METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

1. Scurt istoric Metoda cromatografică a fost inițiată de botanistul rus Țvet M. ( întalnit si Tswet) care a separate pigmenți vegetali printr-o coloană umlpută cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul că inițial a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greacă). Domeniul de aplicație al cromatografiei s-a extins și s-a diversificat foarte mult, denumirea rămânâd consacrată prin folosința și sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferențială între doua faze dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat în etape, pe masură ce apăreau noi lucrări ce introduceau modificări în metodologia operațională. Cromatografia cu două faze lichide inițiată de către Martin și Synge pentru separarea aminoacizilor acetilați, obținută din distribuția acestora între o fază staționară formată din silicagel saturat cu apă și o fază mobilă constituită din cloroform în amestec cu n-butanol. Ulterior, în acest tip de analiză, au fost folosite faze staționare mai puțin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima fază constituind metoda cromatografică cu faze inversate.

1

care permite abordarea analizei la scară microanalitică. care se dezvoltă mai ales după perfecționările introduse de Stahl. deschizând noi domenii de aplicații ale cromatografiei. fiind una dintre cele mai răspândite și mai eficace tehnici de analiză atât în cercetare cât și în industrie. Cromatografia în fază gazoasă a fost descrisă prima dată de James și Martin. Cromatografia pe hârtie de filtru de calitate superioară. atât de binecunoscuta azi este o altă metodă eficientă al cărei principiu este reprezentat de separarea particulelor încărcate relizată prin migrarea lor diferențiată în câmp electric. care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare. organice sau compuși hidrosolubili biologici.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separări de amestecuri complexe din substanțe anorganice .difuzie. Fracționarea cromatografică pe coloana umplută cu gel a luat mare amploare în ultimul timp. 2. Noțiuni generale Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri . metodă propusă de Porath și Flodin. faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. se deplasează prin golurile primei faze). Electroforeza. Gordon și Martin. Indiferent de natura chimică sau starea de agregare. 2 . Izmailov și Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subțire. sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere. a fost inițiată de Consden.

b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse. Amestecul strabate sistemul cromatografic . identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec. În același timp însă. comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe. fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Avantajele cromatografiei ca metodă de separare: a) permite separarea. ceea ce înseamnă că necesită doar cantitate foarte mică de probă. 3 . 3. Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze. c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicată. fiind antrenat de către faza mobilă. se pot aplica și la scară preparativă.Ca mecanism de separare. d) durata analizei este redusă. practice orice produs organic putând fi separate printr-o metodă cromatografică. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară. orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a căror direcție se deplasează în sens favorabil separării și eluției ( procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare) de pe suportul cromatografic.

pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare.Principiul separării cromatografice. Moleculele celor doi compusi. din cauza agitatiei termice. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana. configurația sistemelor cromatografice. 1 si 2 care se gasesc în momentul initial amestecate. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara. 4 . Drept urmare. dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente. cum sunt: starea și natura probei de analizat. hârtie.Principiul este ilustrat în Figura 1. Figura 1. deci este in proces dinamic. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei. vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers. 4. Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face luând în considerare o serie de criterii. mediul de absorbție (lichid. într-un volum restrâns. comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. solid. etc). etc. ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza.

care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia. Cromatografia de bioafinitate. iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. fiind o combinare a acestora. metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie. în care fenomenul principal care sta la baza separări este adsorbtia. în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate. care sunt însa mai putin uzuale. Cromatografie cu faze chimic legate. iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel). în care fenomenul principal este difuzia. 5 . în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie. Cromatografie de repartitie.a) În funcție de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare și după natura celor două faze. iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice. constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face în funcție de diferența dintre coeficienții lor de repartitie între cele doua faze. De asemenea. care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie. Cromatografia de schimb ionic.

se mai întâlnește și cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) în denumirea căreia nu se face refrire la natura fazei staționare. Schema de principiu a cromatografului 6 . cromatografie planară: cromatografie în strat subțire. cromatografia pe coloane capilare. cu condiția ca ca cele două faze selecționate in prealabil să fie nemișcabile. De asemenea.b) Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice. și anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC). • • • 5. • cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC). iar una din ele să fie mobilă. cromatografie pe hârtie. gaz-lichid (GLC). c) Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic este de două tipuri: cromatografie pe coloană: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură).

înregistrator sau integrator Figura 2.coloana cromatografică 5 . Componentele separate ajung în detectorul 5. Faza mobilă care se gaseste într-un rezervor de fază mobila 1 trece printr-un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului 2.dispozitiv de reglare și măsurare a debitului 3 . 1 .rezervor faza mobilă 2 . proba fiind în continuare transportată prin coloana cromatografică 4. Schema de principiu a cromatografului 7 . Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o incintă termostatată (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să se desfășoare la o temperatură stabilită. unde fiecare componentă este pusă în evidență sub forma unui semnal distinct. Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor.detector 6 . unde are loc separarea componentelor. Aici are loc preluarea probei de către faza mobilă.Schema de principiu a cromatografului este prezentată în Figura 2. apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3.dispozitiv de introducere a probei 4 .

8 . cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza. Un exemplu de cromatogrampă este data în Figura 3. iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. În cazul cromatografiei planare. Figura 3. iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi.Diagrama care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă. Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata.

proteina este apoi eluată. o singură moleculă. matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand. moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. Matricea este un suport solid insolubil. adică matricea. Între ligand și moleculă există interacții de tipul celor existente între enzimă și inhibitor. Principiul cromatografiei de afinitate are la bază atașarea covalentă a ligandului la suportul insolubil. Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se atașează covalent o specie reactivă există mai mulți termeni care îl definesc. Exemple de liganzi în funcție de substanța de purificat: substrat. între antigen și anticorp etc. secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). cofactor (pentru enzime). antigene (pentru anticorpi).S) este interpus între matrice și ligand. din care este efectuata o coloana. cum ar fi: matrice. Ligandul poate fi substrat. fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. coenzimă și chiar enzimă sau altă proteină cu funcție biologică. inhibitor. ce prezintă o serie de grupări care pot stabili o serie de legături de tip covalent (M). Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare. Gruparea conector (C) este o grupare implicată în reacțiile de cuplare: matrice-ligand. pentru a evita împiedicările sterice de legare a substanței la ligandul L. inhibitor. Ligandul (L) este o substanță reactivă care se leagă covalent la matrice direct sau indirect și poate recunoaște si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport. peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii conținuți în coloană. suport insolubil. fie prin modificarea conditiilor din coloană (modificarea pH-ului sau concentratiei saline). Brațul de spațiere (spacer . gel. teoretic. matrice-spacer-ligand.6. suport solid. 9 . și împachetarea acestui suport într-un strat cromatografic.

determinarea constantelor de disociere și de echilibru. acizilor nucleici. proteine de legare. Proteina absorbită specific poate fi ulterior eluată prin modificarea compoziției solventului. pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. organite celulare și virusuri. studii cinetice și a unor mecanisme de legare. dacă un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloană. teoretic. proteine receptor.Ca exemplu. Utilizări ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicată dacă o interacție specifică poate fi stabilită între două tipuri de biomolecule. Tehnica poate fi utilizată pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereținute. cofactorilor și proteinelor implicate în diferite procese de recunoaștere biologică. proteine mutant. proteine de transport. pot fi selectați adsorbanți specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor. nelimitate. acizi nucleici și nucleotide complementare. numai acea proteină care manifestă o bioafinitate pentru ligand va fi reținută. proteine represor. drept pentru care aplicațiile acestui tip de cromatografie la purificarea și separarea macromoleculelor de interes biologic sunt. anticorpi. • procedee de separare: celule. proteine denaturate și modificate chimic. Ca și aplicații practice ale cromatografiei de afinitate: • purificarea unor proteine cum ar fi: enzime. peptide marcate pentru afinitate. precum celule. virusuri. • • • concentrarea de soluții proteice diluate. 10 . izoenzime. În acest fel.

Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um. izolându-se o fracție a populației celulare. care apoi este supusă cromatografiei de afinitate. cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metodă de separare a celulelor in subpopulații pe baza proprietăților lor de suprafață. BIBLIOGRAFIE: 1. ediția a III-a. Dicționarul explicativ al limbii române. disocierea interacțiilor celulă-ligand. Separările de celule se realizează pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lăsa între acestea spații largi ce permit trecerea celulelor.Ca și aplicație practică. Editura Univers Enciclopedic. Iga. astfel având loc prin modificarea condițiilor cromatografice. Metode cromatografice de separare și analiză. celulele care au la suprafață ligandul sunt adsorbite. Peter Francisc. Editura Universității din București.Alexandru Rosetti”. stabilindu-se interacții reversibile biospecifice între suportul de afinitate și un component (ligandul) de pe suprafața unui tip de celule. 3. 1996. Chimie bioorganică. În acest mod. D. Academia Română. DEX. 2005. Astfel. celălalt tip de celule fiind eluate liber.P. Universitatea din 11 . 2. Timișoara.. inițial se realizează o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mărimea sau densitatea celulară. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan . 2009.

1987 12 .com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. Metode de separare în chimia analitică. 1983. http://www. Editura tehnică. Dana Iordachescu. Jercan Elena. București.scribd. Jercan Elena. Analize biochimice speciale.4. București. 6. 1982. 7. 5. Analiza cromatografică. București. Editura Academiei Republicii Socialiste România.