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COMPTE RENDU DE TP COLOGIE MICROBIENNE

Professeur TOULZA Eve

Groupe MARY Elodie MASVIDAL Anglique REY-IVAN Eliott

Universit de Perpignan Via Domitia Anne 2011/2012

SOMMAIRE

I- INTRODUCTION...........................................................................................................3 II - MATRIELS & MTHODES.........................................................................................4 III - RSULTATS.................................................................................................................7 IV - CONCLUSION & DISCUSSIONS.....................................................................................10 V - RFRENCES..............................................................................................................11

I)INTRODUCTION
1) Historique
L'tude des micro-organismes tels que les bactries a dbut rellement la fin du 17me sicle et continue se dvelopper de nos jours : en 1677, le savant nerlandais Antoine van Leeuwenhoek dcouvre les bactries grce aux amliorations qu'il a apport au microscope optique. Il est considr comme un des prcurseurs de la microbiologie. En 1884, Hans Christian Gram, bactriologiste danois, dveloppa une technique de coloration, la coloration de Gram, permettant de diffrencier deux grands groupes de bactries : les bactries Gram et les bactries Gram +. Cette technique est grandement utilis en microbiologie pour identifier les bactries. la dcouverte des antibiotiques a permis le dveloppement d'une technique appele antibiogramme, permettant d'tudier la sensibilit de certaines bactries face des antibiotiques. On doit les premires dcouvertes sur les antibiotiques Alexander Fleming qui dcouvrit les proprits antibactriennes d'une toxine produite par le champignon Penicillum : la penicilline. vers 1970, plusieurs scientifiques et hommes de mdecine crent la galerie API, une plaque de petits tubes permettant d'effectuer des tests biochimiques de faon rapide et facile. Cette galerie permet d'identifier des micro-organismes comme les bactries grce une base de donnes administre par la socit Biomrieux. D'autres tests permettant l'identification de souches bactriennes ont t labor au cours de ces annes et qui nous ont permis lors de ce TP d'identifier notre bactrie inconnue.

2) Intrt
L'identification de souches bactriennes a pour but de classer et d'tudier les diffrentes bactries prsentes dans la nature. La dcouverte de leurs proprits biochimiques et/ou physico-chimiques peuvent apporter de grands changements dans le domaine de la Sant comme la mdecine, la pharmacologie, etc... ou encore dans l'industrie agroalimentaire.

3) Objectif du TP
L'objectif principal du TP est d'identifier et caractriser une souche bactrienne inconnue, grce une batterie de tests standards en microbiologie. Cela permet entre autre de se familiariser avec ces diffrents tests, le matriel adquat et la contrainte de travailler en milieu strile.

4) Rsum des expriences


Au cours de ces deux jours de TP, nous avons effectu une srie de tests pour identifier notre souche bactrienne inconnue. Nous avons tout d'abord ralis un talement selon la mthode des quadrants pour isoler une colonie bactrienne, pour pouvoir valuer la densit des bactries mais aussi pour pouvoir utiliser ces colonies pour d'autres expriences. Nous avons ensuite ralis des tests aux antibiogrammes, une galerie API 20E, un test au KOH, un test l'oxydase, un test de la catalase et une coloration de Gram. Le deuxime jour a servi rcolter les rsultats des tests ncessitant une longue incubation.

II)

MATRIELS & MTHODES


1) Coloration de Gram

Matriels requis : une lame de microscope de l'eau distille une anse de platine un bec bunsen un portoir et un bac de coloration colorants : violet de gentiane et fushine du Lugol de l'alcool ou un mlange alcool-actone un microscope Mthode : On dpose tout d'abord une goutte de suspension bactrienne avec l'anse de platine sur une lame de microscope que l'on sche grce la flamme du bec bunsen. Aprs avoir pos la lame sur le portoir, on ralise une premire coloration avec le violet de gentiane que l'on laisse agir environ 1 minute puis on rince avec de l'eau distille. Puis, on effectue un mordanage au Lugol que l'on laisse agir pendant 20 secondes environ. On peut rpter l'opration une seconde fois pour plus de sret. Ensuite, on dcolore l'alcool en inclinant la lame jusqu' ce que le liquide soit clair, et on rince l'eau distille. Enfin, on ralise une deuxime coloration avec la fushine que l'on laisse agir pendant 1 minute environ. On lave ensuite avec de l'eau distille puis on sche la lame avec la flamme du bec bunsen. Une fois sche, on peut observer notre lame sous un microscope optique, avec l'objectif 100 maximum.

2) Test au KOH
Matriels : une lame de microscope un compte-goutte une solution de KOH 3% Mthode : Sur une lame de microscope, on pose quelques gouttes de KOH 3% ainsi qu'une petite colonie de bactries. Il est cependant important que cette colonie soit ge de moins de 48h. Avec le comptegoutte, on homognise le mlange durant 15 30 secondes environ. Au terme de cela, on pourra observer ou non un filament visqueux provenant du mlange.

3) Test de la catalase
Matriels : une lame de microscope une anse de platine de l'eau oxygne 3% Mthode : On dpose tout d'abord sur la lame une goutte d'eau oxygne puis on ajoute une colonie de bactries. On peut aussi dposer en premier la colonie de bactries puis ajouter l'eau oxygne. On pourra observer ou pas une effervescence immdiatement.

4) Test aux Antibiogrammes


Matriels : deux boites de Ptri avec milieu glos un compte-goutte une pince des disques de papier buvard contenant diffrents antibiotiques (ici, 6 antibiotiques diffrents) un bec bunsen un taloir Mthode : Tout d'abord, on effectue deux talement de surface de notre suspension bactrienne dans deux boites de Ptri contenant un milieu glos, tout en restant dans la zone strile du bec bunsen. Puis grce une pince que l'on strilisera avant et aprs chaque utilisation, on dpose 3 disques diffrents dans chaque boite, en prenant soin de les espacer quitablement. Puis, on entrepose nos boites l'tuve environ 35C pendant maximum 24h. Au bout de ce temps l, on pourra observer ou non une zone d'inhibition circulaire plus ou moins grande autour des disques d'antibiotique.

5) Galerie API 20E


Matriels : une galerie API 20E de l'eau distille une boite d'incubation une ampoule de NaCl 0,85% une anse de platine standard Mc Farland N5 de l'huile de paraffine un compte-goutte divers ractifs : hydroxyde de potassium (40%), alpha-naphtol (6%), acide sulfanilique (0,8%), NN-dimethyl-alpha-naphtylamine (0,05%), chlorure ferrique (10%), ractif de Kovac ou James, poudre de zinc Mthode : Prparation de la galerie API : Aprs avoir rcuprer une boite d'incubation, on dpose environ 5mL d'eau distill dans le fond de la boite en prenant soin de remplir toutes les alvoles. Cela permettra de crer une atmosphre humide dans la boite. Puis, on inscrit les rfrences du groupe sur la languette de la boite et on dpose dans cette dernire la galerie. Prparation de l'inoculum : Aprs avoir ouvert une ampoule de NaCl 0,85%, on y introduit une seule colonie isole de bactries avec l'anse de platine et on ralise une suspension bactrienne de concentration 10 8 bactries/mL en comparant notre suspension avec le standard Mc Farland N5 et en ajoutant au besoin de la solution de NaCl 0,85%. Une fois la suspension bactrienne prpare, elle doit tre utilise dans les 15 minutes qui suivent. Inoculation de la galerie API : Grce un compte goutte, on remplit la galerie API 20E comme suit. Pendant ces oprations, il est important de ne pas avoir de bulles d'air dans les tubes et cupules : on remplit les tubes et cupules des tests |CIT|, |VP| et |GEL|. on remplit uniquement les tubes de tous les autres tests. On remplit les cupules d'huile de paraffine des tests ADH, LDC, ODC, URE et H2S pour crer une anarobiose.

Enfin, on ferme la boite d'incubation et on place notre boite l'tuve environ 36C durant 24h. Lecture de la galerie API 20E Aprs incubation, on peut lire les rsultats de notre galerie. Cependant, la plupart des tubes doivent recevoir un ractif pour que l'on puisse obtenir le rsultat du test. Les rsultats seront consigns dans une fiche de rsultats de la galerie API 20E et on pourra dterminer ces rsultats grce un tableau API 20E fourni. L'ajout des ractifs dans les tubes doit tre ralis dans l'ordre qui suit : pour le tube VP, ajouter une goutte d'hydroxyde de potassium (40%) et une goutte d'alphanaphtol (6%) et attendre 10 min avant la lecture du rsultat. pour le tube GLU, il faut ajouter 2 gouttes d'acide sulfanilique (0,8%) et 2 gouttes de NNdimethyl-alpha-naphtylamine (0,05%) et attendre 2 3 min avant lecture. Il faudra pralablement vrifier la prsence ou non de bulles, signifiant la rduction du nitrate sous forme gazeuse (N2). Si la raction est ngative, il faut ajouter de la poudre de zinc et attendre 10 min avant la lecture du rsultat. pour le tube TDA, il faut ajouter une goutte de chlorrure ferrique (10%) et lire immdiatement le rsultat. pour le tube IND, il faut ajouter une goutte de ractif de Kovac ou James et lire le rsultat immdiatement.

III) RSULTATS
1) Coloration de Gram
l'issu de cette exprience, on a pu conclure que notre souche bactrienne tait de nature Gram -, du fait de l'absence de coloration violette. Puis, on a observ nos bactries au microscope, ce qui nous as permis de faire une analyse morphologique de notre bactrie. Cependant, ayant effectu notre observation un faible grossissement, nous ne pouvons parfaitement affirmer la forme de notre bactrie. On peut nanmoins dire que ces bactries ne s'associent pas en chainette. La photo ci-contre montre nos bactries vues au microscope.

2) Test au KOH
On pourra observer ou pas une effervescence. Le test au KOH nous a permis de savoir que notre bactrie tait de nature Gram -, puisque nous avons observ la formation d'un filament visqueux, comme nous le voyons sur la photo ci-contre.

3) Test de la catalase
Lors de ce test nous avons observ un dgagement gazeux. La raction la catalase tant positive, nous pouvons donc dire que notre bactrie possde l'enzyme nomme catalase. Si toutefois ce test ne permet pas d'affirmer que notre bactrie fait partie des Gram (la plupart des Gram- possde cette enzyme mais pas toute), on peut au moins affirmer qu'elle ne fait pas partie du groupe des Enterococcus (qui ne produisent pas de catalase).

4) Test aux Antibiogrammes


D'aprs les rsultats lists dans le tableau ci-dessous, on peut affirmer que notre souche est sensible la Streptomycine, la Polymixine et la Tobramycine et est rsistante l'Ampicilline, la Penicilline et la Tetracycline.

Antibiotiques Diamtre (mm)

Ampicilline (AM) 0

Streptomycine (S) 22

Polymixine (PB) 15

Penicilline (P) 0

Tobramycine (TM) 2

Tetracycline (TE) 14

Photos des boites de Ptri contenant les disques d'antibiotiques :

5) La galerie API
Les photos ci-dessous reprsentent la galerie API que l'on exploite pour obtenir les rsultats.

Cette photo reprsente la galerie API aprs sortie de l'tuve ...

et cette photo reprsente la galerie aprs ajout des ractifs. Les rsultats de la galerie API nous permettent d'obtenir un code que l'on utilisera pour identifier notre souche bactrienne l'aide d'un livre li la galerie API et regroupant plusieurs types de

bactries sous forme de codes. Le code que l'on a obtenu aprs regroupement des rsultats sur notre fiche (photo ci-dessous) est : 0476021.

Ce code nous indique notre bactrie se trouve tre Proteus vulgaris.

IV)

CONCLUSION & DISCUSSIONS

Au cours de ce TP, nous avons pu nous familiariser avec des expriences standards de microbiologie tel que la coloration de Gram ou la galerie API pour pouvoir identifier une souche bactrienne. La coloration de Gram et le test KOH nous ont permis de classer notre bactrie dans le groupe des Gram -. Par la suite, le test de la catalase et celui des antibiogrammes nous donnent des informations sur notre souche : elle produit de la catalase et elle prsente une rsistance l'Ampicilline, la Penicilline et la Tetracycline. C'est une information intressante dans le cas o l'on souhaite liminer la bactrie (lors d'un traitement par antibiotique par exemple). C'est finalement les diffrentes raction de la galerie API qui nous permettent d'identifier notre souche comme tant Proteus vulgaris. l'issue de toutes ces expriences, nous avons pu identifier notre souche bactrienne inconnue et nous pouvons dvelopper certaines de ces caractristiques par des recherches supplmentaires. Notre bactrie se nomme Proteus vulgaris et appartient la famille des entrobactries. C'est une bactrie commensale de l'appareil digestif des mammifres que l'on trouve dans le sol, l'eau et les matires fcales. Elle est responsable des infections urinaires et de plaies. Proteus vulgaris est une bactrie Gram - de forme bacille et a pour principales caractristiques biochimiques la fermentation des sucres, est positive pour la rduction des nitrates en nitrites, la production d'indole, l'H2S, l'urease et la TDA et est ngative pour l'ONPG et l'ornithrine dcarboxylase. Elle est sensible deux antibiotiques aminoside (streptomycine et tobramycine) et la polymixine et est rsistante deux antibiotiques pnicilline (pnicilline et ampicilline) et la tobramycine.

V)

RFRENCES

http://www.chups.jussieu.fr/polys/bacterio/resistlacta/POLY.Chp.12.html http://fr.wikipedia.org/wiki/Proteus_vulgaris http://fr.wikipedia.org/wiki/Classement_des_antibiotiques