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Fundamentos de

CROMATOGRAFIA

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UNIVERSIDADE ESTADUAL

DE

CAMPINAS

Reitor
JOS TADEU JORGE
Coordenador Geral da Universidade
FERNANDO FERREIRA COSTA

Conselho Editorial
Presidente
PAULO FRANCHETTI
ALCIR PCORA ANTNIO CARLOS BANNWART FABIO MAGALHES
GERALDO DI GIOVANNI JOS A. R. GONTIJO LUIZ DAVIDOVICH
LUIZ MARQUES RICARDO ANIDO

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Carol H. Collins
Gilberto L. Braga
Pierina S. Bonato
Organizao

Fundamentos de

CROMATOGRAFIA

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FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA CENTRAL DA UNICAMP
F962

Fundamentos de cromatografia / organizadores: Carol

H. Collins, Gilberto L. Braga e Pierina S. Bonato.
Campinas, SP: Editora da UNICAMP, 2006.

1. Anlise cromatogrfica. 2. Cromatografia

lquida. 3. Cromatografia de gs. I. Collins, Carol
Hollingworth. II. Braga, Gilberto Leite. III. Bonato,
Pierina Sueli. IV. Ttulo.

CDD 544.92
544.924
544.926
ISBN 85-268-0704-8
ndice para catlogo sistemtico:
1. Anlise cromatogrfica
2. Cromatografia lquida
3. Cromatografia de gs

544.92
544.924
544.926

Copyright by Organizadores
Copyright 2006 by Editora da UNICAMP

Nenhuma parte desta publicao pode ser gravada, armazenada

em sistema eletrnico, fotocopiada, reproduzida por meios mecnicos
ou outros quaisquer sem autorizao prvia do editor.

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SUMRIO

APRESENTAO................................................................................................................................

13

I PRINCPIOS BSICOS DE CROMATOGRAFIA (CAROL H. COLLINS)

1

Introduo ....................................................................................................................

17

Aspectos da histria da cromatografia ............................................................................

18

As classificaes da cromatografia...................................................................................

22

Alguns termos tcnicos ..................................................................................................

30

Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

42

II CROMATOGRAFIA EM PAPEL (GILBERTO LEITE BRAGA)

1

Introduo ....................................................................................................................

47

Definies e termos usados na cromatografia em papel ..................................................

51

Consideraes sobre a cromatografia em papel...............................................................

52

3.1 Papel .......................................................................................................................

53

3.2 Fase mvel...............................................................................................................

55

3.3 Efeitos da temperatura .............................................................................................

56

Cromatografia em papel com fase normal e com fase reversa.............................................

57

4.1 Cromatografia em papel com fase normal ................................................................

57

4.2 Cromatografia em papel com fase reversa.................................................................

57

Tcnica da cromatografia em papel ................................................................................

58

5.1 A amostra ................................................................................................................

58

5.2 Aplicao da amostra ...............................................................................................

58

Mtodos para detectar as substncias separadas ..............................................................

59

6.1 Mtodos qumicos ...................................................................................................

60

6.2 Mtodos fsicos........................................................................................................

60

6.3 Mtodos biolgicos e enzimticos............................................................................

61

Anlise qualitativa ..........................................................................................................

62

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Anlise quantitativa........................................................................................................

62

8.1 Diretamente sobre o papel .......................................................................................

62

8.2 Extrao da substncia .............................................................................................

63

Aplicaes da cromatografia em papel ...........................................................................

64

10 Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

65

III CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (JOO LUS CALLEGARI LOPES)

1

Introduo ....................................................................................................................

67

Os adsorventes ..............................................................................................................

68

2.1 Slica (SiO2).............................................................................................................

68

2.2 Alumina (Al2O3) .....................................................................................................

69

2.3 Terra diatomcea .....................................................................................................

69

2.4 Celulose...................................................................................................................

70

2.5 Poliamida.................................................................................................................

70

2.6 Outros.....................................................................................................................

71

3 Tcnicas gerais ................................................................................................................

72

3.1 Preparao de placas ................................................................................................

72

3.2 Ativao das placas...................................................................................................

74

3.3 Seleo da fase mvel...............................................................................................

75

3.4 Aplicao das amostras nas cromatoplacas ...............................................................

76

3.5 Formas de desenvolvimento .....................................................................................

77

3.6 Revelao dos cromatogramas..................................................................................

80

3.7 Documentao.........................................................................................................

82

4 Anlise quantitativa .........................................................................................................

82

5 Cromatografia em camada delgada de alta eficincia ........................................................

83

6 Aplicaes da cromatografia em camada delgada .............................................................

85

7 Referncias bibliogrficas.................................................................................................

85

IV CROMATOGRAFIA POR ADSORO (WALTER VICHENEWSKI)

1 Introduo ......................................................................................................................

87

2 A coluna .........................................................................................................................

87

3 Adsorventes ....................................................................................................................

88

4 Os processos de adsoro em coluna ...............................................................................

90

5 Preparao dos adsorventes .............................................................................................

90

6 Reaes na coluna ...........................................................................................................

92

7 Escolha de eluentes .........................................................................................................

92

8 Enchimento da coluna e aplicao da amostra .................................................................

93

Eluio e localizao dos compostos eludos ..................................................................

94

10 Cromatografia em coluna seca .......................................................................................

98

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11 Aplicaes da cromatografia por adsoro ......................................................................

100

12 Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

100

V CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA (AUGUSTO CSAR C. SPADARO)

1

Introduo ....................................................................................................................

103

O mecanismo de cromatografia por troca inica ............................................................

104

A matriz ........................................................................................................................

106

3.1 Trocadores inorgnicos naturais ...............................................................................

107

3.2 Trocadores inorgnicos sintticos.............................................................................

107

3.3 Trocadores com matriz orgnica natural ..................................................................

108

3.4 Trocadores orgnicos sintticos................................................................................

111

3.5 Matrizes utilizadas em cromatografia lquida de alta eficincia..................................

114

3.6 Trocadores inicos lquidos......................................................................................

115

Os grupos trocadores.....................................................................................................

115

Propriedades de trocadores inicos ................................................................................

120

5.1 Capacidade ..............................................................................................................

120

5.2 Seletividade..............................................................................................................

121

Fatores que influenciam a cromatografia por troca inica...............................................

123

6.1 A escolha do trocador inico ...................................................................................

123

6.2 A seleo da fase mvel............................................................................................

124

6.3 A amostra ................................................................................................................

126

Eluio em cromatografia por troca inica .....................................................................

126

Aplicaes......................................................................................................................

129

Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

136

VI CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO (ZULEIKA ROTHSCHILD)

1

Introduo ....................................................................................................................

139

Conceitos que caracterizam a cromatografia por excluso ..............................................

141

2.1 Fases........................................................................................................................

141

2.2 Eluio ....................................................................................................................

142

2.3 Espalhamento da zona e resoluo...........................................................................

145

2.4 Outros conceitos muito usados em cromatografia por excluso ................................

148

3 Recheios usados em cromatografia por excluso.............................................................

149

3.1 Caractersticas da fase estacionria ............................................................................

149

3.2 Natureza qumica do gel..........................................................................................

150

3.3 Natureza fsica do gel ..............................................................................................

151

3.4 Tipos de gel.............................................................................................................

151

Equipamento para cromatografia por excluso ...............................................................

158

4.1 Coluna cromatogrfica.............................................................................................

158

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4.2 Controle da vazo da fase mvel ..............................................................................

158

4.3 Registro das curvas de eluio..................................................................................

159

Parmetros experimentais em cromatografia por excluso ..............................................

159

5.1 Tipo de gel ..............................................................................................................

160

5.2 Tamanho da coluna .................................................................................................

162

5.3 Tamanho da amostra ...............................................................................................

163

5.4 Vazo da fase mvel.................................................................................................

163

5.5 Tratamento da coluna ..............................................................................................

164

Aplicaes da cromatografia por excluso.......................................................................

165

Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

166

VII CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE (AUGUSTO CSAR C. SPADARO E MARIA JOS VIEIRA FONSECA)
1

Introduo ....................................................................................................................

Princpio do mtodo......................................................................................................

168

Seleo do suporte insolvel ou matriz ..........................................................................

170

3.1 Matriz de agarose ....................................................................................................

170

167

3.2 Matriz de celulose....................................................................................................

171

3.3 Matriz de dextrana...................................................................................................

172

3.4 Matriz de poliacrilamida ..........................................................................................

172

3.5 Matriz de trisacril.....................................................................................................

172

3.6 Outras matrizes orgnicas ........................................................................................

173

3.7 Matrizes inorgnicas ................................................................................................

174

Preparao de fases estacionrias seletivas .......................................................................

175

4.1 Mtodos de ativao de matrizes hidroxlicas ...........................................................

176

4.2 Ativao de matrizes no-hidroxlicas .......................................................................

180

4.3 Acoplamento do ligante matriz ativada..................................................................

181

Metodologia operacional ...............................................................................................

183

5.1 Preparao da coluna ...............................................................................................

183

5.2 Dimenses da coluna ...............................................................................................

184

5.3 Determinao da capacidade ....................................................................................

184

5.4 A preparao da amostra ..........................................................................................

185

5.5 O efeito de vazo e temperatura ..............................................................................

185

5.6 Mtodos de eluio..................................................................................................

186

5.7 Exemplos de resinas por bioafinidade disponveis comercialmente ............................

191

Aplicaes da cromatografia por bioafinidade.................................................................

195

6.1 Purificao de macromolculas por cromatografia por bioafinidade............................

195

6.2 Purificao de pequenas molculas ...........................................................................

199

6.3 Interaes biomoleculares ........................................................................................

200

Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

200

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VIII CROMATOGRAFIA GASOSA (PIERINA SUELI BONATO)

1

Introduo ....................................................................................................................

203

Tcnicas usadas em cromatografia gasosa .......................................................................

205

Eficincia ......................................................................................................................

207

Equipamento para cromatografia gasosa .......................................................................

213

4.1 Fonte do gs de arraste ............................................................................................

213

4.2 Controladores de vazo e de presso........................................................................

214

4.3 Sistema de injeo da amostra ..................................................................................

214

4.4 Coluna cromatogrfica.............................................................................................

219

4.5 Sistemas de deteco................................................................................................

223

4.6 Sistema de registro e tratamento de dados ..............................................................

231

4.7 Controle de temperatura da coluna, injetor e detector ...........................................

232

Fases estacionrias para cromatografia gasosa .................................................................

232

5.1 Fase estacionria slida.............................................................................................

232

5.2 Fase estacionria lquida ...........................................................................................

235

5.3 Fase estacionria imobilizada....................................................................................

242

5.4 Fase estacionria quiral.............................................................................................

242

Derivao ......................................................................................................................

244

Seleo das condies cromatogrficas e otimizao da anlise .......................................

246

7.1 Fase estacionria ......................................................................................................

247

7.2 Dimetro interno.....................................................................................................

247

7.3 Comprimento ..........................................................................................................

247

7.4 Espessura do filme da fase estacionria .....................................................................

248

7.5 Tipo e vazo do gs de arraste .................................................................................

250

7.6 Temperatura da coluna ............................................................................................

250

Anlise qualitativa ..........................................................................................................

251

Anlise quantitativa........................................................................................................

256

10 Aplicaes......................................................................................................................

262

11 Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

270

IX CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (ISABEL CRISTINA SALES FONTES JARDIM,

CAROL H. COLLINS E LUIZ FERNANDO LOPES GUIMARES)
1

Princpios de cromatografia lquida de alta eficincia ......................................................

273

1.1 Cromatografia lquida clssica e cromatografia lquida de alta eficincia....................

275

1.2 Cromatografia lquida de alta eficincia e cromatografia gasosa ................................

277

As tcnicas da cromatografia lquida de alta eficincia ....................................................

280

2.1 Cromatografia lquido-slido ou por adsoro .........................................................

280

2.2 Cromatografia lquido-lquido ou por partio.........................................................

282

2.3 Cromatografia lquida com fase ligada......................................................................

283

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2.4 Cromatografia lquida quiral ....................................................................................

284

2.5 Cromatografia por troca inica ................................................................................

287

2.6 Cromatografia por bioafinidade ...............................................................................

287

2.7 Cromatografia por excluso .....................................................................................

287

Fases mveis usadas em cromatografia lquida de alta eficincia......................................

289

3.1 Conceitos gerais.......................................................................................................

289

3.2 Critrios a serem considerados na seleo da fase mvel ...........................................

289

3.3 Preparao da fase mvel .........................................................................................

296

3.4 Soluo-tampo .......................................................................................................

298

Eluio em cromatografia lquida de alta eficincia.........................................................

301

Caractersticas das partculas usadas em cromatografia lquida de alta eficincia ..............

303

Caractersticas das fases estacionrias usadas em cromatografia lquida de alta eficincia....

308

6.1 Fases estacionrias para cromatografia lquido-slido................................................

308

6.2 Fases estacionrias para cromatografia lquido-lquido ..............................................

312

6.3 Fases estacionrias para cromatografia lquida de fase quimicamente ligada...............

314

6.4 Fases estacionrias quirais.........................................................................................

325

6.5 Fases estacionrias para cromatografia por bioafinidade ............................................

329

6.6 Fases estacionrias para amostras inicas: supresso inica, par inico, troca inica ....

330

6.7 Fases estacionrias para cromatografia por excluso .................................................

338

7 Equipamento para cromatografia lquida de alta eficincia ...............................................

343

7.1 Reservatrios da fase mvel .....................................................................................

345

7.2 Bombas de alta presso ............................................................................................

347

7.3 Programadores de fase mvel...................................................................................

354

7.4 Medidores e controladores de presso......................................................................

356

7.5 Sistemas de injeo da amostra.................................................................................

357

7.6 Colunas ...................................................................................................................

360

7.7 Detectores ...............................................................................................................

367

7.8 Registro dos dados ..................................................................................................

387

Desenvolvendo uma separao .......................................................................................

388

Aplicaes da cromatografia lquida de alta eficincia .....................................................

392

10 Referncias bibliogrficas ...............................................................................................

397

X PRTICAS DE LABORATRIO
1

Cromatografia em papel ................................................................................................

399

1.1 Separao de nions .................................................................................................

399

1.2 Separao de ctions ................................................................................................

401

Cromatografia em camada delgada ................................................................................

402

2.1 Separao de derivados cumarnicos .........................................................................

402

2.2 Separao de nitrofenis ..........................................................................................

403

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2.3 Separao de corantes ..............................................................................................

404

2.4 Separao de nitroanilinas ........................................................................................

404

2.5 Separao de aminocidos ........................................................................................

405

Cromatografia por adsoro...........................................................................................

405

3.1 Separao de fluoreno e fluorenona ........................................................................

405

3.2 Separao de extrato de espinafre.............................................................................

407

3.3 Separao de dicromato e permanganato..................................................................

408

Cromatografia por troca inica ......................................................................................

409

4.1 Separao de ctions em resina de troca catinica......................................................

409

4.2 Separao de ctions com resina de troca aninica......................................................

411

Cromatografia por excluso ...........................................................................................

413

5.1 Separao de albumina e azul de bromofenol ...........................................................

413

5.2 Verificao da reduo de meta-hemoglobinas usando cromatografia por excluso ...

415

Cromatografia por bioafinidade .....................................................................................

416

6.1 Separao de hemoglobinas glicosiladas ...................................................................

416

Cromatografia gasosa.....................................................................................................

419

7.1 Otimizao da anlise e quantificao de uma mistura de hidrocarbonetos ...............

419

7.2 Anlise de diazepam em formulaes farmacuticas.....................................................

420

7.3 Anlise de cafena em refrigerantes ...........................................................................

422

Cromatografia lquida de alta eficincia..........................................................................

424

8.1 Anlise de analgsicos ..............................................................................................

424

8.2 Determinao de cafena em vrias bebidas .............................................................

426

8.3 Anlise de alguns barbitricos ..................................................................................

428

APNDICE
1

Smbolos para cromatografia em coluna .........................................................................

431

Smbolos para cromatografia planar ...............................................................................

433

Smbolos para cromatografia por excluso......................................................................

434

Propriedades de fases mveis usadas em cromatografia lquida .......................................

435

Comparao das malhas dos slidos usados em cromatografia........................................

437

SOBRE OS AUTORES .........................................................................................................................

439

NDICE REMISSIVO ...........................................................................................................................

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APRESENTAO

Os diversos mtodos de separao cromatogrfica tm

sido aplicados em milhares de laboratrios no mundo para
decifrar os inmeros e complexos problemas da qumica, da
bioqumica, das cincias ambientais, da toxicologia etc., tanto no nvel acadmico e em pesquisa como nas aplicaes industriais. Esses mtodos cromatogrficos variam desde os de
extrema simplicidade, que podem ser facilmente manipulados
por aqueles que no so peritos, at os de alta sofisticao,
usados s por especialistas. Entre esses dois extremos, existem
muitas variaes de maior ou menor complexidade.
Para cada modalidade de cromatografia, esto disponveis vrios livros especializados, publicados em ingls ou
outra lngua estrangeira. Porm, so raros os livros em lngua
portuguesa que contenham as informaes bsicas, tericas
e prticas sobre essas tcnicas de to largo uso.
Na tentativa de evitar a dependncia de livros em
lngua estrangeira, publicamos, em 1987, a primeira edio
deste livro bsico sobre tcnicas cromatogrficas, com o ttulo de Introduo a mtodos cromatogrficos, que apresentou
informaes sobre as vrias modalidades de cromatografia. O
sucesso obtido motivou-nos a lanar uma nova edio, em
1990, revista e ampliada, tanto no que se refere ao contedo dos captulos j existentes como a um novo captulo, que
descreve outra modalidade de cromatografia, a cromatografia por bioafinidade.
Ao longo de mais de dez anos desde essa reviso, a literatura especializada aumentou, sendo muito rica nesse tema,

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F U N D A M E N T O S D E C R O M AT O G R A F I A

tanto no que se refere divulgao de novas tcnicas, procedimentos e materiais como divulgao de novas aplicaes. Sendo assim, consideramos bastante oportuno realizar uma nova
reviso, com um novo ttulo, Fundamentos de cromatografia,
procurando uma atualizao mediante os constantes desenvolvimentos relatados na literatura, porm ainda mantendo o objetivo inicial de contar com uma obra que apresente informaes bsicas sobre as diversas modalidades de cromatografia.
Este livro continua sendo destinado ao uso, como
texto, em cursos de graduao, ou como livro introdutrio s
tcnicas de separao cromatogrfica para ps-graduandos.
Pode tambm servir como base para o pesquisador que pretende usar a cromatografia apenas como uma ferramenta em
suas experincias, sem necessitar de uma base terica profunda. Conseqentemente, a obra no se destina a especialistas,
nem um compndio que abrange referncias a todos os novos desenvolvimentos nesse campo.
O livro consiste de um captulo sobre alguns princpios bsicos de cromatografia, oito captulos que descrevem
as diferentes tcnicas cromatogrficas, um captulo que rene sugestes para experimentos na programao experimental das disciplinas de graduao, e apndices com os smbolos
recomendados para uso em cromatografia na lngua portuguesa, alm de outras informaes relevantes.
Apesar de os captulos terem sido escritos por autores
diferentes, cada um descrevendo a sua especialidade, houve
um esforo coletivo de uniformizao do texto no que se refere aos termos e smbolos usados em sua maioria, os recomendados pela Unio Internacional de Qumica Pura e
Aplicada (IUPAC), em 1993 (L. S. Ettre, Pure Appl. Chem.,
65, p.819). As unidades das quantidades fsicas e smbolos
adotados seguiram as indicaes do Sistema Internacional de
Unidades. Entretanto, os leitores que procurarem as referncias citadas devero estar alertas para o fato de que os smbolos e termos usados neste livro podem, em demais obras, ser
substitudos por outros, visto que ainda no existe uniformidade nos smbolos e termos usados nas diferentes modalidades de cromatografia, nem entre autores oriundos das diversas partes do mundo.

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A P R E S E N TA O

Os organizadores e autores desta obra consideram que

nela aplicaram o melhor de seus esforos. No entanto, agradeceriam no s sugestes como indicaes de erros e/ou
conceitos mal formulados. Alm disso, agradecem aos que,
direta ou indiretamente, colaboraram, com seu trabalho e entusiasmo, para que esta publicao se tornasse vivel; em especial, doutora Carla Beatriz Grespan Bottoli, pela dedicao no manuseio das novas figuras encontradas nesta edio.

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PRINCPIOS BSICOS DE CROMATOGRAFIA

Carol H. Collins

1 INTRODUO

Entre os mtodos modernos de anlise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido facilidade com
que efetua separao, identificao e quantificao das espcies qumicas, por si mesma ou em conjunto com outras tcnicas instrumentais de anlise, como a espectrofotometria ou
a espectrometria de massas.
A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da
distribuio desses componentes em duas fases, que esto em
contato ntimo. Uma das fases permanece estacionria, enquanto a outra se move atravs dela. Durante a passagem da
fase mvel sobre a fase estacionria, os componentes da mistura so distribudos pelas duas fases de tal forma que cada
um deles seletivamente retido pela fase estacionria, o que
resulta em migraes diferenciais desses componentes.
Existem vrias formas de realizar o processo cromatogrfico. Detalhes sobre algumas dessas formas sero assuntos
dos captulos a seguir, enquanto neste sero apresentados alguns dos conceitos mais gerais. Antes disso, ser relatada uma
breve reviso histrica do desenvolvimento das tcnicas cromatogrficas mais importantes.

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2 ASPECTOS DA HISTRIA DA CROMATOGRAFIA

Os termos e expresses cromatografia, cromatograma e mtodo cromatogrfico so atribudos ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett, que, em 1906, os
utilizou em dois trabalhos que descrevem suas experincias
na separao dos componentes de extratos de folhas, nas
quais usou colunas de vidro recheadas com vrios slidos,
finamente divididos, e arrastou os diferentes componentes
com ter de petrleo. O nome deriva das palavras gregas
chrom (cor) e graphe (escrever), embora ele tenha explicitado
que o processo no depende da cor, exceto para facilitar a
identificao dos componentes separados.
Todavia, j nessa poca os processos que utilizavam
a migrao diferencial eram bem conhecidos. Paralelamente
aos desenvolvimentos de Tswett, Reed, na Inglaterra, e Day,
nos Estados Unidos, aplicaram colunas contendo slidos e
misturas de solventes orgnicos para a separao de sais orgnicos e amostras de petrleo, respectivamente. Bem antes deles, Runge descrevera os desenhos feitos por misturas de
sais e por tintas que foram colocadas no centro de um papel
de filtro e depois espalhadas pela passagem de um solvente,
enquanto Schoenbein fez experincias similares com tiras de
papel mergulhadas em solventes. O uso de slidos em camada delgada sobre vidro, no lugar de papel, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgnicos, foi experimentado por Beyerinck em 1889.
Apesar dessas experincias, considerou-se que a poca moderna da cromatografia comeou na dcada de 1930,
quando Kuhn e Lederer redescobriram e aperfeioaram a
cromatografia em coluna, repetindo as experincias de Tswett,
separando e identificando as xantofilas da gema de ovo, usando uma coluna recheada com carbonato de clcio pulverizado
como fase estacionria e ter de petrleo como fase mvel.
Em 1941, Martin e Synge publicaram um trabalho importantssimo no qual descreveram a cromatografia por partio (cromatografia lquido-lquido), aplicaram cromatografia o conceito j bem conhecido em outros processos de
separao, de altura equivalente a um prato, e anteciparam o

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surgimento de duas tcnicas cromatogrficas pressurizadas,

a cromatografia gasosa e a cromatografia lquida de alta
eficincia. Por esse trabalho, receberam, em 1952, o Prmio
Nobel. Martin tambm participou em outros desenvolvimentos importantes na histria da cromatografia: com Consden e Gordon, reintroduziu a cromatografia em papel; com
Howard, desenvolveu a cromatografia lquida, aplicando as
chamadas fases reversas; e, com James, atualizou a cromatografia gs-lquido.
A cromatografia gs-slido foi descrita em 1941, por
Hesse e colaboradores, que separaram dois cidos graxos, no
vapor a 100 C, arrastando-os sobre slica com um gs, dixido de carbono, enquanto Cremer e Prior foram os primeiros a descrever um cromatgrafo a gs completo, utilizando
hidrognio como gs de arraste, slica como fase estacionria
e um catarmetro como detector.
A cromatografia gs-lquido foi relatada por Martin
e James em 1952, e o uso de um detector por condutividade trmica, por Ray, em 1954. Um ano depois, os primeiros equipamentos foram colocados no mercado dos Estados
Unidos e da Inglaterra. O desenvolvimento, quase simultneo, do detector por ionizao em chama, por Pretorius e
colaboradores e por McWilliams e Dewar, em 1958, ampliou
a detectibilidade do mtodo cromatogrfico, enquanto a introduo de colunas capilares por Golay, tambm em 1958,
ampliou seus poderes analticos a ponto de tornar a cromatografia gasosa o mtodo analtico de separao e determinao
mais usado no mundo.
A cromatografia em camada delgada foi reintroduzida em 1938, por Izmailov e Schraiber, para a anlise de produtos farmacuticos, mas no foi muito usada at o desenvolvimento, efetuado por Kirchner e colaboradores, do mtodo
de aderir o slido ao suporte, e por Stahl, do mtodo de preparar as placas com reprodutibilidade.
A cromatografia por troca inica tambm teve seu incio, na poca moderna, nos anos 30, com a sntese, feita por
Adams e Holmes, das primeiras resinas de troca inica, baseadas em fenol e formaldedo, que permitem a troca de ctions.
Posteriormente, resinas de poliacrilato ou poliestireno entre-

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cruzado com divinilbenzeno, com substituintes sulfnicos e

carboxlicos (para a troca de ctions) ou alquilaminos (para a
troca de nions), substituram as resinas originais.
As resinas de poliestireno-divinilbenzeno com substituintes inicos so muito aplicadas em bioqumica, e seu uso
teve incio com as experincias, efetuadas por Cohn, de separao de aminocidos originados de protena. A separao de
aminocidos foi aperfeioada por Moore e Stein, que posteriormente a mecanizaram, usando uma bomba peristltica
para empurrar a fase mvel e um fotmetro para a deteco,
aps uma reao ps-coluna para produzir os derivados com
ninhidrina. Em 1959, esse sistema para a anlise de aminocidos foi modificado por Hamilton e Andrews, com a introduo de uma bomba semelhante a um pisto, similar s usadas ainda hoje em cromatografia lquida de alta eficincia.
Outros desenvolvimentos na dcada de 1960, por Karr
e colaboradores, Jentoft e Gouw, Huber e Hulsman, Snyder,
Kirkland e outros, aperfeioaram os sistemas de bombeamento e deteco de cromatografia lquida de alta eficincia,
comprovando que o uso desses equipamentos, operado com
fase mvel lquida sob presso e com mtodos de deteco
sensveis, possibilita anlises de rapidez comparvel quela
obtida em cromatografia gasosa, com resultados altamente
satisfatrios.
Paralelamente, os enchimentos para a cromatografia
lquida de alta eficincia foram sendo desenvolvidos, inicialmente os peliculares (partculas superficialmente porosas),
por Halasz e Horvath, e, posteriormente, as partculas completamente porosas de dimetro pequeno (10 m, 5 m e 3
m), por Kirkland e outros. O desenvolvimento, por Nickless
e colaboradores, de fases estacionrias contendo grupos alquilas quimicamente ligados ao suporte permitiu a aplicao
da chamada fase reversa (fase estacionria apolar), ampliando as aplicaes dessa tcnica; enquanto a introduo de colunas de dimetro interno menores (as microbores e as
capilares recheadas), por Scott, por Ishii e por Novotny e
seus colaboradores, viabilizou o uso de cromatografia 1quida de alta eficincia para qualquer tipo de anlise, quer orgnica quer inorgnica, em microescala.