METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

1. Scurt istoric Metoda cromatografică a fost inițiată de botanistul rus Țvet M. ( întalnit si Tswet) care a separate pigmenți vegetali printr-o coloană umlpută cu carbonat de calciu folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode, provine de la faptul că inițial a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere, in limba greacă). Domeniul de aplicație al cromatografiei s-a extins și s-a diversificat foarte mult, denumirea rămânâd consacrată prin folosința și sub raport istoric pentru toate tehnicile de separare bazate pe migrarea diferențială între doua faze dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Dezvoltarea cromatografiei s-a realizat în etape, pe masură ce apăreau noi lucrări ce introduceau modificări în metodologia operațională. Cromatografia cu două faze lichide inițiată de către Martin și Synge pentru separarea aminoacizilor acetilați, obținută din distribuția acestora între o fază staționară formată din silicagel saturat cu apă și o fază mobilă constituită din cloroform în amestec cu n-butanol. Ulterior, în acest tip de analiză, au fost folosite faze staționare mai puțin polare ca apa sau chiar nepoalre, ultima fază constituind metoda cromatografică cu faze inversate.

1

deschizând noi domenii de aplicații ale cromatografiei. fiind una dintre cele mai răspândite și mai eficace tehnici de analiză atât în cercetare cât și în industrie. Izmailov și Schraiber pun bazele cromatografiei pe strat subțire. sub denumirea de cromatografie de exzcludere pe gel sau cromatografie de excludere.difuzie. 2.Prin cromatografia cu schimb ionic s-au realizat cu succes separări de amestecuri complexe din substanțe anorganice . care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluții) cu două faze cromatografice: faza staționară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) și faza mobilă (aflată în mişcare. Fracționarea cromatografică pe coloana umplută cu gel a luat mare amploare în ultimul timp. care permite abordarea analizei la scară microanalitică. faza staționară se găsește intr-o pronunțată stare de dispersie (în stare fin divizată) pentru a oferi o suprafață de contact cât mai mare. Indiferent de natura chimică sau starea de agregare. organice sau compuși hidrosolubili biologici. metodă propusă de Porath și Flodin. Cromatografia pe hârtie de filtru de calitate superioară. atât de binecunoscuta azi este o altă metodă eficientă al cărei principiu este reprezentat de separarea particulelor încărcate relizată prin migrarea lor diferențiată în câmp electric. a fost inițiată de Consden. 2 . Noțiuni generale Cromatografia este o metodă de separare și analiză a subsanțelor chimice din amestecuri . care se dezvoltă mai ales după perfecționările introduse de Stahl. Gordon și Martin. Electroforeza. Cromatografia în fază gazoasă a fost descrisă prima dată de James și Martin. se deplasează prin golurile primei faze).

Ca mecanism de separare. Avantajele cromatografiei ca metodă de separare: a) permite separarea. practice orice produs organic putând fi separate printr-o metodă cromatografică. fiind antrenat de către faza mobilă. ceea ce înseamnă că necesită doar cantitate foarte mică de probă. 3 . b) se poate aplica unui numar foarte mare de produse. comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor complexe. Principiul cromatografiei sau al separării cromatografice Principiul cromatografiei constă în distribuția inegală a componentelor unui amestec intre faza mobilă și faza staționară. d) durata analizei este redusă. 3. În același timp însă. Distribuția inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze. se pot aplica și la scară preparativă. identificarea și dozarea cantitativă simultană a componentelor unui amestec. c) sensibilitatea metodelor cromatografice este extreme de ridicată. fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Amestecul strabate sistemul cromatografic . orice tip de cromatografie presupune stabilirea unor serii de echilibre a căror direcție se deplasează în sens favorabil separării și eluției ( procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare) de pe suportul cromatografic.

mediul de absorbție (lichid. ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. configurația sistemelor cromatografice. 4 . cum sunt: starea și natura probei de analizat. 4. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara. Figura 1.Principiul este ilustrat în Figura 1. hârtie.Principiul separării cromatografice. Moleculele celor doi compusi. comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. 1 si 2 care se gasesc în momentul initial amestecate. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei. dupa un anumit interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente. vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si invers. Drept urmare. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul deplasarii în coloana. solid. pentru un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. etc. într-un volum restrâns. Clasificarea metodelor cromatografice Clasificarea acestor metode se face luând în considerare o serie de criterii. deci este in proces dinamic. etc). din cauza agitatiei termice.

a) În funcție de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare și după natura celor două faze. constantele de disociere si diametrul efectiv al ionilor. în care fenomenul care determina separarea este extractia si separarea componentelor care se face în funcție de diferența dintre coeficienții lor de repartitie între cele doua faze. Cromatografia de schimb ionic. Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel). De asemenea. Cromatografie de repartitie. care este intermediara între cromatografia de adsorbtie si cea de repartitie. fiind o combinare a acestora. metodele cromatografice se pot clasifica astfel: Cromatografie de adsorbtie. iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice. 5 . iar separarea se face în functie de marimile efective ale moleculelor componentelor. Cromatografie cu faze chimic legate. în practica cromatografica se întâlnesc si variante intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie. care sunt însa mai putin uzuale. iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de coeficientii lor de adsorbtie. care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia. în care fenomenul principal care sta la baza separări este adsorbtia. în care fenomenul principal este difuzia. în care separarea are loc datorita unor interactiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate. Cromatografia de bioafinitate.

b) Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice. • cromatografia de lichide: lichid-lichid (LLC) lichid-solid (LSC). Schema de principiu a cromatografului 6 . • • • 5. cromatografia pe coloane capilare. cu condiția ca ca cele două faze selecționate in prealabil să fie nemișcabile. De asemenea. iar una din ele să fie mobilă. gaz-lichid (GLC). cromatografie planară: cromatografie în strat subțire. cromatografie pe hârtie. se mai întâlnește și cromatografia cu fluide supercritice ( SFC) în denumirea căreia nu se face refrire la natura fazei staționare. și anume: cromatografia de gaze : gaz-solid (GSC). c) Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic este de două tipuri: cromatografie pe coloană: cromatografie pe coloane clasice (cu umplutură).

apoi ajunge în dispozitivul pentru introducerea probei 3. unde are loc separarea componentelor.rezervor faza mobilă 2 . Aceste semnale sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de intrare al unui sistem de achizitii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor.coloana cromatografică 5 .înregistrator sau integrator Figura 2. proba fiind în continuare transportată prin coloana cromatografică 4. Schema de principiu a cromatografului 7 .dispozitiv de introducere a probei 4 . Aici are loc preluarea probei de către faza mobilă. Faza mobilă care se gaseste într-un rezervor de fază mobila 1 trece printr-un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului 2.dispozitiv de reglare și măsurare a debitului 3 . unde fiecare componentă este pusă în evidență sub forma unui semnal distinct.detector 6 . Componentele separate ajung în detectorul 5. Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o incintă termostatată (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să se desfășoare la o temperatură stabilită. 1 .Schema de principiu a cromatografului este prezentată în Figura 2.

8 . iar componentele sunt evidențiate sub forma unor spoturi. Ea este înregistrată în general ca o funcție a intensității semnalului detectorului în raport cu timpul. cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza. Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic cromatografic. Figura 3.Diagrama care reprezintă rezultatul analizei cromatografice se numește cromatogramă. Analiza cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Un exemplu de cromatogrampă este data în Figura 3. Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata. iar aria picului este proporțională cu concentrația componentei respective. În cazul cromatografiei planare.

Exemple de liganzi în funcție de substanța de purificat: substrat. inhibitor. Matricele folosite pentru cromatografia de afinitate Pentru polimerul la care se atașează covalent o specie reactivă există mai mulți termeni care îl definesc. pentru a evita împiedicările sterice de legare a substanței la ligandul L. ce prezintă o serie de grupări care pot stabili o serie de legături de tip covalent (M). moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. teoretic.S) este interpus între matrice și ligand. cum ar fi: matrice. Între ligand și moleculă există interacții de tipul celor existente între enzimă și inhibitor. peste coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii conținuți în coloană. între antigen și anticorp etc. Brațul de spațiere (spacer .6. inhibitor. o singură moleculă. suport insolubil. și împachetarea acestui suport într-un strat cromatografic. Ligandul poate fi substrat. Cromatografia de afinitate Cromatografia de afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare. matrice-grupare conector-spacer-grupare conector-ligand. Matricea este un suport solid insolubil. antigene (pentru anticorpi). suport solid. proteina este apoi eluată. din care este efectuata o coloana. Gruparea conector (C) este o grupare implicată în reacțiile de cuplare: matrice-ligand. 9 . Ligandul (L) este o substanță reactivă care se leagă covalent la matrice direct sau indirect și poate recunoaște si lega selectiv dintr-un amestec multicomponent. gel. cofactor (pentru enzime). fie prin modificarea conditiilor din coloană (modificarea pH-ului sau concentratiei saline). adică matricea. Principiul cromatografiei de afinitate are la bază atașarea covalentă a ligandului la suportul insolubil. coenzimă și chiar enzimă sau altă proteină cu funcție biologică. fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. matrice-spacer-ligand. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport. secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici).

pot fi selectați adsorbanți specifici pentru purificarea enzimelor anticorpilor. Tehnica poate fi utilizată pentru purificarea sau separarea unor structuri supramoleculare. pentru a permite disocierea de ligandul insolubilizat. Ca și aplicații practice ale cromatografiei de afinitate: • purificarea unor proteine cum ar fi: enzime. proteine denaturate și modificate chimic. drept pentru care aplicațiile acestui tip de cromatografie la purificarea și separarea macromoleculelor de interes biologic sunt. proteine mutant. 10 . teoretic. nelimitate. studii cinetice și a unor mecanisme de legare. • • • concentrarea de soluții proteice diluate. peptide marcate pentru afinitate. În acest fel. izoenzime. numai acea proteină care manifestă o bioafinitate pentru ligand va fi reținută. acizi nucleici și nucleotide complementare. • procedee de separare: celule. determinarea constantelor de disociere și de echilibru. Proteinele care nu recunosc stereochimic ligandul insolubilizat vor trece prin stratul cromatografic nereținute. proteine de transport. acizilor nucleici. dacă un amestec de mai multe proteine este aplicat pe o coloană. cofactorilor și proteinelor implicate în diferite procese de recunoaștere biologică.Ca exemplu. proteine receptor. virusuri. proteine represor. anticorpi. proteine de legare. Utilizări ale cromatografiei de afinitate Cromatografia de afinitate poate fi aplicată dacă o interacție specifică poate fi stabilită între două tipuri de biomolecule. precum celule. Proteina absorbită specific poate fi ulterior eluată prin modificarea compoziției solventului. organite celulare și virusuri.

2005. Astfel. Iga. celulele care au la suprafață ligandul sunt adsorbite. izolându-se o fracție a populației celulare. 1996. BIBLIOGRAFIE: 1. inițial se realizează o centrifugare pe baza unor parametrii fizici cum ar fi mărimea sau densitatea celulară.Alexandru Rosetti”. Timișoara.Ca și aplicație practică. astfel având loc prin modificarea condițiilor cromatografice. stabilindu-se interacții reversibile biospecifice între suportul de afinitate și un component (ligandul) de pe suprafața unui tip de celule. disocierea interacțiilor celulă-ligand. Editura Universității din București. cromatografia de afinitate s-a folosit pentru o metodă de separare a celulelor in subpopulații pe baza proprietăților lor de suprafață. Un astfel de material cromatografic este Sepharose 6 MB (macrobeads) care are perle de 250-350 um. Chimie bioorganică. Peter Francisc. care apoi este supusă cromatografiei de afinitate. Separările de celule se realizează pe un material cromatografic constituit din perle mari pentru a lăsa între acestea spații largi ce permit trecerea celulelor. 2009. Academia Română.. D.P. Metode cromatografice de separare și analiză. Universitatea din 11 . ediția a III-a. Editura Univers Enciclopedic. celălalt tip de celule fiind eluate liber. 2. Dicționarul explicativ al limbii române. 3. În acest mod. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan . DEX.

6. București. Analize biochimice speciale. Dana Iordachescu. Metode de separare în chimia analitică. Analiza cromatografică. Editura Academiei Republicii Socialiste România. http://www. Editura tehnică. Jercan Elena. 7. 1987 12 . București. 5. 1983. 1982.scribd.com/doc/23890203/Cromatografia-de-afinitate. Jercan Elena. București.4.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful