INTRODUCERE

Infeciile oportuniste de etiologie micotic fac parte din grupul bolilor infecioase emergente i au pondere din ce n ce mai mare n cadrul bolilor infecioase, mai ales n contextul abuzului de antibiotice de sintez (Odds i colab., 1979). Gravitatea infeciilor produse de Candida este determinat de echilibrul dintre patogenitatea microorganismului i capacitatea de aprare a gazdei i implic afectarea sistemul imun (Fromtling i colab, 2003). Candida albicans este prezent la aproximativ 50% din populaie fr a provoca semne sau simptome de boal i este localizat la diferite niveluri: cavitate bucal, vagin, tract gastrointestinal. Aceste zone pot constitui, sub aciunea unor factori, adevrate "rezervoare" de Candida albicans, grbind astfel apariia manifestrilor (Colosi i col., 2009). Aceti factori pot fi: consumul prelungit de antibiotice, modificri aprute in timpul sarcinii, menstruaiei, menopauzei sau n urma tratamentului cu medicamente hormonale, inclusiv cele anticoncepionale, ali factori de infecie sau boli asociate, deficiena sistemului imunitar, dar i diabetul zaharat. Medicaia antifungic alopat include diferite substane cum sunt hexoralul, fungizon, ampfocin, fluconazol, miconazol, etc. n ultimii ani, pe baza unor cercetri detaliate privind aciunea competitiv a lactobacililor cu fungi din specia Candida albicans, au aprut formule naturale cu iaurt sau probiotice (Lactobaciluls acidophilus) care au dovedit a fi eficiente (Osset i colab, 2001). Usturoiul este de asemenea recomandat, n acelai context. Prezenta tez de doctorat ii propune ca obiective studiul comparativ al unor plante aromatice care pot s aib potenial anti-candida. Astfel, innd seama de multitudinea compuilor bioactivi din plantele aromatice i medicinale, ndeosebi a uleiurilor volatile i a compuilor fenolici (mono-, di- sau polifenoli) care sunt cunoscui ca avnd potenial antimicrobian, ne-am propus caracterizarea chimic a compoziiei unor plante autohtone (16 tipuri de plante) i relaia acestor parametri cu aciunea

antifungic, testat in vitro pe tulpini de Candida prelevate de la purttori, urmat de tratamente in vivo i re-evaluri in vitro marcndu-se efectele nregistrate. Acest studiu este menit s evidenieze care dintre plantele studiate pot fi utilizate n diferite formule antimicotice.

SCOP I OBIECTIVE
Scopul lucrrii: caracterizarea chimic a unor extracte de plante bogate n compui fenolici cu potenial antifungic i testarea comparativ a aciunii acestor extracte de plante aromatice i medicinale cu potenial anti-candida. Obiectivele cercetrilor noastre se refer la dou aspecte: 1. Realizarea i caracterizarea unor extracte din diferite plante medicinale i aromatice din flora spontan sau cultivate n Romnia care au potenial antifungic, studiind compoziia acestora n compui fenolici n relaie cu aciunea antioxidant. 2. Testarea comparativ in vitro i in vivo a aciunii extractelor asupra unor tulpini diferite de Candida albicans (faringian, nazal, vaginal) prin evaluarea calitativ i cantitativ a aciunii acestora, pe pacieni purttori (aparent sntoi, cu boli cronice sau dup tratamente ndelungate cu antibiotice). Concluziile studiilor efectuate au ca finalitate selectarea celor mai eficiente extracte de plante care pot oferi aciune antifungic pe termen lung, fr remisii. Structura tezei Teza include 4 capitole, primele dou capitole sunt dedicate studiilor de literatur, iar dou capitole prezint rezultatele experimentale, conform celor dou obiective menionate mai sus. Capitolul 1, denumit Compui bioactivi cu potenial antimicotic din plante medicinale i aromatice, include date detaliate privind ncadrarea botanic, istoric i compoziia chimic a fiecrei plante care a fost studiat Capitolul 2, denumit Genul Candida - caracterizare general, tehnici de prelevare, cultivare i examinare Capitolele de Cercetri proprii sunt urmtoarele:

Capitolul 3 - Caracterizarea unor extracte vegetale cu potenial antimicotic include 3 studii experimentale paralele efectuate pe plante aromatice i medicinale, dup cum urmeaz: Studiul experimental 1: Realizarea unor extracte n alcool etilic i oet de mere, utiliznd 8 plante medicinale i aromatice Studiul experimental 2: Realizarea unor extracte hidroalcoolice i hidroglicerice din 6 tipuri de plante medicinale i aromatice Studiul experimental 3: realizarea i studiul unor extracte hidrofilice de vsc de diferite proveniene (vsc de mr sau de salcm), distribuia compuilor fenolici n frunze i stem, variaia compoziiei n funcie de sezon i determinarea capacitii antioxidante utiliznd metode specifice de evaluare a inhibiiei radicalilor liberi (DPPH, TEAC) sau a proceselor antioxidante mediate ioni (FRAP, ORAC). Capitolul 4 - Testarea in vitro i in vivo a aciunii antimicotice a extractelor vegetale investigate pe diferii purttori de Candida albicans include Studii in vitro (4.1) i Studii in vivo (4.2.). Subcapitolul 4.1. intitulat Studiile in vitro include rezultate privind evalurile cantitative de inhibare a proliferrii in vitro a tulpinilor de Candida albicans prin spectrometrie UV-Vis (4.1.2.1.). Aceste studii au fost efectuate prin 6 module experimentale, n care s-au utilizat diferite extracte de plante, individuale sau asociate, la diferite concentraii, urmrindu-se dinamica de inhibare la 24, 48 i 72 de ore co-cultivare a extractelor cu tulpinile Candida albicans (faringiene sau vaginale sau nazale) prelevate de la 11 purttori diferii (aparent sntoi, dar cu diferite boli cronice sau dup tratamente cu antibiotice). n paralel s-au fcut evaluri calitative (4.1.2.2.) pe mediu solid, prin acordare de scoruri. n seciunea 4.1.2.3. s-au corelat datele obinute prin determinrile cantitative i calitative. Subcapitolul 4.2. intitulat Studiile in vivo au fost derulate pe durata a 21 de zile de tratament al purttorilor, urmate de investigaii privind viabilitatea, respectiv rezistena fungilor Candida albicans fa de tratament.

CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE CU POTENIAL ANTIMICOTIC

Folosirea extractelor din plante este o form alternativ tratamentului micozelor n general i a candidozelor, n special, bucurndu-se de o popularitate din ce n ce mai mare ncepnd cu anii 1990 (Cowans, 1999). Datele de literatur au demonstrat c exist relaii direct proporionale ntre tipul i concentraia compuilor fenolici (de tip acid fenolic, procianidine, flavonoide sau taninuri) din plantele medicinale i aciunea antimicrobian a acestor plante (Sher, 2009). Aceti compui sunt sintetizai de plante n scop de aprare fa de duntori microscopici (mucegaiuri sau virusuri) sau macroscopici (insecte). Mecanismul de aciune implic biosinteza unor elicitori (molecule de aprare imun i toxine sintetizate, cu efect letal asupra duntorilor. n acest context, pentru a selecta plante i tipuri de extracte cu efect antifungic, am investigat un numr de 16 plante, medicinale i aromatice.

Studiu experimental 1
Materiale i metode S-au utilizat 8 specii de plante aromatice i medicinale i anume: Angelica archangelica (Angelica)(A); Silybum marianum (Armurariu) (B); Ocimum basilicum (Busuioc) (C); Ribes nigrum (Coacze negre) (D); Coriandrum sativum (Coriandru) (E); Majorana hortensis (Maghiran) (F); Rosmarinus officinalis (Rozmarin) (G); Salvia officinalis (Salvie) (H); Plantele au provenit din culturi controlate (Staiunea didactic experimental a USAMV Cluj-Napoca) sau procurate de la PLAFAR Cluj-Napoca. Protocolul de extracie i evaluarea concentraiei fiecrui extract prin spectrometrie UV-Vis Extracia probei mcinat (5 g) a fost fcut mai nti n etanol 35% (50 ml) apoi s-a folosit ca solvent de extracie oetul de mere de aciditate 5% (50 ml). Probele s-au sonicat la ntuneric, 24 ore. Absorbana extractelor obinute (nediluate sau diluate 1:10, 1:100, 1:1000 ), bogate in compui fitochimici, a fost nregistrat pe domeniul 200-700
4

nm (UV-Vis) cu ajutorul unui spectrofotometru JASCO/2005, pentru a stabili care este concentraia total de compui fenolici. Pentru acizi fenolici s-a urmrit semnalul caracteristic la 280 nm, pentru flavonoide la 340 nm, iar pentru antociani la 525 nm. Cuantificarea acizilor fenolici prin Cromatografie de Lichide de nalt Performan (HPLC) Extractele obinute a fost supuse analizei, utiliznd un cromatograf HPLC Shimadzu, echipat cu o pomp solvent binar, un degazor, cuptor pentru coloan i un detector cu fotodiod DAD (diode array detector). Coloana cromatografic, de tip SUPELCOSIL TM LC-18, 5m, 25 cm x 4.6 mm, a fost utilizat la 300C. Faza mobil a constat din doi solveni: solventul A format din metanol : acid acetic: ap bidistilat n raport de 10:1:88 (v/v/v) i solventul B format din metanol: acid acetic: ap bidistilat n raport de 90:3:7 (v/v/v). Determinarea concentraiei de polifenoli totali prin metoda Folin-Cioclteu Coninutul de polifenoli totali din toate probele (extracte alcoolice sau n oet) s-a determinat prin metoda spectrofotometric Folin-Cioclteu (Huang si colab., 2005). Determinarea activitii antioxidante prin metoda DPPH Metoda DPPH (1,1,-difenil-2-picrilhidrazil) este o metod spectrofotometric, larg utilizat pentru a testa abilitatea compuilor de a ndeparta radicalii liberi sau capacitatea lor de a dona hidrogen. Este utilizat pentru cuantificarea antioxidanilor n sisteme bilogice complexe (Miliauskas i colab., 2004). Protocolul de lucru folosit a fost conform metodei descrise de Brand-Williams i colab., (1995). Rezultate i discuii Separarea i cuantificarea prin HPLC a acizilor fenolici din plante medicinale Separarea unui amestec de standarde pure de acizi fenolici s-a realizat prin HPLC, n 30 minute. Ordinea eluiei, n funcie de timpii de retenie, a fost: acid galic (4.3), acid protocatecuic (6,.7), acid clorogenic (13.15), acid cafeic (14.18), acid p-cumaric (19.9), acid ferulic (21.75), acid sinapic (22.65), acid o-cumaric (25.4). n figura I.1 se regsete

imaginea comparativ a amprentei cromatografice a extractului alcoolic comparativ cu cel acid (oet) Ocimum basilicum.

Ocimum basilicum (Oet)

Ocimum basilicum (alcool)

mAU

Timp (min)/ Time (min

Fig. I.1. Imaginea comparativ a amprentei cromatografice a extractului alcoolic comparativ cu cel acid (oet) Ocimum basilicum (B) Fig. I.1. Comparing image of chromatographic fingerprint of alcoholic extract comparing to acidic (vinegar) for Ocimum basilicum (B) Analiza spectrometric UV-Vis a extractelor n alcool i n oet S-au identificat maxime specifice pe domeniul 280-340 nm, specifice acizilor fenolici i a flavonoidelor, care permit recunoaterea unor compui fitochimici caracteristici (markeri spectrali). Determinareac activitii antioxidante prin metoda DPPH Se constat c aciunea antioxidant maxim o are extactul de coacze negre att n alcool ct i n oet, dei concentraia de acizi fenolici este apropiat de a altor plante
6

ca: busuioc, mgheran, salvie. Acest fapt se explic prin potenialul crescut antioxidant al antocianilor, superior fa de acizii fenolici i flavonoide ndeosebi n mediul acid. Dintre plantele medicinale salvia are cea mai mare aciune antioxidant n alcool i de aproximativ 4 ori mai mic n oet (tabel I.1.)
Tabel I 1. Valorile concentraiilor de fenoli totali i activitatea antioxidant (prin metoda DPPH) a extractelor din cele 8 plante medicinale, n alcoole etilic i oet de mere Tabel I.1 Concentrations value of total poliphenols and antioxidant activity (throught DPPH assay) of extracts obtained from 8 medicinal plants in alcohol and vinegar
Nr. Planta Fenoli totali mg/ml extract alcoolic Activitatea antioxidant mM Trolox/ml extract alcoolic No. Plant Total phenolics mg/ml alcoholic extractt A B C D E F G H Angelica archang. Silybummarianum Ocimum basili. Ribes nigrum Coriandrum sativ. Majorana hortensi Rosmarinus off. Salvia officinalis 0.64 0.70 1.21 1.22 0.20 1.17 1.09 1.16 Antioxidant activity mM Trolox/ml alcoholic extract 6.07 4.22 6.59 40.08 4.78 7.39 6.92 37.50 Antioxidant activity mM Trolox/ml vinegar extract 0.38 0.83 4.46 47.85 3.25 1.63 3.30 8.04 Activitatea antioxidant mM Trolox/ml extact n oet

Glucozidele flavonoidice i compui procianidinici au tR mai mare de 30 minute i apar n cantiti semnificative n extractele studiate. Cantitatea de acizi fenolici este mai mic pentru extractele de angelica, armurariu i rozmarin. Extractul alcoolic de mgheran este cel mai bogat n compui fenolici. n general s-au identificat att n oet ct i n alcool regiuni specifice de recunoatere a plantei marcate prin dreptunghiuri n
7

Fig.I.1. Alcoolul are o capacitate mai bun de a asigura o extracie eficient a flavonoidelor comparativ cu oetul. Coninutul n polifenoli totali determinat prin metoda Folin-Cioclteu n tabelul III.3. se regsesc valorile obinute n urma determinrii cantitative a polifenolilor totali din extractele alcoolice, prin metoda spectofotometric. S-a observat c cea mai mare cantitate de polifenoli totali se gsete n extractul vegetal de coacze negre (1.22 mg/ml) i busuioc (1.21 mg/ml) n comparaie cu extractul de coriandru care conine doar 0.20 mg/ml. Coninut asemntor n polifenoli totali (mg/ml extract) au mgheranul i salvia. Concluzii Cea mai mare cantitate de polifenoli totali s-a gsit n extractul vegetal de Ribes nigrum i Ocimum basilicum; Cea mai mare activitate antioxidant corelat coninutul de polifenoli a fost obinut pentru extactul de Ribes nigrum att n alcool ct i n oet; Dintre plantele medicinale cea mai mare aciune antioxidant n alcool s-a nregistrat pentru extractul de Salvia officinalis; n urma acestui experiment s-a constatat c alcoolul asigur o extracie mai bun a flavonoidelor fa de oet; Oetul asigur o extacie mai bun a acizilor fenolici ;

Studiu experimental 2
Materiale i metode n cadrul acestui studiu s-au utilizat plante medicinale din speciile : Melissa officinalis (Roini) din Timioara (I), Melissa citronella (Cluj) (J); Echinaceea purpurea (Echinacea) (K) ; Cynara scolymus (Anghinarea) (L); Hypericum perforatum (Suntoare) (M); Calendula oficinallis (Glbenelele) (N).

Protocolul de extracie i evaluarea concentraiei fiecrui extract prin spectrometrie UV-Vis n acest studiu, pentru obinerea extractelor s-au utilizat 10g plant medicinal uscat la 100 ml solvent de extracie, fie amestec alcool etilic : apa n raport de 45:65 (%), fie amestec glicerina : ap n raport de 50:50 (%). Extracia s-a efectuat pe durata a 7 zile, la ntuneric i la temperatura de 25 C. Analiza spectrometric s-a fcut conform celei prezentate n sucapitolul III.1.2 din tez. Analiza HPLC Separarea HPLC a standardelor de acizi fenolici i flavonoide s-a realizat confrom protocolul menionat n subcapitolul. III.1.1.3 din tez. Rezultate si discuii Analiza HPLC n figura I.2. sunt prezentate cromatogramele HPLC extractelor de Calendula officinalis.
4000

C a le n d u la
3500 3000 2500

10

mAu

2000 1500 1000 500 0 2 4

1 - a c id g a lic 2 - a c id p r o t o c a te c u ic 4 - a c id c a f e ic 5 - a c id p - c u m a r ic 7 - a c id s in a p ic 8 - a c id o - c u m a r ic 1 0 - a c id r o z m a r in ic

n .i 1 2
6 8 10 12

n .i.

5 8

4
14 16 18 20 22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

T im p ( m in )

Fig. I.2. Cromatogramele HPLC ale extractelor de Calendula oficinallis Fig. I.2. HPLC cromatograms of extracts Calendula oficinallis n Tabelul I.2. sunt prezentate cantitile de acizi fenolici i flavonoide mg/g prob uscat. Acid galic (27.77 mg/g) conin doar glbenelele. Acestea conin cantitatea cea mai mare de acid cafeic (14.83 mg/g), acid sinapic (72.45 mg/g), acid o-cumaric (170
9

mg/g) i acid rozmarinic (60.23 mg/g). Cel mai bogat extract vegetal n acid p-cumaric (8.44 mg/g), este cel de Echinaceea purpurea. Acid ferulic (15.38 mg/g) cantitatea cea mai mare se afl n extractul de Melissa officinalis. Acid clorogenic (62.07 mg/g) i acid protocatecuic (129.18 mg/g) n cantitatea cea mai mare se afl n extractul de Hypericum perforatum. Flavonoidele se gsesc n cantitatea cea mai mare n extractul de suntoare i anume quercetina (176,22 mg/g) i kaempherol (127,27 mg/g). Extractul de anghinare conine n principal, miricetina (14,16 mg/g). Extractul de glbenele conine cea mai mare cantitate de acizi fenolici i flavonoide. Extractele de Melissa officinalis i citronella conin acid rozmarinic i acid cafeic n concentraii diferite. Comparnd coninutul de acizi fenolici i flavonoide (din extractele de plante medicinale studiate) s-a constatat c extractul de glbenele este cel mai bogat n acizi fenolici (250 mg/g), iar extractul de suntoare este cel mai bogat n flavonoide (quercetina i kaempherol cu un total de 300 mg/g).

Studiu experimental 3
Materiale i metode Vscul (Viscum album) a fost prelevat n diferite luni (decembrie, mai, iunie, iulie) pe parcursul anului 2009 din diferite locatiti din Nord-Vestul Transilvaniei. Probele au fost denumite n conformitate cu arborele gazd pe care l semi-paraziteaz, astfel: VAM vscul care paraziteaz mrul (Mallus domestica) i VAS vscul care paraziteaz salcmul (Robinia pseudoacacia). S-au utilizat frunze (VAM L i VAS L) i stem (VAM S i VAS S) de la aceste probe. Protocolul de extracie i analiza spectrometric Frunzele, respectiv stemul probelor de vsc au fost cntrite i rapid uscate (pentru a preveni aciunea enzimelor) ntr-o etuv la 900 C, timp de 48 de ore. S-a determinat apoi substana uscat a probelor. Pentru extracia compuilor bioactivi s-a folosit metoda descris de Sakakibara i col., 2003, cu unele modificri. Activitatea antioxidant a compuilor fitochimici se poate determina prin diferite metode. Compusii hidrofilici (compusii fenolici) au mecanisme ionice prin care actioneaza ca reducatori (donori de electroni) , metodele optime de determinare a aciunii antioxidante fiind FRAP i TEAC.
10

Tabel I.2. Concentraiile de compui fenolici individuali i totali obinute prin analiza HPLC din plantele medicinale investigate Table I.2. Concentrations of each phenolic compounds and total phenolics determined through HPLC analysis from medicinal plants investigated
Denumire prob Sample name Acid galic Acid protoca tecuic 54.05 0 31,09 0 129.18 26.5 Acid cloroge nic 0 0 0 31.70 62.07 0 Acid cafeic Concentraia compus fenolic mg/g prob Phenolic compound concentration mg /g sample Rutina Miricet Acid Acid Acid Acid ina pferulic sinapic ocumaric cumari c 0 0 8.44 0 0 5.72 15.38 0 0 13.71 0 0 0 0 0 0 0 52.45 0 7.15 0 0 8.07 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14.51 0 0 Totali polifenoli mg/g prob Total polyphenols mg/g sample 97.44 24.96 39.53 71.96 502.81 219.50

Querceti na

Kaemp herol

Acid rosmarini c 23.92 14.18 0 0 0 80

Melissa officinalis Melissa citronella Echinaceea purpurea Cynara scolymus Hypericum perforatum Calendula oficinallis

0 0 0 0 0 27.77

4,09 3,63 0 0 0 14.83

0 0 0 12.04 176.22 0

0 0 0 0 127.27 0

11

Cuantificarea acizilor fenolici prin Cromatografie de Lichide de nalt Performan Probele au fost extrase conform protocolului de la subcapitolul III.1.1.1. Extractul a fost supus analizei HPLC conform protocolului descris n subcapitolul
III.1.1.2. Cromatogramele obinute au fost monitorizate la 280 nm. Pentru

cuantificarea rezultatelor s-au determinat curbele de etalonare a 9 standarde (acid galic, acid protocatecuic, acid cafeic, acid siringic, acid ferulic, acid sinapic, naringina, quercetina, kaempherol). Evaluarea activitii antioxidante Metoda DPPH, s-a realizat conform protocolului descris n subcapitolul III.1.1.4. Metoda ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) este o metod folosit pentru msurarea capacitaii antioxidante a diferitelor probe. S-a urmarit principiul metodei stabilit de Huang si colab., 2002, ce const n msurarea degradarii unei molecule fluorescente n prezena unui generator de radicali liberi de tip peroxil (Huang i colab., 2002, Cao i colab., 1998). Metoda FRAP (ferric reducing antioxidant power) este o metoda simpl spectrofotometric care testeaz puterea antioxidant a probelor luate n studiu, i se bazeaz pe reducerea complexului tripiridiltriazina feric (Fe(III)-TPTZ) la complexul tripiridiltriazina feroas (Fe(III)-TPTZ) de ctre un reductant la pH acid (Benzie, 1996). Metoda TEAC (Trolox Equivalents Antioxidant Capacity) se bazeaz pe abilitatea antioxidanilor de a diminua viaa radicalului cation (ABTS+), un cromofor albastru verde care absoarbe la 734 nm, comparativ cu Trolox (Arnao i colab., 2001). Rezultate i discuii Cuantificarea acizilor fenolici din vsc prin metoda HPLC Fig.I.3.conine cromatogramele extractelor VAM ( L si S), i VAS ( L si S). Tabelul I.3. include valorile obinute pentru determinarea compuilor fenolici din

12

vsc de pe mr i salcm, calculate pe baza curbei de calibrare HPLC cu standarde, prezentat mai sus.

70000

VAML_H_AcEt
60000
1-Galic 2-Protocatecuic 7,597 3-Cafeic 13,154 4-Siringic 13,353 5-Ferulic 20,273 6-Sinapic 20,583 7-Naringina 27,585 8-Quercetina 30,014 9-Kaempherol 2 8

50000

mAU

40000

30000

20000
3 4

7 6

10000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Timp (min)

70000

VAMs_H_AcEt
1-Galic 4,570 2-Protocatecuic 7,627 3-Cafeic 13,089 4-Siringic 13,827 5-Ferulic 20,668 6-Sinapic 21,091 7-Naringina 27,530 8-Quercetina 9-Kaempherol -

60000

50000

mAU

40000

30000
1 2 3 4 56 7

20000

10000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tim p (m in)

Fig. I.3. Cromatograma HPLC a extractelor din frunze i stem de vsc VAM care paraziteaz mrul A). VAM L B). VAM S Fig. I.3. HPLC chromatogram of leaves and stem extracts of mistletoe that parasites apple tree (VAM) A). VAM L B). VAM S

13

Tabelul I.3. Compui polifenolici totali (acizi fenolici i flavonoide) n diferite extracte de vsc de pe mr i salcm Table I.3. Total polyphenolic compounds (phenolic acids and flavonoids) from different mistletoe extracts that parasites apple and acacia trees
Proba VAM S VAM L VAS L VAM S VAS S Compui polifenolici (acizi fenolici i flavonoide)* - (g/g prob uscat) 1. nd. 39.93 nd. nd. 2. 4.10 0.37 nd. 2.01 3. 6.39 nd. 6.81 nd. 4. nd. nd. nd. nd. 5. 7.81 9.93 6.88 nd. 6. 2.11 19.32 1.13 nd. 7. nd. nd. nd. nd. 8. 0.36 7.90 nd. nd. 9. nd. 7.58 nd. 6.38 Sample Phenolic compunds (phenolic acids and flavonoids)* - (g/g dry sample)

* - numerotarea i denumirea compiilor polifenolici este redat n Tabelul III.9. nd.** - nedetectabil

Se constat c VAM L i S sunt mai bogate n acid ferulic, avnd concentraii de 7.81 i respectiv 6. 88 g/g iar VAS L este bogat n acid galic, n timp ce VAS S n kaemferol, cu concentraii de 39.93 i respectiv 6.38 g/g. n extractele de vsc nu s-au pus n eviden prezena acidului siringic (4) i a acidului galic (1), cu excepia probei VAS L n care s-a detectat o cantitate remarcabil comparativ cu ceilali acizi fenolici, de 39.93 g/g prob uscat. De asemenea, frunzele de vsc sunt mai bogate dect stemul, probei VAM. n figurile I.3 i I. 4 sunt prezentate cromatogramele HPLC a extractelor de vsc recoltate de pe mr i salcm. Extractul de frunze de vsc care crete pe salcm este cel mai bogat n compui bioactivi. Evaluarea activitii antioxidante prin metodele DPPH, ORAC, TEAC, FRAP n ultimii ani au fost studiate intens efectele antioxidante a extractului de vsc aparinand speciei Viscum coloratum, activitate datorat n special flavonoidelor (Leu i colab., 2006, Yao i colab., 2006, Shi i col., 2006; Vica i colab., 2008; 2009). Majoritatea extractelor de plante prezint proprietai antioxidante, n special datorit compuilor bioactivi aparinnd clasei polifenolilor (Aqil i colab., 2006).
14

Determinarea activitii antioxidante prin metoda DPPH n Tabelul I.4. sunt prezentate gradul de inhibiie a radicalului DPPH exercitat de extractele apoase de vsc VAM i VAS (frunze i stem).
Tabel I.4. Capacitatea de inhibare a radicalului DPPH de ctre compuii cu potenial antioxidant din extractul de vsc Tabel I.4. Inhibition capacity of DPPH radical by coumpounds from mistletoe extract with antioxidant potential Probe Decembrie Samples December VAM L VAS L VAM S VAS S 5,20,00 6,050,01 9,450,01 Inbibare a DPPH (%) Mai Inhibition of DPPH (%) May 12,090,01 23,230,01 7,40,00 21,370,01 July 2,220,01 11,490,04 2,560,02 Iulie

Valorile nregistrate prin metoda DPPH, arat c activitatea antioxidant este semnificativ mai mare n luna mai, explicabil prin stimularea activitii enzimatice specifice sezonului de primvar. Determinarea activitii antioxidante prin metoda ORAC Valorile obinute prin metoda ORAC arat c acestea sunt influenate de perioada de recoltare a produsului vegetal. Valorile ORAC sunt mai mari pentru probele recoltate n decembrie. Determinarea activitii antioxidante prin metoda TEAC Valorile TEAC obinute n urma investigrii diferitelor extracte de vsc, au artat c activitatea antioxidant cea mai mare s-a nregistrat n luna mai ndeosebi n stem . Determinarea activitii antioxidante prin metoda FRAP Din punct de vedere al valorilor FRAP am obtinut diferene ntre extractele recoltate n diferite perioade de timp. Dintre extractele investigate, cea mai mare activitate antioxidant a prezentat-o extractul VAS S (4,230,87 mg/L echivalent vitamina C/g stem) recoltat n luna mai.
15

Concluzii Concentraia total de compui fenolici n vscul de salcm (VAS L) ajunge la valori de aprox. 84 mg/kg plant uscat, n timp ce la mr (VAM L) de 4 ori mai puin. In acelai timp, n stem, la VAM concentraia de compui fenolici este de aprox 14 mg/kg, mai mare de 2 ori dect la VAS S. Comparativ cu plantele medicinale de mai sus, concentraia n compui fenolici este semnificativ mai mic. Activitatea antioxidant hidrofil la vsc a fost evaluat prin metodele FRAP i TEAC, respectiv DPPH i ORAC. Activitatea antioxidant este mai mare la probele recoltate n luna mai, cnd procesele biosintetice sunt mai intense. Metodele TEAC si FRAP dau valori mici i similare la cele dou tipuri de extracte. n concluzie, considerm c cele dou metode DPPH i ORAC dau informaii complementare i evideniaz specific potenialul diferit al extractelor VAM i VAS. Corelnd compoziia n compui fenolici cu aciunea antioxidant s-a constatat c vscul recoltat de pe salcm VAS are valori maxime de compui fenolici i concomitent, o activitate antioxidant intens.

TESTAREA IN VITRO I IN VIVO A ACIUNII ANTIMICOTICE A EXTRACTELOR VEGETALE INVESTIGATE PE DIFERII PURTTORI DE CANDIDA ALBICANS
Plantele medicinale sunt utilizate ca tratamente alternative n diferite stri de boal. Tot mai multe recomandri susin tratamentele alternative bazate pe extracte de plante deoarece ofer i protecie organismului n lupta cu patogenii i stimuleaz sistemul imun (Bilia i colab., 2002; Cichewicz i colab.,1996; Dauria i colab., 2005.). Candida albicans este un patogen ce poate cauza infecii locale sau sistemice, putnd afecta pacienii ce au o imunitate sczut i pe cei supui unor tratamente ndelungate cu antibiotice (Istrati-Ghinescu.,1979; Zhang i colab., 2003; Polak i colab., 1985). Potenialul patogen se manifest numai n anumite

16

condiii, dar exist i factori favorizani care duc la manifestarea acestuia (Cutler, 1991). n urma tratamentului cu extracte vegetale la om i animale, pn acum, nu s-au obinut rezultate spectaculoase mpotriva acestui patogen, dei se cunosc cteva specii de plante care au efect anti-candidozic. Aceste date preliminare i unele contradictorii justific derularea unor cercetri care s identifice extracte de plante cu aciune anti-candida (Petran i colab., 2006; Lemar i colab., 2002; Shams i colab., 2006; Mir-Rashed i colab., 2010). Obiectivele prezentului capitol sunt: Evaluarea (calitativ i cantitativ) a aciunii diferitelor extracte de plante aromatice i medicinale (caracterizate conform datelor din capitolul III.) in vitro, pe diferite tulpini de Candida albicans (faringian, vaginal sau nazal) recoltate de la purttori aparent santoi. Au fost elaborate 6 module experimentale, fiecare cu protocol specific. Utilizarea pentru tratamente locale (21 de zile) in vivo a extractelor care au dovedit aciune inhibitoare in vitro. n funcie de prezena sau absena patogenului, dup 21 de zile s-a trecut sau nu, la nsmnarea pe mediul lichid. La probele care au fost pozitive s-au nsmnat tulpinile pe mediul solid i lichid i dup 24, 48, 72 h s-a identificat microscopic prezena patogenului i s-a determinat cantitativ rata sa de proliferare n prezena aceluiai tip de extract vegetal, care s-a dovedit eficient n modulele experimentale in vitro. Re-evaluarea sensibilitii in vitro a tulpinilor de Candida (recoltate de la purttorii tratai in vivo) fa de aceleai tipuri de extracte.

Studii in vitro
IV.1.1. Materiale i metode Efectul in vitro al aciunii antifungice al extractelor de plante medicinale a impus utilizarea de tulpini patogene de Candida prelevate de la diferii purttori P1P11. S-au prelevat tulpini de Candida albicans fie de la purttori aparent sntoi, fie de la purttori cu diferite afeciuni. Tulpinile recoltate au fost inoculate pe medii de cultur standardizate.
17

Material vegetal: Extractele vegetale utilizate au fost de Ocimum basilicum (busuioc), Coriandrum sativum (coriandru), Rosmarinus officinalis (rozmarin), Salvia officinalis (salvie), Angelica archangelica (angelica), Silybum marianum (armurariu), Ribes nigrum (coacze negre), Majorana hortensi (mghiran), Echinaceea purpurea (echinacea), Hypericum perforatum (suntoare), Calendula officinalis (glbenele), Melissa officinalis (Roini) din Timioara, Melissa citronella, Cynara scolymus (anghinare), Vscum album (vsc). Descrierea etapelor experimentale Pentru a obine tulpina de patogen dorit, s-a procedat astfel: s-au izolat n condiii de laborator fungi din prelevatele patologice (secreie faringian, secreie nazal, secreie vaginal) prin nsmnare prin etalare n puncte fixe i mai trziu prin alte tehnici, pe mediu solid i lichid. Dup o incubare de 24, 48, 72 h, placa Petri s-a examinat macroscopic i microscopic. Culturile de Candida albicans de la purttori au fost incubate la 37 C, urmnd a fi folosite fragmente pentru testrile ulterioare. Fiecreia i s-a atribuit un numr de identificare i s-au notat caracterele culturale. Determinri cantitative (pe mediul lichid) Evaluarea cantitativ a activitii antimicotice ,,in vitro s-a realizat n urma punerii n contact a tulpinii agentului fungic n cauz cu antimicoticul pe care l-am considerat control pozitiv (hexoral) i cu extractele vegetale menionate mai sus. n concentraii de la 0,2% pn la 8%. Dup obinerea culturii pure de C. albicans s-au luat fragmente din colonie i s-au transplantat n mediu Sabouraud lichid. O importan deosebit am acordat-o anamnezei purt torilor (P1P11), care pe lng simptomele subiective caracteristice candidozei a relevat prezena unei simptomatologii de baz, date de o boal de ordin general sau loco-regional, cu ecouri asupra economiei ntregului organism, predispozante la micoz. Evaluarea aciunii antifungice s-a fcut n ase module experimentale, prezentate n tabelul I.5.

18

Tabel I.5. Module experimentale i extracte utilizate pentru testarea aciunii anti-Candida in vitro. Tulpini recoltate de la diferii pacieni ( P1-P11) Table I.5. Experimental modules and extracts used for testing the action of anti-Candida in vitro. Strains collected from different patients (P1-P11)
Modul experimental Experimental module 1. Abreviere purtator Abreviation bearer P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 Sursa de recoltare Prelevation source Faringian Extracte utilizate Extract studied Busuioc, Coriandru,Rozmarin, Salvie Angelica, Armurariu, Coacze negre, Mgheran Echinaceea, Suntoare, Glbenele Amestec extracte A1 busuioc+coriandru (1:1) A2 rozmarin+salvie (1:1) Melissa Anghinare HA si HG VAM S si VAS L VAS S i VAS L VAM S Melissa Echinaceea Calendula Amestec extracte A3 busuioc+coriandru (1:3) A4 salvie+rozmarin (1:3)

2. 3. 4. 5.

Faringian Vaginal Nazal Faringian

6.

Vaginal

Module experimentale

Patogenul Candida albicans prelevat de la purttori a fost co-cultivat cu diferite concentraii de extract vegetal (0,2 %; 0.5 %; 1 %; 2 % ; 3 %; 4 %; 5 %; 6 %; 7 % , 8 %) n mediul de cultur lichid. Pentru fiecare prob experimental (abreviat PE), mediul de cultur lichid a fost inoculat cu aceeai tulpin de Candida albicans (106 celule ml ) prelevat de la purttorii P1-P11). Toate analizele s-au realizat in triplicat. La fiecare 24 ore s-a msurat absorbia specific a fiecrei probe la = 560 nm, utiliznd un spectrofotometru de tip ABLE-JASCO 530. Rata de proliferare celular a fost determinat prin msurarea densitii optice la 24, 48, 72 h de la cocultivare cu extractele vegetale i/sau Hexoral.
19

IV.1.1.4 Evaluare calitativ (pe mediu solid)

Metoda calitativ determin gradul de inhibiie pe mediul solid i const n msurarea diametrului ariei de inhibiie a agentului fungic, ca urmare a aciunii produsului antimicotic. Rezultatul s-a citit la un interval de 24, 48, 72 ore. Pentru studiile pe mediul solid Sabouraud s-au folosit plcile notate control - n care patogenul s-a dezvoltat n condiii normale i plci n care au fost fcute co-culturi cu concentraii de extracte vegetale de 0.2 %; 0.5 %; 1 %; 2 %; 3 %; 4 %; 5 %; 6 %; 7 %; respectiv 8 %. S-a urmrit evoluia/involuia culturii agentului patogen la 24, 48, i 72 ore prin comparare cu placa martor. Culturile s-au examinat zilnic, urmrindu-se aspectul macroscopic (suprafaa, relieful, culoarea, prezena pigmentrii, consistena i viteza creterii). n timpul dezvoltrii coloniile i schimb aspectele macroscopice. Aspectele coloniilor s-au notat periodic pentru a surprinde toate caracterele culturale. Paralel s-a fcut i examenul morfologic al fragmentelor de colonii. Temperatura de incubare dup nsmnare a fost de 36-37C. n funcie de gradul de inhibiie a dezvoltrii coloniilor patogene s-a stabilit caracterul aciunii extractelor vegetale: antifungic pronunat; antifungic moderat, antifungic slab. Dup nsmnari repetate, trei la numr, pe mediu Sabouraud s-a determinat caracterul extractului. Rezultate i discuii
Evaluarea cantitativ a aciunii antifungice Modul experimental 1

Figura I.4. reprezint gradul de inhibiie al diferitelor extracte vegetale comparativ cu controlul negativ, exprimat n procente, dup 24, 48 i 72 ore de cocultivare cu specia C. albicans. La purttorul P1 se constat o variaie a efectului dependent de doz i de tipul de extract. n general extractul de Coriandrum sativum (coriandru) a avut cel mai intens efect antifungic (apropiat de controlul pozitiv/hexoral), urmat de Ocimum basilicum (busuioc), n timp ce Rosmarinus officinalis (rozmarin), Salvia officinali (salvie) au avut efect inhibitor redus. Ordinea descresctoare efectului antifungic la acest purttor a fost: Hexoral> coriandru>busuioc> salvia>rozmarin
20

Perioada 24-48 ore pare s fie optim pentru a identifica activitatea antifungic. Dup 48 ore aceasta se menine aproape constant.
40 20 0 -20 Ocimum basilicum -40 -60 -80 -100 24h 48h 0,2% PURTTOR P1/ BEARER P1 72h 24h 48h 8% 72h Coriandrum sativum Rosmarinus officinalis Salvia officinalis Control +

Fig. I.4. Gradul de inhibiie (%) al diferitelor extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans recoltat de la purttorul P1 Fig. I.4. The degree of inhibition (%) of different vegetal extracts co-cultured with C. albicans collected from P1 bearer

concentraia de 8%, are aciune inhibitoare, maxim la 48 de ore, urmat de extractul de Angelica archangelica (angelica). Extractul de Silybum marianum (armurariu) are un efect de inhibare a creterii patogenului Candida numai n primele ore, dar devine stimulator la 72 de ore. Ordinea descresctoare efectului antifungic la acest purttor a fost: Hexoral> coacaze>maghiran > angelica>armurariu La purttorul P3 toate cele 3 extracte (echinaceea, suntoare, calendula) au efect inhibitor la toate concentraiile, dupa 48 de ore, i maxim dup 72 de ore. Asemenea celorlalte variante, valorile inhibiiei de la 48 de ore nu cresc semnificativ la 72 de ore. Ordinea descresctoare efectului antifungic la acest purttor a fost: Hexoral = echinaceea= sunatoare >calendula Dupa 72 ore, la o concentraie de 8%, efectul a fost similar pentru toate extractele i similar cu cel al hexoralului.

Grad de inhibiie (%) Inhibition degree(%)

La purttorul P2, extractul de Ribes nigrum (coacze negre), ndeosebi la

21

Concluzii
Datele obinute n modulul experimental 1 au demonstrat aciunea inhibitoare semnificativ a extractelor de plante, ndeosebi pentru coriandru, coacze, echinaceea, suntoare i calendula. Aciunea a fost dependent de concentraie i de durata cocultivrii.

Modul experimental 2
Figura I.5. reprezint gradul de inhibiie al diferitelor extracte vegetale comparativ cu controlul negativ, exprimat n procente, dup 24, 48 i 72 ore de co-cultivare cu C. albicans prelevat de la purttorul P4.
20

Grad de inhibiie (%) Inhibition degree (%)

-20

-40 A1 A2 -60 Control +

-80

-100 24 h 48h 0,2% PURTTOR P4/ BEARER P4 72h 24 h 48h 8% 72h

Fig I.5. Gradul de inhibiie (%) al diferitelor extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans recoltat de la purttorul P4 Fig I.5. The degree of inhibition (%) of different vegetal extracts co-cultured with C. albicans collected from P4 bearer Amestecul A1 (busuioc+coriandru, 1:1) a fost, n mod semnificativ mai activ dect A2 (rozmarin + salvie, 1:1), att la 0,2% ct i la 8%, dar nu s-au remarcat diferene semnificative ntre % de inhibiie la aceste concentraii, att la 48 de ore ct i la 72 de ore. Am remarcat efect sinergic ntre aciunea inhibitoare a extractului de coriandru i busuioc (observat la P1) n timp ce asocierea rozmarinului cu salvia (care nu au avut efecte semnificative independent) nu au mbuntit efectul antifungic prin asociere. La purttorul P4 amestecul de extracte A1 (busuioc+coriandru, 1:1 ) a fost, n mod semnificativ mai activ dect A2 (rozmarin + salvie, 1:1), att la 0,2% ct i la 8%, dar nu s-au remarcat diferene semnificative ntre % de inhibiie la aceste concentraii, att la 48 de ore ct i la 72 de ore. S-a remarcat un efect sinergic ntre aciunea inhibitoare a 22

extractului de coriandru i busuioc (observat la P1) n timp ce asocierea rozmarinului cu salvia (care nu au avut efecte semnifcative independent) nu au mbuntit efectul antifungic prin asociere. La purttorul P5 acelai amestec de extracte a determinat rezultate similare demonstrnd c efectul antifungic al amestecului A1 este reproductibil. Efectul antifungic al extractului A2 ( rozmarin + salvie, 1:1) a fost i n acest caz mai redus, reprezentnd aprox. 60% din efectul extractului A1. La purttorul P6 aceleai amestecuri de extracte A1 i A2 au determinat rezultate similare cu purttorul P5, demonstrnd c efectul lor antifungic este reproductibil. Efectul antifungic al extractului A2 ( rozmarin + salvie, 1:1) a fost i n acest caz mai redus, repezentnd aprox. 60% din efectul extractului A1. Concluzii Tulpinile de Candida faringiene de la cei trei purttori P4-P6 au rspuns similar fa de extractele adminstrate. Extractul cu activitate fungic evident este amestecul busuioc+coriandru, 1:1, ndeosebi la o concentraie de 8%. Modul experimental 3 Figura I.6. reprezint gradul de inhibiie (%) indus de extracte hidroalcoolice de Melissa officinalis (Roini) din Timioara, Melissa citronella, Cynara scolymus (anghinare) comparativ cu controlul negativ, exprimat n procente, asupra patogenului C. albicans dup 24, 48 i 72 ore..
40 20 0 -20 Melissa officinalis -40 -60 -80 -100 24 h 48h 0,2% PURTTOR P7/ BEARER P7 (HA) 72h 24 h 48h 8% 72h Melissa Timi oara Melissa citronella Cynara scolymus Control +

Fig I.6.Gradul de inhibiie al diferitelor extracte vegetale hidroalcoolice (HA) co-cultivate cu C. albicans vaginal recoltat de la purttorul P7 Fig I.6. The degree of inhibition (%) of different hidroalcoholic vegetal extracts cocultured with C. albicans collected from P7 bearer 23

Grad de inhibiie (%) Inhibition debree (%)

Toate extractele hidroalcoolice (HA) au avut aciune mai slab dect hexoralul, dar Cynara scolymus (anghinare) a dovedit a avea efect inhibitor la concentraie de 8%, indiferent de durata incubrii (constant la 24, 48 si 72 ore). n general, extractele de Melissa officinalis (Roini) din Timioara, Melissa citronella au indus efecte similare, apropiate de anghinare dup 72 ore de co-cultivare la 8% superioare.

Concluzii
n prezena extractelor vegetale hidroalcoolice i hidroglicerice patogenicitatea i virulena celulelor de Candida albicans este redus, efectul inhibitor al extracului de anghinare, la 8%, dup 72 de ore fiind superior Hexoralului. Extractele hidroglicerice (HG) au avut efect inhibitor mai intens dect cele hidroalcoolice, dar nu semnificativ statistic n general aciunea inhibitoare este maxim la 72 ore de co-cultivare dar este eficient i la 24 ore. Extractele de Melissa au avut aciune inhibitoare similar, constant pe interval 48-72 de ore.

Modul experimental 4
Gradul de inhibiie (%) indus de extracte de Viscum album (vsc) este reprezentat n figura I.7. comparativ cu controlul negativ, asupra patogenului C.
40 20 0 -20 VAM S -40 -60 -80 -100 24 h 48h 0,2% PURT TOR P8/BEARR 8 72h 24 h 48h 8% 72h VAM L VAS S VAS L CONTROL+

albicans dup 24, 48 i 72 ore.

Fig. I.7.Gradul de inhibiie al diferitelor extracte de vsc co-cultivate cu C. albicans nazal recoltat de la purttorul P8 Fig I.7. The degree of inhibition (%) of different mistletoe extracts co-cultured with C. albicans collected from bearer P8 24

Grad de inhibiie (%) Inhibition degree (%)

Concluzii Extractul de vsc ce paraziteaz mrul (VAM) a demonstrat efect similar inhibitor cu controlul pozitiv, chiar mai intens n cazul extractului de stem (S) dect cel de frunze (L), mai intens la mr dect la VAS (S sau L). Extractul de VAM S a inhibat creterea culturii de C. albicans chiar de la 24 de ore, fiind mai eficient dect Hexoralul la concentraia de 8%. Efectul inhibitor a fost semnificativ mai mare la concentratia de 8% i nu a crescut semnificativ de la 48 la 72 de ore. n general aciunea inhibitoare a vscului a fost mai redus dect la plantele medicinale investigate n modulele experimentale 1-3. Modul experimental 5 Pornind de la rezultatele obinute n modulele anterioare, au fost selectate extractele cu efect inhibitor mai intens pentru a fi co-cultivate, n aceleai condiii cu Candida albicans faringian. Pentru tulpina Candida recoltat de la purtatorul P9, comparativ cu vscul, toate celelalte extracte Melissa officinalis (Roini) din Timioara, Echinaceea purpurea (echinacea), Calendula oficinallis (glbenele) au avut efect inhibitor mai intens dect extractul de vsc controlul pozitiv (Hexoral). ndeosebi extractele de Calendula officinalis (glbenele) i Echinaceea purpurea (echinacea) au indus inhibiie de peste 70%. Nu au fost remarcate deosebiri semnificative ntre gradul de inhibiie la 0,5% i 7% la cele trei extracte active din plante medicinale. S-a confirmat faptul c extractul de vsc e mai puin activ (Tabel I.6.)

25

Tabelul I 6. Valorile absorbanelor la =560nm, comparativ pentru diferite concentraii de extract de plante co-cultivate cu C. albicans faringian prelevat de la purttorul P9 Table I.6 Absorbance values at =560nm, comparative for different plant extract concentrations cocultured with faringian C. albicans collected from bearer P9

Denumire extract Extract name

Durata (h) Period (h) 0,5 24

Valorile absorbanelor Absorbance values 3 1,620,04 0,9150,021 0,520,049 0,45 0 1,400,028 7 1,380,084 0,8250,035 0,4250,04 0,350,063 0,930,014

VAM S MELISSATIM ECHINACEEA CALENDULA CONTROL + CONTROLVAM S MELISSATIM ECHINACEEA CALENDULA CONTROL + CONTROLVAM S MELISSATIM ECHINACEEA CALENDULA CONTROL + CONTROL-

1,60,141 1,040,04 0,580,028 0,500,007 1,560,035 20,028

48

1,590,007 1,010,021 0,6650,03 0,680,014 1,660,014 2,20,021

1,49 0,035 0,930,014 0,560,028 0,580,042 1,450,021

1,30,042 0,830014 0,470,042 0,350,049 1,340,035

72

1,5650,049 1,1550,02 0,360,014 0,690,028 1,480 2,40

1,480,056 0,9850,021 0,340,007 0,640,035 1,270,007

1,2150,077 0,740,028 0,250,00 0,530,049 1,200,021

26

Concluzii
Aciunea inhibitoare a extractului de Echinaceea purpurea (echinacea) i Calendula oficinallis (glbenele) sunt similare, la toate intervalele de co-cultivare i nu depend de doz. Intensitatea inhibiiei este apropiat de a hexoralului. Semnificativ mai redus este efectul antifungic al extractului de Melissa officinalis (Roini) din Timioara n acest caz, i minim pentru extractul de Viscum album (vsc). Comparativ cu controlul pozitiv, la 24 i 48 de ore sunt mai inhibitoare, dar la 72 de ore devin aproximativ egale.

Modul experimental 6
Tinnd seama de rezultatele obinute n modulul experimental 1 i 2, n acest modul s-au utilizat extracte de busuioc + coriandru (1:3) (extract A3), comparativ cu extracte de salvie+rozmarin (1:3) (extract A4). Tabelul IV.14 include valorile absorbanei obinute la =560nm, comparativ pentru hexoral, amestecuri vegetale A3, A4 co-cultivat cu tulpina de Candida albicans vaginal prelevat de la purttorul P11, comparativ cu controlul pozitiv i negativ. Gradul de inhibiie al amestecuri de extracte vegetale A3 si A4 comparativ cu controlul negativ, exprimat n procente, dup 24, 48 i 72 ore de co-cultivare cu C. albicans
100 80 60 Grad de inhibiie (%) Inhition degree (%) 40 20 0 A3 -20 -40 -60 -80 -100 24 h 48h 0,2% PURTTOR P11/BEARER 11 72h 8 24 h 48h 8% 72h A4 CONTROL+

vaginal

este

reprezentat

figura

I.8.

Figura I.8. Gradul de inhibiie al celor dou amestecuri de extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans recoltat de la purttorul P11 Fig. I.8. The degree of inhibition (%) of two vegetal extracts co-cultured with C. albicans collected from P11 bearer 27

Determinrile cantitative efectuate n modulule experimentale 1-6 au permis evidenierea aciunii antifungice a extractelor de plante medicinale, unele din ele similare cu ale preparatului hexoral, la concentraii similare. De remarcat: 1. Extractele pe baza de coriandru i busuioc au avut aciune intens antifungic fa de tulpinile de Candida faringian i vaginal 2. Extractele de Echinaceea, calendula i suntoare au avut efect intens inhibitor asupra tulpinilor de Candida faringian 3. Extracia n hidroglicerin are efecte similare cu extractul hidroalcoolic i este recomandabil, innd cont de lipsa toxicitii glicerinei fa de alcool 4. Extractele de vsc au efect inhibitor semnificativ mai slab dect al plantelor medicinale. Totui extractul recoltat de pe stem de vsc de mr a avut aciune inhibitoare mai mare dect extractele similare de vsc din frunze sau alte plante (salcm). 5. S-au remarcat efecte reproductibile ale acelorai extracte testate pe tulpini recoltate din zona faringian sau vaginal. 6. Efectele au avut o dependen de doza aplicat n unele cazuri (excepie fcnd extractele intens antifungice unde i dozele mici au indus efect semnificativ) i au demonstrat aciunea antifungic optim pe intervalul de tratament de 48-72 de ore. 7. Efectul amestecurilor A3 i A4 este similar cu efectul Hexoralului, si este similar dup 72 de ore, nu depinde de concentraie (0, 2% sau 8%). n acest caz, spre deosebire de modulul experimental 2, extractul de salvie cu rozmarin a fost mai eficient, ca inhibitor al tulpinii. Se poate aprecia c aceste amestecuri de extracte vegetale pot fi folosite ca ageni antifungici n tratamentul candidozelor, mai ales n cazul candidozelor rezistente la tratamentul antifungic clasic.

28

Evaluare calitativ (pe mediu solid)

Aspectul morfologic al tulpinilor de C. albicans recoltate de la purttorii investigai (P1 P11)

Figura I.9. a i b reprezint aspectul morfologic macroscopic al tulpinilor de C. albicans cultivate pe mediu de cultur solid (a) i recoltate de la purttori (b)

a. Fig. I.9. a. Aspectul morfologic macroscopic al tulpinilor de C. albicans cultivate pe mediu de cultur solid Fig. I.9. a. Morphologic aspect of C. albicans strains cultivated on solid culture media

Coloniile de Candida albicans au avut o cretere rapid pe mediul solid. Aspectul macroscopic al culturilor: colonii rotunde, mici, de culoare crem sau crem-galbuie, reliefate, convexe, umede lucioase, de consisten cremoas, ca untul, neaderente de mediu ce trimit filamente fine n profunzimea mediului. Identificarea fungilor patogeni a fost efectuat prin examenul microscopic direct al probelor patologice prelevate de la purttori i prin colorarea frotiurilor. Produsul patologic recoltat n condiii sterile s-a examinat la microscop, cu obiectivul cu imersie. Celulele levurice gen Candida apar ca formaiuni rotunde, ovalare. n cmpul microscopic apar strlucitoare, unele avnd muguri, fapt care le difereniaz de orice alt element. Dimensiunile celulelor variaz: diametrul lor fiind de 2-3 microni la celulele tinere, ceva mai mare la celulele mature. Pentru examinarea la microscop s-au folosit fie suspensii din cultur, fie mici eantioane. Figura I.10 a-d reprezint aspectul microscopic al tulpinilor de C. albicans identificate la purttori.

29

a.

b.

Fig. I. 10. Aspect microscopic al celulelor fungice a .Gram pozitiv b. nativ Fig. I. 10. Microscopic aspect of fungic cells a.Gram positive coloration b nativ

Aspectul microscopic al culturilor era de ,,pietre n pavaj: Celule levurice (blastospori) de 2-4 microni diametru, rotunde sau ovalare, multe n curs de nmugurire; filamente (filamentarea este caracteristic pentru Candida); clamidiospori (numai la Candida albicans)-celule sferice de 20-22 microni diametru, refringente, cu dublu contur, ce se gsesc la extemitatea unor ramuri pseudomiceliene. Se produc atunci cnd cultura de Candida a fost trecut pe mediul P.C.B. Dup examinare s-a ridicat obiectivul, s-a ters uleiul de cedru de pe obiectivul cu imersie i s-a scos lama de pe platina microscopului. Evaluarea efectului antifungic Pentru a stabili un sistem rapid, screening de evaluare a efectului antifungic al diferitelor extracte, am selectat extractele care au dovedit aciune inhibitoare in vitro, prin determinri cantitative i le-am utilizat, la concentraii de 7-8 % pentru a identifica, pe mediu solid gradul de inhibiie. Au fost acordate scoruri de la + la +++, n funcie de numrul coloniilor de Candida care s-au dezvoltat dup nsmnare cu tulpina Candida i/ sau dup tratamentul cu extracte vegetale. Tabelul IV.15. reprezint dinamica de inhibiie celular (+ = inhibiie minim, +++ = inhibiie maxim), a tulpinii C. albicans n funcie de concentraia fiecrui extract ce s-a folosit ca tratament. Se observ c cea mai eficient concentraie a extractului vegetal este cea mai mare (8%), cu excepia extractului de Calendula oficinallis (glbenele), Echinaceea purpurea (echinacea) i Ocimum basilicum (busuioc) care au fost eficiente i la 7%. O relaie proporional cu durata incubrii a fost observat pentru Echinaceea purpurea (echinacea), coriandru, coacze negre i busuioc, dar nu i pentru Calendula oficinallis (glbenele), a crei actiune nu a depins de durata incubrii.
30

Pe baza scorurilor se pot ierarhiza efectele acestora, n ordine descresctoare, astfel: Coriandru 8% > Echinaceea 7%> Sunatoare 8%> Calendula 7% > Busuioc 8% > Coacaze negre 8% > Melissa Timisiara 8% > Melissa Cluj = Melissa citronella 8%=anghinare8%= salvie 8% = vsc 8% = rozmarin 8%> maghiran 8%. Extractele de angelica i armurariu au prezentat efecte minime. Corelaii ntre rezultatele obinute n determinrile calitative i cantitative la concentraiile cele mai eficiente Tabelul I.7 reprezint rezultatele examinrii macroscopice i microscopice a probelor prelevate la purttorii investigai (P1- P11). Conform datelor obinute se constat corelaii pozitive si semnificative ntre evalurile calitative (scoruri +, ++, +++) i evalurile cantitative ( %- procente de inhibiie). Datele prezentate indic faptul c la purttorii de tulpini de Candida albicans faringian , efecte antifungice semnificative se obin cu extracele de coriandru 8 %, dup 72 de ore ( inhibiie 90%), cu extracte de Calendula ( pe tot intervalul 24-72 ore) sau cu amestec de coriandru i busuioc (A1) 8 % dup 48 de ore. n mod surprinztor, pe tulpini de Candida albicans vaginal, anghinarea 8% i amestecul de salvie i rozmarin (A4) au avut efect inhibitor maxim, dup 72 de ore, i respectiv 48 de ore, confirmat calitativ i cantitativ. Aceste date sunt extrem de utile pentru a demonstra c extractele de plante pot avea, n mod performant, similar cu hexoralul- antifungic de sinteza, la concentraii similare, efect inhibitor la fel de intens.

31

Tabelul I.7 Rezultatele examinrii macroscopice i microscopice a probelor prelevate de la purttorii investigai i corelaiile ntre scorurile obinute pe mediul solid i procentul inhibiiei n comparaie cu controlul, pe mediul lichid Table. I.7 Results obtained after macroscopic and microscopic examination os samples collected from bearer investigated and correlations between scores on solid media and percent of inhibition comparing to control
Nr.purttor Agent patogen Extract utilizat la co-cultivare( %) Identificat No. Bearer P1 Patogen identificated Candida albicans faringian Candida albicans faringian Candida albicans faringian Candida albicans faringian Candida albicans faringian Candida albicans faringian Candida albicans vaginal Candida albicans nazal Candida albicans faringian Candida albicans faringian Candida albicans vaginal Timp Scor evaluare calitativ Score calitative evaluation ++ +++ +++ + +++ ++ ++ ++ +++ + +++ ++ + +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++ +++ + ++ ++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + ++ ++ Grad de inhibiie (%) Inhibition degree (%) -68 -73 -90 -32 -82 -61 -42 -45 -88 -49 -84 -77 -37 -82 -88 -48 -86 -81 -80 -77 -92 -39 -57 -57 -82 -86 -75 -75 -77 -82 -24 -83 -90

Extract utilized for Time co-cultivation (%) Coriandru 8 % 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72

Coacze negre 8% Echinaceea 8% Coriandru + busuioc A1 8% Coriandru + busuioc A1 8% Coriandru + busuioc A1 8% Anghinarea 8% VAM S 8%

P2 P3 P4

P5 P6

P7

P8 P9 P10

Calendula 7% Echinaceea 7%

P11

Salvia + rozmarin A4 8%

32

IV.1.3. Concluzii ( studii in vitro) Cercetrile efectuate, prin determinri cantitative i calitative pe mediu lichid i respectiv solid, au demonstrat posibilitatea utilizrii preparatelor de origine vegetal pentru combaterea tulpinilor de Candida albicans. Aceste date pot fi utile n elaborarea de noi formule antifungice i n stabilirea perspectivei de utilizare clinic a lor. n urma co-cultivrii unor extracte vegetale cu Candida albicans se observ urmtoarele: La purttorii de tulpini de Candida albicans faringian, se obin efecte antifungice semnificative cu extractele de Coriandrum sativum (coriandru) 8 %, dup 72 de ore sau cu extracte de Calendula oficinallis (glbenele) 7-8% (pe tot intervalul 24-72 ore) sau cu Rosmarinus officinalis (rozmarin) i Salvia officinali (salvie) (A4), Ocimum basilicum (busuioc) i Coriandrum sativum (coriandru) (A1) 8 % dup 48 de ore. Pe tulpini de Candida albicans vaginal, Cynara scolymus (anghinare) 8% i amestecul Salvia officinali (salvie) i Rosmarinus officinalis (rozmarin) (A4) au avut efect inhibitor maxim, dup 72 de ore, i respectiv 48 de ore, confirmat calitativ i cantitativ. Punctul critic pentru inhibarea creterii celulare a fost stabilit n intervalul 24-48h (pe ambele medii:lichid i solid). Eficiena extractelor a fost n general observat ncepnd cu intervalul 24-48 ore, cnd rata de proliferare in vitro a C. albicans este maxim. n general extractele de plante la concentraii de peste 1%, devin mai eficiente, ajungnd la o inhibare a creterii celulare la concentraii de 7-8%. Aproape toate extractele vegetale au demonstrat inhibarea proliferrii celulei fungice, dar efectul inhibitor a fost dependent de extractul vegetal, de doz i timp de interaciune in vitro. Relaiile doz-efect nu au fost intotdeauna direct proporionale, ele au depins de natura plantei i a solventului utilizat (hidroalcoolic sau hidrogliceric). Extractele hidroglicerice au aciune antifungic mai bun i sunt mai puin toxice la nivel celular dect cele hidroalcoolice. Trebuie inut cont de faptul c purttorii de tulpini Candida P1-P11 au avut sensibilitate diferit datorit cantitilor de antibiotice pe care le-au luat, candidozele ap rnd mai frecvent la doze mari si dup o administrare mai ndelungat a antibioticelor.

33

Studii in vivo
Materiale i metode Extractele care au demonstrat aciune antifungic in vitro au fost aplicate la aceeasi purttori, pe durata a 21 de zile, prin badijonaj local. Metodele microbiologice i spectrometrice utilizate au fost prezentate la cap. IV.1.1. Dup 21 zile de tratament, s-au prelevat probe de la acela purtator i s-au nsmnat n acela tip de mediu solid, evalund rezultatele macroscopic i microscopic. n funcie de prezena sau absena patogenului pe mediul solid s-a trecut sau nu, la nsmnarea pe mediul lichid. La probele care au fost pozitive s-au nsmnat tulpinile pe mediul lichid i dup 24, 48, 72 ore s-a identificat microscopic prezena patogenului i s-a determinat cantitativ rata sa de proliferare n prezenta aceluiai tip de extract vegetal, care s-a dovedit eficient n modulele experimentale in vitro. Rezultate i discuii Tabelul I.8. prezint comparativ efectul de inhibiie, msurat calitativ i cantitativ (in vitro, pe mediu lichid, pe durata a 72 de ore), ca o indicaie a dinamicii de dezvoltare individual a celulelor de Candida albicans prelevate de la aceeai purttori, dup administrarea in vivo, a extractului vegetal care se presupune c a inhibat patogenul.
Observaii:

Se constat c purttorii P1, P4, P5, P6 si P9 au rspuns bine tratamentului aplicat cu extractele de plante i n urma prelevrii de probe de la acela purttor (faringian) nu s-au mai evideniat tulpinile de Candida albicans. La purttorii P2, P10 i P3 , tratai cu extracte de Echinaceea (P2, P10) i respectiv, coacze negre 8% (P3) s-au identificat acelai tip de tulpini de Candida faringian i dup tratament in vivo, dar care au fost inhibate cu 77%, 81%, respectiv 89%, dup reincubare cu aceleai extracte. La purttorii P7 i P11 de Candida vaginal, tratai cu anghinare 8%, respectiv extract A4 8%, dupa tratamentul in vivo s-au mai evideniat aceleai tip de tulpini, dar care au rmas sensibile fat de aceste extracte, fiind inhibate cu 82%, respectiv 90% dup 72 de ore.

34

Tabelul I.8. Efectul de inhibiie, msurat calitativ sau cantitativ (in vitro, pe mediu lichid, pe durata a 72 de ore) , ca o indicaie a dinamicii de dezvoltare individual a celulelor de Candida albicans prelevate de la aceeai purttori, dup administrarea in vivo, a extractului vegetal care se presupune c a inhibat patogenul Tabelul I.8. Inhibition effect, calitativ or cantitative measured (in vitro, on liquid media, for 72 h), like an indication of dinamics of individual developing of Candida albicans cells colected from the same bearers, after administration in vivo of vegetal extract, which is supposed that inhibited the patogen Numr purttor Agent patogen Concentratia Timp Scor Efect cantitativ mediu identificat tratamentului ( % inhibitie) solid in vitro (%) Bearer number Patogen identificated Treatment Time Score Cantitativ concentration effect (% of solid inhibition= media (%) P1 (diabetic) 24 Coriandru P1(diabetic) 8% 48 72 P2 (tratament antibiotic) P2(tratament antibiotic) P3 (aparent sntos) P4(apparently healthy) Candida albicans faringian Coacaze negre 8% 24 48 72 24 48 72 P4(aparent sntos) P3(apparently healthy) A1 8% 24 48 72 P5(aparent sntos) P5(apparently healthy) A1 8% 24 48 72 P6(aparent sntos) P6(apparently healthy) A1
8%

++ ++ ++ + + +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ + ++ ++

- 43 - 67 - 77 - 35 - 41 -89 -65 -56 -82 -45 -51 -62 -67 -76 -81 -24 -83 -90

Candida albicans faringian

Echinaceea 8%

24 48 72

P7 (tratament antibiotic) P7(tratament antibiotic)

Candida albicans vaginal

Anghinare 8%

24 48 72

P8 (imunitate sczut) P8(low immunity)

Candida albicans nazal

VAM S 8%

24 48 72

P9 (diabetic) P9(diabetic)

Calendula 7%

24 48 72

P10 (diabetic) P10(diabetic)

Candida albicans faringian

Echinaceea (7%)

24 48 72

P11 (aparent sntos) P11(apparently healthy)

Candida albicans vaginal

A4
8%

24 48 72

+++ grad de inhibiie pronunat; ++ grad de inhibiie moderat; + grad de inhibiie slab - nu s-au dezvoltat germeni

35

Concluzii (studii in vivo) 1. Extractele vegetale selecionate a avut succes pentru aprox. 50% dintre purttorii luai n studiu: 5/11 purttori nu au mai avut contaminare fungic dup tatament, 2. La restul purttorilor, dac s-au identificat tulpini la aceeasi locaie, acestea au rmas sensibile prin incubarea in vitro efectuat pe durata a 72 de ore. La acetia se poate recomanda continuarea tratamentului in vivo cu aceleai tipuri de extracte, care s-au dovedit potrivite i eficiente, dar nu sufieciente. 3. n cazurile n care patogenul exist, s-a observat c are o sensibilitate mai mare fa de aciunea antifungic a extractului vegetal selectat i utilizat.

CONCLUZII GENERALE
Obiectivele cercetrilor care fac obiectul prezentei teze de doctorat au fost: 1. Realizarea i caracterizarea unor extracte din 16 tipuri diferite de plante aromatice i medicinale din flora spontan sau cultivate n Romnia, studiind compoziia acestora n compui fenolici n relaie cu aciunea lor antioxidant. 2. Testarea comparativ in vitro i in vivo a aciunii extractelor din aceste plante asupra unor diferite tulpini de Candida albicans (faringian, nazal, vaginal) prelevate de la 11 purttori diferii, prin evaluarea calitativ i cantitativ a aciunii acestora. 1. Rezultatele aferente obiectivului 1 au fost obinute prin metodologii specifice de analiz chimic. Astfel: a. Analizele spectroscopice UV-Vis au fost utile n screeningul de evideniere a compuilor fitochimici specifici plantelor incvestigate. Cu ajutorul maximelor specifice de absorbie i valorilor absorbanei s-au putut recunoate i identifica grupe de compui fitochimici caracteristici b. Determinarea calitativ i cantitativ a compuilor bioactivi din plantele medicinale luate n studiu s-a realizat prin cromatografia de lichide de nalt perfoman (HPLC) cuplat cu detecie cu fotodiod. S-au
36

stabilit amprentele caracteristice fiecrui tip de extract i s-au dozat concentraiile de compui fenolici, pe baza unor curbe de calibrare specifice. c. Capacitatea antioxidant a extractelor a fost evaluat comparativ prin patru metode i a fot corelat cu compoziia n compui fenolici. n raport cu rezultatele obinute pot fi evideniate urmtoarele concluzii, obinute din trei studii experimentale: La extractele de plante investigate n studiul experimental 1 s-a constatat c: Extractele hidroalcoolice de coacze negre, busuioc, salvie au fost cele mai bogate n compui fenolici (corespunznd la 2000-12200 mg/ kg plant), iar coninutul acestora s-a corelat pozitiv cu capacitatea lor antioxidant (determintat prin metoda DPPH), att n oet ct i n alcool, semnificativ statistic pentru coacze i busuioc. Acestea au fost selectate pentru a fi investigat efectul lor antifungic. La extractele de plante investigate n studiul experimental 2 s-a constatat c: Cea mai mare concentraie de polifenoli se ntlnete n suntoare i glbenele. Extractul de suntoare este cel mai bogat n compui fenolici (peste 500 mg/ kg suntoare), fa de 220 mg/kg glbenele. Extractul de glbenele este cel mai bogat n acizi fenolici, iar extractul de suntoare este cel mai bogat n flavonoide (quercetina i kaempherol cu un total de 300 mg/g). Extractele de Melissa- Timioara au fost mai bogate n compui fenolici dect Melissa citronella, fapt explicabil dpdv genetic, Melissa citronella fiind orientat spre biosinteza de uleiuri volatile n detrimentul acizilor fenolici. La extractele de vsc investigate n studiul experimental 3 s-a constatat c: Concentraia total de compui fenolici n vscul de salcm (VAS L) ajunge la valori de aprox. 84 mg/kg plant uscat, n timp ce la mr (VAM L) de 4 ori mai puin. n acelai timp, n stem, la VAM concentraia de compui fenolici este de aprox 14 mg/kg, mai mare de 2 ori dect la VAS S. Comparativ cu plantele medicinale de mai sus, concentraia n compui fenolici este semnificativ mai mic.

37

 Activitatea antioxidant hidrofil la vsc a fost evaluat prin metodele FRAP i TEAC, respectiv DPPH i ORAC. Activitatea antioxidant este mai mare la probele recoltate n luna mai, cnd procesele biosintetice sunt mai intense. Metodele TEAC i FRAP dau valori mici i similare la cele dou tipuri de extracte. n concluzie, considerm c cele dou metode DPPH i ORAC dau informaii complementare i evideniaz specific potenialul diferit al extractelor VAM i VAS. Corelnd compoziia n compui fenolici cu aciunea antioxidant s-a constatat ca vscul recoltat de pe salcm VAS are valori maxime de compui fenolici i concomitent, o activitate antioxidant intens. Pe baza acestor rezultate s-au selectat 14 extracte de plante care au fost supuse testrilor in vitro privind activitatea lor anti-candida. Acestea au fost: fie extracte individuale de busuioc, coriandru, rozmarin, salvie, angelica, armurariu, roini, anghinare, coacze negre, maghiran, echinaceea, suntoare, calendula, vsc (VAM, VAS), fie amestecuri de extracte de busuioc cu coriandru, rozmarin cu salvie. 2.Rezultatele aferente obiectivului 2 (studii in vitro si in vivo) au fost obinute prin metodologii specifice de microbiologie cuplate cu analiza spectrometric. S-au utilizat extracte vegetale (soluii hidroalcoolice sau hidroglicerice) individuale de: coriandru, busuioc, salvie, rozmarin, coacze negre, armurariu, angelica, anghinare, Echinaceea, glbenele, vsc, sau n amestec (coriandru + busuioc, salvie + rozmarin) n diferite rapoarte. Evaluarea efectelor inhibitoare ale extractelor de plante (la diferite concentraii) a fost fcut calitativ (prin microscopie i pe mediu solid, cu determinarea unor scoruri de inhibiie) sau cantitativ, pe mediu lichid, prin analiz spectrometric, pe durata a 24-72 de ore, prin co-incubare a tulpinilor recoltate de la 11 purttori cu concentraii diferite de extracte de plante, comparativ cu un control pozitiv (hexoral- produs antifungic de sintez) i un control negativ. S-au constatat corelaii pozitive i semnificative ntre evalurile calitative (exprimate n scoruri +, ++, +++) i evalurile cantitative ( %- procente de inhibiie).

38

2a. Pe baza datelor obinute la studiile in vitro (6 module experimentale) se pot

evidenia urmtoarele concluzii: 1. Pe baza scorurilor obinute n evalurile calitative, se pot ierarhiza efectele extractelor, n ordine descresctoare, astfel: Coriandru 8% > Echinaceea 7%> Sunatoare 8%> Calendula 7% > Busuioc 8% > Coacaze negre 8% > Melissa Timisiara 8% > Melissa Cluj = Melissa citronella 8%=anghinare8%= salvie 8% = vsc 8% = rozmarin 8%> maghiran 8%. Extractele de angelica i armurariu au prezentat efecte minime. De remarcat: Extractele pe baz de coriandru i busuioc au avut aciune intens antifungic fa de tulpinile de Candida faringian i vaginal. Extractele de Echinaceea, glbenele i suntoare au avut efect intens inhibitor asupra tulpinilor de Candida faringian Extractele de vsc au efect inhibitor semnificativ mai slab dect al plantelor medicinale. La purttorii de tulpini de Candida albicans faringian, s-au obinut efecte antifungice semnificative cu extractele de coriandru 8 %, dupa 72 de ore sau cu extracte de Calendula 7-8% (pe tot intervalul 24-72 ore) sau cu salvie si rozmarin ( A4), coriandru si busuioc (A1) 8 % dup 48 de ore. Pe tulpini de Candida albicans vaginal, anghinarea 8% i amestecul salvie i rozmarin (A4) au avut efect inhibitor maxim, dup 72 de ore, i respectiv 48 de ore, confirmat calitativ i cantitativ. 2. Aproape toate extractele vegetale au demonstrat inhibarea proliferrii celulei fungice, dar efectul inhibitor a fost dependent de extractul vegetal, de doz i timp de interaciune in vitro. n general extractele de plante la concentraii de peste 1%, devin mai eficiente, ajungnd la o inhibare a creterii celulare la concentraii de 7-8%. 3. In vitro, aciunea antifungic a fost optim pe intervalul de tratament de 48-72 de ore, perioad critic pentru inhibarea creterii celulare (pe ambele medii, lichid i solid). Eficiena extractelor a fost n general observat ncepnd cu intervalul 24-48 ore, cnd rata de proliferare in vitro a C. albicans este maxim. 4. Extractele hidroglicerice au aciune antifungic mai bun i sunt mai puin toxice la nivel celular dect cele hidroalcoolice.

2b. Studiind eficiena in vivo a extractelor vegetale care au dovedit aciune anticandida in vitro, la aceeai purttori investigai, s-a constatat c dup 21 zile de

39

tratament local, tulpinile de Candida prelevate, dac au fost prezente, au fost mai mult sau mai puin sensibile fat de acelai tip de extract. Astfel: Extractele vegetale selecionate a avut succes pentru aprox. 50% dintre purttorii luai n studiu: 5/11 purttori nu au mai avut contaminare fungic dup tratamentul in vivo La restul purttorilor, dac s-au identificat tulpini la aceeasi locaie, acestea au rmas sensibile prin incubarea in vitro efectuat pe durata a 72 de ore cu acelai tip de extract. La acetia se poate recomanda continuarea tratamentului in vivo cu aceleai tipuri de extracte, care s-au dovedit potrivite i eficiente, dar nu suficiente. n concluzie, putem aprecia c cercetrile efectuate deschid perspectiva utilizrii extractelor de plante aromatice i medicinale, bogate n compui fenolici, pentru combaterea tulpinilor de Candida albicans. Aceste date pot fi utile n elaborarea de noi formule antifungice i n stabilirea protocolului de utilizare clinic a acestora.

BIBLIOGRAFIE 1. ARNAO M. B., CANOA A., ALCOLEA J. F., ACOSTA M., 2001. Estimation of free radical quenching activity of leaf pigment extracts. Phytochem Anal. ,12: 138-143. 2. AQIL F., AHMAD I., MEHMOOD Z., 2006. Antioxidant and free radical scavenging properties of twelve traditionally used Indian medicinal plants. Turk J. Biol., 30: 177183. 3. BILIA A., BERGONZI M., GALLORI S., MAZZI G., VINCIERI F., 2002. Stability of the constituents of Calendula, milk-thistle and passionflower tinctures by LC-DAD and LC-MS, J. Pharm. Biomed. Anal., 30: 613-24. 4. BENZIE I. F., STRAIN J. J., 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of ''antioxidant power'': The FRAP assay. Anal. Biochem., 239: 70-76. 5. BRAND-WILLIAMS W., CUVELIER M. E, BERSET C., 1995. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie/Food Science and Technology, 28: 25-30. 6. CAO G., PRIOR R. L 1998. Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin. Chem., 44: 1309-1315 7. CICHEWICZ R. H., THORPE P. A., 1996. The antimicrobial properties of chile peppers (Capsicum species) and their uses in Mayan medicine. J. Ethnopharmacol., 52: 6170. 8. CUTLER J.E., 1991. Putative virulence factors of Candida albicans. Ann Rev Microbiol., 45: 187-218. 40

9. COLOSI I., C. COSTACHE, M. JUNIE, 2009.Patogenia infeciilor cu Candida: factorii de patogenitate i factorii de risc ai infeciilor cu fungi din genul Candida, Clujul MedicalVol. LXXXII - nr. 1, 30-34 10. COWANS M. M., (1999) Plant Products Agents, Clinical Microbiology Reviews, 564582. 11. DAURIA F., TECCA M., STRIPPOLI V. , SALVATORE G. , BATTINELLI L., MAZZANTI G., 2005 Antifungal activity of Lavandula angustifolia essential oil against Candida albicans yeast and mycelial form, Med. Mycol., 43 (5): 391-396. 12. FROMTLING RA, RHODES JC, DIXON DM., 2003, Taxonomy, classification and morphology of the fungi, in: MURRAY PR (ed.) Manual of Clinical Microbiology. Vol. 1. 8th ed. Washington D.C (USA): ASM PRESS, 1653-9 13. HUANG D., OU R., HAMPSCH-WOODILL M., FLANAGAN J. A., PRIOR R. L., 2002. . High-throughput assay of oxygen radical absorbance capacity (ORAC) using a multichannel liquid handling system coupled with a microplate fluorescence reader in 96-well format, J. Agric Food Chem., 50 (16): 4437-44. 14. ISTRATI-GHITESCU farmaceutice,12. 15. LEMAR K.M., TURNER M. P., LLOYD D., 2002. Garlic (Allium sativum) as an antiCandida agent: a comparison of the efficacy of fresh garlic and freeze-dried extracts.Journal of Applied Microbiology, 93: 398405. 16. LEU Y-L., HWANG T-L., CHUNG Y-M., HONG P-Y., 2006. The inhibition of superoxide anion generation in human neutrophils by Viscum coloratum, Chem. Pharm. Bull., 54: 1063-1066. 17. MILIAUSKAS G., VENSKUTONIS P. R., VANBEEK T. A. ,2004. Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chem., 85: 231237. 18. MIR-RASHED N., CRUZ I., JESSULAT M., DUMONTIER M., CHESNAIS C., NG J, AMIGUET V.T., GOLSHANI A., ARNASON J. T., SMITH M. L., 2010. Disruption of fungal cell wall by antifungal Echinacea extracts.Med Mycol. 19. ODDS FC.1979. Candida and Candidosis. Leicester University Press; 92-113 20. OSSET J, GARCA E, BARTOLOM RM, ANDREU A., 2001, Role of Lactobacillus as protector against vaginal candidiasis, Med Clin (Barc). 117 (8):285-288 I., 1979. Candidozele dup antibioterapie, Produse

41

21. PETRAN MARIANA, SOCACIU C., 2006. Evaluation of antimicotic effect of calendula officinalis in vitro, Buletin USAMV-CN, 63: ISSN 1454:2382. 22. PETRAN MARIANA, ATANASIU S., MIU C., 2006. Preliminary study regarding efficacity of hexoral drug and dill, marygold, melissa plant extracts against pathogen Candida albicans.The Romanian Review of Laboratory Medicine, 4: 79:80. 23. POLAK A., ODDS F. C., LDIN E., SCHOLER H. J., 1985. Correlation of susceptibility test results in vitro with response in vivo: ketoconazole therapy in a systemic candidiasis model.Chemotherapy, 31 (5): 395:404. 24. SAKAKIBARA H., HONDA Y., NAKAGAWA S., ASHIDA H., KANAZAWA K., 2003. Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits, and tea, J. Agric. Food Chem., 51: 571-581. SCALBERT A., 1991. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry, 30: 3875-3883. 25. SHAMS-GHAHFAROKHI M., SHOKOOHAMIRI M., AMIRRAJAB N., MOGHADASI B., GHAJARI A., ZEINI F., SADEGHI G., RAZZAGHI-ABYANEH M., 2006. In vitro antifungal activities of Allium cepa, Allium sativum and ketoconazole against some pathogenic yeasts and dermatophytes Fitoterapia, 77 (4): 321-3. 26. 27. SHI Z-M., FENG P., JIANG D-Q., WANG X-J., 2006. Mistletoe alkali inhibits peroxidation in rat liver and kidney, World J. Castroenterol, 12: 4052-4055. SHER A., 2009. Antimicrobial Activity of Natural Products from Medicinal Plants.Gomal Journal of Medical Sciences, 7: 72-78 28. VICA S., RUGINA D., SOCACIU C., 2008. Antioxidant activities of Viscum albums leaves from various host trees, Bulletin UASVM, Agriculture, Cluj-Napoca, 65 (1): 327332. 29. VICAS S., RUGINA D., PANTEA S., SOCACIU C., 2009. The Morphological Features and UV-VIS Analysis of Some Taxonomic Markers of Genus Viscum, Bulletin UASVM, Agriculture, 66 (1): 193-200. 30. ZHANG N., HARREX A. L., HOLLAND B. R., FENTON L. E., CANNON R. D, 2003. Sixty alleles of the ALS7 open reading frame in Candida albicans: ALS7 is a hypermutable contingency locus. Genome Res 13: 20052017. 31. YAO H., LIAO Z-X., WU Q., LEI G-Q., LIU Z-J., CHEN D-F., CHEN J-K., ZHOU TS., 2006. Antioxidative flavanone glycosides from the branches and leaves of Viscum coloratum, Chem. Pharm. Bull, 54: 133-135.

42