PARTEA I: CARACTERIZAREA MOLECULAR A INTERACIUNII MEDICAMENT-INT

CAPITOLUL 1 TESTELE CELULARE: UTILIZAREA I IMPACTUL LOR N DESCOPERIREA MEDICAMENTELOR 1.1. Introducere
1.1.1.Testele/experimentele celulare Experimentele bazate pe studiul celulelor permit studierea funciilor preparatelor farmaceutice sau a intelor bolilor n cadrul unui mediu complex i al contextului biologic de ansamblu. Aplicarea noilor tehnologii n biologia molecular, mpreun cu introducerea noilor metode de analiz a mutat cadrul experimentelor celulare de la nivelul fenotipic cum ar fi, proliferarea celular, moartea celular, respiraia i diferenierea funcional, ctre analizele celulare ale funciilor moleculelor semnal - specifice i ale componentelor metabolice. n momentul de fa, experimentele celulare presupun msurtori mecanice, asociate intelor specifice, care permit identificarea componenilor chimici cu funcie specific intei sau funcie modulatoare asociat. Se poate aadar afirma c analizele celulare vor juca un rol din ce n ce mai important n descoperirea medicamentelor, n special a componentelor pentru validarea i optimizarea intei, precum i n selecia modulatorilor cu molecule mici i n opimizarea modulrii. n contrast cu testele biochimice ale substanelor chimice pentru modularea activitii intelor moleculare, sistemele celulare pot oferi informaii adiionale cu privire la transportul, metabolismul i stabilitatea medicamentelor. Cel mai important aspect este acela c intele farmacologice rmn n mediul lor natural atunci cnd este analizat modularea , astfel ca datele s aib o valoare predictiv nalt. (Fig 1.1) Cu toate acestea, mai trebuie spus c, pentru a utiliza experimentele celulare, celulele trebuie scoase din mediul lor natural i crescute n culturi. Acest lucru va
1

conduce inevitabil la alterri ale repertoriului genelor i ale expresiei proteice i deci ale fenotipului. Celulele utilizate n astfel de experimente trebuie deci s fie caracterizate din punctul de vedere al funciilor reelelor intracelulare, rspunsului la stimuli externi - cel puin pentru calea de semnalizare de interes - i comparate cu rspunsul i evenimentele ce au loc la nivelul esutului sau organului. n multe cazuri, acest lucru nu este pe deplin realizabil nc.

Fig. 1.1 Selecia intelor farmaceutice. Numrul mare al intelor farmaceutice poteniale necesit un proces eficient de selectare a acelor inte pentru modularea cilor i fenotipurilor relevante pentru anumite afeciuni. Experimentele celulare, care sunt strns legate cu intele de interes, permit calificarea modulatorilor cu molecul mic identificai n experimentele celulare sau biochimice de nalt capacitate, n conformitate cu funcionalitatea ntr-un mediu fiziologic relevant. Experimentele celulare care nu sunt strns legate cu inta vor indica efectele sistemice ale componenilor i pot fi interpretate ca i clasificare celular de siguran. Testele celulare pot fi utilizate pentru prioritizarea intelor i a componenilor.

1.1.2. Impactul asupra descoperii medicamentelor n timpul descoperii i dezvoltrii medicamentelor, multe elemente sunt pierdute datorit efectelor nedorite sau toxicitii i lipsei eficacitii dorite. O mare parte din aceste efecte pot fi determinate de interaciunile potenialelor medicamente cu alte inte dect cele considerate iniial ca modulatoare ale unei afeciuni. Sistemele
2

de teste celulare au potenialul de a elucida multitudinea interaciunilor medicamentoase i deci de a contribui la o mai bun nelegere a aciunii i selectrii medicamentelor. Celula, prin structura i funciile sale, este organizat n cascade metabolice i de transducie a semnalului. Majoritatea acestor cascade sunt complexe i non-lineare [Stephaopoulos, Kelleher, 2001]. n plus, diferitele cascade comunic unele cu altele, formnd circuite i domenii intracelulare. Majoritatea bolilor nu pot fi explicate prin afectarea unei singure etape a unei ci, de semnalizare, ci prin multiple alterri care afecteaz reelele ntr-o manier complex [Hanahan, Weinberg 2000, Somogyi, Greller 2001]. Similar, medicamentele, fie c interacioneaz specific cu o singur int sau cu mai multe molecule, vor perturba cascadele metabolice i de semnalizare, ntr-un mod complex. n plus, din moment ce multe tipuri de celule utilizeaz aceleai molecule pentru semnalizare n contexte diferite, multe tipuri celulare pot fi afectate n grade diferite de acelai medicament. Introducerea recent a evalurii expresiei genice i proteice pe baza unor sisteme de analiz de mare capacitate, ca i a analizelor metaboliilor [Glassbrook i colab. 2000, Raamsdonk i colab. 2000] permit o mai bun nelegere a gradului i localizrii interferenelor. Experimentele celulare ofer astfel o soluie pentru studierea modulrii unei inte farmacologice n reeaua sa natural complex precum i a potenialelor efecte asupra altor reele. Bolile umane sunt caracterizate prin una sau mai multe alterri ale cilor metabolice i de semnalizare implicate major n meninerea homeostaziei celulare i diferenierea funcional. Testele celulare pot oferi o reprezentare a acestor alterri i devin astfel modele funcionale relevante pentru evaluarea aciunii medicamentelor. n zilele noastre, experimentele celulare ofer oportunitatea de a identifica punctele de interferen care conduc la alterri fenotipice sau modificri finale. Frecvent, multiple nivele de intervenie sunt necesare pentru a altera efectele unor reele biologice. Reguli similare se pot aplica pentru numrul de inte terapeutice care trebuie modulate, n special pentru maladii complexe. intele potrivite i combinaiile medicamentoase pot fi selectate numai n cazul n care fiecare component individual

al unei ci particulare poate fi studiat individual, acest lucru fiind posibil prin utilizarea sistemelor celulare. Combinaia componentelor care duc la efectul dorit poate fi identificat prin analiza mai multor parametri. Mai mult, aceste analize pot facilita aprecierea efectului componentelor individuale asupra mai multor ci. Aceasta permite o estimare a efectelor nedorite (profilul de siguran), dar poate conduce de asemenea la identificarea unor aplicaii n noile condiii. n acest fel testele realizeaz o selecie rapid a componentelor chimice cu variate profile. Ierarhic, citirea spaio-temporal va genera o bun cunoatere a mecanismelor de aciune a medicamentelor i va permite prezicerea efectelor sistemice (Fig 1.2). Dezvoltarea i aplicarea mijloacelor computerizate i a modelelor cilor intracelulare sunt o condiie obligatorie pentru sigurana evalurii i a interpretrii [Gifford, 2002, Karp, 2001]. nelegerea nivelelor sistemelor este posibil numai prin urmrirea rezultatelor experimentale la nivel celular sau sub-celular.

Fig. 1.2 Circuitul celular schematic i conceptul analizei sistemelor celulare . Celulele se conecteaz cu mediul nconjurator printr-o varietate de receptori, canale i transportori. Semnalizarea intracelular ,cile i reelele metabolice reacioneaz la stimulii intra- i extracelulari ntr-o manier dependent spaio-temporal. Diferitele tipuri de celule reacioneaz diferit la acelai stimul. Diferite tipuri de celule ale esuturilor normale i patologice sau celule manipulate genetic pot fi expuse la stimuli diferii n prezenta i n absena medicamentelor i reaciile celulare pot fi evaluate. Analizele multiparametrice identific compuii cu efecte asupra homeostaziei celulei care pot fi specifice intei, nelegate de int, reversibile sau ireversibile. 4

1.1.3. Clasificarea testelor celulare Testele celulare au avantajul c nu necesit purificarea intelor farmacologice. Totui, n multe cazuri, testele celulare necesit manipularea celular pentru a permite citirea specific a semnalului. Supraexprimarea receptorilor de suprafa celular sau a proteinelor intracelulare pot avea efecte substaniale asupra fiziologiei celulei i trebuie luate n considerare atunci cnd se utilizeaz aceste teste pentru descoperirea noilor medicamente. Reaciile precoce ale hormonilor, factorilor de cretere i neurotransmitorilor sunt deseori mediate prin intermediul mesagerilor secunzi sau influxului i efluxului rapid de ioni. Modificrile proteinelor posttranslaionale i translocaia proteinelor sunt urmtoarele etape care altereaz statusul fiziologic al unei celule. Asemenea modificri sunt capabile s conduc la modificri rapide ale cilor metabolice, precum i la alterri ale activitii genelor i expresiei proteice, ducnd n final la noi fenotipuri celulare, ce includ proliferarea i moartea celular. Testele celulare pot fi clasificate n funcie de evenimentele temporale care apar atunci cnd o celul este expus la alterri ale mediului extra- i intracelular (Tabelul 1.1). Rspunsurile rapide indicatoare de modificri ale concentraiilor ionilor sau mesagerilor secunzi conduc n final la modificari funcionale i fenotipice. Unele dintre evenimentele celulare pot fi recapitulate n aa numitele sisteme model, care pot fi mai uor de manevrat i manipulat genetic fa de celulele mamiferelor. Drojdiile s-au dovedit a fi organismele cel mai frecvent utizate n aceste sisteme, deoarece semnalele metabolice i interaciunile protein-protein sunt relevante pentru transducia semnalului, putnd fi traduse ntr-un rspuns al creterii uor msurabil [White, 1996, Ito i colab., 2001]. Cteva modificri ale dublului sistem hibrid al drojdiilor s-au dovedit utile n identificarea compuilor care interfer funcional cu mecanismele intracelulare specifice. Tucker i Fields (2001) au descris un sistem senzor pentru descoperirea medicamentelor bazat pe activarea conformaional, dup legarea medicamentului, a unei enzime implicate major n proliferare. Cu toate acestea, comparativ cu celulele mamiferelor, drojdiile prezint

unele diferene care includ prezena peretelui celular, lipsa genelor pentru complementul total al mamiferelor i alterri ale sistemelor metabolice. Tabelul 1.1 Clasificarea tipurilor de reacii celulare funcionale
nivelele Ca2+ canale ionice transportori nucleotide ciclice Dinamica proteinelor modificari posttranslaionale (fosforilarea) translocaiile proteice Expresia genic tehnologiile pe chip-uri tehnologia ADN ramificat senzori oligonucleotidici Expresia proteic tehnologia genelor reporter reacia ELISA array-uri ale proteinelor pe chip-uri Profilul metaboliilor profilul analitic cantitativ Rspunsurile metabolice i proliferarea celular, citotoxicitatea, fenotipice moartea celular/ apoptoza, acidifierea diferenierea celular Mesageri secunzi i canale

1.1.4.

Progrese

ale

mijloacelor

tehnologiilor

pentru

profilul

componentelor celulare Perfecionarea sistemelor analitice [Straub i colab., 2001] i a sistemelor de citire permite cercettorilor s obin aspecte clare ale alterrilor expresiilor genice i proteice [Celis i colab., 2000], precum i a metaboliilor [Glassbrook i colab., 2000, Nicholson i colab., 2002]. n afara situaiei n care este necesar o analiz pe scar larg, tehnologiile curente permit obinerea unor rezultate convenabile pentru profilul medicamentelor. Pentru studiile expresiei genice, experimentele care utilizeaz sonde fluorescente pot substitui sistemele bzate pe cipuri cel puin pentru unele cazuri bine selecionate [Broach, Thorner, 1996; Goetz i colab, 2000]. Actual sunt disponibile cteva sisteme de imagistic celular sau microscopie de mare capacitate i scanare laser, precum i dezvoltarea unor noi markeri fluoresceni i anticorpi specifici. Aceste combinaii permit studiul traficului proteinelor n celule. Studiile dinamicii i interaciunii proteinelor a fost facilitat de identificarea proteinelor florescente [Raamdonk i colab., 2000, Remington, 2002; Schaufele, 2001] i a altor colorani fluoresceni [Mitchell, 2001], mpreun cu
6

aplicaiile fluorescenei cu transfer de energie prin rezonan (fluorescence resonance energy transfer - FRET). Alte tehnologii, precum spectroscopia cuplat multipolar (multipole coupling spectroscopy - MCS) [Hefti, Kumar, 1999] i biochip-urile pentru monitorizarea celular multiparametric [Baumann, 1999] sunt pe cale de a fi utilizabile. Sistemul FLIPRTM (Cititorul de plci fluorometrice; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) utilizat pentru studiul rspunsurilor rapide ale mesagerilor secundari, precum eliberarea Ca2+, a fost recent mbuntit pentru a permite analiza canalelor ionice. Aplicatiile FLIPR sunt discutate n detaliu mai jos. n seciunile urmtoare, vom descrie n detaliu un set selectat de aplicaii. Discuiile sunt grupate, pe baza tabelului 1.1, n rspunsuri rapide sau sistemele mesagerilor secundari, alterri ale expresiei genice sau proteice, alterri metabolice, precum i efectele asupra fenotipului[Dingerman i Steinhilber,2004].

1.2 Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapide

O varietate de proteine membranare au fost exprimate n diferite celule eucariote (linii celulare ale mamiferelor, celule ale insectelor, drojdii) cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant, pentru a studia receptorii de suprafa celular, canalele ionice sau proteinele de transport. 1.2.1 Receptorii Receptorii de suprafa celular mediaz semnalizarea celular de la suprafaa celular la citoplasm i/sau nucleu prin intermediul a dou procese majore, semnalizarea prin intermediul receptorilor legai la enzime sau a proteinelor de legare a GTP (proteinele G). Receptorii legai la enzime includ receptorii guanilat ciclazici, receptorii tirozin-kinazici, receptorii asociai tirozin kinazei, receptorii tirozin fosfatazici i receptorii serin/treonin kinazici [Schlessinger, 1993]. n toate cazurile, n urma activrii este iniiat o cascad de evenimente care afecteaz statusul receptorilor i concentraia uneia sau mai multor molecule mici de semnalizare intracelulare. n cele ce urmeaz, vom discuta monitorizarea semnalelor mediate de
7

proteinele G, care sunt activate de receptorii cuplai cu proteina G n urma legrii unui ligand specific. Consecutiv stimularii au loc modificari ale AMPc intracelular sau concentraiei Ca2+. Aceste dou molecule semnal specifice sunt implicate n procesele reglatoare ale sistemelor cardiovascular i nervos, mecanismelor imune, diferenierii i creterii celulare i metabolismului. Ambii mesageri acioneaz ca efectori alosterici pe proteine int specifice ale celulei, incluznd kinazele (protein kinaza A i C), lipazele (fosfolipaza C), proteinele de legare a Ca 2+ (calmodulina) i canale ionice (receptori glutamat ionotropici). Concentraiile citoplasmatice ale mesagerilor secundari sunt reglate prin intermediul enzimelor membranei plasmatice n cazul cii AMPc enzima adenilat ciclaza produce direct AMPc, iar n cazul cii Ca2+ lipazele sunt stimulate s produc mesagerul solubil inozitol trifosfatul (IP3) care induce eliberarea Ca2+ din reticulul endoplasmic. n unele cazuri canalele ionice sunt activate prin interaciunea direct cu subunitile proteinei G [Cruce M, 2000]. n prezent au fost realizate diferite tehnologii pentru monitorizarea intracelular a mesagerilor secundari n celule. Detectarea Ca2+ este n general bazat pe indicatorii fluoresceni, care au proprietatea de a penetra cu uurin membranele celulare i a-i altera emisia fluorescent n urma legrii Ca 2+. Pentru msurtorile unui rspuns rapid i tranzitor, reacia de legare a Ca 2+ trebuie s fie reversibil, oferind date cinetice importante care permit diferenierea unui semnal tranzitor tipic datorat activrii specifice a receptorului de un semnal nespecific care afecteaz homeostazia Ca2+ i permeabilitatea membranar. n mod curent se utilizeaz numeroase sisteme, diferite, pentru a detecta AMPc n testele celulare. n cele mai multe cazuri celulele sunt lizate n urma expunerii la un ligand specific, iar cantitatea de AMPc este determinat printr-o imunoreacie competitiv (Perkinelmer Life Sciences, Boston, Ma; Molecular Devices; Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, Ca) sau printr-o reacie enzimatic competitiv de complementare (Discoverx, Fremont, Ca). Tipic, receptorii cuplai cu proteina G sunt supraexprimai n liniile celulelor eucariote pentru a monitoriza concentraia mesagerilor secundari n urma stimulrii cu un ligand specific [Sullivan i colab., 1999]. n multe cazuri, co-exprimarea unei
8

subuniti corespunztoare sau a proteinelor G himerice este necesar pentru a obine un semnal suficient pentru detecie [Milligan, Rees, 1999]. 1.2.1.1 Tehnologia FLIPR pentru detecia eliberrii Ca2+ intracelular Sistemul FLIPR permite citiri repetate pentru sistemele de analiz de mare capacitate n reaciile celulare. Pe scurt, celulele sunt ncrcate cu un indicator fluorescent (ex. Fluo-4 AM pentru Ca2+) care arat un spectru de absorbie compatibil cu o excitaie la 488 nm de la o surs laser argon mergnd pn la o emisie maxim la 516 nm n prezena Ca2+. Emisia fluorescent este indus simultan n toate situsurile unei plci cu 96 sau 384 de situsuri, iar cinetica eliberrii Ca 2+ intracelular, declanat de expunerea la un ligand specific, poate fi monitorizat la o rat de maxim 60 de ori pe minut. Sistemul FLIPR distinge rapid agonitii complei, agonitii pariali i antagonitii pentru a accelera screening-ul primar i secundar. Figura 1.3 ilustreaz un experiment tipic efectuat pe o linie de celular de mamifer transfectat cu un vector ce conine gena GPCR. Componentele pozitive reprezentate n figura 1.3(b) au fost verificate prin msurtori n duplicat, iar modulatorii cu molecul mic au fost ulterior testai pentru relaia doz-rspuns prin experimente EC50/IC50.

Fig 1.3. Determinarea Ca2+ intracelular prin sistemul FLIPR. (a) Este reprezentat o curb a cineticii Ca2+ tipice, precum i parametrii utilizai pentru calcularea semnalului fluorescent maxim. n acest exemplu maximele au fost msurate nainte i dup adiia ligandului (Max 1 si Max 2) i au fost standardizate prin diviziune la minima masurat nainte de adugarea compusului (Min). Media controalelor pozitive a fost stabilit control 100%, iar media controalelor negative a fost stabilit control 0%. Pentru fiecare godeu, au fost calculate activitile relative n funcie de controale. 9

Antagonist

Fig 1.3. Determinarea Ca2+ intracelular prin sistemul FLIPR. Fig 1.3.(a) Este reprezentat o curb a cineticii Ca 2+ tipice, precum i parametrii utilizai pentru calcularea semnalului fluorescent maxim. n acest exemplu maximele au fost msurate nainte i dup adiia ligandului (Max 1 si Max 2) i au fost standardizate prin diviziune la minima masurat nainte de adugarea compusului (Min). Media controalelor pozitive a fost stabilit control 100%, iar media controalelor negative a fost stabilit control 0%. Pentru fiecare godeu, au fost calculate activitile relative n funcie de controale. Fig 1.3 (b) Este reprezentat o diagram a fluxului pentru un experiment tipic. Celulele modificate genetic care au inta GPCR supraexprimat au fost adugate n plci cu 384 de godeuri peste noapte. Celulele au fost splate cu soluie tampon nainte de adaugarea soluiei tampon ce coninea colorantul Fluo-4 AM, urmat de o incubare de 45 de minute. Dup o etap adiional de splare, plcile au fost transferate n aparatul FLIPR i au fost adugai compuii chimici, urmai de adiia ligandului. Emisia fluorescenei a fost monitorizat ncepnd de la un moment anterior adiiei compusului i continuat pn cnd s-a observat o descompunere substaniala a semnalului. Exemple de agonist i antagonist sunt reprezentate n graficele mrite 10

1.2.1.2. Tehnica reaciilor competitive n detecia AMPc intracelular Cele mai multe experimente utilizate pentru detecia AMPc intracelular sunt bazate pe anticorpi monoclonali care recunosc specific AMPc. Clasic, lizatele celulare sunt amestecate cu AMPc biotinilat exogen pentru a forma un heterotrimer cu un anticorp specific i streptavidina. Formarea acestui complex este n competiie cu AMPc endogen nebiotinilat. Streptavidina i anticorpii se pot lega covalent la un fluorofor donor i acceptor (criptat de europiu i aloficocianina), formnd o pereche FRET interactiv dup formarea complexului. Un semnal sczut este observat atunci cnd este crescut producia de AMPc intracelular, datorit competiiei pentru legarea la anticorpul specific. Tehnologia AlphaScreenTM (PerkinElmer Life Sciences) este o tehnologie alternativ care permite detecia cantitativ a unei game variate de componente celulare, inclusiv AMPc. AlphaScreen are la baz utilizarea unor particule donor i acceptor care sunt acoperite cu un strat de hidrogel care ofer grupri funcionale pentru bioconjugare. Cnd particulele sunt aduse una lng alta, este iniiat o cascad de reacii chimice pentru a produce un semnal nalt amplificat. nainte de excitarea laser, un fotosensibilizator din particula donoare convertete oxigenul ambiental la starea excitat de singlet. Moleculele de oxigen n starea de singlet difuzeaz pentru a reaciona cu chemiluminiscentul de la nivelul particulei acceptoare, ceea ce activeaz fluoroforii coninui n aceeai particul. AlphaScreen a fost utilizat n testele funcionale ale GPCR pentru detecia produciei endogene de AMPc. n toate sistemele menionate mai sus, celulele sunt supuse lizei nainte de realizarea msurtorilor, adugnd nu numai un pas suplimentar procedurii, dar, mai important, fcnd imposibile msurtorile cinetice deoarece datele pot fi obinute numai la final. n plus, au fost dezvoltate metode FRET care au la baz studiul celulei ca ntreg pentru studiul dinamicii temporale i spaiale a nucleotidelor ciclice (vezi 1.4.4).

11

1.2.1.3. Tehnologia Complementrii Fragmentelor Enzimatice (EFC) EFC are la baz organisme modificate genetic ce conin dou fragmente legate de o reacie enzimatic, de exemplu acceptorul enzimei (EA) i donorul enzimei (ED). Fragmentele separate sunt inactive i numai formarea spontan de heterodimeri duce la forma enzimatic activ [Zabin, 1982]. Tehnologia HitHunterTM (DiscoveRx) este bazat pe o variant modificat a enzimei -galactozidaza care formeaz perechea EA/ED. Aceast tehnologie a fost adaptat pentru utilizarea n multe reacii n care sunt implicate: kinaza, receptorul progesteronic, receptorul estrogenic i AMPc. n acest capitol vom discuta numai despre aplicaia specific pentru detecia intracelular a AMPc. Pe scurt, este utilizat un conjugat peptidic ED-AMPc din care AMPc este recunoscut de un anticorp specific. n absena anticorpului specific, fragmentul ED este capabil s complementeze EA pentru a forma un complex activ. n aceast reacie, anticorpul AMPc este titrat pentru inhibiia complet a formrii enzimei. Expunerea lizatului celular la o anumit cantitate de anticorp permite formarea complexului anticorp-AMPc, reducnd astfel cantitatea liber de anticorp. Ca urmare, adugarea de conjugat ED n urmatoarea etap a reaciei va conduce la scderea formrii complexului anticorp-ED, promovnd astfel complementarea enzimei active. ED-conjugat liber din reacie este proporional cu concentraia AMPc intracelular, acelai principiu putnd fi aplicat pentru msurarea activitii galactozidazei. 1.2.2. Proteine de transport membranar O mare varietate de substane sunt transportate n interiorul organismelor complexe, n unele cazuri prin intermediul transportului pasiv, prin difuziune facilitat datorat gradientului de concentraie sczut, sau prin intermediul cilor paracelulare sau transcelulare. Absorbia i distribuia multor constitueni alimentari precum ionii, zaharidele, aminoacizii i nucleotidele sunt mediate/facilitate de proteine specifice de transport membranar, care formeaz canale prin membranele celulare. Mecanisme similare sunt necesare pentru ndeprtarea activ a xenobioticelor, produilor de metabolism din esuturi. Aceste proteine specifice de
12

transport carrier sunt divizate n dou clase, transportori uniport (sisteme uniport), respectiv transportori cuplai (sisteme de transport cuplat), primii transportnd un singur tip de molecul de pe o fa pe alta a membranei, iar transportorii cuplai transfer o molecul n funcie de transportul simultan sau secvenial al celei de-a doua [Ardelean, Tripa, 2001]. Sistemele de transport cuplat sunt la rndul lor divizate n transportori simport, care transport simultan moleculele n aceeai direcie i transportori antiport, care transport moleculele n direcii opuse. Unii transportori specifici acioneaz ntr-o manier pasiv, tranfernd moleculele n funcie de gradientul de concentraie; acesta este cazul multor nutrieni precum glucoza, gsit n concentraii mari n spaiul extracelular. O situaie similar este reprezentat de canalele ionice cu poart comandat de ligand sau de voltaj din sistemul nervos, care elibereaz ionii dup stimularea de ctre neurotransmitori, respectiv depolarizarea membranar. n schimb, transportorii activi sunt dependeni de hidroliza ATP-ului i ei transfer moleculele mpotriva gradientului de concentraie. Cel mai bine cunoscut i variat grup de proteine de transport activ l constituie super-familia de transportori ABC (caset legat la ATP) [Dean i colab., 2001]. Au fost descrise peste 50 de transportori ABC, substraturile transportate fiind foarte variate: aminoacizi, zaharide, ioni anorganici, polizaharide, peptide i chiar proteine mari. Unul dintre cei mai studiai transportori ABC, proteina de rezisten la mai multe medicamente - MDR1 (multi-drug resistance) [Brinkmann, Eichelbaum, 2001], a fost n centrul ateniei multor eforturi de descoperire a medicamentelor n ultimii ani deoarece supraexpresia acestei proteine n celulele canceroase umane poate determina rezistena simultan a acestor celule la o varietate de chimioterapice din clase diferite. Alte procese importante n care se implic transportorii ABC includ rezistena la clorochin n malarie, prezentarea peptidelor antigenice celulelor imune n maladia genetic fibroza chistic [Hwang i colab., 2001].

13

1.2.2.1. Canalele ionice Majoritatea celulelor menin un potenial electric de o parte i de alta a membranei,care este cel mai bine studiat la nivelul neuronilor i celulelor musculare al cror potenial atinge o valoare nalt de aproximativ -70mV. Potenialul membranar este meninut de pompa de sodiu i potasiu (Na+, K+ - ATPaza) care funcioneaz ca o pomp antiport de transport activ ce scoate din celula 3 ioni de Na + i introduce 2 ioni de K + pentru fiecare molecula de ATP hidrolizat, crend astfel o ncrctur negativ n interiorul celulei [Ardelean, Tripa, 2001]. Proteinele canal formeaz pori hidrofili care traverseaz bistratul lipidic, permind anumitor ioni s treac de pe o parte pe cealalt a membranei datorit gradientului de concentraie. O caracteristic a canalelor ionice este prezena unui mecanism cu poart care controleaz micarea ionilor. n acest capitol vom insista pe canalele ionice care sunt exprimate n neuroni i celulele musculare, avnd astfel un rol important n semnalizarea neuronal i contracia muscular. Schimbrile potenialului membranar pot fi induse ntr-o manier limitat spaial, prin intermediul canalelor de Na+ cu poart comandate de ligand n acest caz neurotransmitor. Deschiderea ulterioar a canalelor de Na+ comandate de voltaj induce autopropagarea depolarizrii de-a lungul membranei celulare (potenialul de aciune), inducnd n final deschiderea canalelor de Ca2+ cu poart comandate de voltaj de la nivelul sinapsei. Influxul de Ca2+ induce eliberarea neurotransmitorilor n fanta sinaptic, propagnd semnalul n celula post-sinaptic. Funcionarea deficitar a canalelor ionice st la baza multor afeciuni incluznd afeciuni musculare i cardiace, epilepsia, migrena, depresia i ataxia. Deschiderea canalelor ionice este n cele mai multe cazuri monitorizat prin msurarea modificrilor potenialului membranar. Standardul de aur utilizat n acest scop este tehnologia patch clamp, care ofer o sensibilitate foarte nalt, rezoluie temporal bun, precum i msurarea conductanei unui singur canal la un voltaj precis. Aceast tehnologie ofer cele mai bune informaii pentru evaluarea funcional a canalelor ionice; dezavantajele majore ale acestei tehnici includ participarea operatorilor experimentai, experimente laborioase i rezultate puine. n
14

prezent, diferite companii sunt implicate n dezvoltarea noilor echipamente pentru automatizarea procedurilor patch-clamp. Unul dintre cele mai avansate echipamente este staia IonWorksTM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) care utilizeaz tehnicile de fluidic integrat pentru poziionarea automat a unei singure celule n godeurile unui suport special. nregistrri ale unui singur canal ionic au fost obinute la o rat de pn la 2000 de reacii pe zi. Rezultate mai bune sunt obinute prin utilizarea coloranilor solvatocromatici pentru care celulele sunt permeabile, precum DiBAC (Molecular Probes, Eugene, OR) sau prin utilizarea colorantului recent descoperit FMP (Molecular Devices). Asocierea cu sistemul FLIPR permite monitorizarea funciei canalelor ionice prin sisteme de analiz de mare capacitate, depind numrul de 30000 de compui analizai pe zi. Detalii cu privire la alte tehnologii de analiz a canalelor ionice au fost descrise de Xu i colab., ( 2001). Tehnologia FLIPR i analiza canalelor ionice. Pentru identificarea compuilor care moduleaz activitatea canalelor ionice este imperativ disponibilitatea evalurilor rapide i economice ale activitilor biologice prin analize de mare capacitate. Una din metodele bazate pe fluorescen care testeaz modificrile potenialului membranar utilizeaz o sond fluorescent poteniometrica acid bis-(1,3-dibutilbarbituric) trimetin oxonol [DiBAC4(3)], care separ compartimentele intracelulare i extracelulare n funcie de potenialul electric de o parte i de alta a membranei. n urma depolarizrii celulei, colorantul ptrunde n celul, iar legarea la situsurile hidrofobe intracelulare se traduce ntr-o cretere a intensitii semnalului fluorescent. Invers, hiperpolarizarea membranei declaneaz eliminarea colorantului din celul i scderea fluorescenei deoarece cuantumul produciei DiBAC4(3) este sczut n mediu apos. Separarea DiBAC4(3) fiind un proces lent, aceasta tehnologie nu este aplicabil pentru evaluarea canalelor cu o cinetic rapid la nivelul porii sau cu desensibilizare rapid. mbuntiri substaniale au fost obtinue odat cu descoperirea colorantului FMP [Baxter i colab., 2002] care are o cinetic de separare mai rapid. Figura 1.4 prezint un experiment tipic condus cu miotuburi difereniate (linia celular C2C12).
15

Fig 1.4 Activitatea canalelor ionice n miotuburi difereniate . Linia celular de celule musculare murine C2C12 a fost utilizat pentru validarea colorantului FMP. Celulele C2C12 au fost adugate n plci i difereniate n miotuburi prin expunerea la ser de cal. Celulele C2C12 difereniate exprim nAchR, iar depolarizarea celulelor poate fi indus cu un agonist specific pentru receptor, precum carbacol. Exemple de agonist i antagonist sunt reprezentate n graficele mrite.

Biblioteca LOPAC (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) a compuilor farmacologici activi a fost supus screening-ului pentru identificarea compuilor care exercit efecte agoniste sau antagoniste asupra receptorului nicotinic al acetilcolinei (nAChR). Pe scurt, celulele au fost splate cu o soluie tampon i ncrcate cu colorant FMP timp de 30 de minute la temperatura camerei. 644 de compui din libraria LOPAC au fost
16

adaugai n FLIPR, urmai de stimularea cu carbacol. n contrast cu semnalizarea tipic prin intermediul Ca2+, depolarizarea membranar nu prezint o cinetic tranzitorie. Evaluarea datelor i identificarea modulatorilor poate fi efectuat dup modelul descris n figura 1.3. Identificarea agonitilor i antagonitilor este posibil ntr-un singur experiment. Compuii pozitivi au fost supui determinrii EC50/IC50 i, n cazul agonitilor, antagonistul specific al AChR - pancuronium a fost utilizat pentru a evidenia reversul semnalului carbacol (vezi Fig. 1.4). Iniial, 21 de compui au fost identificai ca agoniti, iar 12 compui au avut specificitate pentru AChR. Tehnologia VIPRTM (Voltage Ion Probe Reader) i analiza canalelor ionice. Tehnologia VIPR (electrod folosit la msurtori de potenial ntre mediul intern i extern al unei celule) (Aurora Bioscience, San Diego, CA) este bazat pe FRET i utilizeaz dou molecule fluorescente. Prima molecul, oxonol este un ion hidrofob, nalt fluorescent, ncrcat negativ, care poate fi rapid redistribuit ntre dou situsuri de legatur pe cele dou fee ale membranei plasmatice ca rspuns la modificrile potenialului membranar. Cea de-a doua molecul fluorescent, lipidul coumarina se leag specific pe o fa a membranei plasmatice i funcioneaz c un donor FRET pentru molecula acceptoare de oxonol sensibil la voltaj. Cnd molecula de oxonol ajunge la nivelul situsului intracelular al membranei plasmatice n urma depolarizrii, FRET este sczut, ceea ce se traduce n creterea fluorescenei donorului i descreterea emisiei oxonolului. Aceast tehnologie permite dezvoltatea cercetrilor n domeniul biologiei canalelor ionice. Tehnologia VIPR poate furniza cadre de citire subsecvene real-time n urma reaciilor efectuate n microplci. 1.2.2.2. Proteinele MDR MDR este n principal legat de supraexpresia proteinelor superfamiliei de transportori ABC. Cel mai studiat membru al acestei superfamilii este produsul genei MDR1 (glicoproteina P) care este exprimat n intestin, rinichi, ficat, bariera hematoencefalic i n multe celule tumorale. n ultimul caz, supraexpresia genei MDR1 este unul din factorii principali ai rezistenei celulelor la chimioterapia cancerului. Aceast
17

rezisten este rezultatul pomprii medicamentelor anticanceroase n exteriorul celulelor, rezultnd scderea nivelelor intracelulare ale acestora. Moleculele mici, capabile s reversibilizeze efluxul pot restaura sensibilitatea la medicamente a celulelor tumorale rezistente. Cele mai utilizate metode pentru identificarea inhibitorilor pompei MDR sunt bazate pe substraturile fluorescente ale glicoproteinei P, precum Hoechst 33342, rodamina 123 i rodamina 6G. Celulele sunt ncrcate cu substratul, iar colorantul extracelular este ndeprtat prin splarea cu detergeni anterior lizei [Sarver i colab., 2002]. Msurtorile emisiei fluorescenei ofer rezultate cantitative, proporionale cu acumularea intracelular a substratului. Expunerea celulelor la inhibitorii pompei MDR va reduce efluxul substratului i deci va determina nregistrarea unui semnal fluorescent crescut. Aceste reacii nu sunt omogene i implic etape de splare dup ncrcarea celulelor cu colorantul corespunzator. Un nou substrat pentru pompa MDR a fost dezvoltat recent pentru realizarea unor reacii omogene ntr-un sistem FLIPR. Tehnica FLIPR pentru Multirezistena la Medicamente (FLIPR Multidrug Resistance Assay) (Molecular Devices) este o aplicaie omogen care necesit numai 15 minute de incubare la temperatura camerei cu un colorant proprietar, care este transportat de ctre produsul genei MDR1 i el i modific proprietile fluorescente numai n urma aciunii enzimelor intracelulare asupra sa. Aceasta permite performana reaciilor cinetice asupra celulelor vii pentru screening-ul inhibitorilor pompei MDR. Eliminarea etapelor de splare i controlul temperaturii a determinat automatizarea reaciei [Sarver i colab., 2002].

1.3.Evaluarea expresiei genelor i proteinelor n cadrul unor sisteme de analiz de mare capacitate
Profilul expresiei genelor i proteinelor poate fi aplicat n descoperirea medicamentelor cu cel puin dou scopuri diferite. Prima aplicaie este pentru descoperirea noilor poteniale medicamente. n acest caz, inta de interes o constituie fie o component a sistemului de expresie, fie monitorizarea expresiei ca indicator pentru inta din amonte ce reflect rspunsul
18

celular cuplat [Broach, Thorner, 1996]. Pentru a face un screening de mare capacitate (HTS) posibil, secvenele promotoare de interes, care sunt cuplate cu evenimentele celulare din amonte, sunt legate la aa-numitele gene reporter, care servesc ca indicatori pentru activarea transcripiei i translaiei. Cea de-a doua aplicaie este utilizarea profilului expresiei pentru a obine informaii asupra specificitii la nivel celular a unui medicament candidat sau pentru identificarea unor markeri surogat pentru aciunea medicamentelor. n acest caz, ar trebui investigat expresia genic sau proteic a ct mai multor gene sau proteine ca rspuns la un potenial medicament candidat. Modelele de expresie pot fi utilizate ca un indicator pentru numrul interaciunilor dintr-o celul. Asemenea date pot fi relevante pentru nelegerea impactului modularii unei singure inte terapeutice asupra ntregului sistem celular. Chip-uri de expresie genic au fost introduse recent pentru msurarea simultan a sute de gene exprimate la nivelul ARNm [Epstein, Butow, 2000]. Utilitatea acestei abordri, a fost recent validat la drojdii; n acest caz profilurile expresiilor au identificat ci ale unor mutaii necaracterizate anterior sau au identificat noi poteniale inte terapeutice. Similar, au fost introduse chip-uri pentru caracterizarea expresiei proteice pentru a captura o fraciune particular a proteinelor i a permite analiza cu o cantitate rezonabil de prob [Weinberger i colab, 2002]. n plus, tehnicile de proteomic au fost introduse de Celis i colab., (2000). Analiza a mii de probe devine o condiie obligatorie dac profilurile de expresie sunt utilizate n identificarea unui modulator. Selecia modulatorilor cu molecule mici i optimizarea modulrii vor necesita analize de mare capacitate care s fie la nivelul a sute sau mii de componente. Ambele pot fi obinute prin focalizarea asupra unor gene indicatoare selectate sau a produilor lor, indicatori mai degrab ai intei de interes dect ai profilului complet al expresiei. n seciunea urmtoare ne vom axa pe exemple care pot fi aplicate n descoperirea iniial a medicamentelor. Chip-urile pentru expresia genic [Epstein, Butow, 2000; Weinberger i colab, 2002] i tehnologiile de proteomic sunt subiectul multor recenzii recente.
19

1.3.1. Analiza genelor reporter pentru identificarea modulrii compuilor biologici activi Factorii de transcripie pot fi clasificai att n funcie de natura structural, ct i n funcie de modul n care rspund pentru modularea transduciei semnalului. O astfel de clasificare, esenial pentru tehnologiile ce implic genele reporter, aparine lui Brivanlou i Darnell (2002). Conform acestei clasificri, factorii de transcripie pot fi grupai n dou mari clase aceia care sunt activai constituional i cei a cror activitate este reglat ntr-o manier spaio-temporal, cantitativ i calitativ. Din clasa factorilor de transcripie reglai face parte clasa factorilor de transcripie dependeni de semnal, care sunt activai n urma unui semnal intracelular sau extracelular. Genele reglate prin intermediul acestor factori de transcripie dependeni de semnal sunt atractive ca i gene reporter deoarece cupleaz cile de semnalizare cu rspunsul transcripional. Semnalele extracelulare, n urma interaciunii cu moleculele receptoare corespunzatoare de pe suprafaa celulei, iniiaz o cascad de evenimente intracelulare care conduc la alterri ale expresiei unui set de gene. Una sau cteva dintre aceste gene pot fi utilizate ca indicatori pentru modularea intelor n cadrul unor ci de semnalizare specifice. Activarea unei anumite gene poate fi uor identificat prin ataarea la gena de interes a unei aa-numite gene reporter. Pentru acest scop, trebuie create plasmide care conin promotorul sau regiunea reglatoare a genei de interes lng gena reporter. Aceste plasmide sunt apoi introduse ntr-o linie celular care exprim calea de interes ce conine intele farmacologice i cupleaz indicatorul reporter cu calea particular de interes. Un numr de gene au fost descrise ca fiind gene reporter [Broach, Thorner, 1996]. Expresia poate fi monitorizat prin intermediul fluorescenei, de exemplu prin utilizarea unei proteine fluorescente verzi (GFP) ca reporter sau prin detecia cu anticorpi marcai fluorescent. Alternativ, este utilizat activitatea enzimatic a reporterului, aa cum se ntmpl n cazul luciferazei care convertete substratul ntr-un produs luminescent, sau reporterul este detectat cu ajutorul fluorescenei, luminescenei sau reaciilor colorate ale produilor secundari.

20

Tehnologia ce implic utilizarea genelor reporter a fost utilizat pe scar larg pentru a realiza HTS pentru o varietate de inte de interes n descoperirea medicamentelor. Pentru multe inte, precum receptorii transmembranari pentru care alte metode de screening erau dificil de realizat, tehnologia genelor reporter a devenit metoda cea mai bun pentru identificarea modulrii compuilor biologici/ farmacocinetici activi (lead finding). Exemplele selectate includ utilizarea reaciilor ce implic genele reporter n identificarea agonitilor i antagonitilor pentru o mare varietate de GPCR [Goetz i colab., 2000] transfectai ntr-o linie de celule ovariene de hamster (CHO) cu un construct al reporterului luciferazei 6xCRE. Aceast linie celular a servit ca un indicator pentru GPCR, precum receptorul pentru melanocortina-1 care n urma stimulrii moduleaz nivelele de AMPc n celul. Aceasta reacie poate fi realizat ntr-o plac cu 384 godeuri, oferind astfel economii substaniale de timp, cost i realizare a culturilor celulare. n aceeai linie celular a fost stabilit un sistem HTS pentru receptorul metabotropic al glutamatului mGluR7. Receptorul mGluR7 este cuplat negativ cu adenilat/adenilil ciclaza i stimularea sa duce la scderea nivelelor de AMPc. Celulele CHO au fost transfectate stabil cu ADNc pentru mGluR7 de la obolan i o gen reporter care rspunde la AMPc. Aplicabilitatea pentru HTS a fost demonstrat ntr-o linie n care nivelele de AMPc induse de forskolina (un activator al adenilat ciclazei) au fost reduse semnificativ de ctre agonitii receptorilor. Xing i colab. (2000) au descris o metod direct pentru investigarea receptorilor cuplai negativ cu adenilat ciclaza. Linia celular CHO transfectat stabil a coninut trei plasmide distincte: (i) o proteina himeric G q/i care redirecioneaz semnalul Gi negativ ntr-un semnal Gq pozitiv; (ii) un GPCR cuplat cu Gi, n acest caz receptorul -opioid sau receptorul pentru 5-hidroxitriptamina i, (iii) reporterul 3xNFAT -lactamazei. Astfel, activarea GPCR cuplat cu G i s-a translatat ntr-o activare NFAT prin intermediul cii de semnalizare mediata de Gq, permind monitorizarea expresiei -lactamazei ntr-un format HTS. O mare varietate de linii celulare diferite au fost utilizate pentru a stabili reaciile genelor reporter. Celule din rinichiul embrionar uman (HEK) 293-EBNA crescute n culturi celulare n suspensie au fost utilizate pentru expresia receptorilor
21

prostanoizi cuplai cu un reporter CRE-SEAP (fosfataza alcalin secretat de placenta uman). Celulele ECV304, o linie celular transformat spontan, derivat din celule endoteliale ale venei ombilicale umane, au fost transfectate cu un reporter ICAM-1 pentru screening-ul componenilor care inhib expresia ICAM-1 n urma stimulrii cu interleukina IL-1b. Linia celular provenit din celule de cancer mamar uman MDAMB-453 a fost utilizat ca gazd a transfeciei pentru a stabili reporterii stabili sub controlul promotorului virusului tumorii mamare la oarece (MMTV) pentru a studia agonitii receptorilor androgeni i glucocorticoizi. Celulele MDA-MB exprim att receptorii glucocorticoizi ct i receptorii androgeni, servind astfel ca o celul gazd ideal pentru reporterii construii. Ca un exemplu practic, datele obinute cu ajutorul reaciilor care implic genele reporter n condiiile HTS, sunt prezentate n figura 1.5 i tabelul 1.2. Celulele transfectate stabil cu gena reporter a luciferazei au fost aplicate ntr-o plac cu 384 de godeuri i dozate cu diluii seriate ale unui compus care activeaz promotorul genei reporter. Dup o incubare de 24 de ore, celulele au fost splate, lizate i a fost adugat substratul luciferazei (LucLite2; PerkinElmer Life Sciences). Cantitatea exprimat de proteina luciferaz s-a corelat direct cu cantitatea de substrat metabolizat ntr-un compus luminiscent, care a fost detectat cu ajutorul unui cititor de plci luminometric (TopCount2 NXT; PerkinElmer Life Sciences). Datele prezentate au oferit informaii asupra concentraiei minime a compusului de referin pozitiv necesar ca standard pe fiecare plac pentru HTS a 100000 de compui. Pentru a obine rezultate de calitate pentru fiecare plac individual n timpul HTS, este calculat un criteriu numit factor Z (diferena dintre mediile semnalului de fond i godeurile de control pozitiv) i deviaia standard (SD) a godeurilor de control pentru fiecare plac. Din moment ce factorul Z ia n considerare att intensitatea semnalului, ct i variaia intrinsec, el ofer o msur a stabilitii unei reacii. Screening-ul este considerat posibil dac 0<Z<1; cu toate acestea, n practic, valoarea minim a factorului Z este deseori mai mare. O concentraie de cel puin 3mM a agonistului n controlul pozitiv poate fi necesar pentru a obine o valoare a Z>0.5. Astfel, concentraia controlului pozitiv a fost de 10mM n acest experiment.
22

Tabelul 1.2 Activarea genei reporter a luciferazei i performana reaciei Concentraia (M) 0 0,1 0,3 1 3 10 30 Media a 8 godeuri 6364 6347 9028 12006 20436 31292 38343 SD 641 314 458 509 1476 1181 2027 Factorul Z n.d. -0,238 0,389 0,549 0,781 0,750

Fig 1.5 Inducia dependent de doz a genei reporter a luciferazei de ctre o substan inductoare utilizat ca i control agonist n HTS. Fiecare valoare reprezint media a 8 determinri separate, barele de eroare indic 1 SD. Media determinrilor luminometrice msurate cu TopCount NXT (PerkinElmer Life Science) este reprezentat mpotriva concentraiei substanei inductoare (mM). Valorile obinute n absena compusului se refer la expresia bazal a genei reporter a luciferazei i constituie fundamentul reaciei.

Analizele genelor reporter pot fi nalt informative dac produsul genei de interes i calea de inducie sunt bine caracterizate. Este necesar s se in cont de faptul c o gen reporter poate fi modulat de orice tip de stimul care infueneaz oricare dintre etapele cascadei de transducie a semnalului cuplat. Astfel, efectele expresiei asupra genelor reporter observate ca rspuns la compuii testai trebuie

23

ntotdeauna estimai prin reacii care se adreseaz unor etape specifice ale cii, pentru a exclude mecanisme asociate indirect cu inta de interes. Dei n general expresia genelor reporter nu influeneaz homeostazia celulei, un anumit component artificial este introdus n sistem. n primul rnd, este necesar sa se stabileasc n ce msur calea de transducie a semnalului ce conduce la activarea unui anumit promotor este prezent i funcional activ n celulele de interes. Introducerea unei gene reporter n celule poate s perturbe caracteristicile transcripionale normale, datorit eliminrii unor factori transcripionali sau prin efectele de poziie datorate integrrii plasmidului n timpul generrii clonelor celulare stabilizate. De aceea, trebuie s existe grij n alegerea promotorului i a liniei celulare n care se realizeaz analiza genei reporter. Limitrile pot s apar n legatur cu liniile celulare utilizate, metodele de transfecie i eficiena expresiei genei reporter. Nu n ultimul rnd, dei generarea liniilor celulare bine caracterizate din punct de vedere al genelor reporter este consumatoare de timp, ele constituie un sistem foarte eficient pentru programele HTS. 1.3.2 Teste de detecie genic pentru optimizarea modulrii compuilor activi farmacocinetici Utilizarea array-urilor de expresie genic pentru monitorizarea simultan a expresiei a sute sau mii de gene a fost menionat anterior. Array-urile de expresie sunt metode utile nu numai pentru caracterizarea fenotipurilor de expresie ale celulelor i esuturilor n vederea clasificrii, dar ele permit i monitorizarea impactului mutaiilor sau medicamentelor asupra fenotipului celular. Array-urile sunt utilizate pe scar larg n studiile toxico- i farmacogenomice. n plus, datele obinute au fost utilizate pentru crearea unor modele predictive n scop diagnostic. Utilizarea array-urilor de expresie necesit producerea unor probe adecvate pentru hibridizare, care pot fi foarte dificil de obinut. Mai mult, analiza seturilor de date obinute necesit soft-uri sofisticate, precum i cunotine cu privire la semnificaia i relevana multiplicitii de rspunsuri observate. n unele cazuri, numai o fracie particular a genelor msurate ofer informaii referitoare la inta
24

cercetat. Thomas i colab. (2001) au analizat expresia a 1200 de transcripturi din ficat utiliznd array ADNc, dup administrarea la oareci a 24 de tratamente diferite divizate n cinci categorii. Un set de 12 transcripturi a fost identificat i considerat de importan diagnostic pentru clasificarea tratamentului n clase de toxicitate. Interesant, adugarea altor transcripturi a condus la un declin al acurateei predictive a individualitaii unui profil terapeutic specific. ntr-un studiu similar, Bartosiewicz i colab. (2001) au utilizat un set de 260 de gene implicate n faza I i II a metabolismului medicamentelor pentru a testa efectele a 10 substane toxice asupra profilurilor de expresie n diferite esuturi la momente diferite ale expunerii oarecilor. Diferite grupuri de clase chimice pot fi corelate cu profiluri de expresie diferite ale unui numr relativ sczut de transcripturi. Studii similare ale profilurilor expresiei evaluate pe celulele HepG2 i pe ficat de obolan tratat au aratat c numai cu un set de gene nalt selectate pot fi identificate clase diferite de substane chimice prin intermediul modulrii expresiei setului de gene selectate. n zilele noastre, cea mai bun metod pentru evaluarea profilului expresiei genice in vivo const n utilizarea oligonucleotidelor sau microarray-urilor ADNc sau a chip-urilor de gene. Cu toate acestea, datorit costurilor crescute i a efortului depus pentru prepararea probelor (care n general exclude o metoda de nalt capacitate) studiile au fost efectuate n special n faza tardiv a procesului de descoperire a medicamentelor. De aceea, una sau mai multe componente sunt analizate pentru modelele de expresie ale multor gene. Pentru a reduce uzura n faza tardiv a medicamentelor potenial candidate datorit efectelor adverse neobservate, sunt necesare sistemele de profil al expresiei justificabile pentru HTS. A fost descris o abordare care utilizeaz analiza genelor reporter. Albano i colab. (2001) au selecionat un set de promotori care rspund la stres din genele Escherichia coli pentru a genera construcii ale genei reporter GFP ca o unealt pentru screening-ul mecanicistic al medicamentelor antitumorale ntr-o plac cu 96 de godeuri. Zhu i Fahl (2000) au generat clone celulare stabile HepG2 care exprima GFP sub controlul elementului de rspuns electrofil (EpRE), care permite HTS pentru inducia enzimelor fazei a II-a a metabolismului medicamentelor. Un alt avantaj al
25

construciilor genelor reporter GFP este faptul c expresia poate fi detectat n celule vii, permind monitorizarea facil n dinamic, precum i reversibilitatea induciei. Utilizarea genelor reporter din liniile celulare pentru profilurile expresiei a fost mai profund documentat de Farr i Todd (1998), care au stabilit un model de linii celulare ce conin gena reporter pentru N-acetiltransferaza cloramfenicolului (CAT) sub controlul promotorilor indicatori pentru rspunsurile la stresurile celulare. Inducia unor construcii de reporteri de ctre compuii chimici poate oferi indicaii cu privire la aciunea compuilor la nivel subcelular. Astfel, construciile promotorgen reporter exprimate n linii celulare bine caracterizate pot oferi sisteme utile pentru profilul compuilor innd seama de activarea cilor de transducie a semnalului recunoscut care se asociaz cu anumite fenotipuri. Sistemul de analiz va detecta compui care moduleaz direct expresia genei reporter i pe aceia care interfer cu expresia provocat prin stimuli externi cum ar fi factorii de cretere i citokinele. Cnd un tablou de analize ale genelor reporter este utilizat pentru profilul compuilor, modele de expresie similar pot demonstra mecanisme comparabile de aciune ale compuilor testai n celule intacte. Modificri ale modelelor expresiilor ca rspuns la ci de semnalizare specifice i n linii celulare diferite pot aduce informaii cu privire la specificitatea compuilor testai. Aceste sisteme pot fi uor adaptate pentru HTS i pentru analiza n dinamic i a dependenei de doz a induciei. n consecin, crearea profilului modulatorilor identificai sau a seturilor de compui rezultai din optimizarea modulrii compuilor activi farmacocinetici poate permite organizarea compuilor n grupe cu rspunsuri farmacologice similare. De exemplu, activarea genelor reporter cuplate la elementul p53-responsiv (p53RE) va arta c acel compus testat conduce la lezri ale ADN; activarea reporterilor sub controlul elementului de rspuns la xenobiotice (XRE) va conduce la inducia transcripionala a enzimelor ce catalizeaz metabolismul medicamentelor, precum citocromul P450 i altele. Astfel, realizarea profilului genelor reporter in vitro cu un set de gene bine definite i validate poate contribui nu numai la clasificarea compuilor, dar i la identificarea unor posibile efecte adverse ale compuilor testai.

26

Recent, cu ajutorul unor tehnici mai sensibile de monitorizare a expresiei genice, a fost raportat un nou set de analize. n timp ce analizele genelor reporter au fost coroborate cu ideea vizualizrii unui eveniment particular al expresiei genice prin cuplarea cu o protein care poate fi monitorizat cu uurin, tehnicile noi monitorizeaz direct expresia genic prin cuantificarea nivelelor de ARNm pentru pn la cteva mii de gene simultan. Mai mult, aceste tehnici nu necesit introducerea anterioar a unui sistem de detecie ceea ce permite alegerea n funcie de tipul de celul sau esut derivate din organe. Tabelul 1.3 ofer o privire de ansamblu asupra unor tehnici dezvoltate pentru aplicaiile HTS care sunt disponibile n momentul actual. Tabelul 1.3 . Tehnici pentru identificarea expresiei genelor
Tehnologia SAGE Metodologia transcriptul capturat prin amprenta SAGE, identificarea i cuantificarea prin secvenierea concatemerelor seriate GeneCalling amprentarea prin endonucleaze de (profilarea restricie a ADNc, confirmare prin PCR transcriptului) competitiv TOGA PCR bazat pe ADNc, identificarea ARNm cu capt 3poli(A) prin secveniere Microarray/ hibridizarea ARN total la sonde ale oligoarray ADN genelor aranjate pe chip-uri de silicon sau lame de sticl RT-PCR Cantitativ eliberarea mediat prin PCR a unor sonde (TaqmanTM) fluorogenice specifice genelor; limita de detecie este invers proporional cu concentraia ADN ramificat detecia direct a ARNm prin hibridizarea (branched DNA) cu un linker specific genei i amplificarea (QuantigeneTM) sondei TM HPSA detecia direct a ARNm prin hibridizarea cu captur specific genei i amplificarea sondei Gene int HTcompatibil 96 de reacii Probe puine puine

256 de puine reacii HTpuine compatibil puine sonde format cu 96 de godeuri 1 sond 2 sonde format cu 96 de godeuri format cu 96 de godeuri

n funcie de aplicabilitatea pentru HTS a acestor noi tehnologii, pot fi difereniate dou mari clase. Dintre metode menionm analiza seriat a expresiei genice (SAGE), GeneCalling (realizarea profilului expresiei prin amprentarea cu endonucleaze de restricie) i analiza expresiei genice totale (TOGA), unde
27

prepararea probei iniiale este foarte dificil, dar detecia poate fi realizat n paralel pentru mai multe gene diferite. Aceste tehnici sunt denumite colectiv sisteme deschise nu este necesar nicio informaie despre secven i virtual toate genele induse de un compus particular pot fi detectate. Sistemele deschise pun sub semnul ntrebrii tehnologia ADN microarray, oferind o alternativ la costurile nalte i la necesarul nalt al materialului iniial asociate cu aceste tehnici. n practic, ele se vor dovedi utile dac trebuie analizate doar cteva probe pentru detecia produilor mai multor gene diferite. Reacia de polimerizare n lan cantitativ (RT-PCR), tehnologia ADN ramificat (branched DNA) promovat de Bayer (Emeryville, CA) i amplificarea de nalt performan a semnalului (high-performance signal amplification - HPSA TM) promovat de Chromagen (San Diego, CA) pot detecta moleculele de ARNm. Acestea sunt denumite sisteme nchise deoarece pot fi aplicate numai genelor cu secven cunoscut. Totui, aceste metode pot fi utilizate pentru HTS deoarece reaciile pot fi realizate n plci, permind procesarea simultan a mai multor probe. Mai mult, au avantajul de a fi mai flexibile i pot fi realizate pe orice surs i detecia noilor gene necesit doar design-ul i sinteza unor sonde specifice genelor. Aceste noi tehnologii promit o cretere a sensibilitii, cu rezultate necompromise de efectele secundare datorate genelor reporter, dar nc nu sunt att de larg utilizate ca sistemele genelor reporter.

1.4.Reaciile celulare spaio-temporale i analizele subpopulaiilor

Reaciile celulare care se adreseaz nivelelor expresiei proteinelor, distribuiei spaiale i temporale ale proteinelor n interiorul celulei i dinamicii semnalizrii intracelulare sunt utilizate curent pentru o mai bun nelegere a funciilor intelor farmaeutice n celule. Exista un numr n cretere de reactivi pentru marcare i de sonde fluorescente, incluznd anticorpii specifici intei, enzimele complementare, coloranii (Alexa Fluor dye series; Molecular Probes), reactivii de afinitate i proteinele fluorescente codificate genetic.
28

Sistemele care permit analize de mare capacitate ale celulelor includ tehnici bazate pe citometria n flux, precum sistemul farmacologic de mare capacitate recent descris [Edwards i colab., 2001]. Acest sistem permite caracterizarea multifactorial a celulelor, dar nu permite cuantificarea rearanjamentelor spaiale din interiorul celulei. Tehnologiile de imagistic microscopic recent dezvoltate au aplicaii variate. Ele permit analiza unor funcii celulare variate incluznd motilitatea celular, morfologia celular, motilitatea proteinelor n interiorul celulelor, localizarea proteinelor, mesagerii secunzi intracelulari i msurtorile captului cascadelor de semnalizare. Dezvoltarea unui sistem de imagistic automat a fcut posibil screeningul compuilor ntr-un format bogat n informaii. Avantajul major al imagisticii automate i al tehnicilor de scanare l constituie creterea considerabil a sistemelor de analiz de mare capacitate cuantificate simultan. Sistemul ArrayScan II a fost introdus n 1999 de ctre Cellomics [Brunet i colab. 1999] i a fost unul dintre primele instrumente de imagistic automate pentru screeningul bogat n informaii de pe pia. Pentru moment, alte instrumente, software-uri i hardware-uri au fost dezvoltate de cteva companii incluznd Acumen-Biosciences (www.acusite.co.uk), Amersham Bioscience (www.amersham. com), Applied Biosystems CompuCyte Universal (www.appliedbiosystems.com), (www.compucyte.com), Imaging Kinetics (www.imagel.com), Q3DM Imaging Axon (www.q3dm.com), comparativ cu microscopia manual. n cazul microscopiei cu fluorescen, multiple sonde fluorescente pot fi detectate i

(www.kinetikimaging.com),

Instruments (www.axon.com) i Evotec OAI (www.evotecoai.com). Progresul rapid n dezvoltarea sistemelor analitice pentru analizele subcelulare n combinaie cu reactivii de marcare pentru identificarea specific a moleculelor de interes va permite analiza semnalizrii specifice i a etapelor metabolice prin sisteme de analiz de mare capacitate.

29

1.4.1. Anticorpii specifici etapei de fosforilare De un interes deosebit pentru imagistica automat sunt reactivii dependeni de o activitate, precum anticorpii fosfospecifici care permit analiza selectiv a cilor de semnalizare din celule. Fosforilarea i defosforilarea proteinelor de ctre fosfataze i kinaze sunt procese componente ale reelei complexe de semnalizare a proceselor dinamice fin reglate. Fosforilarea proteinelor se traduce frecvent n redistribuia subcelular a moleculelor semnalizatoare cheie, care este important pentru activitatea lor biologica. Distribuia spaial a dou proteine cheie n semnalizare n urma fosforilarii, kinaza extracelular reglata de semnal (Erk) i MAP kinaza p38, a fost analizat cu anticorpi fosfotirozin-specifici care recunosc numai forma fosforilat a proteinei [Vogt i colab., 2001]. Expunerea celulelor la un inhibitor al fosfatazei Cdc25 s-a tradus ntr-o acumulare nuclear dependent de concentraie a fosfo-Erk i fosfo-p38, dar nu i a factorului nuclear B (NF-B). Aceste experimente au aratat c inhibiia Cdc25 a crescut fosforilarea Erk i acumularea sa n nucleu, indicnd c statusul de fosforilare al Erk este reglat de ctre fosfataza Cdc25. Un anticorp fosfo-histonic H3 care intete situsul de fosforilare Ser10 al histonei H3 i anticorpul fosfo-histonic H1 au fost utilizai pentru a detecta fosforilarea mitogen i oncogen-stimulat n regiunile nucleozomale mici care sunt sensibile la hiperacetilare [Chadee i colab., 1999]. Statusurile kinazei active au fost analizate cu un set de anticorpi monoclonali anti-kinazici fosfospecifici. Specificitatea anticorpilor pentru kinaza specific a fost verificat prin analiza Western blot i cu inhibitori specifici pentru kinazele din amonte. Utiliznd citometria n flux multiparametric, Perez i Nolan (2002) au putut identifica subseturi de limfocite cu ajutorul a patru kinaze intracelulare active. Aceast tehnic permite pentru prima data investigarea simultan a diferitelor kinaze active ntr-o singur celul. n timp ce aceast tehnologie poate fi cel mai bine aplicat celulelor n suspensie, microscopia de nalt capacitate este tehnica cea mai adecvat pentru celulele aderente. n plus, aplicaiile microscopiei permit analiza distribuiei spaiale intracelulare care nu este posibil prin citometria n flux.

30

Celulele n mitoz sunt caracterizate prin creterea nucleolinei fosforilate, o protein nuclear fosforilat n celulele care intra n mitoz. Utiliznd un anticorp monoclonal care recunoate specific nucleolina fosforilat, Mayer i colab. (1999) au dezvoltat o analiza de mare capacitate whole-cell immunoblot. Componentele care opresc celulele n mitoz prin noile metode de aciune au putut fi identificate dup sortarea componentelor cu o a doua reacie. Alte modificri ale proteinelor precum acetilarea pot fi de asemenea detectate cu anticorpi specifici. Organizarea cromatinei active transcripional i activitatea acetiltransferazei i deacetilazei histonelor nucleare au fost investigate prin utilizarea unui anticorp specific acetil-histonei H3. Componentele care afecteaz modificrile stimulate de ligand n structura cromatinei pot fi cel mai bine scanate cu aceti anticorpi prin tehnici de imagistic automate. 1.4.2 Anticorpi specifici intelor proteice Multe proteine joac roluri importante att n citoplasm ct i n nucleu. Deci, ele necesit traficul dintr-un compartiment n altul pentru a-i ndeplini funciile. Exemple tipice sunt factorii de transcripie citoplasmatici lateni sau factorii de transport nucleari. Au fost descrise reacii pentru factorii de transport nuclear care utilizeaz formarea heterocarionului n asociere cu proteine fluorescente. Traficul factorilor de transcripie citoplasmatici lateni n urma activrii ctre nucleu poate fi monitorizat i cuantificat prin imagistica fluorescent automat. Translocaia n nucleu a NF-B indus de IL-1 i de factorul de necroz tumoral a fost cuantificat cu ajutorul aplicaiilor tehnnologiei Cellomics ArrayScan II [Ding i colab, 1998]. Celulele nestimulate conin NF-B inactiv distribuit n interiorul citoplasmei care poate fi detectat cu anticorpi specifici pentru NF-B legai la anticorpi secundari marcai fluorescent. n celulele stimulate cu IL-1, cea mai mare parte a NF-B este activat i este transportat n nucleu ntr-o manier dependent de moment i de doz (Fig 1.6 i 1.7). n urma stimulrii de ctre IL-1, celulele HeLa au fost analizate cu ajutorul sistemului ArrayScan II utiliznd un software specific care
31

permite analiza cantitativ a fluorescenei n nucleu i n citoplasma adiacent. Celulele sunt identificate ca obiecte de ctre software prin colorarea nuclear cu Hoechst 33324 sau DAPI i sunt acoperite pentru msuratori ale fluorescenei nucleare i citoplasmatice (Fig 1.8).

Fig 1.6 Translocaia nuclear a NF-B n dinamic . Celulele HeLa au fost stimulate cu 1 ng/ml de IL-1a la 37oC. Sunt reprezentate valorile medii a 100 de celule msurate n fiecare godeu n dou experimente separate (Exp 1 si Exp 2). Nuc-CytoInten = intensitatea fluorescenei nucleare minus intensitatea fluorescenei citoplasmatice.

Fig 1.7 Relaia doz-rspuns a translocaiei nucleare a NF-B indus de IL-1a . Celulele HeLa au fost stimulate cu concentraiile indicate de IL-1a pentru 30 de minute la 37 oC. Sunt reprezentate valorile medii a 100 celule msurate per godeu n dou experimente separate (Exp 1 si Exp 2). Nuc-CytoInten = intensitatea fluorescenei nucleare minus intensitatea fluorescenei citoplasmatice 32

Fig. 1.8 Translocaia NF-B indus de IL-1a n celulele HeLa . Celulele au fost marcate cu anticorp de iepure antip65 pentru NF-B i anticorp de capr anti-anticorpul de iepure Alexa Fluor 488. ADN-ul nuclear a fost marcat cu Hoechst 33342. NF-B este cuantificat prin msurarea intensitii fluorescenei verzi; nucleii apar albatrii. Celulele nestimulate (stnga) prezint fluorescena verde mai ales n citoplasm, pe cnd celulele stimulate cu IL-1a 2ng/ml 30 de minute la 37oC (dreapta) prezint translocaia NF-B n nucleu.

1.4.3. Fuziunile Proteina-GFP Tehnologiile prin ataare au fost frecvent utilizate pentru monitorizarea traficului sau transportului moleculelor prin membran n celule i n interiorul celulelor. Liganzii extracelulari pot fi conjugai cu biotina i apoi vizualizai cu streptavidina conjugat la o enzima. Un experiment HTS a fost descris pentru internalizarea factorului de cretere epidermal (EGF) [De Wit i colab., 2000]. Proteinele fluorescente contribuie semnificativ la nelegerea dinamicii proteinelor n interiorul celulelor. Ele reprezint instrumente importante i adaosuri ideale pentru evaluarea n timp real, a evenimentelor moleculare n celulele vii, sub forma de proteine reporter sau proteine de fuziune. Cea mai proeminent protein fluorescent este GFP, izolat iniial i clonat din petele cartilaginos Aequorea victoria. Un mare numr de variante GFP au fost realizate cu spectre de excitaie i emisie diferite, incluznd proteina fluorescent albastr intensificat (eBFP), proteina fluorescent
33

galben intensificat (eYFP) i proteina fluorescent azurie intensificat (eCFP). Natura structurilor acestor proteine evalueaz aceste proteine ca extrem de stabile i rezistente la degradare de ctre majoritatea proteazelor. Acest nalt nivel de stabilitate nu reprezint n mod necesar un avantaj pentru aplicaiile celulare. Dac se dorete monitorizarea modificrilor expresiei genice prin reaciile reporterilor transcripiei, este de preferat un reporter cu un timp de njumtire redus. n consecin, au fost create forme cu timp de njumtire redus ale eGFP pentru a putea fi utilizate ca proteine reporter ale transcripiei i ele sunt denumite proteine eGFP destabilizate. n acelai timp, au fost clonate alte proteine fluorescente din nevertebratele marine,cum ar fi proteinele fluorescente din recifurile de corali. Combinaia variantelor spectrale distincte ale proteinelor fluorescente permite o mare varietate de aplicaii, precum analiza simultan a cascadelor expresiei mai multor gene sau translocaia diferitelor proteine. Msurarea co-internalizarii -arestinei legat de GPCR poate fi utilizat pentru monitorizarea activrii i reciclrii receptorului. Barak i colab. (1997) au demonstrat cu ajutorul microscopiei confocale, translocaia proteinelor de fuziune -arestina-2GFP din citoplasma la GPCR ancorai la membrana. Acest lucru a fost demonstrat pentru mai mult de 15 GPCR activai de ligand n celulele HEK-293. n absena activrii receptorului, -arestinele sunt distribuite n citosol i sunt absente n nucleu. Dupa adugarea ligandului la celule, proteinele de fuziune -arestina-2-GFP sunt translocate prin membrana plasmatic i mai departe prin veziculele de endocitoza. Acumularea proteinelor GFP-ataate poate fi cuantificat cu ajutorul tehnicilor imagistice fluorescente. Cu ajutorul proteinei de fuziune -arestina-2-GFP, se realizeaz co-internalizarea arestinei cu receptorul 1 al TRH (thyrotropin-releasing hormone) ca rspuns la agonist ,reacia fiind monitorizat i fotografiat. NORAK Biosciences (Research Triangle Park, NC; www.norakbio.com) exploreaz micarea complexului arestina-GFP sub denumirea de tehnologia TransfluorTM ca o platforma HTS aplicabil pe scar larg, stabil, care permite identificarea modulrii compuilor semnalizrii prin GPCR. Internalizarea receptorului i traficul su au fost explorate prin utilizarea liganzilor marcai fluorescent, ca de exemplu ligandul pentru
34

receptorul transferinei [Ghosh i colab., 2000]. Screening-ul a fost condus cu un sistem ArrayScan II, iar internalizarea i reciclarea receptorului transferinei cu ligandul legat a putut fi monitorizat i cuantificat. Activarea i internalizarea GPCR a fost monitorizat cu ajutorul proteinelor de fuziune fluorescente GPCR-GFP. Conway i colab. (1999) au utilizat sistemul de screening ArrayScan pentru a monitoriza internalizarea receptorului pentru hormonul paratiroid i receptorului 2-adrenergic dup stimularea de ctre liganzii specifici. Alte exemple n care a fost utilizat fuziunea cu proteine fluorescente pentru a cuantifica traficul proteinelor includ translocaia nuclear a calmodulinei sau reglatorul transcripional legat de membrana dupa hidroliza fosfoinozitidului. n alte aplicaii, domeniile de translocaie precum domeniul C2 sensibil la Ca 2+ al protein kinazei C a fost fuzionat cu YFP i exprimat n celule leucemice de obolan. Tehnologia evanescent wave single-cell array (radiaii cu scdere exponenial a intensitii n funcie de distan) a fost aplicat ca o tehnologie imagistic pentru a monitoriza traficul proteic dupa adiia factorului activator plachetar. Analiza simultan a populaiilor celulare mixte poate fi efectuat prin transfecia fiecrei linii celulare cu o singur protein de fuziune fluorescent. Vectorii BFP i YFP au fost utilizai pentru transfecia stabil a dou linii diferite de cancer colonic, linia parental cu gena K-ras mutant i o variant unde gena mutant a fost deletat. Pentru a realiza screening-ul compuilor care omoar selectiv numai varianta tumorigenic cu gena mutant, ambele populaii au fost amestecate i testate simultan pentru supravieuirea celular utiliznd msurtori ale intensitii fluorescenei. Au putut fi identificai compui care afecteaz preferenial celulele cu alela ras mutant. 1.4.4. Fluorescen cu transfer de energie prin rezonan (FRET) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) a devenit o metod utilizat frecvent pentru studiul dinamicii proteinelor n celule. FRET este bazat pe transferul energiei absorbite de o molecul fluorescent la o alt molecul, determinnd
35

excitarea celei de-a doua molecule. Pentru a realiza FRET, cele dou molecule fluorescente cu spectre diferite de excitaie/emisie trebuie sa fie ntr-o strns proximitate. Cea mai general strategie pentru crearea unor astfel de indicatori este interpunerea domeniului de interes sensibil conformaional ntre dou mutante GFP. n cazul legrii ligandului sau al modificrii domeniului, cele doua jumatai fluorescente se gsesc n strns proximitate, ceea ce permite realizarea FRET. ntr-un studiu de pionierat, Mahajan i colab. (1998) au utilizat construcii plasmidice care au exprimat proteinele de fuziune GFP-Bax i BFP-Bcl-2. Bax i Bcl-2 sunt doi modulatori cheie ai apoptozei, dar interaciunea lor direct nu fusese niciodat demonstrat la nivel celular. Pe baza FRET s-a evideniat interaciunea direct a celor dou proteine la nivelul mitocondriei . FRET a fost de asemenea aplicat pentru a determina activitile kinazei n celule vii. Pentru acest scop, au fost creai reporteri constnd din fuziunea CFP, un domeniu de legare a fosfo-aminoacizilor, un substrat de consens pentru kinaza de interes i YFP. n celulele transfectate cu reporteri i stimulate pentru activitatea particular a kinazei, proteina de fuziune dup fosforilare a suferit modificri conformaionale i a permis realizarea FRET ntre YFP i CFP. Modificarea raportului ntre emisia galben i azurie a putut fi cuantificat i determinat temporal i spaial. Aceasta tehnologie a fost aplicat cu succes pentru protein kinaza A i cele trei tirozin kinaze Abl, Scr i receptorul EGF. ntr-o abordare similar, Honda i colab. (2001) au demonstrat utilizarea unui indicator fluorescent codificat genetic pentru a investiga dinamica GMPc n celule individuale. Indicatorul GMPc a fost construit din mutani cu deleii ai protein kinazei GMPc dependente ntre mutantii galben i azuriu ai GFP. Legarea GMPc la indicatorul proteinei de fuziune a alterat FRET dar i raportul ntre emisia galben i azurie, care a fost selectiv peste AMPc. Prin utilizarea acestei metode, dinamica temporal i spaial a nivelelor de GMPc intracelular n fibroblastele plmnului fetal de obolan i n neuronii Purkinje a fost monitorizat n urma adugrii diferiilor stimuli.De asemenea au fost studiai senzori similari pentru AMPc .

36

Senzorii bazai pe FRET au fost de asemenea utilizati pentru a demonstra comportamentul spaio-temporal al proteinelor de legare a GTB n urma stimulrii celulare cu factori de cretere. A fost creat o protein de fuziune ce cuprinde H-Ras, domeniul de legare al Ras la Raf i a fost flancat de o pereche de mutani galben i azuriu ai GFP. H-Ras a fost nlocuit n cea de-a doua construcie cu proteina analoag Rap1. Activarea cii Ras/Rap de ctre factorii de cretere a indus FRET. Localizarea spaio-temporal a proteinei de fuziune a indicat c stimularea de ctre EGF a celulelor COS-1 a activat Ras la nivelul membranei plasmatice, iar Rap la nivelul regiunii perinucleare. n plus, acest studiu a demonstrat c factorii de cretere activeaz numai o subpopulaie a Ras i Rap i numai la nivelul unor arii restrnse din celul. Aceast tehnologie n combinaie cu imagistica celular va crete sensibilitatea i va facilita abordrile HTS celulare pentru evenimente specifice ale semnalizrii celulare. 1.4.5. Activarea GPCR prin biolominiscena cu transfer de energie prin rezonan (BRET) BRET (Bioluminiscence Resonance Energy Transfer) este un fenomen care apare n mod natural. Petele cartilaginos A. victoria sau Renilla reniformes produc fluorescena verde prin BRET. n cazul anterior al emisiei de lumin albastr, aequorina se asociaz cu GFP, n timp ce n ultimul caz, energia generat n urma degradrii coelanterazinei de ctre luciferaz este transferat ctre GFP. Acest transfer apare numai n cazul n care luciferaza i GFP formeaz un heterodimer. BRET a fost utilizat pentru a demonstra interaciunea proteinelor ceasului circadian de la cianobacteriile exprimate n E. coli. Mai recent, BRET a fost aplicat pentru studiul activarii GPCR de cteva grupuri de cercetatori [Angers i colab., 2000]. Pentru a demonstra dimerizarea receptorului 2-adrenergic (2-AR), construciile 2AR-Renilla luciferaza i 2AR-GFP supus efectului Doppler (redshift) (YFP) au fost co-exprimate n celulele HEK-293. Apariia BRET a fost un indicator al dimerizrii receptorului. n acelai studiu, -arestina, cunoscut a se asocia cu domeniul intracelular al receptorilor cuplai cu proteina G activai, a fost exprimat ca
37

o construcie arestina-YFP mpreun cu luciferaza- 2AR-Renilla. A fost prezent BRET ntre dou proteine, dar a fost n totalitate dependent dup activarea receptorului, indicnd asocierea arestinei cu domeniul intracelular al 2AR n starea activ a receptorului. Aceasta reacie a fost dezvoltat ca o tehnologie pentru HTS de ctre PerkinElmer Life Sciences. 1.4.6. Teste de detecie prin complementaritate a fragmentelor proteice (Protein Fragment Complementation Assays - PCA) Metodele descrise anterior pentru studiul interaciunilor protein-protein sunt asociate cu unele neajunsuri. Dublul sistem al drojdiilor este bazat pe transcripie, care necesit disponibilitatea proteinelor n nucleu. n FRET, proteinele fluorescente trebuie s fie exprimate n celule la nivele relativ nalte i interaciunea trebuie sa aib loc ntr-un asemenea mod nct proteinele s fie n strns proximitate pentru a permite transferul energiei. Complementarea enzimelor i utilizarea PCA n studiul interaciunilor protein-proteia a fost dezvoltat pentru -galactozidaza la E. coli, dihidrofolat reductaza (DHFR) i mai recent pentru -lactamaza. n cazul -galactozidazei, doi mutani cu deleii, complementari sunt fuzionai cu dou proteine pentru a proba interaciunea. Numai n cazul n care cele dou proteine interacioneaz ele sunt cele dou pri ale galactozidazei forate s se completeze una pe cealalt i s exercite activitate enzimatic. Sistemul a fost dezvoltat pentru demonstrarea interaciunii FRAP i FKBP12 n prezena rapamicinei. Mai recent, complementarea galactozidazei a fost utilizat pentru a crea sisteme HTS pentru screening-ul antagonitilor dimerizrii EGF-R mediat de ctre EGF. Pentru acest scop, mutanii cu deleii complementari ai -galactozidazei au fost fuzionai cu domeniile intracelulare ale EGF-R i cotransfectate n mioblaste de oarece C2C12. Activitatea enzimei a fost reconstruit n urma adugarii EGF la celulele din cultur. Cu ajutorul acestei reacii, adaptat la un format cu 384 de godeuri, modulatorii cu molecule mici primar identificai n reacia EGF-R au fost supui screening-ului pentru specificitate cu doi mutani cu deleii complementari ai -galactozidazei fuzionai cu 238

adrenoreceptorul i -arestina uman. Prin utilizarea reactivilor chemiluminisceni i a galactozidazei fluorescente, aceast tehnic permite msurarea interaciunilor protein-protein n celulele vii pentru aplicaii HTS. Reasamblarea DHFR activ din fragmente create raional a fost realizat de ctre Pelletier i colab. (1998) ntr-un sistem procariot. DHFR a E. coli este inhibat selectiv de ctre antifolatul trimetoprim. DHFR murin poate salva celulele E. coli. Fragmentele complementare ale DHFR murin fuzionate cu proteine homo- sau heterodimerizate au fost utilizate pentru a transforma E. coli crescute ntr-un mediu cu trimetoprim. Supravieuirea a fost considerat ca o msur pentru interaciunile proteice i complementarea enzimei. n alt studiu, partenerii proteici fuzionai pentru complementarea fragmentelor DHFR murin au fost introdui n celule de mamifere DHFR-negative crescute n absena nucleotidelor. Celulele n care proteinele se asociaz i DHFR poate complementa sunt capabile s supravieuiasc n aceste condiii. Ca o alternativ, interaciunea proteic i complementarea DHFR pot fi monitorizate prin adugarea de metotrexat conjugat cu fluorescein. Metotrexatul se leag la DHFR numai n condiiile co-exprimrii i reasamblrii fragmentelor complementare. Semnalele fluorescente pot fi monitorizate prin microscopie fluorescent FACS sau prin metode spectroscopice utilizate n HTS. Complexul FKBP-rapamicina-FRAP i activarea receptorului pentru eritropoietin au fost utilizate ca sisteme model [Remy, Michnick, 1999]. Mai recent, reacia PCA-DHFR a fost utilizat pentru a analiza totalitatea reelelor biochimice n celule vii. Celulele ce exprim perechi de proteine asociate au fost selectate i metotrexatul conjugat cu fluoresceina, care se leag la DHFR reconstituit a fost aplicat pentru a localiza partenerii proteici interacionati i pentru a studia inhibitorii care previn interaciunea. Aceeai metod a fost utilizat cu succes pentru protoplastele plantelor care exprim fragmente complementare ale DHFR fuzionate cu proteinele interacionate. Legarea metotrexatului conjugat cu fluoresceina ca o msur a interaciunii protein-protein a fost monitorizat prin microscopie fluorescent [Subramaniam i colab., 2001].

39

1.5 Analizele fenotipice

1.5.1 Proliferarea/Respiraia/Toxicitatea Multe reacii pentru citotoxicitate i proliferare se bazeaz pe msurarea radioactivitii i msurarea ncorporrii nucleotidelor marcate radioactiv precum [3H] timidina n ADN-ul celular. Dei foarte sensibil, reacia ce utilizeaz [ 3H] timidina este relativ costisitoare i consumatoare de timp i presupune manipularea i nlturarea deeurilor radioactive. Alte reacii de citotoxicitate, precum MTT [3-(4,5dimetiltiazol-2yl)-2,5difeniltetrazolium bromide], Alamar Blue, lactat dehidrogenaza i coninutul de ATP, necesit adiia unor reactivi specifici pentru generarea semnalului. Dintre aceste tehnici, cea mai utilizat este MTT. Aceasta sare de tetrazoliun este redus n interiorul mitocondriilor celulelor pentru a forma un precipitat colorat formazan. Utilitatea MTT este limitat de faptul c poate fi susceptibil la interferena cu medicamentele, fie prin reacia cu gruprile reductoare ale medicamentelor, fie prin difuzarea absorbanei ce rezult din precipitarea n spectrul vizibil a luminii absorbite de medicamente. Msurarea viabilitii celulare prin reacia MTT se bazeaz pe reacia sa cu succinat dehidrogenaza mitocondrial, care poate ea nsi s perturbe celulele. Mai mult, testul n sine nu este reversibil i, datorit faptului c se realizeaz o citire la finalul reaciei, citirea pentru fiecare moment necesit o reacie separat. Trebuie notat faptul c reaciile de toxicitate i proliferare sunt utilizate att separat i independent una fa de cealalt, ct i n combinaie. Combinaia ambelor reacii permite o investigare detaliat a efectelor compuilor asupra unei linii celulare particulare. Reaciile omogene i reversibile sunt n mod considerabil necesare. Sistemul Oxygen Biosensor System (OBSTM; BD Biosciences, Bedford, MA) poate fi privit c un prototip reprezentativ. n acest sistem nu este necesar adugarea niciunui reactiv pentru generarea semnalului. OBS este o reacie realizat ntr-o microplac care permite monitorizarea cinetic a oxigenului dizolvat. Colorantul sensibil la oxigen este nvelit cu o matrice de silicon care este permanent ataat de baza fiecarui godeu al microplcii. Matricea permeabil pentru gaze permite oxigenului din vecintatea colorantului s fie n
40

echilibru cu oxigenul din mediul lichid. Oxigenul atenueaz capacitatea colorantului de a emite fluorescena ntr-o manier predictibil, dependent de concentraie. Prin urmare, pe msur ce oxigenul este depletat din godeu (celulele consum oxigenul din mediul nconjurator pe msur ce cresc), concentraia oxigenului n matrice descrete i fluorescena crete. Nivelul fluorescenei se coreleaz direct cu consumul de oxigen din godeu. Consumul de oxigen este n legatur direct cu numrul sau viabilitatea relativ a celulelor din fiecare godeu. Orice reacie care poate fi legat de consumul sau generarea de oxigen poate fi potenial msurat de ctre acest sistem (Fig. 1.9). Semnalul este dinamic i este citit n timp real. Probele pot fi citite orict de frecvent i de cte ori se dorete. Semnalul este complet reversibil i va crete pe msur ce celulele prolifereaz i va descrete pe msur ce celulele mor, oferind o imagine complet a cineticii proliferrii i toxicitii.

Fig 1.9 Consumul de oxigen de ctre celulele HeLa n urma expunerii la trinitrat de sodiu. Celulele (1x105), au fost adugate n godeuri separate ale unei plci cu biosenzori pentru oxigen i tratate cu trinitrat de sodiu n concentraiile indicate. Celulele au fost cultivate i fluorescena a fost msurat la momentele indicate. Concentraiile micromolare mici ale trinitratului nu au influenat creterea celulelor HeLa. n schimb, concentraiile micromolare ale trinitratului de Na sunt toxice i fluorescena relativ este meninut la un nivel constant. Descreterea consumului de oxigen la 126 de ore dup adugarea medicamentului indic faptul c celulele au confluat i au ncetat s prolifereze.

41

1.5.2. Apoptoza Apoptoza, sau moartea celular programat, este unul dintre cele mai complexe procese celulare. Evenimentele timpurii i tardive care apar n celulele supuse apoptozei cuprind activarea diferitelor caspaze, modificri ale citoscheletului, modificri ale potenialului membranei mitocondriale i a masei mitocondriale, condensarea sau fragmentarea nuclear, micarea de flip a fosfatidilserinei pe faa extern a membranei celulare i dezorganizarea membranei plasmatice. Modificri ale morfologiei nucleare, reorganizarea actinei i a potenialului i continutului mitocondriei pot fi detectate i cuantificate prin analiza multiparametric a apoptozei [Woo i colab., 1999]. Mrirea sau ngustarea ariei nucleare i distribuia cromatinei n interiorul nucleului este analizat prin colorarea celulelor cu un colorant ADN fluorescent, precum DAPI sau Hoechst 33342. Gruparea filamentelor intracelulare de actin F i mrirea coninutului n actin a celulelor apoptotice sunt detectate cu ajutorul faloidinei fluorescente. Aceast falotoxin, izolat din ciuperca Amanita phalloides, se leag foarte nalt specific la actina F i poate fi marcat cu un colorant fluorescent. Cu toate acestea, creterea coninutului de actina F nu este observat n toate cazurile n celulele apoptotice, depinznd de tipul de celul sau de inducator. Colorantul cationic specific mitocondriilor, MitotrackerR Red, care se acumuleaz n mitocondriile active, este utilizat pentru a estima potenialul membranar i coninutul mitocondrial [Camilleri-Broet i colab., 1998]. n ambele cazuri, cantitatea de colorant de la nivelul mitocondriei este o masur a nivelului apoptozei. n cazul aplicaiei multiparametrice a apoptozei, algoritmul ArrayScan II nu numai c cuantific marcajul, dar ia n considerare distribuia colorantului fluorescent n compartimentele celulare i calculeaz fragmentarea nuclear i creterea coninutului mitocondial. Acest algoritm a fost aplicat cu succes n detecia apoptozei induse de anumii compui i poate fi utilizat pentru HTS.

42

1.5.3. Diferenierea Celulele stem umane de diferite tipuri au capacitatea de a se diferenia ntr-un numr de tipuri de celule mature.Asemenea celule stem fiind n mod curent utilizate n transplantul de mduv osoas i n cercetarea medicamentelor. Noi medicamente, precum factorul stimulator al coloniilor de granulocite i eritropoietina au fost create pentru a aciona direct asupra acestor celule, fiind eseniale pentru succesul transplantului de maduv osoas. Expansiunea progenitorilor din maduva osoas este extrem de sensibil la o varietate de chimioterapice i ali agenti toxici. n unele cazuri, efectele adverse toxice ale medicamentelor sunt specifice pentru liniile hematopoietice. n trecut, utilizarea progenitorilor hematopoietici pentru descoperirea medicamentelor pe baza analizelor de mare capacitate i screening-ul toxicologic era limitat de disponibilitatea esutului. innd seama de disponibilitatea actual a progenitorilor hematopoietici umani de nalt calitate, impasul curent l constituie utilizarea acestor celule n reaciile fenotipurilor lor de difereniere. Cea mai utilizat reacie in vitro pentru a determina rspunsul diferenierii celulelor progenitoare hematopoietice este reacia coloniei [Eaves, 1995]. Aceast reacie utilizeaz populaii progenitoare selectate din mduva osoas uman, cordonul ombilical sau sngele periferic mobilizat n reacii clonogenice ntr-un mediu semisolid. Dup o perioad de 14 zile apar colonii ale diferitelor tipuri de celule sanguine difereniate care sunt numrate manual. Diferite tipuri de colonii sunt identificate datorit morfologiei lor (mieloide sau eritroide) sau prin tehnici de colorare citochimic (megacariocite). Dei parametrii acestei reacii au fost optimizai pentru a obine date cantitative, rezultatele extrem de reduse i natura subiectiv a acestei reacii determin anumite probleme atunci cnd reacia este utilizat pentru screening-ul bibliotecii de compui chimici, descoperirea iniiala a medicamentelor i screening-ul toxicitii prin analize de mare capacitate. Rspunsuri difereniate pot fi obinute i prin transfecia unei celule int cu o gen pentru un receptor legat de expresia unui marker specific de difereniere.

43

Aceasta necesit transfecia unei celule ce conine cascade de transducie a semnalului caracteristice progenitorilor hematopoietici intaci. O alt abordare a fost descris de Warren i colab. (1995). Autorii au descris o imunoreacie celular n care celulele sunt transferate ntr-o plac de reacie tratat cu fixator, i fixate anterior incubrii cu anticorpii primari i secundari. Dei aceast reacie a fost utilizat cu succes, transferul celulelor din placa de cultur n placa de reacie este consumator de timp i nu este justificabil pentru HTS. Recent, aceast reacie a fost revizuit i mbuntit de ctre Greenwalt i colab. (2001) pentru a reduce numrul de manipulri necesare. La finalul perioadei de cultur, supernatantul culturii celulare este ndeprtat prin filtrare prin vacuum i este adugat un anticorp specific. Pentru a obine sensibilitatea dorit, anticorpii monoclonali au fost conjugai cu un chelat de europium DELFIA. Pe lng sensibilitate, emisia relativ lung a chelatului de europium DELFIA a permis utilizarea TRF (time-resolved fluorescence) pentru a preveni fluorescena fundalului endogen care este deseori o problem semnificativ n analizele biologice. ndeprtarea supernatantului culturii, a anticorpilor nelegai i etape ulterioare de splare sunt realizate ntr-o plac cu filtru cu 96 de godeuri. Deoarece este prezent numai o contaminare redus de la un ciclu de splare la altul, ndeprtarea anticorpului nelegat este foarte eficient. Sunt posibile splari repetate fr pierderea celulelor. Pentru detecia semnalului, a fost adugat o soluie de intensificare i fluorescena europiului (excitare la 340 nm i emisie la 615 nm) i a fost msurat cu ajutorul unui spectrofluorometru dup o perioad de 400 s dup ntrzierea iniial de 400 s. 1.5.4. Monitorizarea metabolismului celular Determinarea direct a metaboliilor la nivel celular sau in vivo ofer un sistem sensibil pentru evaluarea aciunii medicamentului deoarece metaboliii reprezint produii finali ai proceselor reglatoare celulare. n plus, metaboliii celulari sunt n general mult mai puin abundeni dect proteinele. n mediul celular, transducia semnalului, iniierea expresiei genice, sinteza proteinelor i rspunsurile metabolice la stres trebuie s fie secveniale. n ultimii ani s-au dezvoltat domeniile
44

metabolomicii, care investigheaz reglarea metabolic i fluxurile celulelor individuale sau tipurilor de celule, i metabonomicii, care determin profilurile biochimice sistemice i reglarea funciei n organismul ca ntreg prin analiza fluidelor biologice i a esuturilor [Nicholson i colab., 2002]. Studiul efectelor adverse ale medicamentelor asupra celulelor sau a ntregului organism prin metabonomic se bazeaz pe msurtori multiparametrice ale alterrilor metabolice n timp, ca rspuns la un factor de stres. Probele sunt cartografiate n funcie de compoziia lor biochimic [Nicholson i colab., 1999]. Metaboliii s-au dovedit extrem de utili n caracterizarea fenotipurilor mutante, aa cum s-a aratat recent la plante [Fiehn, 2002] i n caracterizarea aa-numitor mutaii silenioase la drojdii [Raamsdonk i colab., 2000]. Multe gene sunt silenioase, ceea ce nseamn c dac sufer o mutaie, ele nu conduc la modificri fenotipice uor observabile, precum alterri ale ratei de cretere. Rata de cretere poate s nu fie modificat deoarece concentraiile diferiilor metabolii intracelulari sunt adaptate ntr-un mod care compenseaz efectul mutaiei. Corespunzator, analize metabolomice pot releva un fenotip al metaboliilor anterior considerat ca silenios. n plus, cuantificarea modificrilor relative ale concentraiei metaboliilor cauzat de o mutaie face posibil identificarea unui situs de aciune al produsului genic alterat, dupa cum a demonstrat Raamsdonk i colab. (2000). Prin utilizarea aplicaiilor rezonanei magnetice nucleare sau spectrometriei de mas (MS)/cromatografia lichid/MS, este posibil analiza de mare capacitate. Aceasta va permite utilizarea analizelor metabolomice i metabonomice n descoperirea medicamentelor ca o estimare sensibil a aciunii medicamentelor [Nicholson i colab., 2002]. O abordare nou, care permite analiza statusului metabolic n celule intacte, este analiza funcional a celulelor vii n medii controlate fiziologic pe perioade mari de timp (biochip-uri). Eforturile sunt direcionate ctre dezvoltarea, adaptarea i integrarea senzorilor microelectronici n biochip-uri miniaturizate pentru monitorizarea celular multiparametric (Cell Monitoring System). Unele dintre citirile posibile ale activitilor celulare corespunzatoare sunt sumarizate n tabelul 1.4.
45

Monitorizarea schimburilor oxigenului celular poate fi utilizat pentru evaluarea activitii mitocondriale. Mitocondria, pe lng faptul c furnizeaz energie celulei, se presupune c este implicat i n mbtrnirea celular accelerat datorat speciilor reactive de oxigen (ROS), n apoptoz i mecanismele toxice ale multor medicamente. Monitorizarea activitii mitocondriale prin colorani lipofilici precum rodamina 123 prezint riscul unor poteniale artefacte i deci, tehnicile non-toxice i neinvazive sunt n mod particular valoroase. OBS a fost descris mai sus ca una dintre primele tehnici neinvazive pentru monitorizarea consumului de oxigen. O limitare a OBS este determinat de necesitatea unui numr mare de celule. Sistemul necesit cel puin 50000 de celule n fiecare godeu pentru a produce rezultate viabile (un numr mai mic de celule nu consum suficient oxigen pentru a compensa difuzia oxigenului din mediul exterior la biosenzor). Comparativ, tehnologiile bazate pe microsenzori permit, n condiii ideale, nregistrarea semnalelor de la o singur celul. nregistrarea pH-ului bazat pe microsenzori este predominant utilizat pentru determinarea ratelor de acidifiere extracelulare. Cteva ci metabolice contribuie la acidifierea celular i, astfel, pot fi privite ca un indicator global al activitii metabolice. n acest sens, modificrile rapide (minute) tind s reflecte evenimentele activrii celulare (semnalizarea mediat de receptor), pe cnd modificarile lente (ore) sunt de obicei atribuite creterii sau morii celulare. Monitorizarea adeziunii celulare (metastazele tumorale) sau a creterii spre exterior (neurite) poate fi obinut prin creterea celulelor plasate direct pe perechi de electrozi interdigitai. Semnalul impedanei celulare rezult din izolarea prin membranele celulare. Dac celulele sunt plasate pe electrozi, ele blocheaz fluxul curentului ntr-un mod pasiv i astfel impedana crete. Astfel, impedana unui sistem ofer o privire asupra comportamentului de adeziune al celulelor. Aceast metodologie se bazeaz pe achiziia datelor utiliznd dispozitive multiparametrice cu microsenzori. Un sistem de fluide pentru suplimentarea mediului de cultur/soluiei de medicamente i pentru realizarea msurtorilor metabolice este conectat la chip. De asemenea este necesar meninerea precis a condiiilor
46

micromediului in vitro. Parametrii celulari rspunztori de citirea chip-urilor cu senzori sunt activitatea metabolic (ratele acidificrii extracelulare i respiraiei celulare), proprietile morfologice i unele fluxuri ionice. Chip-urile cu senzor la scar mic necesit cantiti foarte mici ale probei celulare. Au fost dezvoltate metode care permit testarea unui numr mare de compui, iar formatul n plci cu 96 de godeuri ar putea deveni disponibil n curnd. Tabelul 1.4 Citirile pentru sistemele multiparametrice de monitorizare a activitii celulare
Citirea Modificri ale nivelului de oxigen Acidifierea mediului Modificari ale impedanei Fluxul ionic Metabolii Emisia de lumin Activitatea celular corespunzatoare activitate mitocondrial (metabolism energetic, mbtrnire celular, apoptoz) indicator global pentru activitatea metabolic; modificri rapide: activri celulare; modificri lente: cretere sau moarte celular adeziune celular: ataarea la matrix, metastaze tumorale; excrescene celulare: diferenierea neuritelor influx sau eflux de Ca2+, Na+, K+ preluarea glucozei, excreia lactatului inducia expresiei genei reporter cuplat cu generarea de bioluminiscen

1.5.5. Alte reacii fenotipice Datorit unor limitri ale tehnologiilor existente actual, se nregistreaz o cretere a necesitilor pentru observaii n timp real, fr compui marcani ai proteinelor i celulelor n condiii naturale (neperturbate). Un dezavantaj major al tehnologiilor actuale este necesitatea marcrii i supraexpresiei proteinei de interes. Datorit supraexpresiei i modificrii, activitatea biochimic a proteinei i localizarea sa pot s nu reflecte condiiile naturale (neperturbate) i de aceea rezultatele trebuie interpretate cu precauie. O tehnologie care se adreseaz acestei probleme utilizeaz unde de radiofrecven [Hefti, Kumar, 1999] pentru a proba statusul fiziologic al unei proteine n contextul celulei c ntreg. MCS utilizeaz microunde, care corespund frecvenei naturale a dinamicii proteice, permind msurarea proprietilor electrodinamice ale proteinelor i celulelor. MCS nu permite utilizarea niciunor
47

adaosuri sau markeri i poate fi realizat n orice mediu, de la soluii apoase simple la mixturi foarte complexe (celule), permind o abordare direct pentru determinarea modificrilor n fenotipul celular (difereniere). Proteinele izolate n soluii tampon fiziologice expuse la o serie de frecvene ale microundelor, demonstreaz dou proprieti: rspunsul spectral (semnatura proteinelor) i profilul biofizic. Prima proprietate determin un rspuns natural al fiecarei proteine ntr-un interval de frecvene. Profilul biofizic descrie modul n care o protein interacioneaz cu mediul volumul molecular, complexarea cu apa, interaciunea cu ali compui/proteine precum i modul n care se compar cu alte proteine aparinnd unor clase similare. Prin scanarea unui interval de frecvene i evaluarea diferitelor medii (condiiile de tamponare, prezena cofactorilor), aceast analiz definete o semntur multidimensional pentru fiecare protein chiar i n medii complexe (celulare). Aceasta ar putea permite dezvoltarea unor reacii cellbased prin care profilul biofizic al proteinelor int s poat fi analizat ntr-un mediu care mimeaz situaia din esuturile primare afectate de boal.

48