METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

1. Scurt istoric Metoda cromatografică a fost inițiată de botanistul rus Țvet M. ( întalnit si Tswet) care a separate pigmenți vegetali printr-o coloană umlpută cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul că inițial a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greacă). Domeniul de aplicație al cromatografiei s-a extins și s-a diversificat foarte mult, denumirea rămânâd consacrată prin folosința și sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferențială între doua faze dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat în etape, pe masură ce apăreau noi lucrări ce introduceau modificări în metodologia operațională. Cromatografia cu două faze lichide inițiată de către Martin și Synge pentru separarea aminoacizilor acetilați, obținută din distribuția acestora între o fază staționară formată din silicagel saturat cu apă și o fază mobilă constituită din cloroform în amestec cu n-butanol. Ulterior, în acest tip de analiză, au fost folosite faze staționare mai puțin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima fază constituind metoda cromatografică cu faze inversate.

1

Indiferent de natura chimică sau starea de agregare. a fost inițiată de Consden.difuzie. se deplasează prin golurile primei faze). fiind una dintre cele mai răspândite și mai eficace tehnici de analiză atât în cercetare cât și în industrie. atât de binecunoscuta azi este o altă metodă eficientă al cărei principiu este reprezentat de separarea particulelor încărcate relizată prin migrarea lor diferențiată în câmp electric. Cromatografia pe hârtie de filtru de calitate superioară. faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere. Izmailov și Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subțire. metodă propusă de Porath și Flodin. Noțiuni generale Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri . Gordon și Martin. Fracționarea cromatografică pe coloana umplută cu gel a luat mare amploare în ultimul timp. Electroforeza. Cromatografia în fază gazoasă a fost descrisă prima dată de James și Martin. care se dezvoltă mai ales după perfecționările introduse de Stahl. 2. care permite abordarea analizei la scară microanalitică. 2 . organice sau compuși hidrosolubili biologici. care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separări de amestecuri complexe din substanțe anorganice . deschizând noi domenii de aplicații ale cromatografiei.

Ca mecanism de separare. identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec. b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse. d) durata analizei este redusă. se pot aplica și la scară preparativă. În același timp însă. Avantajele cromatografiei ca metodă de separare: a) permite separarea. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară. orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a căror direcție se deplasează în sens favorabil separării și eluției ( procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare) de pe suportul cromatografic. fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. practice orice produs organic putând fi separate printr-o metodă cromatografică. Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze. fiind antrenat de către faza mobilă. 3 . c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicată. Amestecul strabate sistemul cromatografic . 3. comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe. ceea ce înseamnă că necesită doar cantitate foarte mică de probă.

Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara. solid. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana.Principiul separării cromatografice. Figura 1. mediul de absorbție (lichid. Moleculele celor doi compusi.Principiul este ilustrat în Figura 1. 4 . pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. configurația sistemelor cromatografice. deci este in proces dinamic. dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente. într-un volum restrâns. cum sunt: starea și natura probei de analizat. etc. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei. vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers. 1 si 2 care se gasesc în momentul initial amestecate. etc). comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. din cauza agitatiei termice. 4. Drept urmare. Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face luând în considerare o serie de criterii. hârtie.

în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face în funcție de diferența dintre coeficienții lor de repartitie între cele doua faze. De asemenea. iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice. în care fenomenul principal care sta la baza separări este adsorbtia. Cromatografia de schimb ionic. Cromatografie cu faze chimic legate. în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie. constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie. fiind o combinare a acestora. în care fenomenul principal este difuzia. care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia. Cromatografia de bioafinitate. Cromatografie de repartitie. metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie. care sunt însa mai putin uzuale. 5 . iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie.a) În funcție de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare și după natura celor două faze. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel). în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate.

• cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC). cromatografie pe hârtie. cromatografia pe coloane capilare. De asemenea. c) Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic este de două tipuri: cromatografie pe coloană: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură). Schema de principiu a cromatografului 6 . cromatografie planară: cromatografie în strat subțire. și anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC).b) Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice. se mai întâlnește și cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) în denumirea căreia nu se face refrire la natura fazei staționare. iar una din ele să fie mobilă. • • • 5. cu condiția ca ca cele două faze selecționate in prealabil să fie nemișcabile. gaz-lichid (GLC).

Schema de principiu a cromatografului 7 .Schema de principiu a cromatografului este prezentată în Figura 2.înregistrator sau integrator Figura 2. Aici are loc preluarea probei de către faza mobilă. Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o incintă termostatată (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să se desfășoare la o temperatură stabilită. proba fiind în continuare transportată prin coloana cromatografică 4. Componentele separate ajung în detectorul 5. apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3. 1 .dispozitiv de introducere a probei 4 . unde fiecare componentă este pusă în evidență sub forma unui semnal distinct.rezervor faza mobilă 2 .detector 6 .coloana cromatografică 5 . Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor. unde are loc separarea componentelor. Faza mobilă care se gaseste într-un rezervor de fază mobila 1 trece printr-un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului 2.dispozitiv de reglare și măsurare a debitului 3 .

iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatogrampă este data în Figura 3. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic. În cazul cromatografiei planare. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata. 8 . Figura 3.Diagrama care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă. Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza. iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective.

ce prezintă o serie de grupări care pot stabili o serie de legături de tip covalent (M). 9 . Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport.S) este interpus între matrice și ligand. suport insolubil. între antigen și anticorp etc. din care este efectuata o coloana. coenzimă și chiar enzimă sau altă proteină cu funcție biologică. fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. cofactor (pentru enzime). pentru a evita împiedicările sterice de legare a substanței la ligandul L. Ligandul poate fi substrat. Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare. proteina este apoi eluată. teoretic. Matricea este un suport solid insolubil. și împachetarea acestui suport într-un strat cromatografic. secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). inhibitor. inhibitor. matrice-spacer-ligand. fie prin modificarea conditiilor din coloană (modificarea pH-ului sau concentratiei saline). Între ligand și moleculă există interacții de tipul celor existente între enzimă și inhibitor. matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand. Brațul de spațiere (spacer . antigene (pentru anticorpi). Gruparea conector (C) este o grupare implicată în reacțiile de cuplare: matrice-ligand. gel. Exemple de liganzi în funcție de substanța de purificat: substrat. adică matricea. Ligandul (L) este o substanță reactivă care se leagă covalent la matrice direct sau indirect și poate recunoaște si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent. peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii conținuți în coloană.6. Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se atașează covalent o specie reactivă există mai mulți termeni care îl definesc. cum ar fi: matrice. Principiul cromatografiei de afinitate are la bază atașarea covalentă a ligandului la suportul insolubil. moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. suport solid. o singură moleculă.

proteine denaturate și modificate chimic. izoenzime.Ca exemplu. organite celulare și virusuri. numai acea proteină care manifestă o bioafinitate pentru ligand va fi reținută. proteine de transport. proteine mutant. virusuri. teoretic. • • • concentrarea de soluții proteice diluate. proteine represor. nelimitate. acizilor nucleici. studii cinetice și a unor mecanisme de legare. proteine receptor. anticorpi. dacă un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloană. Proteina absorbită specific poate fi ulterior eluată prin modificarea compoziției solventului. 10 . peptide marcate pentru afinitate. determinarea constantelor de disociere și de echilibru. Tehnica poate fi utilizată pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereținute. pot fi selectați adsorbanți specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor. În acest fel. cofactorilor și proteinelor implicate în diferite procese de recunoaștere biologică. drept pentru care aplicațiile acestui tip de cromatografie la purificarea și separarea macromoleculelor de interes biologic sunt. acizi nucleici și nucleotide complementare. proteine de legare. precum celule. • procedee de separare: celule. Utilizări ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicată dacă o interacție specifică poate fi stabilită între două tipuri de biomolecule. pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. Ca și aplicații practice ale cromatografiei de afinitate: • purificarea unor proteine cum ar fi: enzime.

2009. DEX.Ca și aplicație practică. BIBLIOGRAFIE: 1. Separările de celule se realizează pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lăsa între acestea spații largi ce permit trecerea celulelor. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan . Astfel. 2.Alexandru Rosetti”. 3. În acest mod.P. Dicționarul explicativ al limbii române. Peter Francisc. Editura Univers Enciclopedic. Academia Română. cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metodă de separare a celulelor in subpopulații pe baza proprietăților lor de suprafață. disocierea interacțiilor celulă-ligand. Metode cromatografice de separare și analiză. celălalt tip de celule fiind eluate liber. Timișoara. celulele care au la suprafață ligandul sunt adsorbite. Iga. D. Universitatea din 11 . 1996. stabilindu-se interacții reversibile biospecifice între suportul de afinitate și un component (ligandul) de pe suprafața unui tip de celule. Editura Universității din București. ediția a III-a. care apoi este supusă cromatografiei de afinitate. Chimie bioorganică. astfel având loc prin modificarea condițiilor cromatografice. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um. 2005. inițial se realizează o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mărimea sau densitatea celulară.. izolându-se o fracție a populației celulare.

1982. http://www. Metode de separare în chimia analitică. 7. 1983. Analize biochimice speciale. Analiza cromatografică. Jercan Elena. Jercan Elena. 6. 1987 12 . Dana Iordachescu. București. Editura tehnică.com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. 5. București.4. Editura Academiei Republicii Socialiste România.scribd. București.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful