Metode Cromatografice de Separare Si Analiza

METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

1. Scurt istoric Metoda cromatografică a fost inițiată de botanistul rus Țvet M. ( întalnit si Tswet) care a separate pigmenți vegetali printr-o coloană umlpută cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul că inițial a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greacă). Domeniul de aplicație al cromatografiei s-a extins și s-a diversificat foarte mult, denumirea rămânâd consacrată prin folosința și sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferențială între doua faze dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat în etape, pe masură ce apăreau noi lucrări ce introduceau modificări în metodologia operațională. Cromatografia cu două faze lichide inițiată de către Martin și Synge pentru separarea aminoacizilor acetilați, obținută din distribuția acestora între o fază staționară formată din silicagel saturat cu apă și o fază mobilă constituită din cloroform în amestec cu n-butanol. Ulterior, în acest tip de analiză, au fost folosite faze staționare mai puțin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima fază constituind metoda cromatografică cu faze inversate.

1

care se dezvoltă mai ales după perfecționările introduse de Stahl. organice sau compuși hidrosolubili biologici. Cromatografia în fază gazoasă a fost descrisă prima dată de James și Martin.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separări de amestecuri complexe din substanțe anorganice . Indiferent de natura chimică sau starea de agregare. atât de binecunoscuta azi este o altă metodă eficientă al cărei principiu este reprezentat de separarea particulelor încărcate relizată prin migrarea lor diferențiată în câmp electric. Electroforeza. se deplasează prin golurile primei faze). Fracționarea cromatografică pe coloana umplută cu gel a luat mare amploare în ultimul timp. Gordon și Martin. care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare. sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere. metodă propusă de Porath și Flodin. deschizând noi domenii de aplicații ale cromatografiei. faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. a fost inițiată de Consden. 2. fiind una dintre cele mai răspândite și mai eficace tehnici de analiză atât în cercetare cât și în industrie. Cromatografia pe hârtie de filtru de calitate superioară. Izmailov și Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subțire.difuzie. care permite abordarea analizei la scară microanalitică. Noțiuni generale Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri . 2 .

Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze. fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Avantajele cromatografiei ca metodă de separare: a) permite separarea. 3. d) durata analizei este redusă. 3 . c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicată. ceea ce înseamnă că necesită doar cantitate foarte mică de probă. fiind antrenat de către faza mobilă. În același timp însă. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară. se pot aplica și la scară preparativă.Ca mecanism de separare. orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a căror direcție se deplasează în sens favorabil separării și eluției ( procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare) de pe suportul cromatografic. identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec. b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse. comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe. practice orice produs organic putând fi separate printr-o metodă cromatografică. Amestecul strabate sistemul cromatografic .

Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face luând în considerare o serie de criterii. solid. deci este in proces dinamic. Figura 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana. etc).Principiul este ilustrat în Figura 1. Moleculele celor doi compusi. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara. hârtie. vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers. comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente.Principiul separării cromatografice. din cauza agitatiei termice. 1 si 2 care se gasesc în momentul initial amestecate. cum sunt: starea și natura probei de analizat. ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei. mediul de absorbție (lichid. Drept urmare. 4. pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. 4 . configurația sistemelor cromatografice. într-un volum restrâns. etc.

Cromatografia de schimb ionic. iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie. Cromatografia de bioafinitate.a) În funcție de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare și după natura celor două faze. 5 . iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. Cromatografie cu faze chimic legate. iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice. care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia. în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie. în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face în funcție de diferența dintre coeficienții lor de repartitie între cele doua faze. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel). în care fenomenul principal este difuzia. în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate. metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie. De asemenea. care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie. Cromatografie de repartitie. în care fenomenul principal care sta la baza separări este adsorbtia. constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. care sunt însa mai putin uzuale. fiind o combinare a acestora.

b) Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice. se mai întâlnește și cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) în denumirea căreia nu se face refrire la natura fazei staționare. cromatografie pe hârtie. De asemenea. • cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC). cu condiția ca ca cele două faze selecționate in prealabil să fie nemișcabile. c) Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic este de două tipuri: cromatografie pe coloană: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură). Schema de principiu a cromatografului 6 . • • • 5. gaz-lichid (GLC). iar una din ele să fie mobilă. cromatografie planară: cromatografie în strat subțire. cromatografia pe coloane capilare. și anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC).

rezervor faza mobilă 2 . apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3. Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o incintă termostatată (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să se desfășoare la o temperatură stabilită. 1 .coloana cromatografică 5 . proba fiind în continuare transportată prin coloana cromatografică 4. unde are loc separarea componentelor. Aici are loc preluarea probei de către faza mobilă. Faza mobilă care se gaseste într-un rezervor de fază mobila 1 trece printr-un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului 2.Schema de principiu a cromatografului este prezentată în Figura 2.detector 6 . unde fiecare componentă este pusă în evidență sub forma unui semnal distinct.dispozitiv de reglare și măsurare a debitului 3 . Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor.dispozitiv de introducere a probei 4 .înregistrator sau integrator Figura 2. Schema de principiu a cromatografului 7 . Componentele separate ajung în detectorul 5.

cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza. În cazul cromatografiei planare. Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata.Diagrama care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă. iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatogrampă este data în Figura 3. 8 . Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic. Figura 3. iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective.

Principiul cromatografiei de afinitate are la bază atașarea covalentă a ligandului la suportul insolubil. Exemple de liganzi în funcție de substanța de purificat: substrat. proteina este apoi eluată. matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand. între antigen și anticorp etc. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport. Ligandul poate fi substrat. din care este efectuata o coloana. fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. Ligandul (L) este o substanță reactivă care se leagă covalent la matrice direct sau indirect și poate recunoaște si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent. Între ligand și moleculă există interacții de tipul celor existente între enzimă și inhibitor. fie prin modificarea conditiilor din coloană (modificarea pH-ului sau concentratiei saline). suport insolubil. coenzimă și chiar enzimă sau altă proteină cu funcție biologică. suport solid. Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se atașează covalent o specie reactivă există mai mulți termeni care îl definesc. teoretic. Gruparea conector (C) este o grupare implicată în reacțiile de cuplare: matrice-ligand. Brațul de spațiere (spacer .6. ce prezintă o serie de grupări care pot stabili o serie de legături de tip covalent (M). adică matricea. o singură moleculă. moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. Matricea este un suport solid insolubil. și împachetarea acestui suport într-un strat cromatografic. antigene (pentru anticorpi).S) este interpus între matrice și ligand. cofactor (pentru enzime). inhibitor. Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare. 9 . secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). gel. inhibitor. pentru a evita împiedicările sterice de legare a substanței la ligandul L. peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii conținuți în coloană. matrice-spacer-ligand. cum ar fi: matrice.

teoretic. dacă un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloană.Ca exemplu. determinarea constantelor de disociere și de echilibru. studii cinetice și a unor mecanisme de legare. proteine receptor. organite celulare și virusuri. virusuri. Utilizări ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicată dacă o interacție specifică poate fi stabilită între două tipuri de biomolecule. acizi nucleici și nucleotide complementare. În acest fel. izoenzime. cofactorilor și proteinelor implicate în diferite procese de recunoaștere biologică. proteine de transport. numai acea proteină care manifestă o bioafinitate pentru ligand va fi reținută. Ca și aplicații practice ale cromatografiei de afinitate: • purificarea unor proteine cum ar fi: enzime. proteine denaturate și modificate chimic. nelimitate. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereținute. proteine mutant. drept pentru care aplicațiile acestui tip de cromatografie la purificarea și separarea macromoleculelor de interes biologic sunt. proteine de legare. anticorpi. Tehnica poate fi utilizată pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare. 10 . precum celule. proteine represor. • • • concentrarea de soluții proteice diluate. pot fi selectați adsorbanți specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor. pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. peptide marcate pentru afinitate. • procedee de separare: celule. Proteina absorbită specific poate fi ulterior eluată prin modificarea compoziției solventului. acizilor nucleici.

Iga. inițial se realizează o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mărimea sau densitatea celulară. În acest mod. D. cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metodă de separare a celulelor in subpopulații pe baza proprietăților lor de suprafață. BIBLIOGRAFIE: 1. 2009.P. Separările de celule se realizează pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lăsa între acestea spații largi ce permit trecerea celulelor. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um.Ca și aplicație practică. Chimie bioorganică. Timișoara. Astfel. 1996.Alexandru Rosetti”. 3. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan . DEX. Universitatea din 11 . celălalt tip de celule fiind eluate liber.. izolându-se o fracție a populației celulare. Metode cromatografice de separare și analiză. 2005. stabilindu-se interacții reversibile biospecifice între suportul de afinitate și un component (ligandul) de pe suprafața unui tip de celule. celulele care au la suprafață ligandul sunt adsorbite. Editura Univers Enciclopedic. ediția a III-a. disocierea interacțiilor celulă-ligand. Academia Română. care apoi este supusă cromatografiei de afinitate. 2. Editura Universității din București. Peter Francisc. astfel având loc prin modificarea condițiilor cromatografice. Dicționarul explicativ al limbii române.

București. 1983. Analiza cromatografică. Analize biochimice speciale. Editura tehnică. Metode de separare în chimia analitică.4. 1987 12 .com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. 7. Editura Academiei Republicii Socialiste România. Jercan Elena.scribd. 1982. București. Dana Iordachescu. 5. 6. Jercan Elena. http://www. București.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful