METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

1. Scurt istoric Metoda cromatografică a fost inițiată de botanistul rus Țvet M. ( întalnit si Tswet) care a separate pigmenți vegetali printr-o coloană umlpută cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul că inițial a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greacă). Domeniul de aplicație al cromatografiei s-a extins și s-a diversificat foarte mult, denumirea rămânâd consacrată prin folosința și sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferențială între doua faze dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat în etape, pe masură ce apăreau noi lucrări ce introduceau modificări în metodologia operațională. Cromatografia cu două faze lichide inițiată de către Martin și Synge pentru separarea aminoacizilor acetilați, obținută din distribuția acestora între o fază staționară formată din silicagel saturat cu apă și o fază mobilă constituită din cloroform în amestec cu n-butanol. Ulterior, în acest tip de analiză, au fost folosite faze staționare mai puțin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima fază constituind metoda cromatografică cu faze inversate.

1

Fracționarea cromatografică pe coloana umplută cu gel a luat mare amploare în ultimul timp. fiind una dintre cele mai răspândite și mai eficace tehnici de analiză atât în cercetare cât și în industrie. care se dezvoltă mai ales după perfecționările introduse de Stahl. deschizând noi domenii de aplicații ale cromatografiei. metodă propusă de Porath și Flodin. Izmailov și Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subțire. Noțiuni generale Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri . 2. se deplasează prin golurile primei faze). 2 . sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere. Electroforeza. Gordon și Martin. atât de binecunoscuta azi este o altă metodă eficientă al cărei principiu este reprezentat de separarea particulelor încărcate relizată prin migrarea lor diferențiată în câmp electric.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separări de amestecuri complexe din substanțe anorganice .difuzie. care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare. Cromatografia în fază gazoasă a fost descrisă prima dată de James și Martin. care permite abordarea analizei la scară microanalitică. faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. organice sau compuși hidrosolubili biologici. a fost inițiată de Consden. Indiferent de natura chimică sau starea de agregare. Cromatografia pe hârtie de filtru de calitate superioară.

3. În același timp însă. practice orice produs organic putând fi separate printr-o metodă cromatografică.Ca mecanism de separare. b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară. fiind antrenat de către faza mobilă. Amestecul strabate sistemul cromatografic . Avantajele cromatografiei ca metodă de separare: a) permite separarea. d) durata analizei este redusă. identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec. Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze. ceea ce înseamnă că necesită doar cantitate foarte mică de probă. c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicată. orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a căror direcție se deplasează în sens favorabil separării și eluției ( procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare) de pe suportul cromatografic. 3 . fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe. se pot aplica și la scară preparativă.

solid. vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers. ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. Figura 1. dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana.Principiul separării cromatografice. Moleculele celor doi compusi. Drept urmare. Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face luând în considerare o serie de criterii. mediul de absorbție (lichid.Principiul este ilustrat în Figura 1. 4. cum sunt: starea și natura probei de analizat. hârtie. comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. din cauza agitatiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara. 1 si 2 care se gasesc în momentul initial amestecate. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei. pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. configurația sistemelor cromatografice. deci este in proces dinamic. etc). într-un volum restrâns. 4 . etc.

fiind o combinare a acestora. în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie. Cromatografie de repartitie. care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie. în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face în funcție de diferența dintre coeficienții lor de repartitie între cele doua faze. De asemenea. în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate. 5 . în care fenomenul principal care sta la baza separări este adsorbtia. metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie. iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice. iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie. Cromatografia de schimb ionic. Cromatografie cu faze chimic legate. care sunt însa mai putin uzuale. iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel). constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. Cromatografia de bioafinitate. care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia.a) În funcție de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare și după natura celor două faze. în care fenomenul principal este difuzia.

gaz-lichid (GLC). cromatografie pe hârtie. De asemenea. cromatografia pe coloane capilare. cu condiția ca ca cele două faze selecționate in prealabil să fie nemișcabile.b) Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice. se mai întâlnește și cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) în denumirea căreia nu se face refrire la natura fazei staționare. iar una din ele să fie mobilă. • cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC). • • • 5. și anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC). c) Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic este de două tipuri: cromatografie pe coloană: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură). cromatografie planară: cromatografie în strat subțire. Schema de principiu a cromatografului 6 .

Faza mobilă care se gaseste într-un rezervor de fază mobila 1 trece printr-un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului 2.Schema de principiu a cromatografului este prezentată în Figura 2. proba fiind în continuare transportată prin coloana cromatografică 4.înregistrator sau integrator Figura 2.coloana cromatografică 5 .detector 6 . Schema de principiu a cromatografului 7 . Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o incintă termostatată (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să se desfășoare la o temperatură stabilită. Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor. unde fiecare componentă este pusă în evidență sub forma unui semnal distinct. Componentele separate ajung în detectorul 5.rezervor faza mobilă 2 .dispozitiv de introducere a probei 4 . 1 . unde are loc separarea componentelor. Aici are loc preluarea probei de către faza mobilă. apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3.dispozitiv de reglare și măsurare a debitului 3 .

Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. În cazul cromatografiei planare. 8 . Un exemplu de cromatogrampă este data în Figura 3. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic. Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata. cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective. iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. Figura 3.Diagrama care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă.

fie prin modificarea conditiilor din coloană (modificarea pH-ului sau concentratiei saline). gel. moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. Între ligand și moleculă există interacții de tipul celor existente între enzimă și inhibitor. o singură moleculă. inhibitor. cum ar fi: matrice. inhibitor. Ligandul poate fi substrat. din care este efectuata o coloana. matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand.6. Brațul de spațiere (spacer . și împachetarea acestui suport într-un strat cromatografic. peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii conținuți în coloană. secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici). teoretic. Gruparea conector (C) este o grupare implicată în reacțiile de cuplare: matrice-ligand. Matricea este un suport solid insolubil. pentru a evita împiedicările sterice de legare a substanței la ligandul L. cofactor (pentru enzime). între antigen și anticorp etc. adică matricea. antigene (pentru anticorpi). Exemple de liganzi în funcție de substanța de purificat: substrat. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport.S) este interpus între matrice și ligand. suport insolubil. Principiul cromatografiei de afinitate are la bază atașarea covalentă a ligandului la suportul insolubil. matrice-spacer-ligand. coenzimă și chiar enzimă sau altă proteină cu funcție biologică. Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare. 9 . Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se atașează covalent o specie reactivă există mai mulți termeni care îl definesc. fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. suport solid. proteina este apoi eluată. Ligandul (L) este o substanță reactivă care se leagă covalent la matrice direct sau indirect și poate recunoaște si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent. ce prezintă o serie de grupări care pot stabili o serie de legături de tip covalent (M).

proteine represor. cofactorilor și proteinelor implicate în diferite procese de recunoaștere biologică. precum celule. acizilor nucleici. Utilizări ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicată dacă o interacție specifică poate fi stabilită între două tipuri de biomolecule. numai acea proteină care manifestă o bioafinitate pentru ligand va fi reținută. nelimitate. proteine receptor. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereținute. proteine denaturate și modificate chimic. Tehnica poate fi utilizată pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare. În acest fel. Ca și aplicații practice ale cromatografiei de afinitate: • purificarea unor proteine cum ar fi: enzime. peptide marcate pentru afinitate.Ca exemplu. pot fi selectați adsorbanți specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor. proteine de transport. proteine de legare. anticorpi. izoenzime. teoretic. proteine mutant. dacă un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloană. virusuri. • • • concentrarea de soluții proteice diluate. studii cinetice și a unor mecanisme de legare. organite celulare și virusuri. 10 . • procedee de separare: celule. drept pentru care aplicațiile acestui tip de cromatografie la purificarea și separarea macromoleculelor de interes biologic sunt. acizi nucleici și nucleotide complementare. pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. determinarea constantelor de disociere și de echilibru. Proteina absorbită specific poate fi ulterior eluată prin modificarea compoziției solventului.

disocierea interacțiilor celulă-ligand. Editura Universității din București.Ca și aplicație practică. Astfel. Universitatea din 11 . care apoi este supusă cromatografiei de afinitate. stabilindu-se interacții reversibile biospecifice între suportul de afinitate și un component (ligandul) de pe suprafața unui tip de celule. inițial se realizează o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mărimea sau densitatea celulară. Editura Univers Enciclopedic. Academia Română. Dicționarul explicativ al limbii române. Iga.. 2009. D. 3. Separările de celule se realizează pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lăsa între acestea spații largi ce permit trecerea celulelor. În acest mod. Chimie bioorganică. BIBLIOGRAFIE: 1. Timișoara. celălalt tip de celule fiind eluate liber. izolându-se o fracție a populației celulare. cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metodă de separare a celulelor in subpopulații pe baza proprietăților lor de suprafață. astfel având loc prin modificarea condițiilor cromatografice.Alexandru Rosetti”. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um. 2. Peter Francisc. 2005. celulele care au la suprafață ligandul sunt adsorbite.P. ediția a III-a. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan . 1996. Metode cromatografice de separare și analiză. DEX.

1987 12 . Jercan Elena. 7.scribd. Dana Iordachescu. București. 1983. Analize biochimice speciale.com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. București. Editura tehnică. 6. Jercan Elena. București. 5.4. Analiza cromatografică. 1982. Editura Academiei Republicii Socialiste România. Metode de separare în chimia analitică. http://www.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful