METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

1. Scurt istoric Metoda cromatografică a fost inițiată de botanistul rus Țvet M. ( întalnit si Tswet) care a separate pigmenți vegetali printr-o coloană umlpută cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul că inițial a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greacă). Domeniul de aplicație al cromatografiei s-a extins și s-a diversificat foarte mult, denumirea rămânâd consacrată prin folosința și sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferențială între doua faze dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat în etape, pe masură ce apăreau noi lucrări ce introduceau modificări în metodologia operațională. Cromatografia cu două faze lichide inițiată de către Martin și Synge pentru separarea aminoacizilor acetilați, obținută din distribuția acestora între o fază staționară formată din silicagel saturat cu apă și o fază mobilă constituită din cloroform în amestec cu n-butanol. Ulterior, în acest tip de analiză, au fost folosite faze staționare mai puțin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima fază constituind metoda cromatografică cu faze inversate.

1

Fracționarea cromatografică pe coloana umplută cu gel a luat mare amploare în ultimul timp. care se dezvoltă mai ales după perfecționările introduse de Stahl. Indiferent de natura chimică sau starea de agregare. 2. se deplasează prin golurile primei faze). metodă propusă de Porath și Flodin.difuzie. organice sau compuși hidrosolubili biologici. Cromatografia pe hârtie de filtru de calitate superioară. a fost inițiată de Consden. Electroforeza. Noțiuni generale Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri . sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere. care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare. atât de binecunoscuta azi este o altă metodă eficientă al cărei principiu este reprezentat de separarea particulelor încărcate relizată prin migrarea lor diferențiată în câmp electric. Cromatografia în fază gazoasă a fost descrisă prima dată de James și Martin. faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. deschizând noi domenii de aplicații ale cromatografiei. care permite abordarea analizei la scară microanalitică. 2 . Izmailov și Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subțire. fiind una dintre cele mai răspândite și mai eficace tehnici de analiză atât în cercetare cât și în industrie. Gordon și Martin.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separări de amestecuri complexe din substanțe anorganice .

practice orice produs organic putând fi separate printr-o metodă cromatografică. c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicată. d) durata analizei este redusă. În același timp însă. identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec. 3.Ca mecanism de separare. ceea ce înseamnă că necesită doar cantitate foarte mică de probă. fiind antrenat de către faza mobilă. b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse. se pot aplica și la scară preparativă. Avantajele cromatografiei ca metodă de separare: a) permite separarea. comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe. orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a căror direcție se deplasează în sens favorabil separării și eluției ( procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare) de pe suportul cromatografic. 3 . Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze. fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară. Amestecul strabate sistemul cromatografic .

comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. 1 si 2 care se gasesc în momentul initial amestecate.Principiul separării cromatografice. 4 . cum sunt: starea și natura probei de analizat. mediul de absorbție (lichid. din cauza agitatiei termice. pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. solid. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara.Principiul este ilustrat în Figura 1. ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. într-un volum restrâns. hârtie. configurația sistemelor cromatografice. etc). Moleculele celor doi compusi. Figura 1. Drept urmare. 4. Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face luând în considerare o serie de criterii. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei. etc. deci este in proces dinamic. vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana. dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente.

care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie. iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie. care sunt însa mai putin uzuale. iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice. Cromatografie de repartitie. în care fenomenul principal care sta la baza separări este adsorbtia. care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia. metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie. în care fenomenul principal este difuzia. iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. Cromatografie cu faze chimic legate. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel). fiind o combinare a acestora. De asemenea. în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face în funcție de diferența dintre coeficienții lor de repartitie între cele doua faze. Cromatografia de schimb ionic. 5 .a) În funcție de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare și după natura celor două faze. în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate. în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie. Cromatografia de bioafinitate.

gaz-lichid (GLC). De asemenea. iar una din ele să fie mobilă. și anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC). cu condiția ca ca cele două faze selecționate in prealabil să fie nemișcabile. cromatografia pe coloane capilare. • cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC).b) Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice. cromatografie planară: cromatografie în strat subțire. cromatografie pe hârtie. Schema de principiu a cromatografului 6 . c) Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic este de două tipuri: cromatografie pe coloană: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură). • • • 5. se mai întâlnește și cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) în denumirea căreia nu se face refrire la natura fazei staționare.

unde are loc separarea componentelor. Faza mobilă care se gaseste într-un rezervor de fază mobila 1 trece printr-un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului 2. Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o incintă termostatată (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să se desfășoare la o temperatură stabilită.dispozitiv de introducere a probei 4 . Aici are loc preluarea probei de către faza mobilă.Schema de principiu a cromatografului este prezentată în Figura 2.dispozitiv de reglare și măsurare a debitului 3 . Schema de principiu a cromatografului 7 . apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3.înregistrator sau integrator Figura 2.rezervor faza mobilă 2 . unde fiecare componentă este pusă în evidență sub forma unui semnal distinct. 1 . Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor. Componentele separate ajung în detectorul 5.coloana cromatografică 5 . proba fiind în continuare transportată prin coloana cromatografică 4.detector 6 .

Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic.Diagrama care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă. cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza. În cazul cromatografiei planare. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. Un exemplu de cromatogrampă este data în Figura 3. iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. Figura 3. 8 . iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective.

pentru a evita împiedicările sterice de legare a substanței la ligandul L.S) este interpus între matrice și ligand. și împachetarea acestui suport într-un strat cromatografic. suport solid. Principiul cromatografiei de afinitate are la bază atașarea covalentă a ligandului la suportul insolubil. Brațul de spațiere (spacer . Ligandul poate fi substrat. între antigen și anticorp etc. fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. cum ar fi: matrice. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport. Matricea este un suport solid insolubil. proteina este apoi eluată. Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare. Ligandul (L) este o substanță reactivă care se leagă covalent la matrice direct sau indirect și poate recunoaște si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent. secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). Gruparea conector (C) este o grupare implicată în reacțiile de cuplare: matrice-ligand. din care este efectuata o coloana. cofactor (pentru enzime). o singură moleculă. matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand. matrice-spacer-ligand. antigene (pentru anticorpi). suport insolubil. inhibitor. teoretic.6. peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii conținuți în coloană. adică matricea. moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. fie prin modificarea conditiilor din coloană (modificarea pH-ului sau concentratiei saline). inhibitor. gel. ce prezintă o serie de grupări care pot stabili o serie de legături de tip covalent (M). coenzimă și chiar enzimă sau altă proteină cu funcție biologică. 9 . Exemple de liganzi în funcție de substanța de purificat: substrat. Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se atașează covalent o specie reactivă există mai mulți termeni care îl definesc. Între ligand și moleculă există interacții de tipul celor existente între enzimă și inhibitor.

• procedee de separare: celule. organite celulare și virusuri. acizilor nucleici. dacă un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloană. pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. peptide marcate pentru afinitate. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereținute. drept pentru care aplicațiile acestui tip de cromatografie la purificarea și separarea macromoleculelor de interes biologic sunt. studii cinetice și a unor mecanisme de legare. nelimitate. proteine mutant. proteine de transport. proteine receptor. Proteina absorbită specific poate fi ulterior eluată prin modificarea compoziției solventului. izoenzime. proteine de legare. virusuri. 10 . determinarea constantelor de disociere și de echilibru. cofactorilor și proteinelor implicate în diferite procese de recunoaștere biologică. teoretic. pot fi selectați adsorbanți specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor. proteine represor. Utilizări ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicată dacă o interacție specifică poate fi stabilită între două tipuri de biomolecule.Ca exemplu. Tehnica poate fi utilizată pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare. • • • concentrarea de soluții proteice diluate. anticorpi. proteine denaturate și modificate chimic. Ca și aplicații practice ale cromatografiei de afinitate: • purificarea unor proteine cum ar fi: enzime. numai acea proteină care manifestă o bioafinitate pentru ligand va fi reținută. acizi nucleici și nucleotide complementare. precum celule. În acest fel.

2. izolându-se o fracție a populației celulare. În acest mod. 1996. Iga. Academia Română. DEX. 2009..Alexandru Rosetti”. Dicționarul explicativ al limbii române. disocierea interacțiilor celulă-ligand. Metode cromatografice de separare și analiză. Peter Francisc. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan . Separările de celule se realizează pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lăsa între acestea spații largi ce permit trecerea celulelor. Chimie bioorganică. ediția a III-a. Astfel. Universitatea din 11 . Editura Universității din București. D. Editura Univers Enciclopedic. 3.Ca și aplicație practică. stabilindu-se interacții reversibile biospecifice între suportul de afinitate și un component (ligandul) de pe suprafața unui tip de celule. celulele care au la suprafață ligandul sunt adsorbite. Timișoara. BIBLIOGRAFIE: 1. care apoi este supusă cromatografiei de afinitate. astfel având loc prin modificarea condițiilor cromatografice. cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metodă de separare a celulelor in subpopulații pe baza proprietăților lor de suprafață. celălalt tip de celule fiind eluate liber.P. 2005. inițial se realizează o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mărimea sau densitatea celulară.

Jercan Elena. Editura Academiei Republicii Socialiste România. 5.com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. Jercan Elena. 1982. Editura tehnică. 6. Metode de separare în chimia analitică.scribd. București. 1987 12 . București. Analize biochimice speciale. 1983. Analiza cromatografică. 7. http://www.4. Dana Iordachescu. București.