P. 1
Metode Cromatografice de Separare Si Analiza

Metode Cromatografice de Separare Si Analiza

|Views: 761|Likes:
Published by cristinabuda

More info:

Published by: cristinabuda on Apr 24, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

12/17/2014

pdf

text

original

METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

1. Scurt istoric Metoda cromatografică a fost inițiată de botanistul rus Țvet M. ( întalnit si Tswet) care a separate pigmenți vegetali printr-o coloană umlpută cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul că inițial a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greacă). Domeniul de aplicație al cromatografiei s-a extins și s-a diversificat foarte mult, denumirea rămânâd consacrată prin folosința și sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferențială între doua faze dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat în etape, pe masură ce apăreau noi lucrări ce introduceau modificări în metodologia operațională. Cromatografia cu două faze lichide inițiată de către Martin și Synge pentru separarea aminoacizilor acetilați, obținută din distribuția acestora între o fază staționară formată din silicagel saturat cu apă și o fază mobilă constituită din cloroform în amestec cu n-butanol. Ulterior, în acest tip de analiză, au fost folosite faze staționare mai puțin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima fază constituind metoda cromatografică cu faze inversate.

1

atât de binecunoscuta azi este o altă metodă eficientă al cărei principiu este reprezentat de separarea particulelor încărcate relizată prin migrarea lor diferențiată în câmp electric. a fost inițiată de Consden. Cromatografia pe hârtie de filtru de calitate superioară.difuzie. care permite abordarea analizei la scară microanalitică. Cromatografia în fază gazoasă a fost descrisă prima dată de James și Martin. fiind una dintre cele mai răspândite și mai eficace tehnici de analiză atât în cercetare cât și în industrie. care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare. deschizând noi domenii de aplicații ale cromatografiei. 2 . organice sau compuși hidrosolubili biologici. Gordon și Martin. metodă propusă de Porath și Flodin. Electroforeza. Indiferent de natura chimică sau starea de agregare. faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. Noțiuni generale Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri . sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere. Fracționarea cromatografică pe coloana umplută cu gel a luat mare amploare în ultimul timp. se deplasează prin golurile primei faze). care se dezvoltă mai ales după perfecționările introduse de Stahl. Izmailov și Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subțire.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separări de amestecuri complexe din substanțe anorganice . 2.

se pot aplica și la scară preparativă. identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec. Amestecul strabate sistemul cromatografic . Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze. c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicată. orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a căror direcție se deplasează în sens favorabil separării și eluției ( procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare) de pe suportul cromatografic. 3. comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe. 3 . Avantajele cromatografiei ca metodă de separare: a) permite separarea. fiind antrenat de către faza mobilă. ceea ce înseamnă că necesită doar cantitate foarte mică de probă.Ca mecanism de separare. În același timp însă. b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse. practice orice produs organic putând fi separate printr-o metodă cromatografică. d) durata analizei este redusă. fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară.

Drept urmare.Principiul separării cromatografice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara. 4 . 4.Principiul este ilustrat în Figura 1. Figura 1. deci este in proces dinamic. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei. hârtie. Moleculele celor doi compusi. cum sunt: starea și natura probei de analizat. etc). configurația sistemelor cromatografice. vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers. comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. etc. într-un volum restrâns. 1 si 2 care se gasesc în momentul initial amestecate. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana. dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente. ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. solid. din cauza agitatiei termice. Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face luând în considerare o serie de criterii. mediul de absorbție (lichid.

a) În funcție de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare și după natura celor două faze. constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. în care fenomenul principal care sta la baza separări este adsorbtia. Cromatografia de bioafinitate. în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie. care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel). care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie. De asemenea. iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice. Cromatografie de repartitie. în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face în funcție de diferența dintre coeficienții lor de repartitie între cele doua faze. Cromatografie cu faze chimic legate. Cromatografia de schimb ionic. iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie. iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. 5 . în care fenomenul principal este difuzia. în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate. care sunt însa mai putin uzuale. fiind o combinare a acestora. metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie.

b) Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice. cromatografie planară: cromatografie în strat subțire. c) Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic este de două tipuri: cromatografie pe coloană: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură). gaz-lichid (GLC). și anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC). • • • 5. • cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC). cromatografia pe coloane capilare. se mai întâlnește și cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) în denumirea căreia nu se face refrire la natura fazei staționare. Schema de principiu a cromatografului 6 . cromatografie pe hârtie. cu condiția ca ca cele două faze selecționate in prealabil să fie nemișcabile. iar una din ele să fie mobilă. De asemenea.

detector 6 . unde fiecare componentă este pusă în evidență sub forma unui semnal distinct. Componentele separate ajung în detectorul 5. Aici are loc preluarea probei de către faza mobilă. Schema de principiu a cromatografului 7 .rezervor faza mobilă 2 . 1 . Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o incintă termostatată (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să se desfășoare la o temperatură stabilită. proba fiind în continuare transportată prin coloana cromatografică 4. unde are loc separarea componentelor. Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor.coloana cromatografică 5 .înregistrator sau integrator Figura 2.Schema de principiu a cromatografului este prezentată în Figura 2. apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3.dispozitiv de reglare și măsurare a debitului 3 . Faza mobilă care se gaseste într-un rezervor de fază mobila 1 trece printr-un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului 2.dispozitiv de introducere a probei 4 .

iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective. cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza. Un exemplu de cromatogrampă este data în Figura 3. În cazul cromatografiei planare.Diagrama care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă. Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. 8 . Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata. Figura 3.

Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se atașează covalent o specie reactivă există mai mulți termeni care îl definesc. Ligandul poate fi substrat. Exemple de liganzi în funcție de substanța de purificat: substrat. suport insolubil. peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii conținuți în coloană. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport. moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. cofactor (pentru enzime). gel.6. inhibitor. pentru a evita împiedicările sterice de legare a substanței la ligandul L. matrice-spacer-ligand. între antigen și anticorp etc. din care este efectuata o coloana. Gruparea conector (C) este o grupare implicată în reacțiile de cuplare: matrice-ligand. fie prin modificarea conditiilor din coloană (modificarea pH-ului sau concentratiei saline). cum ar fi: matrice. Brațul de spațiere (spacer . suport solid. teoretic. proteina este apoi eluată. inhibitor. fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. Între ligand și moleculă există interacții de tipul celor existente între enzimă și inhibitor. coenzimă și chiar enzimă sau altă proteină cu funcție biologică. 9 . ce prezintă o serie de grupări care pot stabili o serie de legături de tip covalent (M). secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare. Matricea este un suport solid insolubil.S) este interpus între matrice și ligand. și împachetarea acestui suport într-un strat cromatografic. antigene (pentru anticorpi). adică matricea. Principiul cromatografiei de afinitate are la bază atașarea covalentă a ligandului la suportul insolubil. Ligandul (L) este o substanță reactivă care se leagă covalent la matrice direct sau indirect și poate recunoaște si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent. matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand. o singură moleculă.

determinarea constantelor de disociere și de echilibru. • procedee de separare: celule. peptide marcate pentru afinitate. teoretic. Ca și aplicații practice ale cromatografiei de afinitate: • purificarea unor proteine cum ar fi: enzime. proteine receptor. proteine de transport. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereținute. În acest fel. • • • concentrarea de soluții proteice diluate. Proteina absorbită specific poate fi ulterior eluată prin modificarea compoziției solventului. numai acea proteină care manifestă o bioafinitate pentru ligand va fi reținută. proteine represor. nelimitate.Ca exemplu. dacă un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloană. virusuri. proteine mutant. anticorpi. drept pentru care aplicațiile acestui tip de cromatografie la purificarea și separarea macromoleculelor de interes biologic sunt. acizilor nucleici. precum celule. pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. proteine denaturate și modificate chimic. Tehnica poate fi utilizată pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare. organite celulare și virusuri. cofactorilor și proteinelor implicate în diferite procese de recunoaștere biologică. acizi nucleici și nucleotide complementare. proteine de legare. 10 . izoenzime. studii cinetice și a unor mecanisme de legare. Utilizări ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicată dacă o interacție specifică poate fi stabilită între două tipuri de biomolecule. pot fi selectați adsorbanți specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor.

D. Dicționarul explicativ al limbii române. stabilindu-se interacții reversibile biospecifice între suportul de afinitate și un component (ligandul) de pe suprafața unui tip de celule.Ca și aplicație practică. Chimie bioorganică. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um. izolându-se o fracție a populației celulare. disocierea interacțiilor celulă-ligand. 2009. Iga. Academia Română. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan .. Editura Universității din București. Editura Univers Enciclopedic. 2005. inițial se realizează o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mărimea sau densitatea celulară. celălalt tip de celule fiind eluate liber. Metode cromatografice de separare și analiză. astfel având loc prin modificarea condițiilor cromatografice. DEX. 3. În acest mod. Timișoara.P. care apoi este supusă cromatografiei de afinitate. 2. 1996. Separările de celule se realizează pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lăsa între acestea spații largi ce permit trecerea celulelor. cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metodă de separare a celulelor in subpopulații pe baza proprietăților lor de suprafață. celulele care au la suprafață ligandul sunt adsorbite. BIBLIOGRAFIE: 1. Universitatea din 11 .Alexandru Rosetti”. ediția a III-a. Astfel. Peter Francisc.

1982. 6.com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. București.scribd. București. Analiza cromatografică. 1983. 5. București. Jercan Elena. http://www. Editura Academiei Republicii Socialiste România. Editura tehnică. Jercan Elena. 1987 12 . Dana Iordachescu. Analize biochimice speciale. 7.4. Metode de separare în chimia analitică.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->