, frecvena unei alele se calculeaz dup formula: p=1-q sau q=1-p, deoarece p+q = 1. Presupunnd c s-a stabilit pentru o gen A frecvena de 75%, frecvena alelei perechi a va fi de p = 1-0, 75 = 0,25 adic de 25%. J. Rendel (1952) constat c dintr-un efectiv de 2681 viei de ras Shorthorn, 1234 au avut culoarea roie (aa), 1215 culoarea galben (Aa) iar 232 culoarea alb (AA). innd seama c fiecare viel purta cte dou alele, cte una pe fiecare cromozom omolog, se poate spune c cei 2681 viei purtau n total 5362 alele. Dintre acestea 1215 + (2 x 232) = 1679 au fost A, iar restul 1215 + (2 1679 = 0,31, iar a x 1234) = 3683 au fost a. Frecvena alelei A, (notat p) este de 5362 3683 alelei a, (notat q) este de = 0,69 sau cu 1-0,31 = 0,69. 5362
267

Introducnd aceste date n formula pentru calcularea genotipurilor rezultate din libera combinare a celor dou gene vom obine structura celor trei genotipuri: (0,31 + 0,69)2 = 0,0961 AA + 0,4278 Aa + 0,4761 aa = 1 Cifrele obinute prin dezvoltarea binomului exprim raportul ntre cele trei fenotipuri de viei din populaia analizat. n cazul populaiilor cu reproducere autogam echilibrul genetic se modific, n sensul descreterii heterozigoiei n favoarea homozigoiei. Ritmul scderii heterozigoilor i a creterii homozigoilor n procente n funcie de o pereche de alele se poate observa n tabelul 14.1.

14.5. FRECVENA GENELOR LEGATE DE SEX

Structura genetic analizat mai sus se refer la unele perechi de alele plasate n cromozomii omologi. Cu totul alta este comportarea genelor legate de sex, care nu dispun dect de un locus la sexul heterogametic. Dac frecvena celor dou alele A i a este aceeai la ambele sexe, atunci la sexul homogametic vor apare trei genotipuri corespunztor formulei p2 + 2pq + q2. La sexul heterogametic vor apare numai dou genotipuri, iar frecvenele p i q vor coincide cu frecvenele celor dou alele care se ntlnesc n populaie. Tabelul 14.1. Descreterea heterozigoiei i a creterii homozigoiei n funcie de numrul de generaii
Generaia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 n AA 0,00 25,00 37,50 43,75 46,88 48,44 49,22 49,60 49,80 49,90 49,95 50,00 Autofecundare Aa 100,00 50,00 25,00 12,50 6,25 3,12 1,56 0,80 0,40 0,20 0,10 0,00 Aa 0,00 25,00 37,50 43,75 46,88 48,44 49,22 49,60 49,80 49,90 49,95 50,00 AA 0,00 25,00 25,00 31,25 34,38 37,50 39,85 41,80 43,36 44,63 45,65 50,00 Frai x surori Aa 100,00 50,00 50,00 37,25 31,24 25,00 20,30 16,40 13,28 10,74 8,70 0,00 aa 0,00 25,00 25,00 31,25 34,38 37,50 39,85 41,80 43,36 44,63 45,65 50,00

Situaia este mai complex cnd frecvena celor dou alele difer, la mascul i femel. Echilibrul nu se stabilete la fiecare generaie aa cum se ntmpl cu alelele situate pe autozomi, ci dup un oarecare numr de generaii. Dac notm cu p1 frecvena unei alele A pentru sexul heterogametic i cu p2 frecvena aceleiai alele pentru sexul homogametic, iar cu q1 i q2 frecvenele
268

pentru alelele corespunztoare a, se poate alctui ahul de combinaie din figura 14.4. Din acest ah se vede c la sexul heterogametic alelele A i a reiau valorile p2 i q2 ca i n generaia precedent. La sexul homogametic alelele A i a se distribuie la fel ca i la alelele situate pe autozomi (ahul precedent), dar p p intervalul de timp ntre cele dou sexe este redus la jumtate 1 2 . 2 Distribuirea genelor din cromozomi se face dup tipul criss cross, adic de la mam la fiu i de la tat la fiic. Ph. L. Hritier (1954) consider un caz extrem, cnd sexul heterogametic ar fi omogen pentru alela A, p1 = 100%, iar cellalt sex pentru alela a, p2 = 0%. n tabelul dat de autor sunt necesare opt generaii pentru a ajunge la starea de echilibru a populaiei pentru aceste gene la ambele sexe (tabelul 14.2.).
Gena Sexul homogametic Sexul heterogametic A a Gena Frecvena p1 q1 A p2 AA p1p2 Aa p2q1 A p2 a q2 Aa p 1q 2 aa q 1q 2 a q2

Fig.14.4. Frecvena genelor legate de sex ntr-o populaie panmictic

Tabelul 14.2. Realizarea echilibrului genetic pentru o pereche de gene legate de sex la cele dou sexe n opt generaii
Generaia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Sexul homogametic 0,0 50,0 25,0 37,0 31,0 34,3 32,7 33,5 33,1 Sexul heterogametic 100,0 0,0 50,0 25,0 37,0 31,2 34,3 32,7 33,5 Diferena 100,0 50,0 25,0 12,5 6,2 3,1 1,6 0,8 0,4

269

14.6. FRECVENA GENELOR N CAZUL A MAI MULTOR LOCI

Realizarea unui echilibru n frecvena genotipurilor, dup o generaie de hibridare la ntmplare privete toi locii de pe cromozomii autozomi considerai separat. Atunci cnd se consider simultan doi sau mai muli loci, echilibrul nu mai poate fi realizat. Drept exemplu, s considerm o populaie format dintr-un numr egal de indivizi pentru genele A1A1B1B1 i A2A2B2B2. Frecvena genei considerat pentru ambii loci este de . Din mperecherea lor la ntmplare, n prima descenden nu vor apare toate genotipurile. Genotipurile absente vor apare n descendenele ulterioare refcnd echilibrul. Li (1955) ia n considerare doi loci fiecare cu cte dou alele i frecvena celor patru tipuri de gamei formai n populaia iniial dup cum urmeaz: gamei frecvena A1B1 r A1B2 s A2B1 t A2B2 u

Dup combinaia alelelor populaia va fi n echilibru cnd ru = st. Deprtarea fa de echilibru este dat de ru st. Ea scade, njumtindu-se cu fiecare generaie succesiv. Dac numrul de loci luai n considerare este mai mare de doi, apropierea de echilibru are loc cu att mai lent, cu ct numrul locilor este mai mare.

14.7. FRECVENA GENELOR N CAZUL NLNUIRII LOCILOR

nlnuirea genelor ncetinete realizarea echilibrului n condiiile hibridrii la ntmplare i ea este cu att mai lent cu ct fora de nlnuire este mai mare. Echilibrul se realizeaz cnd cuplarea i schimbul dintre loci sunt la fel de frecvente. Apropierea de echilibru a genelor a doi loci nlnuii poate fi demonstrat ca i n cazul anterior: d = ru st, n care: ru este frecvena heterozigoilor cu gene nlnuite, iar st frecvena heterozigoilor n care genele au suferit crossing-over. Dac notm i cu c frecvena de recombinare ntre cei doi loci i cu t generaia respectiv se poate scrie: dt = (1-c) x dt 1 Dac n urma ncrucirii se obin 20% indivizi recombinai pentru doi loci, aceasta nseamn c diferena se reduce cu 1/5 (20%) pentru fiecare generaie pentru a se ajunge la echilibru pentru genele din aceti loci.
270

14.8. FRECVENA GENELOR N CAZUL ALELELOR MULTIPLE

Aplicarea legii pentru dou alele se poate extinde i cnd la un locus exist mai mult dect dou. n asemenea situaie se ia n considerare o singur alel, iar toate celelalte alele de la acest locul pot fi considerate ca i cnd ar constitui o singur grup o singur alel. Dac intereseaz diferite alele de la acelai locus, atunci se ia n considerare fiecare alel pe rnd, celelalte formnd o grup corespunztoare celei de a doua alel. Echilibrul frecvenelor acestor alele este realizat dup o generaie de hibridare. Un exemplu privind frecvenele unor alele multiple poate fi dat de grupele sangvine la om. Vom considera genele A, B i O referitoare la stabilirea grupelor sangvine din sistemul A.B.O. Frecvena acestor trei gene le vom nota p, q i r, iar conform legii Hardy-Weinberg p+q+r=1 Din componena diferitelor grupe sangvine fac parte diferite genotipuri, figurate n tabelul care va urma. Race i Sanger (1954) au fcut observaii la 190177 aviatori din Anglia. Repartizarea lor pe grupe se poate vedea tot n tabelul 14.3. Tabelul 14.3. Grupele sangvine, genotipurile care le determin i frecvena lor
Genotipul Grupa sangvin Frecvena ateptat Frecvena observat % AA A p2 + 2pr 41,716 AO BB B q2 + 2qr 8,560 BO O O r2 46,684 O AB AB 2pq 3,040

Calcularea frecvenei genelor se poate face n felul urmtor: - Frecvena genei O este rdcina ptrat a frecvenei grupului O, de unde r = , fiind grupul O. - Suma frecvenelor grupelor B i O este q2 + 2qr + r2 = (q + r)2 = (1 2 p) , iar p = 1 B + , B i fiind frecvenele grupelor sangvine B i O. - Suma frecvenelor A i O este p2 + 2pr + r2 = (p + r)2 = (1 q)2 iar q = 1 + , i fiind grupele sangvine A i O. Calcularea frecvenei celor trei gene prin aceast metod a dus la urmtoarele rezultate: gena A = 0,2567 gena B = 0,0598 gena O = 0,6833 ______________ Total = 0,9998
271

Pe baza lui p i q se poate calcula i frecvena pentru grupa sangvin AB. Rezultatul este 3,070%, proporia care se apropie foarte mult de aceea menionat n tabelul de mai sus (3,040).

14.9. FACTORII CARE MODIFIC STRUCTURA GENETIC A POPULAIILOR

Constatarea faptului c n snul populaiilor se manifest o inerie n meninerea structurii genetice (homeostazie) nu nseamn c populaiile nu pot fi modificate. Modificrile sunt ndreptate spre gsirea unui nou echilibru, util organismului sau omului, dup cum selecia o face natura sau omul. tiina care se ocup cu modificarea structurii genetice a populaiilor n interesul omului, poart numele de ameliorare. Exist dou categorii de factori ce contribuie la modificarea structurii genetice a populaiei: prima categorie se refer la modificarea frecvenei genelor (selecia, migraia, mutaia, aciunea ntmplrii) i a doua categorie, la modificarea frecvenei genotipurilor (homogamia i consangvinizarea).

14.9.1. Selecia
Selecia este procesul de supravieuire a indivizilor ce prezint unele caliti i de eliminare a acelora mai puin nzestrai. Deoarece selecia este de dou tipuri, natural sau artificial i sensul noiunii de calitate difer. Efectul pe care l are selecia asupra frecvenei genelor se exprim prin doi indicatori: coeficientul de selecie, care se noteaz cu S i valoarea selectiv. S presupunem c la efectuarea unei analize genetice s-au gsit la 100 de indivizi cu alele dominante AA i Aa, 99 de indivizi cu alelele recesive aa. Valoarea selectiv a alelelor dominante se noteaz cu 1. n acest caz valoarea alelei recesive va fi de 0,99, iar coeficientul de selecie S = 1,00 0,99 = 0,01. Dac n aceast situaie introducem unele valori extreme putem obine urmtoarele rezultatele: a) cnd genotipurilor conin alelele dominante sau recesive ce produc sterilitatea sau moartea indivizilor S = 1-0 = 1; b) cnd raportul dintre cele dou genotipuri este egal, la cele dou categorii de indivizi S = 1 1 = 0. Selecia este n acest caz nul. Valoarea selectiv este sinonim cu valoarea adaptiv i se apreciaz prin numrul de descendeni pe care-l realizeaz fa de genotipurile normale. Referindu-ne n continuare la genele A i a, n care gena A este dominant i gena a recesiv i la coeficientul de selecie notat mpotriva lui aa va fi s, contribuia genotipurilor mpotriva crora acioneaz selecia va fi s-1 (tabelul 14.4).

272

Tabelul 14.4 Situaia genotipurilor i a frecvenei genelor n urma aciunii seleciei

Genotipurile Frecvenele iniiale Capacitatea Contribuia genetic AA p p
2

Aa 2pq 1 2pq
2

aa q
2

Total 1 1-sq2

1
2

1-s q (1-s)

Genele nefavorabile duc la ndeprtarea indivizilor ce le posed, din snul populaiei. Odat cu aceasta, numrul genelor favorabile crete. Viteza cu care sunt ndeprtate genele dominante i recesive din populaie este diferit. Unele gene, care au caracter letal sau de sterilitate pot elimina indivizii chiar din prima generaie n care au aprut. Alteori ele, dei micoreaz vitalitatea sau prolificitatea se pot menine mai multe generaii. Unele mutaii recesive, prin acumulare ndelungat pot constitui mari rezerve de gene. Dei unele mutaii recesive cu efect letal sunt ndeprtate din populaie, indivizii heterozigoi pentru aceste gene, le pot menine timp de zeci i sute de generaii. Studiul factorilor de selecie n legtur cu modificarea frecvenei genelor ntr-o populaie are o mare importan pentru ameliorare. Se va urmri multiplicarea descendenelor cu gene care intereseaz. Trebuie ns s inem seama de diferitele tipuri de relaii ntre aceste gene (dominan, epistazie, aditivitate .a). Pentru caracterele cantitative se fac studii statistice, iar selecia se face prin deplasarea valorii medii a caracterului studiat spre una din valorile extreme.

14.9.2. Migraia
Migraia este procesul de ndeprtare sau introducere a unui fond genetic strin, ntr-o anumit populaie. n primul caz se numete emigraie, iar n cel de al doilea imigraie. Gradul de modificare a frecvenei genelor prin migraie depinde de numrul de indivizi ce au emigrat sau imigrat i de numrul de gene native a populaiei respective. Notm cu: m gene imigrante n fiecare generaie 1-m restul indivizilor din populaie qm frecvena unei gene imigrante q0 - frecvena unei gene native (existente n populaie) q1 frecvena acestei gene n ntreaga populaie, care va fi urmtoarea: q1 = mqm + (1 m) q0 = m (qm q0) + q0 Modificarea frecvenei dup o generaie (Dq) va fi: Dq = q1 q0 = m (qm q0)

273

Reiese c ritmul de schimb a genei supus imigrrii este corelat cu ritmul de imigrare i de diferena dintre genele imigrante i cele existente iniial n populaie. n ameliorare, imigrrile au importan i ele constau n ncruciarea indivizilor dintr-o populaie cu indivizi strini, pentru formarea de soiuri sau rase noi.

14.9.3. Mutaia
Mutaia modific structura genetic a populaiilor n msura n care ea este izolat sau repetat, recesiv sau dominant, folositoare sau nefolositoare organismelor, direct sau reversibil. Mutaiile izolate prezint o mai mic importan pentru evoluie. Dac sunt recesive se pot menine mult timp n populaie i fiind n stare heterozigot foarte rar se evideniaz sub aspect fenotipic. Dac sunt dominante, ceea ce se ntmpl foarte rar, produc modificri, adeseori evidente i soarta lor depinde de avantajul sau neajunsul pe care l prezint n perpetuarea individului. De obicei, alelele de tip slbatic produc mutaii recesive. Din aceast cauz, acestea din urm se acumuleaz n populaie i sunt mai greu de eliminat prin selecie, doar cnd devin homozigote. Frecvena lor scade atunci cnd au o aciune duntoare i crete atunci cnd, din contra, au o aciune favorabil. Rspndirea mutaiilor n populaie este condiionat i de efectul pe care-l produc asupra vitalitii i prolificitii individului mutant. S presupunem c gena A sufer un proces de mutaie i se transform n gena a cu o frecven u pe generaie. S notm frecvena ei cu p0, iar frecvena noilor gene mutante cu up0. Frecvena nou a genei A devine p0-up0. S urmrim acum ce se ntmpl cnd mutaia se produce n ambele sensuri: de la A la a i de la a la A. Pentru frecvena mutaiei inverse, de la a la A s folosim notaia v iar a genei a iniiale q0. n primul caz, atunci cnd gena A trece n gena a se va produce un ctig de gene a egal cu up0 i o pierdere, datorit mutaiei inverse egal cu vq0. Cele afirmate mai sus se pot nota Ritmul de mutaie: u A a v Frecvena iniial a genelor p0 q0 Frecvena celor dou gene se va modifica pn se va ajunge la un echilibru: pu = qv sau p v u = sau q = q u u+v Dac mutaia invers nu se produce, se poate observa din formul c echilibrul nu se realizeaz dect dac gena A este eliminat din populaie.
274

Tot din formula de mai sus se poate observa c frecvena genelor mutante directe este mai mare dect frecvena genelor mutante inverse. Aceasta ar nsemna c alelele mutante ar deveni, cu timpul, mai numeroase dect cele de tip slbatic. n realitate, situaia este tocmai invers, deoarece majoritatea alelelor mutante sunt eliminate din populaie prin aciunea seleciei. Posibilitatea genei mutante de a rmne n stare heterozigot sau de a deveni homozigot depinde i de numrul de indivizi din populaia care particip la ncruciri. Cu ct acest numr este mai mic, cu att exist anse mai mari ca gena recesiv s devin homozigot i s se evidenieze.

14.9.4. Drift-ul genetic

Drift-ul genetic numit i deriv genetic este modificarea frecvenei genelor la populaiile mici, datorit unor factori ntmpltori. Aa dup cum o corabie lipsit de crm i motor este dus de valuri i vnt (mers n deriv), tot astfel i indivizii unor populaii mici i modific structura genetic n direcii neprevzute, fr o aciune a factorilor despre care s-a vorbit anterior. Din numrul mare de gamei produi de un organism, nu toi particip la fecundare. Din aceast cauz frecvena genelor care se afl ntmpltor n gameii ce particip la fecundare crete, n timp ce cele din gameii care se pierd o face s scad. Evoluia organismului n funcie de prezena unor anumite gene, n acest caz este ntmpltoare. n populaiile mari acest fenomen nu prezint importan deoarece exist anse mai mari ca genele s fie repartizate n toate combinaiile posibile. S-a artat c pentru o pereche de alele ntr-o populaie panmictic 25% au genotipul AA, 25% aa i 50% Aa. La un numr mic de indivizi s-ar putea s apar numai genotipul AA sau aa. Drift-ul genetic prezint o importan mare pentru amelioratorii de animale care se ocup de un numr redus de indivizi. Acest grup evolueaz n diferite direcii, dup cum are loc o cretere a frecvenei unor gene, care se gsesc n gameii care au contribuit la formarea indivizilor, sau o pierdere a altor gene, de la gameii care nu au participat la formarea lor. Intrarea unui efectiv de animale n drift poate fi pus n eviden calculnd Ne, adic numrul efectiv de indivizi ce se mperecheaz liber i nu dirijat. 4Nm x Nf Ne = 4Nm + Nf S-a notat cu Nm numrul de masculi i cu Nf numrul de femele.

275

14.9.5. Factorii care modific frecvena genotipurilor ntr-o populaie

ncrucirile libere, ntmpltoare ntre indivizi, contribuie la meninerea structurii genetice constante a populaiilor. Orice factor care ar dirija ncrucirile ntr-un anumit sens, modific schimbul de gene i formeaz fenotipuri noi. Unii factori geografici (muni sau ape), ecologici (pedoclimatici, macro sau microclimatici), biologici (genetici sau fiziologici) asigur izolarea reproductiv, oprind total sau parial schimbul de gene ntre populaii. Dou mari categorii de factori sunt capabili s modifice structura genotipic a populaiilor: - ncruciarea consangvin la animale, n care indivizii ce se mperecheaz sunt nrudii; - autopolenizarea forat a plantelor alogame. Pentru a ne da seama de efectele genetice al consangvinizrii, s considerm mai nti cazul unei populaii panmictice care este supus autofecundrii. Prin autofecundare formele homozigote se menin mai departe tot homozigote, iar acele heterozigote segreg n raport de 0,25 AA : 0,5 Aa : 0,25 aa. Numrul de heterozigoi se njumtete la fiecare generaie. n acest timp crete numrul homozigoilor. Autofecundarea, ntr-un timp foarte scurt, face ca genotipurile s fie homozigote pentru toate genele componente. Oricare ar fi sistemul de reproducere consangvin ce acioneaz n populaie, efectul este desfacerea ei n linii homozigote i scderea heterozigoilor. Homozigoii recesivi ce formeaz fenotipuri cu defecte sunt eliminai de selecie. Cnd prezint totui unele caliti pentru amelioratori asemenea homozigoi pot fi reinui, iar prin ncruciarea liniilor se obine efectul de heterozis.

14.9.6. Homeostazia genetic i evoluia populaiilor

Oricare ar fi nivelul de organizare a materiei vii, celular, individual i populaional exist o capacitate a acesteia de a-i menine ntre anumite limite, constante, structurile i funciile. Populaiile i menin echilibrul genetic prin heterozigoie, polimorfism i o anumit direcie a procesului mutagen. Acest echilibru, care le imprim o relativ stabilitate genetic poart numele de homeostazie genetic. n populaiile panmictice, dei indivizii par foarte asemntori, ei ascund o mare diversitate genetic. Heterozigoia asigur adaptarea organismelor la diferite condiii de mediu, imprim organismului plasticitate ecologic. Prin polimorfism se nelege existena n populaie a unor forme ce se deosebesc dup unele caractere i funcii ce le ndeplinesc n colectivitate. Aici se pot ncadra mprirea n sexe, heterostilia, diviziunea funciilor n colectivitate (furnici, albine .a).
276

ntr-o populaie, exist un numr enorm de mutani recesivi, a cror frecven se modific, n funcie de numrul de indivizi, condiiile externe i interne. Aceste mutaii constituie mari rezerve de variabilitate genetic. O anumit schimbare a condiiilor de via permite organismului s foloseasc din aceast rezerv, unele nsuiri, care n vechile condiii nu s-au manifestat. n capitolul de fa s-au artat care sunt factorii ce modific structura genetic a populaiilor i cum acioneaz ei. Mutaia i recombinarea constituie surse de variabilitate; selecia este fora care dirijeaz evoluia i menine formele cele mai bine adaptate; izolarea geografic separ populaiile i face posibil izolarea reproductiv i formarea de noi specii. Aspectele complexe pe care le mbrac mecanismul de evoluie a populaiilor naturale, a animalelor domestice i plantelor de cultur, fac s rmn n prezent nc multe probleme nerezolvate. Sarcina de viitor const n a gsi modaliti noi, prin care interaciunea dintre factorii genetici i mediu determin schimbarea organismelor, evoluia lor. Aceasta are o importan deosebit att pentru studierea procesului de evoluie din natur, ct i pentru producerea de forme noi de plante cultivate sau animale domestice.

277

GLOSAR de termeni tiinifici

Aberaie (anomalie) cromozomic - modificare a numrului de cromozomi, caracteristic fiecrei specii (a. numeric) sau a structurii unuia sau mai multor cromozomi (a. structural). Adaptare (lat. adaptare-a potrivi) - proces de schimbri evolutive prin care un organism sau o specie supravieuiesc i se reproduc ntr-o ni ecologic. Adenin (6-aminopurin) - baz azotat pirimidinic prezent n acizii nucleici. Adenozin-trifosfat (ATP) nucleotid alctuit dintr-o baz azotat (adenina), un zahar (riboza) i trei grupri fosfat, ataate de carbonul 5 al zaharului; desfacerea legturilor de fosfor, prin hidroliz elibereaz cantiti mari de energie. Albinism (lat. albus) tulburare metabolic, caracterizat prin deficiena tirozinazei, care intervine n transformarea tirozinei n melanin, ceea ce face ca prul, pielea, irisul, s fie albe, la animale; la plante, albinismul se datoreaz unei deficiene a cromoplastelor. Albomaculatus (lat. albus - alb; maculatus ptat)- pe frunzele plantelor alterneaz zone cu pigmentaie normal cu altele cu pigmentaie anormal (alb sau galben). Alchilani substane care nlocuiesc un atom de hidrogen, cu o grupare alchil, ntr-un compus organic. Alel (prescurtare de la alelomorf; gr. allelon dintr-una n alta; morphe form) fiecare din formele sub care poate exista o gen de pe un locus dat, aprnd prin mutaie i ndeplinind aceeai funcie. Cnd cele dou alele de pe cromozomii omologi sunt identice, individul este homogametic (homozigot), iar cnd alelele sunt diferite, individul este heterogametic (heterozigot). Alofenic (gr. allos altul; phainen a aprea) animal rezultat din fuziunea a doi embrioni i a crui esuturi sunt diferite genetic. Alogamie (gr. allos altul; gamos cstorie) - ncruciare ntre indivizi diferii genetic, un mascul i o femel, care produc gamei masculini i
278

respectiv feminini. Numeroase plante porumb, ceap, morcov, secar - i majoritatea animalelor, sunt alogame. Amber (arab. ambar - chihlimbar) nume dat codonului UAG, unul din codonii STOP, denumit i codon non-sens. Amfidiploid (gr. amphi amndoi; diploos dublu; eidos form) poliploid rezultat prin dublarea numrului de cromozomi a unui hibrid interspecific diploid. Aminoacid compus organic ce conine o grupare amino (NH2), un grup carboxil (O=C-OH), un atom de hidrogen i un radical care-i confer specificitate. Aminoacil ARNt-sintetaza enzim care catalizeaz activarea aminoacizilor printr-o reacie cu adenozin-5-trifosfat. Amitoza (gr. a fr; mitos filament; osis condiie) diviziune celular direct, caracterizat prin fragmentarea nucleului i apoi a citoplasmei, fr participarea fusului nuclear. Amplificare genic - mrirea numrului de copii a unei gene. Androgenez (gr. andros brbat; genesis natere) dezvoltarea unui organism care conine numai genomul patern. Androsterilitate (gr. andros brbat; lat. sterilitas sterilitate) sterilitate masculin, determinat de absena gameilor, sau formarea gameilor nefuncionali. Aneuploid (gr. an fr; eu bine; haploos odat; eidos form) organism cu unul sau mai muli cromozomi n plus sau la care lipsesc unul sau mai muli cromozomi (2n+1, 2n+2, 2n-1, 2n-2 etc.). unui codon. Anticodon secven de trei nucleotide din ARNt ,complementar

Antigen (gr. anti - mpotriva; genos gen, familie) substan capabil s induc formarea de anticorpi, dup ptrunderea sa n organism. Aparat mitotic complex de structuri(asterii i fusul nuclear), care asigur migrarea cromozomilor, n timpul diviziunii celulare.

279

Apogamie (gr. apo fr; gamos cstorie) dezvoltare a embrionului dintr-o alt celul a sacului embrionar, exceptnd oosfera. Apoptoza moarte celular programat genetic, ntr-un esut sau organ n dezvoltare. Autofecundare (gr. autos - nsui; lat. fecundare a fertiliza) fuziune a doi gamei de sex diferit, produi de acelai individ (ex. plantele hermafrodite). Autopoliploidie (gr. autos - nsui; polys muli; haploos odat; eidos form) multiplicarea numrului de genomuri, pe baza unui genom propriu. Autotrof (gr. autos - nsui; trophe hran) organism care folosete drept surs de carbon, bioxidul de carbon, nefiind dependent de substanele organice din mediul extern. Autozom.(gr. autos - nsui; soma corp) oricare din cromozomi, n afara celor ce determin sexul. Autoradiografia tehnic fotografic ce permite detectarea substanelor radioactive ntr-o structur celular sau ntr-o macromolecul. Imaginea este produs pe o emulsie fotografic, ca urmare a emisiei de raze beta , de ctre materialul radioactiv. Auxotrof (gr. auxein a crete; trophe hran) form mutant a unui microorganism, care crete numai ntr-un mediu suplimentat cu factori de cretere specifici.

***
Backcross (engl. back - napoi; cross - ncruciare) - ncruciarea unui individ cu structur genetic necunoscut, cu un printe homozigot (de obicei, recesiv pentru una sau mai multe perechi de gene). Se mai numete retroncruciare sau ncruciare analizatoare. Bacteriofag (gr. bacterion bastona; phagein a mnca) virus ce se multiplic n celula bacterian. Baze minore baze azotate prezente n ADN sau ARN, n cantiti foarte mici (ex. 5-metil-citozina, 6-aminopurina, N-dimetil-guanozina etc.).

280

Bivalent (lat. bis de dou ori; valens tare, puternic) complex format din doi cromozomi omologi, fiecare cu cte dou cromatide (tetrad cromozomic).

***
Capsid (lat. capsa cutie) - nveliul proteic al unui virus (sin. anvelop viral). Cariotip (gr. karyon nucleu; typos tip) totalitatea cromozomilor unei specii, clasificai n funcie de form, mrime i alte particulariti. Centimorgan unitate de msur a distanei dintre gene, egal cu 1% recombinri prin crossing over. Chiasma (gr. chiasma - n form de cruce) zon de suprapunere a cromatidelor nesurori ale cromozomilor omologi, n stadiile zigonema pachinema, fiind expresia citologic a crossing-over-ului. Chinetocor (gr. kinein a mica; chorion loc) structur localizat la nivelul constriciei primare, prin care, cromozomul se ataeaz de fibrele fusului nuclear. Citochinine (gr. kytos cavitate; kinein a mica) factori de cretere vegetali, ce stimuleaz diviziunea celular. Clon (gr. klon ramur mic) populaie de dimensiuni variabile, rezultat dintr-un singur organism (bacterii) sau dintr-o singur celul avnd aceeai structur genetic. Cloroplast (gr. chloros verde; plastos formaiune) organit citoplasmatic delimitat de o membran dubl, cu rol n fotosintez. Cod genetic triplete de nucleotide din ADN sau ARNm ce codific aminoacizii existeni ntr-un lan polipeptidic. Codon secven de trei nucleotide din ARNm ce codific unul sau mai muli aminoacizi. Colinearitate (lat. cum cu; linea linie) corespondena dintre succesiunea nucleotidelor dintr-un lan polinucleotidic i succesiunea aminoacizilor unui lan polipeptidic.
281

Consangvinizare (lat. consangvineus - nrudit prin snge; engl. inbreeding reproducere prin cstorie ntre rude) - ncruciare ntre indivizi nrudii. Corepresor (lat. cum cu; repressus oprit) produs final al unui lan metabolic, de natur proteic, care intervine n sistarea propriei sinteze, prin combinarea sa cu un represor, codificat de o gen reglatoare. Cromatid (gr. chroma culoare) una din subunitile longitudinale ale cromozomului, rezultat n urma replicrii acestuia, rezultnd dou cromatide surori, respectiv, doi cromozomi monocromatidici. Cromatin (gr. chroma culoare; tainia filament) agregarea macromoleculei de ADN cu proteinele histonice, mici cantiti de ARN, constituind structuri ale cromozomilor interfazici la eucariote. Cromocentru (gr. chroma culoare; kentron centru) corpuscul, rezultat prin fuzionarea centromerului i a regiunii heterocromatice a mai multor cromozomi. Cromomer (gr. chroma culoare; meros parte) nume dat benzilor mai intens sau mai slab colorate, dispuse succesiv, n cromozomi. Cromonema, pl. chromonemata (gr. chroma culoare; nema filament) subdiviziune longitudinal a cromatidei. Cromozom (gr. chroma culoare; soma corp) structur nuclear, nucleoproteic, purttor al informaiei genetice prin genele sale. Crossing-over (gr. crossing - ncruciare; over peste) schimb reciproc de segmente omoloage ntre cromatidele nesurori ale cromozomilor omologi.

***
Degenerare (lat. de lipsit de; generare a genera) caracteristic a codului genetic, prin care, un aminoacid este codificat de mai muli codoni (triplete). Deleie (lat. deletio pierdere) tip de aberaie cromozomic, determinat de pierderea unui segment dintr-un cromozom, iar la nivel molecular, pierderea unui nucleotid sau a unui grup de nucleotide din ADN.

282

Diachinez (gr. dia prin; kinesis micare) subfaz a profazei I a meiozei, n care bivalenii sunt condensai, chiasmele localizate spre capetele acestora, conferindu-le un aspect caracteristic. Diada (gr. dias doi) cele dou celule fiice rezultate n urma meiozei primare(heterotipic). Diauxie (gr. di dublu; auxein a crete) capacitatea microorganismelor de a se dezvolta n medii de cultur ce conin doi carbohidrai diferii. Dihaploid (gr. dis de dou ori; haploos simplu; eidos form) organism cu dou seturi de cromozomi, rezultat prin reducerea la jumtate a numrului de cromozomi ai unui organism tetraploid. Dihibridare (gr. dis de dou ori; hybrida metis) - ncruciare ntre prini (genitori) ce se deosebesc prin dou perechi de caractere. Dimorfism (gr. dis de dou ori; morphe form) dou forme diferite morfo-fiziologic, n cadrul aceleiai specii. Dioic (gr. dis de dou ori; oikos cas) plant unisexuat, cu florile mascule i femele, pe indivizi diferii. Diploid (gr. diploos dublu; eidos form) celul sau organism cu dou seturi de cromozomi, 2n, caracteristic celulelor somatice. Diplonema (gr. diploos dublu; nema fir) stadiu din profaza I a meiozei, cnd la fiecare bivalent, se disting cele patru cromatide (tetrad cromozomic). Disjuncie (lat. disjunctio separare) separarea cromozomilor omologi sau a cromatidelor unui cromozom n urma clivrii longitudinale a acestuia. Dominan (lat. dominare a domina) manifestarea fenotipic a unei gene sau a caracterului fenotipic corespondent, n stare heterozigot. Duplicaie (lat. duplicare a dubla) aberaie cromozomic n care, un segment cromozomic sau o gen se gsesc n dou exemplare, n acelai cromozom.

***
283

Endomitoz (gr., endon - nuntru; mitos filament) tip particular de diviziune, pe parcursul creia, replicarea cromozomilor, nu este nsoit de diviziunea nucleului i citoplasmei. Endonucleaz - enzim care desface legturile fosfo-diesterice din cadrul unui lan polinucleotidic, intervenind n procesele de reparaie, n rupturile monocatenare, fiind specifice pentru ADN i ARN . Enucleare (lat. enucleare a scoate smburi) - ndeprtarea experimental a nucleului. Enzim de restricie enzim care secioneaz macromolecula de ADN, ntr-un loc specific. Epistasia (gr. epi pe; stasis stare, poziie) interaciunea dintre dou gene nealele, prin care una inhib activitatea celeilalte. Eucariot (gr. eu adevrat; karyon nucleu) organism unicelular sau pluricelular, cu nucleu delimitat de membran nuclear, n interiorul cruia se gsete materialul genetic. Eucromatina (gr. eu adevrat; chroma culoare) regiune a cromozomului, care n interfaz este nespiralizat, cu gene structurale active. Exon (engl. expressed exprimat) - segment informaional al unei gene, transcris i translat ntr-o secven de aminoacizi. Explant (lat. explantare a sdi n afar) fragment de esut vegetal sau animal, transferat pe un mediu artificial de cretere.

***
Fenocopie (gr. phaino apariie; copia abunden) modificare morfo-fiziologic produs de un factor de mediu, care imit o modificare similar, condiionat genetic. Fenotip (gr. phaino apariie; typos model) totalitatea caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice i comportamentale, rezultate din interaciunea genotipului cu mediul. Filogenie (gr. phylon ras; genesis natere) totalitatea relaiilor evolutive dintre grupe sistematice de plante sau animale, stabilite pe criterii genetice.
284

Fragmoplast (gr. phragmos gard; plastos format) membran separatoare a celor dou celule fiice, ce rezult n urma mitozei.

***
Gamet (gr. gamete soie; gametes so) celul sexual matur, ce poate fi fecundat de alta de sex opus, rezultnd celula ou sau zigotul. Gametogenez (gr. gametes so; genesis natere) procesul de formare a gameilor. Gen (gr. genos urma) secven nucleotidic din ADN sau ARNv, ce deine informaia genetic pentru sinteza unui lan polipeptidic, a unei molecule de ARNt sau a unei molecule de ARNr la nivel cromozomic, ocupnd un loc bine definit, denumit locus. Genofond (gr. genos urma; fr. fond fond) totalitatea genelor unei populaii vegetale sau animale. Genom (gr. genos urma) - totalitatea genelor dintr-o celul sau dintr-un virus; la eucariote, totalitatea genelor dintr-un set haploid de cromozomi. Genotip (gr. gennaein a produce; typos tip, model) constituia (structura) genetic a unui organism; n sens restrns, genotipul, se refer la tipul alelelor, uneia sau mai multor gene luate n studiu. Gonocorism (gr. gonos urma; chorisma separare) separarea indivizilor unei specii, n cele dou sexe, pe baza caracterelor sexuale primare i secundare. Guanin (2- amino 6- oxipurin) baz azotat purinic, prezent n unul din cele patru tipuri de nucleotide din ADN i ARN.

***
Haploid (gr. haploos odat; eidos form) stare n care o celul sau un organism posed un singur set de cromozomi(n); n gamei, haploidia este o caracteristic normal, n urma fecundrii , restabilindu-se structura diploid (2n), caracteristic speciei. Hemizigot (gr. hemi jumtate; zygotos - njugat, mperecheat) individ diploid care ntr-un anumit locus, a unei perechi de cromozomi, poseda numai una din cele dou alele, cum este cazul sexului heterogametic XY.
285

Heritabilitate (engl. heritability ereditar) indice statistic, care exprim msura n care un caracter ereditar este determinat de genotip sau de factorii de mediu. Heterocarion (gr. heteros altul; karyon nucleu) celul cu doi sau mai muli nuclei diferii. Heterocromatin (gr. heteros altul; chroma culoare; tainia filament) regiune a cromozomului , adiacent centromerului i telomerelor, intens condensat n interfaz, inactiv genic, fiind alctuit din ADN repetitiv. Heterocromozom (gr. heteros altul; chroma culoare; soma corp) unul din cei doi cromozomi X , ai unui organism homogametic XX, care n interfaz formeaz cromatina sexual. Heterozigot (gr. heteros altul; zygotos - mpreun) individ diploid sau poliploid, care, ntr-un locus sau mai muli , posed gene alele diferite. Heterozis (gr. heterosis schimbare) superioritatea hibrizilor fa de fiecare genitor, privind unul sau mai multe caractere ereditare (vigoare hibrid). Hexaploid (gr. hexa ase; haploos simplu; eidos form) celul sau organism, cu ase seturi complete de cromozomi (2n=6x). Hfr (engl. high frequency of recombination nalt frecven de recombinare) su bacterian cu factorul de fertilitate integrat n cromozomul propriu zis, care realizeaz procesul de conjugare cu o frecven foarte mare. Hibridoma (lat. hybrida metis; gr. oma sufix cu sensul de tumor) cultur de celule hibride care produc anticorpi monoclonali. Histone proteine bazice ce realizeaz cu ADN, complexul nucleohistonic; cele cinci tipuri principale de histone sunt: H1, H2A, H2B, H3 i H4. Holandric (gr. holos tot; ander brbat) caracter determinat de o gen localizat pe cromozomul Y, sex-linkat cu sexul heterogametic XY. Homeostazie (gr. homoios asemntor; stasis stare) - nsuire adaptativ a unui organism, de a-i menine integritatea genetic, ntre anumite limite, n condiii de mediu variabile. Homozigot (gr. homos acelai; zygotos - mpreunat) individ diploid sau poliploid, avnd aceleai gene alele la un anumit locus, n cromozomi omologi.
286

***
Idiogram (gr. idios propriu; gramma desen) reprezentare grafic a cromozomilor unei specii, la o anumit scar, ce red numrul, forma, mrimea i alte particulariti ale acestora. Incompatibilitate (fr. incompatibilite incompatibilitate) incapacitatea gameilor de sex diferit de a se fecunda, pentru a da natere la un zigot viabil. Inductor (lat. inducere a duce la ) substan care inactiveaz un represor, care la rndul su, nu mai blocheaz gena operatoare, operonul este funcional i genele structurale fiind activate, determin sinteza enzimelor catabolizante. Inducie enzimatic - sinteza unei enzime n prezena unui metabolit, de obicei, a propriului substrat ce trebuie catabolizat Interferen (lat. interferire - a se mpotrivi) tendina unui crossing-over, ca pe o anumit distan, exprimat n uniti de recombinare, s modifice frecvena cu care se produce un alt crossing-over. Intron (engl. intragene - n gen) secven nucleotidic noninformaional, de 100-1000 nucleotide, care poate fi situat la capetele unei gene sau n interiorul acesteia, separnd exonii. Inversie (lat. inversio rsturnare) aberaie cromozomic, constnd n ruperea unui segment cromozomic, rsucirea lui cu 180o i reataarea n acelai loc, ducnd la inversarea ordinii unui grup de gene. In vitro (lat. vitrum sticl) experien efectuat n condiii de laborator(n afara organismului). In vivo (lat. vivum viu) procese i experiene ce se realizeaz n organisme vii. IS (engl. insertion sequence segmente de inserie) secvene scurte de ADN, coninnd 800-2000 nucleotide, care se pot integra n diferite locuri ale genomului, fiind denumite i transpozoni.

***
287

Kilobaz (kb) unitate de msur, egal cu 1000 de nucleotide, din molecula de ADN sau ARN. Kilodalton (Kdal) unitate de mas, egal cu 1000 de daltoni (dal.). Knob (engl. knob nod) zon heterocromatic prezent la unii cromozomi ai unor specii vegetale sau animale, detectabil n interfaz i folosit ca marker genetic.

***
Leptonema (gr. leptos subire; nema fir) stadiu din profaza primar a meiozei, cnd cromozomii, n numr diploid(2n), au aspectul unor filamente extrem de subiri i foarte lungi, datorit gradului maxim de despiralizare a comatinei. Linkage (engl. linkage legtur, nlnuire) asocierea a dou sau mai multe gene nealele, situate n acelai cromozom, care se transmit cu o frecven mai mare n aceast stare, dect s segrege independent Liz (gr. lysis dizolvare) distrugere sau dizolvare a unei celule de un agent fizic, chimic sau biologic. Lizogenizare (gr. lysis dizolvare; gennaein a produce) multiplicarea materialului genetic al fagilor, n urma integrrii cromozomului fagic, n cromozomul bacterian. Lizozom (gr. lysis dizolvare; soma corp) organit citoplasmatic, specific celulei animale, produs de aparatul Golgi, ce conine enzime denumite hidrolaze. Locus pl. loci (lat. locus loc) poziia unei gene ntr-un cromozom.

***
Marker (engl. marker care indic) secven nucleotidic din ADN, gen cu efect fenotipic detectabil, al crui locus este cunoscut, folosit pentru localizarea altor gene; un cromozom cu o anumit particularitate morfologic(ex. cromozomii cu knob). Meioz (gr. meion mai puin; osis condiie) diviziune specific celulelor sexuale, pe parcursul creia, dintr-o celul cu 2n cromozomi, rezult patru celule fiice cu n cromozomi.
288

Merogonie (gr. meros parte; gone descendent) formarea unui embrion, prin fecundarea unui ovul anucleat, de un spermatozoid normal. Mitoz (gr. mitos filament; osis condiie) diviziune caracteristic celulelor somatice, n urma creia, dintr-o celul celul iniial cu 2n cromozomi, rezult dou celule fiice identice, cu acelai numr de cromozomi i aceeai structur genetic. Modificaie (lat. modificatio msurare) caracter a crui modificare a fost determinat de mediu, nefiind ereditar. Monoploid (gr. monos singur; haploos simplu; eidos form) individ care posed n celulele somatice, un numr haploid de cromozomi, provenind dintr-o specie diploid (2n=2x); sin. haploid adevrat. Monosomie (gr. monos singur; soma corp) absena unui cromozom dintr-o pereche (2n-1), la o celul sau la un individ. Mutaie (lat. mutatio schimbare) orice modificare n structura materialului genetic, la orice nivel de organizare a acestuia (subgen, gen, cromozom, genom), care se transmite ereditar. Muton cea mai mic unitate din molecula de ADN, ce poate suferi o mutaie, echivalent unei perechi de nucleotide.

***
Nucleoid (lat. nucleus smbure) zon mai dens n celula procariot, format din ADN spiralizat, nconjurat de mici cantiti de proteine. Nulisomie (lat. nullus nici unul; gr. soma corp ) absena unei perechi de cromozomi dintr-o celul sau din celulele unui organism (2n-2).

***
Okazaki fragmente Okazaki secvene de 400 2000 nucleotide ale ADN mpreun cu scurte secvene de ARN la un capt (50 100 ribonucleotide), care particip la sinteza replicativ a ADN. Existena lor a permis explicarea modului n care are loc sinteza a dou lanuri polinucleotidice, cu polaritate opus (3-5; 5-3), de ctre o singur enzim, ADN polimeraza III, care acioneaz ntr-o singur direcie

289

Operon (lat. operare a opera) unitate funcional din genomul bacterian, alctuit din promotor, gena operatoare i mai multe gene structurale, ce intervine n reglajul activitii genice. Ovogenez (lat. ovum ou; gr. genesis natere) procesul n urma cruia se formeaz celulele sexuale femele.

***
Pachiten (gr. pachys gros; tainia filament) stadiu din profaza primar a meiozei, n care cromozomii bivaleni sunt ntr-o sinaps complet, puternic rsucii unul n jurul celuilalt nct, aparent, numrul lor este haploid. Panmixie (gr. pan tot; mixis amestec) caracteristic ce presupune c un individ dintr-o populaie are aceeai ans de a se ncrucia cu oricare individ de sex opus din populaia respectiv. Partenogenez (gr. parthenos virgin; genesis natere) formarea unui embrion, dintr-o celul sexual femel (ginogenez) sau dintr-o celul sexual mascul (androgenez). Pericentric (gr. peri - n jur; kentron centru) restructurare cromozomic, care implic un segment ce include centromerul. Perisoploid (gr. perissos impar; haploos simplu; eidos form) poliploid cu numr impar de garnituri cromozomice (3x, 5x, 7x etc. ) Poliploidie (gr. polys muli; haploos odat; eidos form) multiplicarea numrului de seturi cromozomice. Polizom (gr. polys muli; soma corp) complex structural, format prin asocierea mai multor ribozomi cu o molecul de ARNm, a crei informaie genetic urmeaz a fi tradus (translat) ntr-o secven polipeptidic. Primer (engl. primer primul) secven scurt de nucleotide (ADN sau ARN), cu care ncepe sinteza lanurilor polinucleotidice. Procariote (gr. pro - nainte; karyon nucleu) organisme simple, unicelulare, care nu au nucleu, materialul genetic, fiind n contact direct cu citoplasma. Profag (gr. pro - nainte; phagein a mnca) bacteriofag integrat n cromozomul bacteriei infectate, replicndu-se odat cu replicarea cromozomului bacteriei gazd.
290

Protoplast (gr. protos primul; plastos format) celul procariot sau eucariot, a crei membran extern, de obicei rigid (peretele celular), a fost ndeprtat. Puf (engl. puff puf de pudrier) modificare structural a cromozomilor politeni, n care se sintetizeaz ARN i proteine.

***
Rad (prescurtare de la Radiation absorbed dose doz de radiaie absorbit) doza de radiaii echivalent cu o energie de 100 de ergi, absorbit de 1g de substan iradiat. Radiogenetic (lat. radius raz; gr. gennaein a nate) ramur a geneticii care studiaz efectele mutagene ale radiaiilor electromagnetice (razele X, gamma) i corpusculare (raze beta, protoni, neutroni etc.). Receptor (lat. receptor care primete) protein localizat pe membrana celular sau n citoplasm, care se poate lega specific de o protein din afara celulei. Recombinare (lat. re din nou; combinare a uni dou lucruri) apariia genotipurilor noi la descendeni, comparativ cu genotipurile prinilor (recombinare cromozomic, recombinare genic, conversie genic). Replicare semiconservativ (lat. replicare a ndoi, a mpturi) formarea a dou molecule bicatenare de ADN, dintr-o molecul bicatenar iniial; dup ruperea punilor de hidrogen dintre catenele moleculei iniiale, fiecare devine matri pentru sinteza unei catene noi, complementare. Ribozom (gr. ribos boab; soma corp) organit citoplasmatic, la nivelul cruia are loc sinteza proteinelor.

***
Segregare (lat. segregare a separa) separarea cromozomilor omologi n meioz i implicit segregarea genelor alele. Semidominan (lat. semi jumtate; dominans dominant) interaciune ntre genele alele, n urma creia, indivizii heterozigoi (Aa) manifest un fenotip intermediar ntre fenotipurile parentale (AA i aa).

291

Sex ducie (lat. sexus sex; ducere a duce) transferul unei gene de la o bacterie la alta, cu ajutorul factorului de fertilitate recombinat, F. Sex ratio (lat. sexus sex; ratio raport) raportul dintre numrul de masculi i numrul de femele. Sex linkage (lat. sexus sex; engl. linkage legtur) tip special de transmitere a caracterelor, determinate de gene localizate pe heterozomi (X sau Y). Sinaps (gr. synapsis unire) gruparea cromozomilor omologi n profaza I a meiozei prin complexul sinaptinemal. Sinergid (gr. synergos colaborator) una din cele dou celule haploide din apropierea oosferei, prezent la plante n sacul embrionar. Singamie (gr. syn - mpreun; gamos cstorie) fuzionarea complet a gameilor de la cele dou sexe, rezultnd celula ou sau zigotul. Soma (gr. soma corp) totalitatea celulelor unui organism, cu excepia celulelor sexuale (gamei). Spermatocit (gr. sperma smn; kytos cavitate) celul animal, rezultat prin mitoza unei spermatogonii. Spermatogenez (gr. sperma smn; genesis natere) procesul de formare a gameilor masculi. Statmochinez (gr. stathmos oprire; kinesis micare) mitoz anormal, determinat de blocarea formrii fusului nuclear, ceea ce determin dublarea numrului de cromozomi (nucleu de restituie).

***
Telofaz (gr. telos capt; phasis faz) ultima faz a mitozei sau meiozei, ce coincide cu formarea celor doi nuclei fii i a celulelor fiice. Telomer (gr. telos capt; meros parte) segment terminal al cromatidei unui cromozom. Test cross (engl. ncruciare de prob) metod de hibridare ce permite stabilirea structurii genetice a unui individ cu genotip necunoscut, prin ncruciare cu un individ homozigot recesiv (tester).
292

Tetrad (gr. tetras patru) tetrad cromozomic - cele patru cromatide ale cromozomilor bivaleni din meioz; tetrad celular - grup de patru celule haploide ce rezult n urma meiozei. Tetraploid (gr. tetras patru; haploos simplu; eidos form) celul sau organism, cu patru seturi haploide de cromozomi (2n = 4x). Tetrasomie (gr. tetras patru; soma corp) prezena a doi cromozomi suplimentari la una din perechile de cromozomi omologi (2n+2). Timina ( 2,6oxi 5- metil pirimidina) baz pirimidinic prezent n dezoxiribonucleotide. Transcripie (lat. transcriptio transcriere) copierea informaiei genetice de pe o poriune a unei catene de ADN, ntr-o molecul de ARNm, n prezena enzimei ARN polimeraza. Transducie (lat. transducere a transfera) transferul uneia, rar dou i foarte rar trei gene, de la o bacterie la alta, cu ajutorul unui fag temperat. Transgresie (lat. transgressio trecere dincolo de.) - apariia n generaia a doua sau mai trziu, a unor fenotipuri ce se abat de la limitele de variaie ale genitorilor i a celor din generaia F1. Translaie (lat. trans de cealalt parte; locus loc) traducerea secvenei ribonucleotidice din ARNm, ntr-o secven de aminoacizi, la nivelul polizomilor. Translocaie (lat. trans dincolo de; locatio - nchiriere) trecerea unui segment dintr-un cromozom, ntr-o ruptur a altui cromozom neomolog. Transpozon (lat. trans dincolo de; positio poziie) secven nucleotidic de ADN care-i poate schimba poziia n genom. Triploid (gr. triploos triplu; haploos simplu; eidos form) celul sau organism cu trei seturi de cromozomi (2n=3x). Trivalent (gr. tria trei; lat. valens puternic) asocierea a trei cromozomi omologi n meioz.

***
Unisexuat (lat. unus unul; sexus sex) animal sau plant care produc numai gameii unui sex.
293

Unitate Morgan msura distanei relative dintre genele aceluiai cromozom, exprimat prin frecvena recombinrilor dintre cromozomii omologi. Uracil (2 dioxipirimidina) baz pirimidinic, component a ribonucleotidelor (ARN).

***
Variabilitate (lat. variabilis variabil) deosebirile dintre indivizii unei populaii sau specii, ce nu sunt determinate de sex sau vrst. Varian - gradul de dispersie a valorilor individuale n jurul mediei aritmetice, ce exprim gradul de variabilitate al unui caracter ereditar. Viroid (lat. virus otrav; oid asemntor) agent infecios subviral, format dintr-o molecul de ARN, cu greutatea molecular de 75-100.000 daltoni, fr capsid. Virus (lat. virus otrav) procariot extrem de simplu, ce conine o molecul de ADN (dezoxiribovirus) sau ARNv (ribovirus), nconjurate de un nveli proteic (capsid).

***
Xenie (gr. xenos strin) prezena unor caractere paterne n endospermul seminelor.

***
Zigot (gr. zygotos - mpreunat) celul diploid ce rezult n urma fecundrii gameilor haploizi, a celor dou sexe. Zigonema (gr. zygon - mperecheat; nema fir) stadiu din profaza I a meiozei, n care are loc sinapsa cromozomilor omologi, rezultnd cromozomi bivaleni.

294

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. ANTOHI, St., GAVRILA, L., 1981, Progrese n genetica molecular. Edit. tiinific i enciclopedic, Bucureti. 2. BRA, I., CORNEANU, G., 1989, Elemente de radiobiologie vegetal, Edit. Ceres, Bucureti. 3. BECKWITH, J.R., ZIPSER, D., 1970, The lactose Operon. New Zork. Cold Spring Harbor Laboratory. 4. BENOIT, J., LEROY, P., VENDRELY, R., VENDRELY, C., 1959, Modification des caractres raciaux du canard Pkin par l'DNA du canard Kaki Campbell et leur transmission a la descendence. Lige, Col. Int. DNA. 5. BENZER, S., 1962, The structure of the gene. In: Sci. Amer. 6. BRESCH, C., 1965, Klassische und molekulare Genetik. Berlin, Springer Verlag, Heiselberg, New-York. 7. BREWBAKAR, J.L., 1964, Agricultural Genetics. Englewood Cliffs N.J.: Prentice-Hall. 8. BUTNARU, GALLIA, 1985, Genetica, vol. I i II, Lito., Inst. Agronomic, Timioara. 9. BUTNARU, GALLIA., NICOLAE, I., TMAS, ELENA, 1999, Genetica molecular, Edit. Mirton, Timioara. 10. CEAPOIU, N., 1976, Genetica i evoluia populaiilor biologice. Edit. Academiei R.S.R., Bucureti. 11. CELIS, E.J., 1994, Cell Biology, a laboratory handbook, vol.1, Academic Press, London 12. COLES, N., 1974, Genetica. Craiova, Lito universitate. 13. CRCIUN, T., 1970, Genetica. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 14. CRCIUN, T., 1972, Haploidia n cercetrile de genetic i n ameliorarea plantelor. Probleme de genetic teoretic i aplicat, I.C.C.P.T., Fundulea, vol. IV,b. 15. CRCIUN, T., CRCIUN, V., 1976, Mic dicionar de biologie. Edit.Albatros, Bucureti. 16. CRCIUN, T., PATRASCU, MINODORA, 1978, Mecanismele ereditii. Edit. Albatros, Bucureti. 17. CRCIUN, T., TOMOZEI, I., COLES, N., NASTA, A., 1978, Genetica. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 18. CRCIUN, T., 1981, Genetica plantelor horticole. Edit. Ceres, Bucureti. 19. CRCIUN, T., TOMOZEI, I., COLES, N., BUTNARU, GALLIA, 1991, Genetica, Edit. didactic i pedagogic, Bucureti. 20. CRLAN, M., 1996, Elemente de genetic animal normal. Edit. Polirom, Iai.
295

21. CRLAN, M., CREANG, T., 2001, Evoluia determinismului genetic al sexelor, Edit. Sedcom Libris, Iai. 22. CORNEANU, MIHAELA, 2001, Genetic. Edit. Sitechi, Craiova. 23. CRICK, F.H.C., 1962, The genetic code. Sci. Am. 10. 24. DARVASI, A., SOLLER, M., 1993, A Simple Method to Calculate Resolving Power and Confidence Interval of QTL Map Location Behavior Genetics, vol. 27, No. 2 25. DARVASI, A., SOLLER, M., 1994, Selectiv DNA Pooling for Determination of Linkage Between a Molecular Marker and a Quantitative Trait Locus, Genetics 138, 1365-1373 26. DIACONU, P., 1971, Ereditatea i factorii mutageni. Edit. Ceres, Bucureti. 27. DIACONU, P., 1974, De la factorii ereditari la codul genetic. Edit. Ceres, Bucureti. 28. DRACEA, I., 1972, Genetica. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 29. DRACEA, I., 1973, Genetica. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 30. DUBININ, N.P., 1965, Genetica molecular i aciunea radiaiilor asupra ereditii. Edit. Agro-Silvic, Bucureti. 31. DUBININ, N.P., 1977, Micarea etern. Edit. Politic, Bucureti. 32. DUDLEY, J.W., 1993, Molecular Markers in Plant Improvement: Manipulation of Genes Affecting Quantitative Traits, Crop Sci. 33: 660-668 33. DU PRAW, E.J., 1970, DNA and Chromosomes. New York Holt. Rinehart and Winston. 34. FREIFELDER, D., 1987, Microbial genetics, Jones and Barlett Publishers, Boston, London. 35. GARDNER, E.J., 1967, Principles of Genetics. New York, John Wiley and Sons. Inc. 36. GAVRIL, L., DABALA, I., 1975, Genetica diviziunii celulare. Edit. Dacia, Cluj-Napoca. 37. GAVRIL, L., DABALA, I., 1981, Descifrnd tainele ereditii. Edit. Dacia, Cluj-Napoca. 38. GIOSAN, N., SULESCU, N., 1972, Principii de genetic. Edit.tiinific, Bucureti. 39. GRIFFITHS, J.F.A., i colab., 1999, Modern Genetic Analysis, W.H. Freeman and Co, New York. 40. HAGGIS, G.H., MICHIE, D., MUIR, A.R., ROBERTS, K.B., WALKER, P.M.B., 1967, Introducere n biologia molecular. Edit. tiinific, Bucureti. 41. HARTL, L.D., FREIFELDER, D., SNYDER, A.L., 1994, Basic Genetics, Jones and Bartlett, Publishers, Boston. 42. JACOB, F., MONOD, J., 1961, Genetic regulator mechanism in the synthesis of proteins. In rev. J. Mol. Biol. nr.3. 43. JACOB, F., 1970, Logica viului. Edit. tiinific i enciclopedic, Bucureti. 44. JONES, N., OUGHAM, HELEN, THOMAS, H., 1997, New Phytol., 137, 165-177 45. KEARSEY, M.J., FARQUHAR, A.G.L., 1998, QTL Analyses in Plants; where are we now? Heredity, 80, 137-142
296

46. KING, R.C., 1962, Genetics. Oxford University Press, New York 47. KNAPP, S.J., 1991, Using molecular markers to map multiple quantitative trait loci: model for backcross, recombinant inbred and doubled haploid progeny, Theor. Appl. Genet., 81; 333-338 48. LANDER, E.S., BOTSTEIN, D., 1989, Mapping Mendelian Factors Underlying Quantitative Traits Using RFLP Linkage Maps, Genetics, 121, 185-199 49. LEVINE, R.P., 1962, Genetics. New York, Holt, Rinehart and Winston. 50. LEWIN, B., 1994, Genes V, Oxford University Press, New York. 51. LIU, Z.W., BIYASHER, R.M., SAGHAI MAROOF, M.A., 1996, Theor. Appl. Genet., 93: 869-876 52. LINTS, F., 1991, Genetique 3, Office International de Librairie Bruxelles, Technique et Documentation, Paris. 53. MANLY, K.F., OLSON, M. JANE, 1999, Manager QT, Mammalian Genom, 10, 327-334 54. MAXIMILIAN, C., 1982, Genetica uman. Edit. tiinific i enciclopedic, Bucureti. 55. MAXIMILIAN, C., IOAN, DOINA MARIA, 1984, Dicionar enciclopedic de genetic. Edit. tiinific i enciclopedic, Bucureti. 56. MENDEL, GR., 1945, Experiene asupra hibrizilor de plante. Buletinul cultivrii i fecundrii tutunului. Nr. 3-4. 57. MORARU, I., ANTOHI, ST., 1966, Introducerea n genetica molecular. Edit. Medical, Ed. a. 2-a, Bucureti. 58. MORGAN, T.H., 1938, Bazele tiinifice ale evoluiei. Bucureti, Imp. central. 59. NEGRUIU, E., PETRE, A., PIPERNEA, A., 1969, Genetica i ameliorarea animalelor. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 60. NICOLAE, I., 1978, Mutageneza experimental, Edit. Ceres, Bucureti. 61. OPRESCU, S., 1983, naintai ai geneticii n Romnia. Edit. Ceres, Bucureti. 62. PANFIL, C., 1974, Genetica. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 63. PANFIL, C., 1980, ntrebri i rspunsuri din genetic. Edit. Dacia, ClujNapoca. 64. PATERSON, A.H., LANDER, E.S., HEWITT, J.D., PETERSON, SUSAN, LINCOLN, S.E., TANKSLEY, S.D., 1988, Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms, Nature, vol. 335. 65. PETIT, C., PREVOST, G., 1967, Gntique et evolution. Hermann Collection, Paris. 66. POPA, L., REPANOVICI, RODICA, 1982, Tehnologia ADN recombinat. Edit. tiinific i enciclopedic, Bucureti. 67. POPESCU, St., 1947, Genetic, Edit. Politehnicii Gh. Asachi, Iai. 68. POPESCU VIFOR, St., PIPERNEA, N., PETRE, A., VINTIL, I., 1979, Genetica animal. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 69. PORTOCALA, R., POPA, L., 1966, Acizii ribonucleici celulari i virali. Edit. Academiei R.S.R., Bucureti.
297

70. RAICU, P., 1980, Genetica. Edit. Didactic i pedagogic, Bucureti. 71. RAICU, P., GORENFLOT, R., 1980, Cytogntique et evolution. Edit. Academiei R.S.R., Bucureti. 72. RAICU, P., STOIAN, VERONICA, 1989, Gene i cromozomi. Edit. tiinific i enciclopedic, Bucureti. 73. RAICU, P., 1997, Genetic general i uman, Edit. Humanitas, Bucureti. 74. RIEGER, R., MICHAELIS, A., GREEN, M.M., 1976, Glossary of genetics and cytogenetics. Gustav Fischer Verlag, Jena. 75. RUSU, V., 1996, Nobel, retrospectiv 1901-1995, Edit. Omnia, Iai. 76. SERRA, J.A., 1965, Modern Genetics, vol.1, vol.2, 1968, vol.3. Academic Press, London, New York. 77. SINGLETON, R.W., 1967, Elementary genetics, 2nd Editions, Van Nostrand Regional Offices, New York. 78. SRB, A.M., OWEN, R.D., EDGAR, R.S., 1965, General Genetics. Freeman and Co., San Francisco and London. 79. STRJERU, SILVIA, MURARIU, DANELA, POPA, MIRELA, PLCINT, DOMNICA, 2001, Conservarea i utilizarea resurselor genetice vegetale, Tipogr. Univ. Suceava 80. TANKSLEY, S.D., 1993, Mapping Polygenes, Annu. Rev. Genet, 27, 205233 81. TAYLOR, J.H., 1963, The replication and organisation of DNA in chomosomes. In Molecular genetics, Academic Press, New York. 82. TAYLOR, J.H., 1967, Molecular Genetics, Part II, Academic Press, New York. 83. TINKER, N.A:, MATHER, D.E., Methods for QTL analysis with progeny replicated in multiple environments 84. TOMA, C., NI, MIHAELA, 1995, Celula vegetal. Edit. Universitii Al. I. Cuza, Iai. 85. TOMOZEI, I., 1967, Curs de genetic. Lito Ins. Agron. Iai. 86. TOMOZEI, I., RDEA, GH., 1985, Genetica. Lito inst. Agron. Iai. 87. TUDOSE, I. GH., 1992, Genetica, vol.1, Edit. Univ. Al. I. Cuza, Iai. 88. TUDOSE, I. GH., 1993, Genetica, vol.2, Edit. Univ. Al. I. Cuza, Iai. 89. RDEA, GH., 1996, Genetica, Lito, UAMV Iai. 90. WATSON, J.D., CRICK, F.H.C., 1953, The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol., 18. 91. WATSON, J.D., 1974, Biologia molecular a genei. Edit. tiinific, Bucureti. 92. WILKINS, M.H.F., 1961, The molecular structure of DNA. J. Chim. Phys. 58. 93. WILKINS, M.H.F., 1963, Molecular configuration of nucleic acids. Science, 140. 94. ZARNEA, G., 1986, Tratat de microbiologie general, vol. III, Edit. Academiei R.S.R., Bucureti. 95. ZOLYNEAK, C.C., 1967, Radiogenetica. Fasc. I. ndrumtor de laborator. Lito., Iai.
298

96. ZOLYNEAK, C.C., 1968, Radiogenetica. Fasc. a II-a ndrumtor de laborator. Lito., Iai. 97. ZOLYNEAK, C.C., 1968, Genetica. Lito. Universitatea Iai. 98. ZOLYNEAK, C.C., 1978, Dicionar de genetic. Xerox, Univ. Al.I. Cuza Iai. 99. ZOLYNEAK, C.C., 1982, Genetica i ameliorarea plantelor i animalelor. Partea I. Xerox, Univ. Al.I. Cuza Iai.

299