Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Fluorescena i fosforescena constau n reemisia de energie radiant ce are loc dup un proces de absorbie. Determinrile fluorimetrice se fac de obicei la temperatura obinuit pentru probe dizolvate. Fosforescena este studiat n cele mai multe cazuri la temperaturi foarte sczute n medii rigide (ngheate). Intensitatea radiaiilor emise prin fluorescen i fosforescen (dar nu i poziia spectrului emis) depinde de lungimea de und a radiaiei excitatoare. Emisia de fosforescen are loc de obicei la lungimi de und mai mari dect emisia de fluorescen. Spectrele de fluorescen i fosforescen, pentru o anumit substan, sunt frecvent imaginea n oglind a spectrului de absorbie. Metodele fluorimetrice de analiz sunt utilizate mai mult n practic dect cele fosforimetrice, necesitnd o aparatur mai simpl.
PRINCIPIUL APARATURII
Schema unui fluorimetru fotoelectric monofascicul cu filtre este prezentat n fig. 1. Aceast schem este asemntoare cu a unui aparat utilizat pentru msurarea absorbiei n domeniul vizibil i UV al spectrului, cu dou excepii: 1) detectorul este rotit cu 90 0 fa de direcia radiaiei incidente; 2) un al doilea sistem de separare a radiaiilor este plasat naintea detectorului. Sursa de radiaii (1) const de obicei dintr-o lamp cu vapori de mercur sau o lamp cu xenon. Ambele surse emit intens n domeniul UV al spectrului. Filtrul (2) permite trecerea unor radiaii excitatoare de anumite lungimi de und, iar filtrul (4) a radiaiei de fluorescen. Semnalul produs de detector, care este un curent proporional cu intensitatea radiaiei de fluorescen, este amplificat sau acioneaz direct sistemul de evaluare, care este un instrument de msur, un nregistrator etc. Aparatele n care separarea radiaiilor excitatoare i de fluorescen se face cu ajutorul unor monocromatoare se numesc spectrofluorimetre.
Fig. 1 Flurimetru Pentru majoritatea aparatelor msurarea radiaiei de fluorescen se face la un unghi de 90 0 fa de direcia radiaiei excitatoare, n aceste condiii obinndu-se cel mai redus fond dat de radiaia excitatoare. Un fosforimetru este asemntor cu un fluorimetru ns are n plus un dispozitiv optic care permite alternativ excitarea probei la anumite intervale de timp, excitri urmate de msurarea radiaiei de fosforescen. Pentru efectuarea determinrilor, proba de analizat este rcit frecvent la temperatura azotului lichid.
eozina sunt puternic fluorescente dar un compus asemntor, fenolftaleina, care nu are o structur rigid i pentru care sistemul conjugat este ntrerupt, nu este fluorescent. Formarea chelailor cu ionii metalici determin frecvent apariia fenomenului de fluorescen deoarece crete rigiditatea moleculei i micoreaz vibraiile interne. Factorii de mediu cei mai importani care determin fluorescena sunt: pH-ul, temperatura, ionii metalici i oxigenul dizolvat. Pentru a obine bune rezultate n determinrile de fluorescen trebuie utilizai solveni foarte puri. pH-ul influeneaz fluorescena prin schimbrile mari pe care le poate produce n structura anumitor molecule n urma unor fenomene de disociere sau protonare. Oxigenul molecular dizolvat precum i unii ioni metalici pot determina fenomenul de stingere a fluorescenei. Scderea temperaturii determin de obicei o cretere a intensitii fluorescenei. Aceasta deoarece procesele competitive neradiative (prin care se pierde energia strii excitate) decurg cu o vitez mai mic la temperaturi coborte. Metodele fluorimetrice i gsesc aplicaii deosebite n analiza biochimic, n cercetri biomedicale i pentru analizele chimice obinuite ale unor probe de origine biologic. Aceste metode prezint avantajul c pot fi aplicate frecvent fr o separare prealabil a compuilor analizai din matricea n care se gsesc (separare care poate fi destul de dificil). De asemenea, metodele fluorimetrice pot fi utilizate cu rezultate foarte bune pentru cercetarea proceselor celulare la nivel molecular ca i n studiul compuilor activi biologic, ca acizii nucleici sau n studiul structurii i funciilor proteinelor. Un mare numr de compui de interes biochimic pot fi determinai fluorimetric, cum ar fi: aminoacizi, vitamine, steroizi, clorofile, medicamente, droguri etc. Metoda se aplic i la determinarea unor insecticide, poluani i a altor compui organici. Unii compui prezint o fluorescen proprie i pot fi determinai direct, alii, care nu prezint fluorescen, pot fi transformai folosind reactivi adecvai, n compui fluoresceni. n acest mod pot fi analizai numeroi ioni metalici pe baza unor compui fluoresceni pe care i formeaz. Aminoacizi ca: fenilalanina, tirozina i triptofanul prezint fluorescen proprie ce permite determinarea lor direct. n fig. 1.56 se prezint spectrele de absorbie, de fluorescen i fosforescen ale triptofanului. Unele vitamine, ca de exemplu vitamina A, pot fi determinate fluorimetric direct, la concentraii de ordinul ppm i fraciuni de ppm. Alte vitamine, ca de exemplu vitamina A i riboflavina, ce nu prezint fluorescen proprie, pot fi convertite la fluorofori (compui ce prezint fluorescen intens) printr-o reacie simpl, ceea ce permite determinarea lor cu o mai mare sensibilitate. Astfel, Tiamina Tiocrom (ex. = 368 nm; em. = 440 nm) Riboflavina Lumiflavina (ex. = 440 nm; em. = 550 nm) Colesterolul, prin tratare cu acid sulfuric, formeaz un fluorofor ce permite determinarea lui n cantiti de 0,1-2 g (ex. = 546 nm; em. = 590 nm). Fluorescena a fost folosit cu rezultate foarte bune pentru determinarea mecanismului fotosintezei, deoarece diferitele clorofile: a, b, c, d etc., protoclorofila i ali produi implicai n fotosintez sunt fluoresceni la anumite lungimi de und. Metodele fluorimetrice sunt aplicate la analiza unor medicamente sau drogur. Datorit sensibilitii i specificitii, metodele fluorimetrice i gsesc largi aplicaii n enzimologie. Pentru determinarea activitii unei enzime, se msoar fluorimetric viteza reaciei catalizate de aceasta. De exemplu, NADH i NADPH, formele reduse ale nicotinamidadenin dinucleotidului (NAD ) i nicotinamidadenin dinucleotidfosfatului (NADP ), au o fluorescen intens. Astfel, toate reaciile depinznd de NAD + i NADP+ implicate n analiza enzimatic pot fi studiate fluorimetric. Sensibilitatea este ns cu dou-trei ordine de mrime mai mare dect n cazul metodelor de analiz bazate pe absorbia radiaiei. Metodele fluorimetrice sunt utilizate pentru determinarea unui mare numr de ioni metalici, dup transformarea lor n chelai ce prezint fluorescen. Unele din acestea sunt cele mai sensibile i selective metode analitice pentru determinarea ionilor respectivi. Metodele fosforimetrice sunt utilizate pentru analiza unor aminoacizi, proteine, acizi nucleici, nucleotide, nucleozide, purine, pirimide, enzime, medicamente, poluani, pesticide etc. Se poate spune c metodele fosforimetrice sunt mai selective dect metodele fluorimetrice de analiz (aceasta deoarece mai puine substane prezint fosforescen). n ceea ce privete sensibilitatea, aceasta este asemntoare cu a metodelor fluorimetrice.
+ +