UNIVERSITATEA TEHNICA GH.

ASACHI DIN IASI FACULTATEA DE INGINERIE CHIMICA SI PROTECTIA MEDIULUI

Senzorul cu principiu de functionare pe baza fluorescentei R WT

Prof:

Conf.Dr.Ing.

Igor

Cretescu

Student: Ursan Marian Robert

Introducere si principiu de operare Rhodamina WT este un colorant rosu care este folosit adesea in studiile asupra curgerilor de apa. Cantitatea de specii in diferite puncte (orizontal si vertical ) in apa supusa examinarii este determinata prin folosirea caracteristiicii de fluorescenta a Rhodamine WT atunci cand este iradiata cu o lumina de o anumita lungime de unda si astfel senzorul YSI613 Rhodamina WT functioneaza pe acelasi principiu descris pentru senzorul 6025 pentru clorofila In ceea ce priveste clorofila , Rhodamina WT manifest fluorescenta, cand este iradiata cu o lumina de o anumita lungime de unda, si astfel emite lumina de o lungime de unda mai inalta (sau de anergie mai mica). Abilitatea Rhodaminei WT de a manifesta fluorescenta este baza de functionare a tuturor fluorometrelor comerciale capabile sa masaoare anilitic in situ ( pe loc). Fluorometrele de acest tip sunt date in folosinta de ceva timp. Aceste instrumente fac Rhodamina WT sa flouresceze prin emiterea unei raze de lumina de o lungime de unda potrivita , asupra mostrei de analizat si apoi masoara lumina, de lungime de unda inalta, care este emisa ca reszultat al procesului de fluorescenta. Majoritatea sistemelor cu Rhodamina folosesc diode de emisie luminoasa (LED) casursa pentru lumina de iradiere ce are un varf de lungime de unda de 540 nanometri. LED-urile cu aceasta caracteristica produc radiatii in spectrul vizibil cu lumina de culoare verde pentru ochi. La iradierea cu lumina verde, Rhodamina WT din apa emite lumina vizibila cu o lungime de unda mai mare decat cea a razei de excitatie , in alte cuvinte Rhodamina manifesta fluorescenta.Pentru a cuantifica aceasta fluorescenta , detectorul de sistem, este deobicei o fotodiodade mare sensibilitate ce este ecranata de un filtru optic ce restrictioneaza influenta luminii rosii.Filtrul micsoreaza(a) lumina de excitatie care este detectata atunci cand este refractata de

particulele din apa si (b) interferenta datorata altor specii fluorescente cum ar fi clorofila din fitoplancton. Fara filtru, apa tulburata sau apa cu mult fitoplancton ar parea sa contina Rhodamina WT, desi nu se afla in apa deloc. Calibrarea si efectul temperaturii Soft-ul sondei ofera optiunea unor proceduri de calibrare intrun punct, in doua puncte sau trei. Pentru majoritatea aplicatiilor, o calibrare in doua puncte la 0 si la 100 ug/L este suficienta. Cu toate acestea , pentru o acuratete maxima pe intreg intervalul 0200 ug/L a senzorului, o procedura de calibrare in trei puncte poate mari relativ( cu putin) acuratetea senzorului. Important este faptul ca nu se ofera standarde pentru Rhodamina WT, dar sugereaza un furnizor pentru standarde utilizator-productie si , mai tarziu in aceasta sectiune , furnizeaza instructiuni pentru prepararea unei solutii care este de 100 ug/L in Rhodamina WT. In timp ce efectul temperaturii asupra senzorului de Rhodamina si asupra componentelor electronice este redus, fluorescenta Rhodaminei WT se schimba semnificativ cu temperatura. Combinatia celor doi factori este luata in considerare automat de soft-ul sondei furnizand rezultate compensate in functie de temperatura. Solutia standard de Rhodamina WT Preparare si Uz Atentionare!!! Inainte folosirii unei solutii concentrate de RhodaminaWT pentru prepararea standardelor, trebuie cunoscute cu acuratete instructiunile de folosire in siguranta , furnizate de producatorul acestei substante. De retinut este faptul ca numai personalul calificat poate ar trebui sa manevreze substante chimice. Preparare

Sa se foloseasca urmatoarea procedura pentru a prepara solutia 100 ug/L care poate fi folosita pentru calibrarea senzorului de Rhodamina WT pentru uzul in teren. Trebuie cantarit cu acuratete 0,500 grame din concetratul de 20% Rhodamina, transferati cantitativ lichidul vascos intr-un balon cotat de 1000 de mL si acesta trebuie umplut pana la gradatia superioara.Aceasta solutie contine 100 mg de RhodaminaWT pe mia de mL de apa
1.

Trebuie transferat 1.0 mL din solutia preparata in treapta anterioara intrun volum de 1000 de mL si apoi se umple balonul pana la gradatia superiaora. Se amesteca bine pentru a obtine o solutie de 100 ug/L (0,10 ug/L) in apa (o dilutie de 1000:1 a solutiei concentrate).
2.

Se pastreaza solutia concentrata standard intr-o sticla inchisa la culoare in frigiderpentru a intarzia descompunerea. Solutia standard diluata, preparata in pasul anterior, ar trebui folosita in maxim 5 zile de la obtinere.
3.

Cand va mai fi nevoie de solutii standard, este de preferat sa se faca o alta dilutie a colorantului concentratdupa incalzirea acesteia la tempperatura ambientala( a camerei). Experienta noastra a aratat aceea ca solutia concentrata care a fost pastrata la o temperatura joasa este mult mai stabila decat solutia diluata pastrata la temperatura camerei.

EFECTUL TURBIDITATII RHODAMINA WT

ASUPRA

REZULTATELOR

CU

Asa cum a fost descris mai sus, filtrele din fata fotodiodei in sonda YSI 6130 de Rhodamina WT, previn ca lumina verde de la sursa de excitatie pentru moleculele de Rhodamina WT sa fie reflectata inapoi spre detector de pe particulele non-fluorescente (turbidice) in apa incojuratoare (sondei). Cu toate acestea

sistemul de filtrare nu este perfect si o interferenta minora asupra rezultatelor cu Rhodamina WTdatorita solidelor din suspensie ar putea aparea. Experimentele de laborator indica ca o suspensie de sol tipic, masurata cu un senor de turbiditate va avea o interferenta datorata turbiditatii caracterizata de un factor de aproximativ 0.03 ug/L per NTU (unitatea de turbiditate nefelometrica). De exemplu , turbiditatea apei trebuie sa fie peste 100 NTU pentru a produce un rezultat aparent de Rhodamina WT egal cu 0.3 ug/L. In apa foarte tulbure , utilizatorular putea dori sa foloseasca valoarea de turbiditate determinata independent si factorul de compensatie de mai sus pentru a corecta valorile masurate de clorofila folosind de exemplu un grafic, curba.

EFECTUL CLOROFILEI ASUPRA REZULTATELOR CU RHODAMINA WT In vreme ce LED-ul verde folosit in senzorul cu Rhodamina WT nu este ideala pentru excitarea clorofilei din fitoplancton, o cantitate de fluorescenta din clorofila din mediu va fi intotdeuan indusa de senzorul de Rhodamina. Pentru ca sistemul de filtrare pentru fotodioda cu Rhodamina , nu ese perfect, in excluderea fluorescentei produsa de clorofila, o interferenta scazuta asupra rezultatelor Rhodaminei WT datorate fitoplanctonului, ar putea rezulta. Experimentele in laborator indica faptul ca o suspensie de fitoplancton analizata cu senzorul YSI 6025 va avea o o interferenta, produsa de clorofila, caracterizata de un factor de aproximativ 0,10 ug/L Rhodamina WT per ug/L de clorofila. De exemplu , continutul de clorofila din apa trebuie sa fie peste 30 ug/L clorofila pentru a produce un rezultat aparent de 3 ug/L Rhodamina WT. In apa cu un continut mare de alge , utilizatorul ar putea dori sa foloseasca valoare de clorofila determinata

independent si factorul de corectie de mai sus pentru a masura ceorect valorile de Rhodamina folosind de exemplu un grafic.

ALGELE GALBENE ALBASTRUI CE CONTIN FICOCIANINA Introducere Algele galbene-albastrui (BGA). De asemeni cunoscute si ca cianobacterii, sunt forme obisnuite de bacterii fotosintetice prezente in majoritatea mediilor cu apa dulce si marina. BGA contin un set unic de pigmenti secundari din familia ficobiliproteinelor care servesc o varietate de functii pentru organism. Pigmentii primari ficobilinici sunt ficocianina (PC) si ficoercitina(PE) si se intampla ca ambele sa aiba semnaturi fluorescente puternice care nu interfera puternic cu fluorescenta clorofilelor. Aceasta permite detectia in vivo(pe viu) a cianobacteriilor cu interferenta minima din partea altor grupuri de alge. BGA cu pigmentul ficobilina PC pot fi gasite atat in apa dulce cat si in apa mixta, sarata in vreme ce BGA cu pigmentul ficobilina sunt de obicei gasite doar in medii mixturate (apa dulce-apa sarata) si marine. Monitorizarea BGA prezinta un interes crescut intr-un numar de domenii de cercetare si monitorizare si un interes particular avandu-l monitorizarea BGA ca factor de risc public in apa dulce si zonele de estuar. Pe masura ce rata de eutrofizare creste datorita impactului uman asupra ecosistemelor acvatice , inmultirile algelor devin o problema comuna. In cazul inmultirii BGA, unele specii pot produce toxine numite in general cianotoxine care po cauza riscuri de sanatate pentru oameni si animale. Monitorizarea in timp real a BGA prin fluorometrie poate servi ca un sistem de avertizare precoce pentru conditii potential-periculoase.In aditie la productia potential de toxine, inmultirea BGA poate duce la cauzarea unei ape neplacute la vedere, si in cazul apei potabile, un gust si miros neplacute. Aceste problema afecteaza calitatea

apei in mod negativ si diminueaza calitatea apei ca potential recreativ. Deasemeni de interes mai este si concentratia mare de celule ce cauzeaza cresterea in numarul de filtrari necesare in uzinele de epurare. Prin urmare , monitorizarea populatiei de BGA si distributia in lacuri, rezervoare si zonele de estuar, este extrem de importanta pentru cercetarile de baza , protectia resurselor si sanatatea si siguranta publica. Senzorul YSI 6131, cand este folosit impreuna cu sondele multiparametrice YSi din seria 6, este construit pentru a detecta si monitoriza prezenta BGA ce contin PC, pentru a elimina, sau macar reduce, riscurile pe care le impun la adresa sanatatii publice si a efectului lor asupra purificarii apei potabile. Determinarea BGA ca indicator a calitatii apei a fost efectuata de mult timp fie folosind (a) prelevarea probelor de BGA urmata de analiza probelor cu ajutorul fluorometriei, HPLC, ori o combinatie acelor doua tehnici sau (b) numararea automata sau manuala a celulelor de BGA intr-un volum cunoscut de apa de analiza. Desi aceste metode sunt exacte, acest tip de analize sunt pentru analize punctuale si nu pot furniza aproape niciodata un curent de date continuu cu privire la continutul de BGA. Metodele sunt costisitoare cu privire la timp si de obicei trebuie efectuate de un analist experimentat si eficient , pentru a obtine rezultate reproductibile si exacte de incredere. Cel mai miportant , aceste metode nu pot fi imprumutate pentru monitorizarea continua a BGA cu continut de PC, din vreme ce analiza unei colectii de probe prelevate la intervale de timp , rezonabile , de ex. la fiecare ora,ar fi extrem de obositoare. YSI a dezvoltat snzorul YSI 6131 pentru determinarea BGA cu continut de PC in prelevarea punctuala si in aplicatiile de monitorizare continua. Este bazata pe o metoda alternativa de masurare a BGA ce depaseste dezavantajele metodelor de laborator discrete , precizate mai sus, desi cu o potentiala pierdere in exactitate. In aceasta procedura , BGA cu continut de

PC sunt masurate in vivo (pe viu), fara distrugerea celulelor ca in procedura extractiva a analizei de laborator sau folosind tehnicile de numarare a celulelor cum au fost descrise mai sus. Senzorul YSI 6131 este construit oentru aceste aplicatii in vivo si folosirea acesteia permita colectarea facila a cantitati mari de date atat in prelevarea punctuala sau monitorizarea continua. Este important de amintit , totusi, aceea ca rezultatele analiza in vivo nu vor fi aproape sigur , exacte precum cele din procedurile certificate de numarare a celulelor sau extractia analitica. Limitele metodei in vivo sunt subliniate mai jos si ar trebui luate in considerare cu atentie inainte de efectuarea determinarilor de BGA cu sonda sau senzorul YSI. Cateva dintre sursele de eroare pot fi minimalizate prin combinarea datelor de la YSI 6131 cu datele din analiza standard de laborator a catorva probe obtinute pe parcursul unei prelevari sau studiu de monitorizare. Totusi, studiile in vivo nu vor inlocui niciodata procedurile stnadard . Mai degraba, estimarile concentratiei de BGA de la sonda usor de folosit pentru detectarea ficocianinei, YSI,sunt facute pentru a complementa rezultatele mai exacte (dar mai greu de obtinut) din metodele mai traditionale de determinare a BGA. Senzorul YSI 6131 este ideal pentru monitorizarea schimbarilor relative (temporale sau spatiale)in populatia ce contine PC.

MASURATORI ALE BGA CU UN CONTINUT DE PC IN VIVO O caracteristica cheie a BGA continand PC, este aceea ca celulele menifesta fluorescenta, atunci cand sunt iradiate cu lumina de o anumita lungime de unda, ele emit lumina de lungime de unda mai mare ( sau cu energie mai mica). Abilitatea ficocianinei de a manifesta flourescenta in vreme ce este prezenta in celule intregi , este baza dupa care functioneaza toate florimetrele comerciale capabile de analiza in vivo. Aceste

instrumente induc flourescenta ficocianinei prin folosirea unei raze de lumina de lungime de unda potrivita asupra probei, si apoi masurand lumina cu lungime de unda mai lunga ce este emisa ca rezultat a procesului de flourescenta. Sonda pentru Ficocianina YSI 6131 foloseste o dioda de emisie luminoasa (LED) pentru procesul de excitatie. La iradierea cu aceasta lumina portocalie , moleculele de ficocianina din intregul celulelor emit lumina in regiunea 600-700nm a spectrului.Pentru a cuantifica fluorescenta, sistemul de detectie esste o fotodioda de inalta sensibilitate ce este ecranata de un filtru optic ce restrictioneaza lumina detectata. Filtrul previne ca lumina de culoare portocalie folosite pentru excitatie , sa fie detectata atunci cand este reflectata ianpoi de particulele din apa. Fara filtru , apa cu turbiditate (tulbure) ar parea sa contina cantitati semnificative de BGA continand PC, desi nu ar fi fost prezente. Sistemul unic YSI 6131 BGA consta dintr-o sonda care este compatibila cu porturile optice ale sondelor din seria YSI 6. Semnalul senzorului este procesat automatic prin soft-ul sondei pentru a furniza rezultatele fie in unitati generice de fluorescenta (RFU) sau celule/mL de BGA continand PC. Ca toate sondele optice YSI, versiunea 6131 este echipata cu un stergator mecanic pentru a curata periodic interfata optica la activare manuala sau automata. Cu aceasta caracteristica, senzorul YSI 6131 poate fi folosit in apa din mediu pentru cateva saptamani fara necesitatea unor reparatii si este idealapentru furnizarea unei monitorizari continue unei potentiale popultii daunatoare de BGA continand PC.

METODE DE CALIBRARE Pentru calibrarea sondei YSI BBA-PC , doar un singur tip de standar va asigura cea mai buna acuratete posibila pentru citirile din teren: o suspensie de celule, de BGA, cunoscute ca avand

continut de PC. Concentratia de BGA a acestei suspensii ar trebui determinata fie prin numararea celulelor sau prin extractia pigmentului PC. Totusi, majoritatea utilizatorilor s-ar putea sa nu aiba culturi de BGA disponibile inaintea studiilor din teren , pentru folosirea in procedura de calibrare in 2 puncte, ce este inserata in softul de functionare a sondei si astfel cea mai buna metoda de calibrare este compusa din urmatorii pasi : 1. Inaintea de folosirea in teren , se pune senzorul in apa curata si se efectueaza calibrarea intr-un punct la 0 celule/mL. 2. Se imerseaza sonda intr-o vopsea standard (de vazut mai jos)si se inregistreaza citirea. De notat este ca nu se face calibrarea pentru citirea vopselei, ci doar verificarea valorii relative pentru sensibilitatea standard a senzorului. 3. In vreme ce se efectueaza citirile din teren (prelevare sau studii nesupravegheate), se colecteaza cateva probe punctuale si se inregistreaza data/momentul si locatia unde au fost colectate. 4. Probele din teren se colecteaza si se transporta conform metodelor standard pentru a asigura ca celulele de BGA sa nu fie distruse , sau semnificativ schimbate de la momentul colectarii. 5. La intoarcerea la laborator, se analizeaza probele punctuale pentru cantitatea de BGA continand PC, si se inregistreaza rezultatele pentru o folosire ulterioara. 6. Dupa ce studiul este complet , datele obtinute cu sonda YSI BGA-PC intr-o coloana a unui grafic si datele obtinute in laborator intr-o coloana adiacenta primei coloane pentru comparare. Se calculeaza raportul dintre datele obtinute pe teren pentru fiecare proba punctuala si apoi se efectueaza o medie pentru a produce un raport de ajustarea (sau postcalibrarea) datelor obtinute in teren in valori mai exacte.

7. Se foloseste abilitatea de calcul a foii de raport pentru a inmulti toate citirile din teren cu raportul de corectie obtinut pentru a obtine cea mai buna corectie a datelor provenite de la sonda 6131. O variatie a aceste metode este de a efectua o calibrare in doua puncte inaintea folosirii folosind apa fara particule si o vopsea standard, setand echivalentul aparent pentru BGA continand PC la valoare aratata in tabelul din sectiunea urmatoare. Totusi, trebuie atrasa atentia ca aceasta tehnica nu creste acuratetea senzorului Pc intr-o masura semnificativa fata de calibrarea simpla intr-un singur punct recomandata mai sus utilizatorul tot va trebui sa colectezeprobe puntuale si sa efectueze analiza de laborator pentru a fi sigur de valorile BGAPC. Utilitatea primara a vopselei este aceea de a verifica desensibilizarea( alunecarea spre o sensbilitate diferita datorita masuratorilor efectuate) senzorului in timpul folosirii in teren , prin reanalizarea vopselei dupa recuperarea sondei. Folosirea procedurii de calibrare cu un colorant in doua puncte ar putea face mai usoara cuantificarvalorii obtinuta la analiza colorantului si , daca este asa, ar putea fi preferabila. De tinut minte este faptul ca , totusi, nici o imbunatatire reala acuratetei senzorului nu este obtinuta prin folosirea colorantului ca si calibrant. PREPARAREA SOLUTIILOR DE VERIFICAREA DEVIERII DE SENZOR RHODAMINA WT PENTRU

ATENTIE: Inainte folosirii colutiei concentrate de Rhodamnia WT pentru a prepara standarde, trebuie sa se se asigure utilizatorii de luarea la cunostinta de instructiunile de folosirea in siguranta , a acestei substante, furnizate de producator. De amintit faptul ca numai personalul calificat ar trebui sa manevreze substantele chimice. Cand standardele de Rhodamina WT sunt necesare in viitor, se efectueaza alta dilutie a colorantului concentrat dupa incalzirea

acestuia la temperatura ambientala. Experienta noastra ne-a aratat faptul ca solutia concentrata care a fost pastrata la temperatura joasa este mult mai stabila decat solutia diluata pastrata la temperatura camerei. Este bine stiut ca intensitatea fluorescentei a mai multo coloranti arata o relatie invers proportionala cu temperatura. Efectul trebuie deasemeni luat in considerare pentru calibrarea senzorului YSI PC cu Rhodamina WT. Se introduc valorile de calibrare din tabelul de mai jos corespunzatoare temperaturii standardului. EFECTUL TURBIDITATII ASUPRA CITIRILOR BGA- PC Asa cum este descris mai sus , filtrele in fata fotodiodei in sonda de ficocianina YSI 6131 opresc aproape toata cantitatea de lumina portocalie , folosita pentru excitarea moleculelor de Rhodamina, pentru a nu ajunge la detector dupa ce este reflectata de pe particulele non-fluorescente (turbiditatea) din apa din mediu. Totusi , sistemul de filtrare nu este perfect si o interferenta minora asupra citirilor de BGA continand PC, apare datorita solidelor aflate in suspensie .Experimentele de laborator indica faptul ca senzorul YSI 6131 va avea o interferenta datorata turbiditatii caracterizata de un factor de aproximativ 21 celule/mL de BGA continand PC pe NTU de turbiditate. De exemplu la o turbiditate de 100 NTU , un afisaj cu valoare de 2100 celule /mL de BGA continand Pc, va fi citit pe deasupra citirii normale chiar datorita prezentei BGA. Utilizatoii vor putea folosi, daca doresc sa o faca, valoarea turbiditatii determinata independent si factorul de corectie amintit mai suspentru a corecta valorile de BGA continand PC cu ajutorul , de exemplu, unui grafic.

EFECTUL CLOROFILEI ASUPRA VALORILOR BGA-PC In vreme ce LED-ul portocaliu folosit in sonda de de ficocianina YSI 6131 nu este ideal pentru excitarea clorofilei in fitoplanctonul non-BGA, ptina fluorescenta de la clorofila din mediu va fi intotdeauna indusa de sonda de ficocianina. Datorita faptului ca sistemul de filtrare pentru fotodioda 6131 nu este perfect in excluderea fluorescentei de la clorofila , o interferenta minora asupra citirilor de BGA continand PC, va rezulta de la clorofila continuta de fitoplancton. Experimentele de laborator indica faptul ca o suspensie de fitoplancton din Scenedesmus quadricauda al carui continut de clorofila a fost masurat folosind un senzor YSI 6025 , va avea o interferenta datorata clorofilei caracterizata de un fator de aproximativ 77 celule/mL de BGA continand PC pe ug/L al clorofillei. De exemplu. La o valoare a clorofilei de 30 ug/L din Scenedesmus quadricauda , va fi observata o citire a BGA continand PC de 2310 celule/mL peste rezultatul normal datorita prezentei BGA.De notat , totusi, aceea ca interferentele de clorofila din partea altor specii de alge sunt predispuse sa fie semnificativ diferite de acelea folosite in test, si asa valoarea cotat de 77 celule/mL per ug/Lde clorofila este doar o aproximatie grosso modo. EFECTUL DEPUNERILOR ASUPRA CITIRILOR DE BGA PC Masuratorile optice de pe teren sunt in mod special susceptibile la murdarire, nu numai datorita adunarii dupa perioade indelungate de folosire a reziduurilor biologice si chimice, dar so deasemeni formarii pe termen scurt a bulelor din degazarea apei din mediul de analiza. Aceste bule pot fi uneori in actiunile de prelevare pe termen scurt fie prin agitare simpla a sondei sau prin activarea manuala a stergatorului. Pentru studii mai lungi da cateva ore cand utilizatorul nu este prezent la locatie , calitatea datelor PC obtinute cu un senzor pentru fluorescenta care nu are nici o capacitate de curatare mecanica , este foarte predispusa compromiterii (calitatea). Sonda YSI 6131 este echipata cu un

stergator mecanic care o face idealapentru aplicatii nesupravegheate. Stergatorul poate fi activat in timp real pe parcursul operatiunilor de prelevare, separate, sau va funtiona automatic inaintea momentului prelevarii unei probe noi pe perioada monitorizarlor pe termen lung,i nesupravegheate. Numarul de miscari ale stergatoruluisi frcventa ciclului de curatare pentru modul nesupravegheat, poate fi setat din softul sondei. In general, o singura miscare este suficienta pentru majoritatea aplicatiilor de mediu, dar in medie la depunerile abundente vor fi necesare cicluri de curatare in plus. LIMITARI ALE EXACTITATII PENTRU SENZORUL BGA PC Asa cum a fost mentionat mai sus, masurarea BGA continand PC din masuratorile de fluorescenta in vivo , va fi aproape in totdeauna mai putin exacta decat determinarile facute folosind fie numararea celulara ori cuantificarea spectrofluorimetrica a ficocianinei moleculare dupa extractia celulara. Unele di motivele acestei limitari ale exactitatii la masuratorile BGA - PC in vivo include urmatoarele: - Interferentele de la alte specii microbiologice cum ar fi fitoplanctonul cu un continut de clorofila - Interferenta de la turbiditatea probei. - Diferente intre intensitatea general a intensitatii a speciilor diferite de BGA cu un continut de PC. - Diferenta in efectul temperaturii asupra intensitatii fluorescentei a speciilor diferite de BGA cu un continut de PC. - Efectul variatiei conditiilorde luminare ambientala asupra fluorescentei BGA si diferentele in acest afect intre speciile diferite de BGA cu un continut de PC. In plus , cand sunt prezente in concentratii mari, coloniile de BGA pot fi adesea vazute cu ochiul liber si ar putea semana cu resturile maruntite de la taiat iarba, sau ar putea avea forma unor gogoloase mici neregulate ori sfere de marimea gamaliilor de bolduri. Cand BGA colonizeaza sub aceste forme , sensibilitatrea senzorului YSI in termeni de fluorescenta per celula de BGA este redusa deoarece a fost construita pentru a detecta celule care plutesc liber la nivel microscopic si nu particule plutitoare macroscopice, mari. Prin urmare senzorul este predispus sa

subestimeze cantitatea totala de BGA prezenta in apa in cazurile in care se manifesta existenta formatiunilor macroscopice. Utilizatorii ar trebui sa aiba mare grija la faptul ca aceste limitari inseamna ca orice senzor in vivo cum ar fi cei de BGA-PC sau clorofila va fi mai putin cantitativ decat orice alt senzor oferit pentru utilizarea cu sondele din seriile YSI 6 , facand imposibila redarea exacta de catre YSI a unor rezultate in celule/mL pentru sonda de ficocianina 6131. ESTIMAREA INTERVALULUI DE BGA PC IN CELULE/mL Dupa cum s-a aratat in sectiunea de mai sus, utilizarea fluorescentei ficocianinei in vivo pentru estimarea cantitatii de celule de alge cu un continut de PC, are limitari semnificative. Aceste limitari ajuta la determinarea unui interval (sau citire la scara maxima a senzorului) pentru orice senzor BGA PC mai putin decat cantitativ. Estimarea de interval de concentratie pentru senzorul 6131 este bazata pe faptul ca rezultatul la analiaza unei probe empirice de alge cu un continut de PC este cu aproximativ 40% mai putin decat un fluorimetru standard industrial produs de Turne Designs ce este configurat pentru BGA PC. In experimentul de estimare, un senzor Turner Ciclop a fost fixat la mijlocul scalei sale de determinare si apoi a fost aflata voltajul de raspuns al acesteia intr-o cultura BGA PC ( Microcystis aeruginosa). Senzorul YSI 6131 a fost plasat in aceeasi cultura si sensibilitatea acestuia a fost cu aproximativ 40 % mai putin in termeni de deviatie pe scara intreaga relativ fata de senzorul Turner aflat la jumate de scala. In vreme Turnuer Designs a atribuit intervalul mediu a senzorului la 0 200,000 celule/mL, senzorul YSI a fost estimat ca avand un interval cu aproximativ 40 % mai mult ori 280, 000 celule /mL. In mod natural, acest interval de activitate este doar o estimare pentru ambii senzori YSI si Turner, datorita limitarilor generale a masuratorilor, in vivo a flurescentei, descrise mai sus. 5.17 ALGELE FICOERITRINA Introducere GALBEN-ALBASTRUI CU UN CONTINUT DE

Algele galben-albastrui (BGA), cunoscute si ca cianobacterii, sunt forme comune de bacterii cu capacitatea de fotosinteza , prezente in majoritatea mediilor de apa dulce si marine. BGA contin unset unic de pigmenti accesibili din familia ficobiliproteinelorcare servesc unei varietati de roluri in organism. Pigmentii primari de ficobilina sunt ficocianina (PC) si ficoeritrina (PE) si se intampla ca ambele sa aiba capacitati de fluorescenta foarte puternice care nu interfera semnificativ cu fluorescenta clorofilei. Aceasta permite detectarea in vivo a BGA cu interferente minime din partea altor grupuri de alge. BGA cu un continut de pigment ficobilin PC pot fi gasite atat in apele curgatoare cat si in cele bogate in saruri, in vreme ce BGA cu pigmentul ficobilin PE se gaseste de obicei numai in apele cu saruri si cele marine. Monitorizarea BGA prezinta un interes crescut intr-un numar de domenii de cercetare si monitorizare si un interes particular il are monitorizarea BGA ca factor de risc pentru santatea si siguranta publice cat si ca producator primar in unele medii oceanice. In timp ce rata de eutroficare accelereaza datorita impactului uman asupra ecosistemelor acvatice, inmultirea periculoasa a algelor (HABs) devine o problema in devenire. In cazul inmultirii cianobacteriilor, unele specii pot produce toxine numite generic cianotoxine care pot cauza riscuri de sanatate pentru oameni si animale. Senzorul YSI 6132, cand este in functie alaturi de sondele multiparametri YSI seria 6 , este construit pentru a detecta si monitoriza prezenta BGA cu in continut de PE, pentru a furniza un sistem precoce de avertizare pentru coditii potential periculoase cat si pentru a caracteriza temeinic mediile acvatice unde BGA cu un continut de PE se afla. Determinarea BGA ca indicator a calitatii apei a fost, din punct de vedere istoric, efectuata fie folosind (a) prelevarea probelor de BGA urmata de de analiza extractului prin intermediul fluorimetriei. HLPC, sau o combinatie a doua tehnici (b) numararea automatizata sau manuala a celulelor fizice de BGA intr-un volum cunoscut de apa de analiza. In vreme ce aceste analize sunt exacte , sunt deobicei efectuate ca aprte a cercetarilor punctuale si aproape niciodata nu pot ofri un curent continuu de date cu referire la continutul de BGA. Metodele sunt

costisitoare ca durata si deobicei este nevoie de un analist eperimentat si eficient pentru a obtine date exacte in mod constant si reproductibile.Cel mai important, metodele nu pot fi imprumutate pur si simplu monitorizarii continue a BGA cu un continut de PE, in vreme ce analiza unei colectii de probe recoltate regulat , de exemplu la fiecare ora, ar fi lipsite de relevanta. YSI a dezvoltat senzorul 6132 pentru determinarea BGA cu un continut de PE in prelevarile punctuale si aplicatiile de monitorizare continua. Este bazat pe o metoda alternativa pentru masurarea BGA care in general depaseste dezavantajul metodelor separate de laborator relevate mai sus, cu toate ca exista potntialul de pierdere a a exactitatii. In aceasta procedura , BGA cu un continut de PE , masurate in conditii in vivo, in alte cuvinte, fara a distruge celulele ca in cazul procedurii de analiza extractiva in laborator sau folosind tehnici de numarare a celulelor descrise mai sus. Senzorul YSI 6132 este proiectat pentru aceste aplicatii in vivo si folosirea acestuia permite colectarea usoara a unor cantitati mari de date fie in analiza punctuala sau in aplicatii de monitorizarea continua. Este important sa amintim, totusi, ca rezultatele analizei in vivo nu vor fi la fel de exacte ca cele obtinute in procedurile certificate de analiza extractiva sau numarare a celulelor. Limitarile metodei iin vivo sunt subliniate mai jos si ar trebui considerate cu atentie inaintea efecturii masuratorilor de BGA cu sinda sau senzorul YSI. Unele dintre sursele de eroare pot fi micsorate ca influenta prin combinarea datelor de la senzorul YSI 6132 cu datele din analizele standard de laborator a catorva probe recoltate pe perioada unui studiu de prelevare sau de monitorizare.Totusi, studiile in vivonu vor inlocui niciodata procedura standard. Mai degraba , estimarile concentratiei de BGA de la sonda usor de folosit YSI PE sunt proiectate pentru complementa rezultatele mult mai exacte (dar mai greu de obtinut) de la metodele traditionale a determinarii de BGA. Denzorul YSI 6132 se potriveste ideal pentru monitorizarea schimbarilor relative (temporal sau spatial) in populatia de BGA cu un continut de PE.