Introducere Cartoful este ceea mai importanta specie a genului Solanum.

Tuberculii nu sunt utilizati doar ca o sursa importanta de amidon, ci de asemenea si ca o surs valoroas de proteine, sunt bogati n unii aminoacizi esentiali care nu au fost gsiti n alte culturi, lipide si sruri. Reproducerea clasica a cartofului este dificil din cauza propagarii sale vegetative. Un soi nou poate fi obtinut doar n 8-10 ani, dup o grijulie selectare a unui numr mare de plante. Noile strategii de manipulare genetica a plantelor trebuie s fie considerate ca o alternativ foarte promittoare pentru reproducerea de cartofi. Hibridizarea somatica a cartofului cu specii slbatice de Solanum a fcut posibil transferarea n germoplasma (plasma germinativa) cartofului a unor caractere foarte importante, cum ar fi: rezistenta la virusi (S. tuberosum + S. brevidens) rezistenta la Phytophtora infestans si Globodera palida (S. tuberosum + S. circaeifolium) rezistenta la colorado (S. tuberosum + S.chacoense) Rezistenta la Phytophtora infestans si Colorado sunt dificile de obtinut, dac nu imposibil s se introduc n germoplasma de cartofi prin reproducere conventionala. Multe alte tehnici, cum ar fi variatia somaclonala, Agrobacterium mediat sau transferul direct al genei au fost de asemenea, folosite cu succes pentru mbuntatirea genetic a cartofului. Ca un prim pas pentru manipularea genetica a cartofului, prin hibridizare somatica inter-sau intraspecific, transferul de gene direct sau variatie protoclonala, trebuie s fie dezvoltate metode eficiente de izolarea a protoplastei si culturii. Protoplastele de cartofi au fost cultivate cu succes pentru multe tetraploide sau linii dublu-haploid si pentru mai mult de 30 de specii slbatice. S-a raportat aici regenerare plantelor din protoplast mezofilic izolat, a soiului tetraploid Desire si a liniei dublu-haploid 687061/1. Linia dublu-haploid a fost derivata prin partenogenez (Form de dezvoltare a unui organism dintr-un ovul sau dintr-o oosfer nefecundate, prezent la unele animale i plante (inferioare)) dup incrucisarea liniei 38.7/49 cu Solanum phureja. Linia dublu-haploida a fost furnizate de catre Dr.Traian Gorea de la institutul din Brasov. Materiale si metode protoplastul mezofilic a fost izolat din plante de S. tuberosum cultivar Desire (2n = 4x) cultivate in vitro si micropropagate pe mediu RMB5. Linia dublu-haploida 687061/1 a fost cultivata pornind de la tuberculi. Plantele au fost cultivate n perlit, in laborator si fragmentele nodale au fost utilizate pentru a initia cultura in vitro. Lastarii au fost sterilizati cu etanol 70% timp de 3 minute si 10% hipoclorit de sodiu timp de 10 minute. Lastarii au fost apoi splati de 3 ori cu apa sterila mediu MS (Murashige i Skoog, 1962) cu 20 gr/ l zaharoz, 2,5 mg / l. acidul giberelic (GA3) si agar 0,8% (pH = 5.6) a fost utilizat pentru a initia cultura in vitro.

Plantele cultivate in vitro au fost in continuare micropropagate pe mediu MS cu 10 gr / l zaharoz i agar 0,8% (pH = 5.8). Cartofi din culturile in vitro au fost meninuti ntr-o camer de cretere cu fotoperioada de 16 h, la 25 C/23 C Temperatura i intensitatea luminii de 4000 luxes. Plantele vechi de 3-4 saptamani au fost utilizate pentru izolarea protoplastului atat penttru linia dubluhaploida cat si pentru ceea tetraploida. Pentru izolarea protoplatilor s-au recoltat frunzele i s-au taiat n felii mici. Mixul de enzime utilizat pentru izolarea protoplastului a fost n cazul Desire: 1% (g / v) Celulaza R-10, 0.25 (w / v) Macerozyme R-10 n mediu de izolare W-S-S la un pH =5.8. i n cazul liniei dublu-haploid: 1,5% Celulaz R-10, Macerozyme 0,3% n mediu de izolare W-S-S la un pH = 5,5. Amestecurile de enzime au fost sterilizate cu filtru Incubare n solutia de enzime a fost facut pentru 18 h la temperatura camerei la Desire, i 4 h la lumina obscura pe un agitator la 8-10 rpm, pentru linia dublu-haploida. Dup izolare, suspensia cu protoplaste a fost filtrata printr-un nailon cu ochiurile (100 m )) i s-au plutit ????protoplastele prin centrifugare la 1500 rpm, timp de 5 min. Protoplastele mezofilice colectate au fost spalate de doua ori cu 0,5 M sorbitol sau soluie W5 la 800 rpm timp de 3 min. Protoplastele mezofilice izolate au fost cultivate in mediu lichid W-S-S. In cazul Desire s-au utilizat 2 protocoale diferite

n primul protocol densitatea protoplatilor a fost de 2 x 104/ml, prima dilutie a mediului W-S-S a fost facut dupa 16 de zile de la cultur 1:1, si doua alte diluie de mediu a fost efectuate n prima lun a culturii. Dup 6 sptmni, coloniile au fost transferate pe mediu solid ST-1 . Calusurile au fost transferate dup 10 sptmni pe mediu proaspt si dupa inca 3 luni pe mediu ST-2 Lstarii regenerati au fost transferati pe mediu S-3 n cazul n care s-au dezvoltat radacinile. Al doilea protocol de cultur a avut urmtoarele schimbri: soluiile de enzime au fost pregtite n sruri CPW cu 0,4 M zaharoz (pH = 5.8) Prima dilutie cu mediu W-S-S (1: 1) a fost fcut dup 10 zile de la cultura, dilutia a doua dup 2 sptmni de la cultur cu mediu W-S-S, care conine 0,5 mg/l NAA ( naphthaleneacetic acid) i 1 mg/l zeatina n raport de 1: 1, i 0.2 ml din ultimul mediu a fost adugat la fiecare 2 zile pentru urmtoarele 3 sptmni de cultur. Coloniile au fost transferate la mediu ST-1 dup 5 sptmni de cultur.

Protoplastul mezofilic a liniei dublu-haploid 687061/1 au fost cultivat n mediu lichid WS-S la o densitate de 2.8 x 105 protoplaste/ml. Prima dilutie a fost fcut dup 4 zile la un raport de 1: 2 (mediu vechi: mediu W-SS proaspat). Diluiea a doua cu W-S-S s-a efectuat dup 3 sptmni de cultura la raportul de 1: 1.Colonii celulare formate dup 7 sptmni de cultura au fost transferate pe mediu ST-1. Mediu ST-2 a fost completat cu 1 mg/l zeatine la primul transfer al calusului i cu 0,2 mg/l BA (6 - benzylaminopurine) i 0,5 mg/l GA3 (gibberellic acid), pentru al doilea transfer.Lastarii care au format rdcini au fost transferati pe mediu S-3. Pentru toate protocoalele de cultur testate, protoplaste culturilor au fost meninute la lumin diminuat la 27 -28 C. Coloniile de pe mediu ST-1 , au fost transferate la lumina (300 luxes, 16 h fotoperioada) la 25 / 22 C iar atunci cnd au fost transferate in al doilea rnd pe mediu ST-1 mediu, au fost n continuare pstrate la 4000 luxes, 16 h fotoperioada i 25 / 23 C..