REPUBLIQUE DU TCHAD ========== MINISTERE DE LA SANTE PUBLIQUE ========= SECRETARIAT GENERAL

UNITE * TRAVAIL * PROGRES

GUIDE PRATIQUE DE TRANSFUSION SANGUINE

A lusage du personnel des centres de transfusion et banque de sang.

Avril 2004

I.

LE DON DE SANG

I.1. Prise en charge du donneur - Accueil - Entretien - Suivi I.2. I.3. I.4. I.5. I.6. II. II.1. II.2. II.3. II.4. II.5. III. III.1. Gestion du fichier des donneurs Prlvement Geste durgence de ranimation Prparation Conservation et stockage IMMUNO HEMATO Groupe sanguin ABO et Rh Difficults de groupage Test de coombs direct et indirect Test de compatibilit Recherche dACP irrgulier QUALIFICATION BIOLOGIQUE DU DON Dpistage

VIH HBs Hbc Syphilis IV. PRPARATION CONDITIONNEMENT CONSERVATION DISTRIBUTION DES PSL

I. PRISE EN CHARGE DU DONNEUR

I.1. Accueil
Il est un indniable quen matire de transfusion sanguine, le plus important est le donneur. Sans les donneurs, aucun service de transfusion ne peut fonctionner. Cest pourquoi le don de sang doit seffectuer dans les meilleurs conditions de scurit et de confort pour le donneur si non la rputation du service en ptit favorisant ainsi la rticence au don de sang volontaire. Par consquent les personnels des centres de transfusion doivent faire preuve de beaucoup de courtoisie et de professionnalisme. Ils doivent avoir une tenue lgante et soigne, symbole dun haut degr dhygine personnel. Ils doivent tre dun abord facile et communiquer avec les donneurs surtout lors de la prise de sang. Ils doivent avoir une attitude amicale, mais aussi ils doivent faire preuve de professionnalisme lors des diffrents contacts pour que les donneurs aient limpression dtre en de bonnes mains. Sil faut beaucoup de temps deffort et dargent pour recruter avec succs des donneurs volontaires, il suffit pour les perdre dune petite ngligence ou dune maladresse du personnel avant, pendant ou aprs le don. Voici la liste de quelques manquements qui peuvent faire du don de sang une exprience dsagrable pour le donneur. Recevoir les donneurs dans un local dont lhygine ou la scurit laissent dsirer ; Ne pas veiller ce que lentretien pr don se droule dans lintimit ; Leur imposer une attente prolonge au cours du prlvement ; Ne pas accueillir personnellement chaque donneur son arrive ; Bavarder avec dautres membres du personnel en ignorant les donneurs ; Faire des commentaires indiscrets au sujet du donneur a propos de ses rsultats ; Ngliger de remercier les donneurs ou de leur exprimer sa gratitude sous une autre forme ; Ne pas servir au donneur une collation pendant quil se repose aprs le don du sang.

1.1.1. Entretien
Lentretien vise slectionner les donneurs et dont le but est dune part de protger ces derniers de possibles effets nocifs du don sur leur sant, et dautre part viter la transfusion dventuelles maladies aux receveurs. Lentretien repose sur la

pratique dun interrogatoire au moyen dun questionnaire. Les questions devraient permettre au donneur de comprendre le rapport entre le don et certaines maladies transmissibles par celui ci, de lui rappeler quil est susceptible dtre infect par lune delle et dexplorer son tat de sant en gnral. La mesure de la tension artrielle, la dtermination du taux dhmoglobine o de lhmatocrite et dans une moindre mesure la temprature corporelle devrait permettre de dterminer si le donneur est apte ou non au don. Cet examen doit se faire dans des conditions garantissant la confidentialit la confiance et respect du secret mdical. Ainsi, Le prestataire de service recherche les affections qui contre indiquent le don du sang. Si une contre indication existe, le prestataire doit prparer psychologiquement le donneur sans leffrayer. En dbut dentretien, le prestataire informations sur le don de sang bnvole : donne quelques

o Le principe thique o Le droulement du prlvement(quantit prleve, intervalle entre deux dons etc.) o Les analyses qui seront effectues sur le prlvement dans lintrt du donneur et du receveur o Le devenir de son sang(transfusion en pdiatrie par exemple) Le prestataire doit ensuite informer le donneur que lentretien est couvert du secret mdical et quil doit rpondre sincrement Le prestataire doit sassurer que le donneur a bien compris le questionnaire et laider complter certaines rponses Le prestataire doit rappeler au donneur sa responsabilit en matire de scurit transfusionnelle Le prestataire rappelle au donneur les analyses qui seront effectues sur le don en vue de garantir sa propre scurit mais aussi celle du receveur. Il profite de cette occasion pour linformer de la ncessit de connatre les rsultats des analyses en vue de sa propre scurit. IL prpare ainsi le donneur en vue de lacceptation des rsultats

Le prestataire rappelle enfin les principales contre - indications au don de sang et les comportements risque. Etant donn que certaines personnes se sentent dj anxieuses lors quelles se prsentent dans un centre de transfusion pour donner leur sang, pensez ce quelles pourraient ressentir lide de rpondre des questions trs personnelles au sujet de leur comportement sexuel risque . En ce qui concerne la formulation des questions relatives la vie sexuelle, il doit prter une attention particulire au respect de la dignit du donneur tout en rappelant le couvert du secret mdical. Pour atteindre les objectifs ci dessus dfini, il faut ncessairement tablir un bon rapport avec les donneurs. Pour tablir un bon rapport, il faut matriser les techniques de communication verbale cest dire la faon de parler et de poser des questions aux donneurs ; et les techniques de communication non verbale cest dire la faon de se comporter envers aux.

1.1.1.1.

Communication non verbale

La cl dune communication non verbale efficace est de traiter le patient avec respect et de lui accorder toute votre attention. Ces quatre points trs simple peuvent savrer dterminants lorsquil sagit de gagner la confiance des donneurs.

Prserver le caractre priv et confidentielle de lentretien : lentretien doit avoir lieu dans un endroit calme o lon ne vous drangera pas ; Regarder le patient en face ; de faon percevoir les motions cls qui vous permettront de ragir convenablement ; Ecouter attentivement le donneur ; montrez au donneur que vous lcoutez en vous penchant lgrement vers lui, loccasion faites un signe de tte affirmatif o faite des commentaires pour lencourager ; Inviter le donneur sasseoir ; restez aussi prs de donneur quil est culturement acceptable de la faire ; il vaut mieux se tenir cot dune table ou dun bureau que dernire.

1.1.1.2.

Communication verbale

Pour recueillir les informations ncessaire lacception ou lexclusion au don du sang, il faut poser beaucoup de questions non seulement sur ses symptmes et ses antcdents mdicaux, mais aussi sur son pass sexuel pour ce faire, il est utile de savoir poser des questions. Formulez toujours vos questions de faon polie et respectueuse ; Employez des mots que les donneurs comprennent ; Posez des questions prcises ; Posez des questions qui ne comportent aucun jugement moral ; Demandez aux donneurs la permission de les interroger sur leur IST ou leur comportement sexuel. N.B. : il y a en gros deux sortes de questions que lon peut poser : Des questions fermes, qui appellent de la part du donneur une rponse en quelques mots, souvent oui ou non ; Des questions ouvertes permettant aux donneurs de donner une rponse plus longue, dexpliquer leur faon ce qui ne va pas ou ce qui ressentent. La meilleure faon dutiliser chacun des deux types de questions est de commencer lentretien par des question ouvertes, lorsquon sait que les personnes prouvent souvent des difficults fournir des renseignements au sujet de leur propre sexualit ; les questions ouvertes leur permettront de se sentir laise. Une fois que vous tes sr davoir cerner les apprhensions du donneur, les questions fermes peuvent savrer utiles pour obtenir des dtails spcifiques que vous souhaitez connatre.

1.1.2. Examen clinique

Chaque donneur qui se prsente pour donner son sang doit tre soumis un examen physique afin de faire un bilan complet de son tat de sant Examen gnral Etat gnral : taille, poids (tre prudent si poids < 50 kg, apprciation de coloration des muqueuses) ;

Contrle de certains constantes physiologiques (tension artrielle, poids, temprature) ;

Examen appareil par appareil Cur ; la recherche dune cardiopathie, Poumons ; la recherche dune affection pulmonaire(tuberculose asthme) Abdomen (hpato splnomgalie) , Examen de la peau, la recherche de cicatrice de zona, de tatouage etc., Aires ganglionnaires la recherche dune adnopathie, Examen ORL/Stomatologie, la recherche dune carie, dun goitre ; Contrle des paramtres biologiques (hmatocrite, hmoglobine)

1.1.2.1.

Critre de prlvement
Age : 17 60 ans ; Antcdent sans particularit ; Examen physique normal en particulier la TA ; Paramtre biologique normal ; Donneur pas sous mdicaments interdits.

1.1.2.2.

Contre indications au don du sang

Lentretien mdical et lexamen clinique permettent didentifier les contre indications au don du sang. Ces contre indications sont nombreuses et une seule suffit comme critre dexclusion. Sujet de moins de 17 ans ou plus de 60 ans ; Poids < 45 kg ; T.A : maxi > 20 mini < 05 Don de sang moins de 2 mois ; Fivre ; Subictre ou ictre ; Pleur ; Amaigrissement (altration de lEG) ; Grossesse ; Allaitement ;

Dermatose ;

Traitement en cours ;
Convalescence ; Terrain allergique ; Antcdent de pathologie chronique ; Perturbation de paramtre biologique .

1.1.3. Suivi des donneurs

Les donneurs volontaires et bnvoles ne viendront que si le service leur laisse une bonne impression et sils se sentent ncessaires, importants et si leur geste est apprci.

1.1.3.1.

Suivi mdical
Nous voluons dans un contexte o les pathologies sont frquentes, et o laccs aux soins est difficile pour les populations ; en plus de la possibilit dtre inform sur son tat de sant, un suivi minima (consultation et examen de labo simple), sil vient tre instaur, contribuera montrer au donneur que le service lapprcie. Il peut galement tre ncessaire dorganiser le suivi des donneurs si les preuves de laboratoires rvlent la prsence dune infection transmissible comme le VIH ou lHpatite B. Il est ncessaire de mettre au point une politique sur la manire dinformer les donneurs de sang qui sont sropositif. Chaque fois que cela est possible, on communiquera les rsultats des tests lintress au cours dun entretien particulier. On pourra ventuellement orienter le donneur vers dautres services de soutient tel que lAPMS du Centre Polyvalent Al Nadjma.

1.1.3.2.

Suivi non mdical

Les activits de relations publiques sont une importante forme de suivi qui aide renforcer le lien entre le service de transfusion et les donneurs, en rendant ces derniers encore plus conscient de leur importance et de la ncessit dune poursuite de leur collaboration avec le service. Aussi chaque service devrait sefforcer dentreprendre certaines

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activits pour donneurs ;

entretenir

la

motivation

des

Leur adresser des lettres de remerciements individuelles ; Leur remettre une carte de groupe sanguin, puis une carte de donneur, puis des attestations au bout de plusieurs dons ; Leur donner des rcompenses diverses en fonction du nombre de don ; Prvoir des oprations types porte ouverte lintention des donneurs dans le service.

1.2. GESTION DU FICHIER DES DONNEURS

Les dossiers des donneurs doivent rester confidentiels et leur accs doit tre interdit des tiers, dans les limites permises par la lgislation nationale. Ils devraient malgr tout permettre de constituer un tableau de donneur de sang volontaire et rgulier dune part ; dautre part de dterminer les informations ncessaire ltablissement des rapports. Fiche de renseignement personnel (coordonnes du donneur, consentement clair, interrogatoire et examen sommaire) ; Fiche de donneur dune collecte mobile ; Registre des dons ; Registre des donneurs volontaires et de groupe sanguin rare ; Une cartographie des lieux de collectes. En effet la gestion rigoureuse de ces dossiers est indispensable pour dfinir un certains nombres dindicateurs permettant de contrler lefficacit des collectes, didentifier les donneurs rgulier rcompenser, dtablir des statistiques (sro prvalence des ITT) et de prendre des mesures pour prserver la sant des receveurs.

1.3. PRELEVEMENT
Un des moments sinon le seul o un microbe peut sinfiltrer dans la poche est celui de la ponction veineuse. Une hygine scrupuleuse du personnel, une dcontamination soigneuse du site de

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ponction veineuse, le port de gants peuvent contribuer limiter ce risque. Un bon prlvement doit tre minutieusement prpar.

1.3.1. Le matriel doit tre prt avant le dbut du prlvement

Coton ; Dsinfectant (alcool ou autres) ; Garrot ; Poche de sang ; Pansement ; Portoirs ; Tubes ; Conteneur pour aiguilles usages Poubelle. Des fauteuils adopt au prlvement Des pinces clamper Des pairs de ciseaux Des pses poches Le matriel pour pansement adhsif Une trousse mdicale durgences

1.3.2. Identification du donneur avant le prlvement

Souhaiter la bienvenue au donneur ; Vrifier lidentit au moyen de la fiche de renseignement en lui demandant Nom et prnom ; Sexe ; Age ; Profession etc. Vrifier que le numro du don est le mme sur la fiche et sur la poche ;

1.3.3. Prlvement
Le donneur doit tre bien install, allonger sur le fauteuil ; Le prleveur doit choisir une bonne veine de prfrence au pli du code ; Rassurer le donneur ;

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Reprer la veine ponctionner ; Dsinfecter la zone (ne pas frotter vigoureusement) ; Poser le garrot, dcapuchonner laiguille et inciser rapidement en tenant laiguille un angle denviron 45 Abaisser laiguille jusqu ce quelle soit parallle la surface de la peau Piquer la veine pour y faire dlicatement pntrer laiguille ; Dclamper la tubulure ds que lon se trouve dans la veine ; Enfoncer laiguille de 1 2 cm dans la lumire de la veine ; Fixer laiguille avec deux morceaux de ruban adhsif et enclencher la minuterie pour calculer le temps de prlvement ; Placer un tampon de gaz strile lendroit de la ponction veineuse ; Assurer rgulirement le mlange sang / anticoagulant au cours du prlvement ; Prlever 7 ml de sang par kilogramme de poids corporel sans dpasser le volume de 450 ml pour un sujet de plus de 60 kg et viter de prlever moins de 300 ml dans les poches ayant 500 ml de capacit ; Une fois le volume atteint, mesurer la dure du prlvement, clamper la tubulure et sectionner en amont ; Remplir les tubes dexamens au 2/3 ;

1.3.4. Fin de prlvement

Prparer un pansement strile et des tubes a vide en prenant soins de dsinfecter le bouchon ; Dcoller le sparadrap qui fixe laiguille lavant bras ; Retirer laiguille vers larrire paralllement la peau (pour viter la rupture de la veine) ; Demander au donneur de comprim le pansement et lever le bras de prlvement.

1.3.5. Collecte des chantillons pour le laboratoire

Introduire laiguille dans le bouchon en caoutchouc du tube et ouvrir le clamp jusquau remplissage du tube ;

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Clamper nouveau la tubulure et extraire laiguille du bouchon ; Introduire laiguille dans le conteneur par aiguille usages ; Couper la tubulure au dessous du clamp afin que laiguille tombe dans le conteneur.

1.4. GESTE DURGENCE DE REANIMATION, REPOS, COLLATION

Le personnel de la zone de prlvement doit avoir une comptence suffisante pour dceler le cas chant les signes des diffrentes ractions pouvant survenir au cours du prlvement. Ces incidents de gravit variable peuvent tre contrler par la vigilance et la discrtion dans laction.

1.4.1. Le malaise +++

Les malaises apparus lors du don de sang sont dus au stress psychologique qui est surtout lapanage de nouveau donneurs et qui est le rsultat dun syndrome vaso vagal qui provoque une insuffisance temporelle dirrigation sanguine du cerceau. Circonstances Jene (risque dypoglycmie) ; Prlvement abondant chez les jeunes ; Attente prolonge ; Local exigu, confin ; Vu du sang ; Signes Pleur ; Lipothymie avec sueur ; Perte de connaissance ; Crise convulsives ; Vomissements Conduite tenir Arrter le prlvement ;

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Isoler le donneur ; Lallonger en rehaussant ses jambes au dessus du niveau de sa tte ; Desserrer les vtements ; Librer les voies respiratoires ; Surveiller la TA, le poids , la respiration. Laisser le donneur se reposer le temps ncessaire, le faire asseoir doucement et lenvoyer la collation en laccompagnant. Autres incidents.

1.4.2.

Ponction artrielle : sang rouge vif, grand

Retrait immdiat de laiguille ; Compression manuelle en amont au moins 10 minutes ; Surveillance pendant 30 minutes au moins.

dbit

1.4.3. Blessure dun nerf

picotement, fourmillement, rarement dcharge lectrique Retirer laiguille.

1.4.4. Hmorragie :
Pansement compressif.

1.4.5. Hmatome
Pansement compressif ; Pose de glace ; Surrelation du membre.

1.5. PREPARATION
1.5.1. Contrle de poids et enregistrement des anomalies
La quantit de sang prlev doit tre de 450 ml # 50 ml environ 475 g. Il faut donc peser toutes les

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units de sang et porter le poids sur ltiquette de la poche, les poches de moins de 425 g et plus de 525 g ne doivent pas tre utilis pour laborer les concentr de plaquettes. Il en serra de mme pour les poches dont le prlvement a dur plus de 15 mn. Au fin de la prparation correcte des units, il savre utile dtablir une liste dtaille de toutes les anomalies de poids et/ou de dure du prlvement sans oublier le numro du don correspondant.

1.5.2. Sparation
La simple sdimentation des globules rouges sous leffet de la pesanteur spare le sang total recueilli sur lanticoagulant en concentr globulaire, surnageant plasmatique et linterface des deux, la couche leuco plaquettaire. But de la sparation : Prparer plusieurs produits sanguins partir dun mme don ; Conserver les produits sanguins une temprature adapte chacun des constituants 30 pour le plasma, 4 pour le culot et 22 pour les plaquettes ; Eviter au cours de la conservation toute interaction mtabolique entre constituant.

1.5.2.1.

Matriel
Centrifugeuse rfrigr ; Extracteur de plasma ; Soudeuse lectronique de tubulure ou clip Poches multiples (double ou triple) ; Enceinte adapt chaque produit ; Banque de sang 4 Conglateur 80 Conglateur 30.

1.5.2.2.

Mthodes
Respecter la bactrimie naturelle du sang total en maintenant 1 2 heures temprature ambiante les units prlevs.

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Centrifugation du sang total Centrifugation rapide : 40.000 g x min permet dobtenir trois composants : le plasma et le concentr de globule rouge et bien sur la couche leuco plaquettaire ou buffy coat. Centrifugation lente : 2.500 g x min permet dobtenir deux composants : un plasma riche en plaquette et un concentr de globule rouge. A dfaut, sdimentation 4 pendant 12 24 heures Sparation La sparation la plus simple est lexpression du plasma dans une poche vide attache partir de la poche primaire dans laquelle les globules rouges et la couche leuco plaquettaire restent. Dautres techniques permettent de sparer la couche leuco plaquettaire des globules rouges et du plasma. La sparation peut tre manuelle ou automatique.

Solution additives Les solutions additives ont pour but dapporter des lments nutritifs aux globules rouges et de les diluer dans une concentration utile dans un milieu appropri pour rduire la viscosit (80 100 ml de S.A pour 450 ml de sang). La solution additive la plus communment utilises contient du srum physiologique sal, de ladnine, du glucose du mannitol (SAGM).

1.6. CONSERVATION ET STOCKAGE

1.6.1. Principes gnraux
Deux heures maximum aprs leur prlvement, les units de sang doivent tre plac 4 pendant le transport, et lors de leur traitement. La chane de froid devrait par la suite tre respecte pour garantir la qualit des produits sanguins. Toute variation de temprature au cours de la conservation altre la qualit des cellules ou

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des facteurs de coagulation des oprations de sparation et dtiquetage devrait seffectuer en chambre froide et /ou climatise. Une rgle : ds quun produit sanguin est place la temprature requise pour sa conservation (+22C, 4C ou 30C) il doit y rester jusquau moment de sa transfusion. Le transport des poches de sang de ltablissement de transfusion jusqu ltablissement de soins voire jusquau lit du malade doit se faire dans des containers ou des bacs isothermes.

1.6.2. Condition sanguins

de

conservation

des

produits

Globules rouges Le sang total prlev sur CPD Adnine peut tre conserv entre +4 et 8C pendant 5 semaines. Les concentrs de globules rouges prpar avec du SAG mannitol peuvent tre conservs entre 4 et 8C pendant 5 6 semaines.

Plasma congel Doit tre conserv 30C pendant 1 an si possible mais jamais au dessus de 20C.

Plaquettes La temprature doit tre de + 22C et la conservation sous agitation continue pendant 36 72 heures.

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II. IMMUNO HEMATOLOGIE

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2.1. Rappel : lments dimmunologie 2.1.1. antignes

un antigne est une substance qui, introduit dans un organisme et reconnue comme trangre, va susciter une rponse immunitaire. Cette rponse immunitaire dbouche sur la production de cellules immuno comptentes, mais aussi sur la production danticorps qui vont ragir de manire spcifique et observable avec cet antigne.

2.1.2.

Anticorps

Un anticorps est un produit de la rponse immunitaire qui va ragir de manire spcifique avec lantigne qui lui a donn naissance. Les anticorps ou immunoglobulines sont de cinq types en fonction de leur caractristiques physico chimiques et leur proprits. On les distinguent en Ig G, Ig A, Ig M, Ig E et Ig D nanmoins ils ont un structure de base commune : deux chanes lourdes et deux chanes lgres unies entre elles par des ponts disulfures.

Pont disulfures

chane lgre Chane lourde

2.1.3.

Ractions antignes anticorps

Lorsquun antigne est mis en prsence dun anticorps correspondant, il se produit une union antigne anticorps. Cette combinaison spcifique reprsente le phnomne fondamentale en immunologie. Cette combinaison est due lexistence sur les molcules danticorps de sites de combinaison complmentaire des dterminants antigniques prsent sur les antignes.

2.1.3.1. Condition de mise en vidence des ractions antignes anticorps

Il y a deux facteurs Facteurs non spcifiques La concentration du milieu La temprature

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 Facteurs spcifiques

Le PH

La multivalence spcifiques des antignes et des anticorps Lexistence dun rapport convenable entre antigne et anticorps.

Pour que les ractions antignes anticorps soient visibles in vitro, il faut que ces facteurs soient respectes. Les facteurs spcifiques relvent de la thorie du rseau de MARRACK qui permet la visualisation de la raction antigne anticorps.

2.1.3.2. Condition de visualisation ractions antignes anticorps

des

Pour que la raction antigne anticorps soit visible, il faut que la molcule dantigne ait au moins trois dterminants et la molcule danticorps deux sites de combinaisons. Dans ces conditions, il se forme un rseau tridimensionnel qui va tre visualis soit par la prcipitation, soit par lagglutination quil sagisse dune solution ou dune particule.

2.1.3.3. Mthodes de mise en vidence de la raction antignes anticorps

Il existe plusieurs mthodes pour mettre in vitro la raction antigne anticorps. Ces diffrentes mthodes permettent au laboratoire de rechercher : La prsence dun anticorps dans un srum La prsence dun antigne dans un organisme. Deux mthodes obissent la thorie du rseau de MARRACK. Il sagit de la prcipitation et de lagglutination. Les autres mthodes relvent dautres artifices techniques. Dans le prsent chapitre nous essentiellement de lagglutination. allons traiter

2.1.4.

Agglutination
Il y a deux types dagglutination

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Lagglutination immunologique Lagglutination non immunologique

2.1.4.1.

Agglutination immunologique
Lagglutination immunologique met en jeu des anticorps dune part et dautres part des particules. Ces particules peuvent possder des antignes correspondant la spcificit des anticorps : on parle dagglutination direct. Dans dautres cas, la particule peut servir de support inerte tel que les globules rouge, les particules de latex ou les cristaux de cholestrol : on parle dagglutination passive. Lorsquune suspension de particules portant des dterminants antigniques est mise en prsence dun srum contenant des anticorps spcifiques, il se produit un rassemblement des particules ; la runion en amas de ces cellules avec clarification du liquide environnant constitue lagglutination immunologique. Lagglutination deux tapes : immunologique comporte donc

Raction antigne anticorps correspondant la fixation spcifique de lanticorps sur lantigne ; Formation de lagglutination si les conditions le permettent.

2.1.4.2.

Agglutination non immunologique

Il existe des agglutinations non immunologiques provoqus par certaines substances non spcifiques des cellules agglutiner tels que les contaminant chimique (dtergents par exemple) les composs neutres (sulfate de protamine, dextran etc. ) les substances vgtales (concanavaline A).

2.1.4.3. Mcanisme globules rouges

de

lagglutination

des

La raction dagglutination est beaucoup plus sensible que la prcipitation. Elle est beaucoup

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employe en immunologie et plus particulirement en immuno hmatologie. Lagglutination des globules rouges relve donc de la thorie du rseau du MARRACK. Mais galement dautres facteurs notamment. La surface des globules rouges ; Le type danticorps ; Et le type de milieu. Surface des globules rouges Le nombre de sites rcepteurs spcifiques est probablement le facteur le plus important ; La situation des sites, la surface ou en profondeur dans la membrane des globules rouges aussi a un rle fondamental ; Le mcanisme physico chimique : le produit zta. Une suspension de globules rouges est soumise deux types de forces ; des forces de rpulsion dues la charge lectrostatique des globules rouges ; des forces de cohsions lies la tension inter faciale des globules rouges. En effet les globules rouges se comportent comme des particules caractristiques anionique. Lorigine de cette charge est lie la prsence sur la surface de lhmatie de groupement carboxyliques des acides sciatiques attaches des glycoprotines de la membrane. Toutes les hmaties tant porteuses de la mme charge ngative, il se cre en suspension saline une force de rpulsion interrogatoire. Aucune agglutination ne peut survenir si les globules rouges ne se rapprochent pas suffisamment. Dans une solution lectrostatique, les globules rouges sont entours dun nuage de charge oppos (positif) dont la densit diminue au fur et mesure que lon sloigne de lrythrocyte, ce qui cre une diffrence de potentiel entre le nuage de cathion entourant le globule rouge et le milieu environnant. Cest le potentiel () Zta. La force de rpulsion entre deux globules rouges va dpendre de la valeur du potentiel Zta au dessous de la quelle la suspension reste stable et au dessus de la quelle la suspension reste instable.

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ANTICORPS AGGLUTINANTS ET NON AGGLUTINANTS

Un anticorps est dit agglutinant quand il est capable de produire une agglutination des hmaties en suspension en solution physiologique. Au contraire un anticorps est dit non agglutinant, quand sa fixation la surface de lhmatie ne suffit pas provoquer lagglutination des hmaties en suspension en eau physiologique. Trs schmatiquement, les anticorps de type IgM sont gnralement agglutinants alors que les anticorps de Ig G ne le sont pas, mais il apparat que certains anticorps de type IgG (par exemple anti A) sont agglutinant, alors que dautres de nature IgM ne le sont pas (par exemple anti Jka). Ce qui veut dire que lactivit agglutinante dun systme nest pas uniquement lie au type molculaire des anticorps utiliss, mais aussi dautres facteurs telle que la qualit des structures ractives propre lantigne lui mme.

Type de milieu
Les substances hydrosolubles utilises telles que lalbumine se polarise dans le champ lectrique des globules rouges et diminue la force de rpulsion inter globulaire. Leffet de ces molcules est donc dlever la constante lectrique du milieu, ce qui entrane une diminution de potentiel Zta et favorise le phnomne dagglutination.

2.2. LES GROUPES ERYTHROCYTAIRES

SANGUINS

Il existe plusieurs systmes de groupes sanguins dont les plus importants sont : le systme ABO et le systme Rhsus (Rh).

2.2.1.

Le systme ABO
Il est dfini par deux lments : Les antignes prsents la surface des globules rouges de chaque individu ;

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Les anticorps prsents dans son plasma ;

Ainsi, le sujet de groupe A possde : Sur les globules rouges lantigne A ; Dans son plasma lanticorps anti B. Le sujet de groupe B possde : Sur les globules rouges lantigne B ; Dans son plasma lanticorps anti A. Ces anticorps sont dits naturels ; ils sont actifs froid, ce sont des IgM. TABLEAU 1 : systme ABO Antignes et Anticorps du

2.2.2.

Le systme Rhsus
Le systme Rhsus est dfini par la prsence ou labsence de lantigne D sur les hmaties. Les sujets qui le possdent sont dits Rhsus positifs et ceux qui ne le possdent pas, Rhsus ngatifs. Il faut cependant savoir quen dehors de lantigne D, le systme Rhsus comprend une mosaque dantigne ; C, c, E, e etc. . Dans le systme Rhsus, il y a pas danticorps naturels. Les anticorps sont acquis par allo immunisation et sont de type IgG, actifs chaud.

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2.3. LE GROUPAGE SANGUIN

Le groupage sanguin consiste dterminer le groupe dun sujet ; groupe qui signifie ensemble des antignes allotypiques de la membrane du globule rouge. Nous parlerons ici essentiellement des systmes ABO et Rhsus.

2.3.1.

Groupage ABO
Dans le systme ABO, le groupage sanguin seffectue obligatoirement par deux preuves complmentaires : Epreuve globulaire (Beth Vincent) qui consiste mettre en vidence les antignes prsent la surface des hmaties du sujet grce des srums tests connus anti A, anti B, anti AB. Epreuve srique (Simonin) qui consiste rechercher les anticorps prsents dans le plasma ou srum du sujet grce des globules rouges connus A1, B et O. Ces deux preuves (globulaire et srique) doivent tre ralises par deux techniciens diffrents.

TECHNIQUES
Sang coagul : Prparer le sang tester, en sparant le caillot sanguin du srum exud. Celui ci recueilli dans un tube soigneusement not, doit tre dbarrass par centrifugation des hmaties en suspension. Sang prlev sur anti coagulant Centrifuger le sang tester afin dobtenir dune part le culot globulaire tass, dautre part le plasma ; dcanter laide dune pipette pasteur le plasma ; centrifug et le recueillir dans un second tube soigneusement not. Prparer une suspension des globules rouges tester dans leur propre plasma ou en srum physiologique (Na CI 9%).

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10% pour le groupage sur plaque ; 5% pour le groupage en tube.

2.3.1.1. Groupage sur plaque ( la temprature du laboratoire)

Ractifs et matriel Suspension globulaire 10% des globules rouges tester ; Srum ou plasma centrifugs tester ; Plaque dopaline ou de verre ; Srums tests anti A, anti B, anti AB ; Globules rouges tests A1, B et O ; Baguette de verre bout rode ; Tampon dovate ou papier absorbant ; Pipette pasteur. Epreuve globulaire (Beth Vincent) Dposer sur la plaque dopaline une goutte de chacun des srums tests anti - A, anti B et anti AB ; Ajouter une goutte de globule rouge tester 10% ; Mlanger les ractifs laide dune baguette de verre ou le fond dun tube, afin dobtenir un cercle de 2 3 cm de diamtre ; Prendre la plaque deux mains et lui imprimer un mouvement de rotation (chalouper) ; La lecture dfinitive sera effectue au bout de 3 minutes. Epreuve srique (Simonin) A laide dune pipette pasteur, dposer sur la plaque 3 fois 2 gouttes de srum ou plasma tester ; Ajouter une goutte des hmaties tests, A1, B et O en suspension 10% en milieu salin ; Mlanger laide dune baguette de verre ou le fond dun tube ; Imprimer la plaque un mouvement de rotation (chalouper) ; Lire la raction.

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Pour ces deux preuves, prendre soins dessuyer soigneusement la baguette de verre ou le fond du tube entre le passage dun antigne lautre, ou dun srum test lautre.

FIGURE 1 : Technique sur plaque dopaline

EPREUVE GLOBULAIR E (Beth Vincent) EPREUVE SERIQUE (Simonin)

1 goutte de ractif (antiA, antiB, anti- AB) 1 goutte dhmaties du malade 10% en saline ou en plasma/sru m autologue

2 gouttes de srums / plasma du malade 1 goutte dhmaties test 10% en saline.

2.3.1.2. Groupage en tube ( la temprature du laboratoire)

Ractifs et matriels Suspension des hmaties tester 5% en milieu salin, plasma / srum autologue ; Srum ou plasma centrifug ; Tube hmolyse ; Serums tests anti A, anti B, anti AB ; Globules tests A1, B, O en suspension 5% en milieu salin.

Epreuve globulaire (Beth Vincent)

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Rpartir dans 3 tubes disposs et bien tiquets sur un portoir une goutte de suspension des hmaties tester ; Ajouter une goutte de chacun de srums tests ; Agiter doucement pour bien mlanger ; Centrifuger 1 minute 1000 tours / minute ; Lire par simple agitation sur un fond blanc.

Epreuve srique (Simonin) Rpartir dans 3 tubes marqus : A1, B, O deux gouttes du srum ou du plasma tester ; Ajouter une goutte des globules rouges test A1, B, O ; Centrifuger 1 minute 1000 tours / minute ; Lire par simple agitation sur un fond blanc.

FIGURE 2 : Technique en tubes

Beth Vincent 1 goutte de ractif (anti A, anti B, anti AB) + 1 goutte des hmaties tester 5% en saline, plasma / srum

Simonin 2 gouttes de srum ou plasma tester + 1 goutte des globules rouges tests A1, B, O en milieu salin

LES TEMOINS
AUTO : 1 goutte de srum / plasma du malade + 1 goutte GR du malade 10% ou 5% en saline AB : 1 goutte de srum + 1 goutte GR du malade 10% ou 5% en saline ALLO : 1 goutte du srum / plasma du malade + 1 goutte du panel en saline (chantillon slectionne)

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Les tmoins sont effectus dans les mmes conditions que la dtermination des groupages ABO sur plaque et en tube en cas de discordance entre preuve globulaire et srique.
ALLO

La concordance des rsultats entre lpreuve globulaire et lpreuve srique est imprative. Il ne faut jamais conclure en cas de discordance.

2.3.1.3. Interprtation groupage ABO

des

rsultats

du

TABLEAU 1 : Rsultats du groupage ABO

B

Lapparition des agglutinants dans lpreuve globulaire est trs rapide ; parce que les anti srums anti A, anti B et anti AB ont t slectionns pour leur avidit. Par contre, lapparition des agglutinants dans lpreuve srique est beaucoup lus lente car les

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anticorps anti A et anti B naturel ont un titre beaucoup plus faible et une avidit moins forte. Lintensit de lagglutination sera value de la manire suivante : Agglutination totale sans globules rouges libres ++ + Agglutination dune dizaine dagglutinants ++ Agglutination de plus de dix (10) agglutinants + Micro agglutinants # Absence dagglutination

2.3.1.4.

Quelques difficults de groupage

Les agglutinines froides Les ractions globulaires et sriques sont positives. Le tmoin auto est positif, et le tmoin allo le plus souvent lest galement. La poly agglutinabilit : relve dun phnomne immunologique, un antigne anormalement prsent la surface du globule rouge est reconnue par un anticorps spcifique prsent dans la plupart des srums humains ; dans ce cas le tmoin AB est positif. Le groupes rares : les hmaties ne portent pas les antignes attendu par rapport aux antignes anti A et/ou anti B prsent dans le srum ; il sagit dun groupe rare mais normal (groupe a faible, B faible). La dtermination du groupe sanguin fait sur du sang du cordon peut provoquer de fausses ractions positives du fait de la gle de Wharton. On peut dans certaines circonstance tre confront aux phnomnes de double population (leucmies, hmopathies, malignes, sujet de groupe A et/ou B antrieurement transfus par du sang O, chimre ou mosaque etc..).

2.3.2.

Le groupage Rhsus
Groupage sur plaque /Rhsuscope Ractifs et matriels.

Hmaties tester en suspension 40% dans leur propre plasma ou srum ; Rhsuscope (40C environ) ;

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Baguette de verre bout rod Anti D ; Anti CDE Hmaties test O Rh+ et O Rh- en suspension 40% ; Tmoin albumineux (mlange srum AB et albumine bovine ou humaine 30%).

Mthode
Dposer sur la plaque de gauche droite 3 fois deux gouttes de ractifs anti D range suprieure 3 fois deux goutte de ractif anti CDE range du milieu 3 fois deux goutte de tmoin albumineux range infrieure taler les gouttes laide de la baguette en verre ou avec le fond dun tube pour obtenir un cercle denviron 2 cm ; essuyer soigneusement la baguette ou le fond du tube entre chaque passage ; imprimer la plaque un mouvement de rotation (chalouper) ; lire la raction aprs 3 minutes.

FIGURE 3 : Groupage Rhsus sur plaque 1

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Groupage en tube Ractifs et matriels Hmaties tester en suspension 5% dans leur propre srum / plasma Tubes hmolyse Pipette pasteur Anti D Bain marie ou tuve 37 Mthode Dans une srie de tubes soigneusement marqus, disposer : 1 goutte danti - D + 1 goutte de suspension des hmaties tester 1 goutte danti D + 1 goutte dhmatie tmoin Rh+ 1 goutte danti D + 1 goutte dhmatie tmoin Rhagiter doucement pour mlanger les ractifs incuber 1 h 30 37C lire la raction au microscope aprs clatement sur lame effectuer simultanment et dans les mmes conditions, le tmoin albumine. Difficults de groupage Rhsus

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Phnomne de rouleaux : d la prsence dune grande concentration dimmunoglobuline (mylome, waldenstrom). Le tmoin albumineux est positif enlevant toute valeur la raction avec le ractif anti D. Refaire le groupage sur les hmaties laves et remises en suspension en srum AB.

Cas danmies hmolytiques auto immune (auto anticorps IgG). Ici aussi le tmoin albumineux est positif. Refaire le groupage Rhsus avec un anti D salin (agglutinant). Cas des D faibles (Du) du une faible expression des antignes Rhsus standard. Leur mise en vidence ncessite des techniques plus labors.

TECHNIQUES DE DEPISTAGE DES FAIBLES (Du)

Le Rh D faible apparaissent sur plaque comme des Rh ngatif . il faudra donc employer des techniques de laboratoires plus labors pour les mettre en vidence. Il sagira ici de la technique de Coombs indirect.

REACTIONS DE COOMBS INDIRECT

1. temps : fixation de lanti D (sensibilisation) mettre en suspension 5% en eau physiologique les hmaties que lon veut tester, pralablement laves 3 fois en eau physiologique. Dans un tube marqu, mettre une goutte de suspension globulaire et ajouter 2 gouttes de srum test. Incuber 37C pendant 1 heure

2. temps : rvlation de la sensibilisation laver 3 fois la suspension au dernier, dcanter soigneusement le surnageant ajouter 2 gouttes lavage danti globuline polyvalente ou anti IgG centrifuger 1000 tours / mn pendant une minute agiter et faire la lecture sur le fond blanc Ne pas oublier les tmoins O Rh+ et O Rh -

2.2.3. Recherche dhmolysines chez les donneurs du groupe O

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Certains donneurs du groupe O sont dits dangereux, par ce que possdant dans leur plasma des anticorps anti A et / ou anti B immuns. Ces anticorps sont des IgG, actifs chaud, proprit qui va tre utilise pour les rechercher. TECHNIQUE Prparer une suspension 5% dhmaties A et B laves ; Prparer du srum du donneur frachement prlever (moins de 6 heures) ; - Dans deux tubes marqus A et B, mettre respectivement une goutte de suspension dhmatie A et B ; - Ajouter dans chaque tube, 9 gouttes de srum frais du donneur ; - Incuber les tubes 37 pendant 2 heures ; Sortir les tubes et remettre les globules rouges en suspension ; Centrifuger les tubes une minute 1000 tours / minutes ; Examiner la couleur su surnageant : Couleur jauntre : absence dhmolysine Couleur rostre : prsence dhmolysines La prsence dhmolysines signifie que le donneur est dangereux. Son sang ne peut tre transfus qu un sujet du groupe O.

2.3.4.

Les preuves de compatibilit

Consiste mettre en prsence le srum du receveur et les hmaties des poches de sang que lon se propose de transfuser. Dans nos pays o la recherche danticorps irrguliers est souvent irralisable, le test de compatibilit est indispensable et doit tre fait avant toute transfusion pour viter dventuel accident surtout chez les polytransfuss.

2.3.4.1. Le cross match

Consiste tester le srum du receveur contre les globules rouges du ou des donneurs. TECHNIQUE Sur une plaque propre et dgraisse ;

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Mettre deux gouttes de srum du malade ; Ajouter sur le srum 1 goutte de globules rouges du donneur ; Mlanger avec le fond dun tube Lire le rsultat. La prsence dune agglutination traduit une incompatibilit.

2.3.4.2. Compatibilit tube

Il faut utiliser conjointement plusieurs techniques ; au moins trois : une raction en milieu salin 20 (temprature du laboratoire) ; une raction de Coombs indirect ; une raction de Coombs basse force ionique. TECHNIQUES Tests dagglutination en saline 22C o Globules rouges transfuser lavs 3 fois ; o Remise en suspension 5 en eau ; o Dans une srie de tubes, mettre 1 gouttes de suspension de chacun des globules rouges ; o Ajouter une goutte de srum tester ; o Laisser incuber 1 h 30 20 ; o Lire au microscope aprs talement sur lame. Test de Coombs indirect o Lavage des globules rouges transfuser 3 fois en eau & et remise en suspension 5% en eau & o Sensibilisation : dans une srie de tubes marqus, mettre 1 volume de srum tester et un volume de suspension globulaire ; o Laisser incuber 1 heure 37 ; o Lavage du hmaties sensibilises 3 fois en eau & ; o Ajouter une 2 gouttes dantiglobuline ; o Centrifuger pendant une minute 1000 tours / minute ; o Lecture macroscopique et microscopique. Test de Coombs basse force ionique (BFI) o Sensibilisation :

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1 goutte de srum ; 1 goutte dhmaties lave en suspension 2% BFI o incubation : 10 minutes au bain marie ou 15 minutes ltuve puis lavage en solution saline. o Raction lantiglobuline : 1 goutte dhmaties sensibilises laves, 2 gouttes dantiglobulines polyvalente, centrifugation 1 minute 1000 tours / minute, lecture au microscopique.

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III. DEPISTAGES DES INFECTIONS TRANSMISSIBLES

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3.1. DEPISTAGE DE VIH

Le syndrome dimmunodficience acquise reste encore de nos jours, une maladie incurable. Sa transmission un patient signifie une condamnation mort ou long terme. Il est donc particulirement important de sassurer que le sang que nous proposons nos malades nest pas une source de transmission du VIH.

3.2. LA STRUCTURE DU VIH

Le VIH est un rtrovirus : virus ARN. Il comprend un noyau une matrice une enveloppe 1 = ARN ; 2 = Capside ; 3 = P24 ; 4 = P7/P9 ; 5 Reverse transcriptase ; 6 = P17 ; 8 = gp 120 ; 9 = enveloppe ; 10 = virion. Figure n 1 : structure du VIH On en distingue deux types : le VIH 1 et le VIH 2. Le VIH - 1 est le plus rpandu dans le monde. En effet on le trouve sur tous les continents et dans tous les pays. Le VIH 2 dcouvert initialement sur la cote ouest Africaine a t retrouv en Europe, en Amrique du Nord et du Sud. Sur le plan de la structure, les deux virus ont la mme configuration. Cependant ils diffrent au niveau des protines qui les composent. Cest ainsi que : au niveau de lenveloppe de la gp 160 est remplace par la gp 140 la gp 120 par la gp 125 ou gp 105 au niveau du noyau la p 24 par la p 26 au niveau de la matrice la p 17 par la p 16. Il faut cependant retenir quil existe 40 45% dhomologie entre le VIH 1 et le VIH 2. N.B. la gp 160 est le prcurseur de la gp 120, la gp 140 le prcurseur de la gp 125 ou gp 105.

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3.3. LA REPONSE DE LORGANISME DE LINFECTION PAR LE VIH

La pntration du VIH dans lorganisme, nentrane pas tout de suite une protection danticorps. Il existe au dbut de linfection une priode de latence plus ou moins longue, allant de deux semaines quelques mois, pendant laquelle aucun anticorps anti VIH ne peut tre mis en vidence (figure 2) : cest la fentre srologique. Cest pour cette raison quil est recommand dtre particulirement rigoureux dans la slection des donneurs de sang. Toute personne suspecte et appartenant un groupe risque, doit tre exclue du don de sang. Aprs la priode de latence, lorganisme produit des anticorps dirigs contre les diffrentes protines virales. Les diffrents tests de dpistage du VIH consistent rechercher ces anticorps, qui une fois produits, persistent toute vie, lexception de lanticorps anti p24 qui la phase ultime de la maladie voit son taux dcrotre et mme tomber zro au profit dune remonte du taux de lantigne p24 dans le sang.

3.4. LES MOYENS DU DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE DES INFECTION VIH

Le diagnostic des infections VIH repose chez ladulte sur dtection des anticorps. Le dveloppement des techniques de biologie molculaire ne permet pas pour lheure de remplacer les techniques srologiques qui restent partout dans le monde les techniques de rfrences pour le dpistage et la confirmation des infections VIH de ladulte. Seul le diagnostic prcoce dans les premiers mois de vie chez lenfant n de mre sropositive ncessite la mise en vidence du virus, de ses composants ou de son gnome.

3.5. PRINCIPES DES TESTS DE DEPISTAGE

Le dpistage des anticorps anti VIH 1 et anti VIH 2 seffectue souvent par des tests dits ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) ou par

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des tests rapides utilisant comme antignes des lysats viraux ou des protines recombinantes ou synthtiques. Ces protines correspondent aux pitopes immuno dominants de 2 virus VIH 1 du sous type B (souche LAI, MN) et VIH 2 du sous type A (souche ROD). Ces tests mixtes sont donc capables de dpister les anticorps anti VIH 1 et anti VIH 2. Plusieurs formats de tests sont disponibles. Les tests ELISA : Les tests EIA indirect : la fixation des anticorps du patient sur les antignes du kit est releve par une anti globuline humaine anti Ig G marque par une enzyme. Ce sont des test robustes. Peu sensibles aux variations des pitopes des variants VIH surtout si les antignes sont du lysat viral. Mais ils manquent de sensibilit lors de la primo infection car ils sont incapables de dtecter les iso types dimmunoglobulines non G. Leur spcificit est mdiocre, des immunoglobulines non spcifiques pouvant se fixer sur le support solide et tre rvles par lanti globulines marque. Les tests EIA Sandwich : la rvlation de la raction antigne du kit anticorps anti VIH du patient se fait non plus par une anti globuline mais par une antigne marqu, se fixant sur les anticorps rests libres. Ce sont les tests les plus sensibles pour la dtection des anticorps anti VIH du sous type B lors de la sroconversion. La spcificit est galement excellente. Ils sont les plus utiliss dans le cadre du dpistage des dons de sang. Ils peuvent tre pris en dfaut lors dinfections par variants majeur comme les VIH 0 et manquent de sensibilit lors des sroconversion par les variants non B. Les tests EIAs par immunocapture : les immunoglobulines du patients se lient par leur extrmit Fc des antiglobulines anti Fc de la phase solide. La rvlation de liaison se fait par des antignes marqus, se fixant sur les sites Fab des anticorps rests libres. Ils permettent de dtecter des immunoglobulines mme en cas de forte dilution dans des milieux comme lurine ou la salive. Cependant ils sont lgrement moins sensibles que les tests de troisime gnration lors des sroconversions (4) mais leur spcificit est bonne. Les tests EIA par comptition utilisent la diffrence daffinit pour un antigne entre les anticorps anti VIH du patient et un anticorps anti VIH marqu par une enzyme. Les tests par comptition commercialiss utilisent uniquement des antignes VIH 1 du groupe M. Ces tests sont hautement spcifiques. En cas de forte ractivit, linfection VIH 1

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groupe M est certaine. Les infections par VIH 2 et VIH 0 sont non ou mal dtectes et cette spcificit peut tre utilis pour diffrencier le type de souche infectante. Les tests rapides : Ce sont le plus souvent des tests par filtration du srum sur une membrane ou un support recouvert dantignes recombinants VIH 1 et VIH 2. Ils ne ncessitent aucun quipement et sont ralises en moins de 30 minutes. La simplicit demploi leur assure une large diffusion dans les pays en voie de dveloppement. Dautres tests de ralisation simples sont les tests par agglutinations de particules sensibilises aux antignes VIH. Ils sont gnralement sensibles et de ralisation simple mais linterprtation peut tre parfois difficile. De ralisation unitaire et rapide. Ils sont faciles dexcution. Pour lensemble de ces tests, labsence de rsultats quantifis et enregistrs sur support papier sont des obstacles la traabilit des manipulations.

Les tests de confirmation

La technique du Western Blot (WB) est une mthode de rfrence mais son interprtation peut tre dlicate. Le recours au WB pour une confirmation VIH nest pas systmatique dans tous les pays, y compris dans les pays industrialiss. Elle est parfois informative permettant dvoquer une sroconversion rcente ou une infection par des variants. Le plus souvent en cas dinfection VIH, le WB sera pleinement ractif et donnera peu dinformation complmentaire. Inversement, en cas de non infection, des ractivits non spcifiques sont frquentes et dinterprtation difficile. Aussi des alternatives au WB sont ncessaires pour viter un recours systmatique cet examen coteux. Le WB est une technique de transfert sur la nitrocellulose, aprs migration lectrophortique en gel de polyacrylanide, de protines dun lysat viral VIH1 ou VIH 2 . Sur la bandelette de WB, diffrentes protines constitutives des virus seront reconnus par des anticorps spcifiques anti VIH- 1 ou VIH- 2.

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VIRUS LHEPATITE B
Structure : virus (42 nm) de l famille des hepadnavirus ; cest un virus ADN symtrie icosadrique. Il possde une enveloppe ; Epidmiologie : La transmission du virus se fait par voie parentrale ; il y a environ 0,5% de porteurs chronique du virus en France (jusqu 20% dans certaines rgions du globe) ; lexposition au WHB est suivie chez le sujet normal dune infection chronique dans 10% des cas. Mortalit : environ 1% des cas. Chez les donneurs de sang : lincidence de lAg HBs est denviron 10 pour 10.000 chez les nouveaux donneurs et 0,1 pour 10.000 chez le donneurs connus. Malgr une forte diminution du nombre de nouvelles infections VHB qui doit tre en partie lie laugmentation de la couverture vaccinale, cest toujours pour le VHB que lon identifie le plus grand nombre de nouvelles contaminations. Clinique : aprs une incubation de 4 12 semaines suivant le contact avec le virus, survient un ictre avec ne asthnie intense et des signes de cytolyses. Environ 90% des hpatites B sont anictriques. Le risque de survenue dune hpatite fulminante est de 1%. Spcificit antigniques : enveloppe antignes HBs, prS1 prS2 core ; antignes HBc et Hbe ; ADN bicatnaire Diagnostic srologie : recherche des antignes et anticorps spcifiques ; Ag HBs ; Ac HBs ; Ac HBc (Ig totales et IgM) Ag HBe ; Ac HBe. Lantigne HBs apparat en premier, avant les signes cliniques. Il persiste de quelques jours quelques annes (hpatite chronique si > 6 mois) Lantigne anti HBe apparat juste lAg HBs ; il est un tmoin de la rplication du virus ; Lanticorps anti HBe apparat aprs la disparition de lAg HBs ; il est bon de pronostic ; polymrase ; ADN

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Lanticorps anti HBc est dtect peu de temps aprs lAg HBs. Les IgM signent linfection aigu ; les Ig G persistent trs longtemps (tmoins dun contact avec le VHB) ; Lanticorps anti HBs (neutralisant) signe de la gurison de lhpatite B ; il est le seul signe biologique aprs une vaccination. Diagnostic spcialis : recherche de lADN viral (hybridation ou PCR) ; recherche de lADN polymrase.

VIRUS DE LHEPATITE C
Structure : virus denviron 50 mm de la famille des Flaviviridae, genre Hepacavirus ; cest un virus ARN symtrie icosadrique. Il a t identifi par biologie molculaire en constitutive de core, les rgions E1 et E2 NSI pour les protines denveloppe, les rgions NS2 NS5 pour des protines non structurales (hlicase, ARN polymrase ) On dcrit 6 gnotypes principaux, diviss pour certains sous types. Epidmiologie : Transmission parentrale, > 85% de la population Franaise serait porteuse du virus. Environ 20 40% des cas prvalences ont lis une transfusion sanguine (avant la srologie VHC systmatique lors de chaque don du sang depuis le 1er mars 1990) et 25% 30% une toxicomanie IV. Outre le risque transfusionnel maintenant matris (risque rsiduel = 1/380.000), la transmission par le VHC. Les contamination par voie sexuelle et maternofoetale existent mais probablement rares ( ?). Les risque de contamination par le HHC chez les personnes stant piques accidentellement avec une aiguille souille par le sang est valu 5 10%. Enfin la vie courante offre de nombreuse occasions de contaminations percutanes parentrales peu vidents (partage de rasoirs, brosse dents ) chez environ 20% des sujets, le mode de contamination reste de mcanisme non identifi. Chez les donneurs de sang : lincidence est denviron 10 pour 10.000 chez les nouveaux donneurs et de 1 pour 10.000 chez les donneurs connus.

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Sur 633 donneurs confirms positifs pour le VHC entre le 01/01/1994 et les 31/12/1997, 109 (17%) taient des sroconversions : la facteur de risque identifi le plus frquemment (31% des donneurs interrogs) tait lexposition nosocomiale (explorations fonctionnelles et chirurgie sans transfusion). Le risque li lusage de drogue, malgr la slection en amont du don, reprsentait 22%. La notion de partenaire sexuel positif pour le VHC a t voque chez 8% des donneurs. Clinique : aprs une incubation denviron 5 12 semaines suivant le contact avec le virus, survient un ictre avec une asthnie et une cytolyse (transaminases ALT modrment augmentes et fluctuantes). Les formes anictriques sont trs frquentes : au moins 2/3 des cas. Il na pas t dcrit dhpatites fulminantes VHC hormis des associations avec dautres virus (VHB). Le passage la chronicit sobserve dans environ 60 80% des cas ; au sein de ces formes chroniques, au moins 20% risquent de dvelopper une cirrhose dans un dlai de 7 30 ans. Diagnostic srologie : techniques ELISA et tests de validation (immunoblots) les tests de 3me gnration utilisent des protines recombinantes et/ou des peptides synthtiques. La fentre srologique reste importante : environ 66 jour. Biologique molculaire (PCR) : une recherche dARN viral est utile en cas de discordance entre le tests de dpistage et / o de RIBA indtermin. Dans le cas dun traitement par interfron, la recherche dARN viral est effectu avant le dbut du traitement puis intervalles rguliers. La persistance de lARN viral aprs 3 mois de traitement serait prdictive dune absence de rponse long terme ou dune rechute. Prophylaxie : en fonction des facteurs de risque, mais chez environ 20% des sujets, le mode de contamination reste de mcanisme non identifi ! Risque rsiduel transfusionnel : 1/380.000.

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SYPHILIS (Infection Treponema pallidum)

La syphilis est linfection cause par Treponema pallidum dont la transmission est essentiellement vnrienne, bien quelle puisse galement tre transmise par contact avec des muqueuses lses. Autrefois, la transfusion, surtout de sang frais, tait un mode dinfection potentiel ; la conservation du sang pendant 24 48 heures 4C limine le risque en tuant le trponme qui est sensible au froid. Il existe encore quelques cas de transmission par piqre accidentelle des doigts. Le fait que des donneurs soient infects par la syphilis est souvent utilis comme marqueur fiabilit, en mettant en vidence un comportement sexuel risque. Ce comportement augmentant leur risque dexposition au VIH, il est prfrable de les exclure. Lagent infectieux Treponema pallidum est une bactrie de la famille des spirochtes. Il existe quatre trponmes humains si semblables quils sont dcrits comme des sous espces de T. pallidum : T. T. T. T. pallidum, pallidum, pallidum, pallidum, sous sous sous sous espce espce espce espce pallidum (syphilis) pertenue (pian) carateum ( pinta) endemicum (bejel).

T. pallidum est le plus important et cest essentiellement de cette sous espce que nous traiterons, nenvisageons les autres que brivement. Pour simplifier, nous la dsignerons par T. pallidum. Les spirochtes ont des parois souples, Gram ngatif, composes dune membrane externe glycopeptidique portant les antignes et dun membrane cytoplasmique interne.

Histoire naturelle de linfection

Aprs linfection initiale, lvolution naturelle de la syphilis peut tre divise en trois tapes cliniques :

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1. La syphilis primaire : aprs le contact infectant, les spirochtes traversent la muqueuse et pntrent dans le systme lymphatique, laissant une lsion pleine de trponme la porte dentre. 2. La syphilis secondaire : alors que la lsion initiale gurit, des lsions secondaires apparaissent sur la peau et les muqueuses. Elles fourmillent de trponmes et sont donc trs infectieuses. Il peut, ce stade, y avoir dissmination non vnrienne de la maladie. 3. La syphilis tertiaire : apparat 5 40 ans plus tard. Les lsions affectent le systme nerveux central et lappareil cardio vasculaire, o elles peuvent causer des altrations majeures. Linfection congnitale constitue une autre mode de transmission. Le trponme traverse le placenta et infecte le ftus. Ceci aboutit la mort ftale ou une syphilis congnitale qui, non traite, conduit des incapacits graves telles que ccit, surdit et lsions osseuses.

Diagnostic biologique de linfection

Bien que lobservation directe des spirochtes soit possible en microscope sur fond noir, elle se limite certains stades de linfection. Le diagnostic repose donc sur la srologie, laide de tests spcifiques ou non spcifiques. Les tests non spcifiques ( raction antigne non trponmique) Principe Les ractions du groupe 1 de la nomenclature utilisent un antigne non trponmique permettant la dtection danticorps non spcifiques des trponmes appels ragines. Il sagit des techniques dagglutination du VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) et drives qui utilisent une suspension de microcristaux de cholestrol sensibiliss par du phosphatidyl glycrol (cardiolipide). Rsultats

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Le rsultat qualitatif est exprim en croix selon la taille de lagglutinat (0+++). Le VDRL permet une mesure semi quantitative du titre danitcorps par dilutions successives du srum de raison 2 : le titre danticorps correspond linverse de la dernire dilution donnant encore une raction positive. Intrt Le VDRL est une technique peu coteuse et facile raliser. Son principal intrt est de permettre un suivi thrapeutique : un dclin significatif ( dau moins deux dilutions) du titre des anticorps indique une rponse favorable au traitement. Son inconvnient majeur est lexistence de ractions non spcifiques ( faux positifs). Les tests spcifiques trponmique) (ractions antigne

Les ractions du groupe 2 de la nomenclature permettent la dtection des anticorps dirigs contre les antignes trponmiques.

Les ractions dhmagglutination : le TPHA

Principe Le TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutination Assay) est une raction dhmagglutination passive utilisant des hmaties tannes et formoles (homme, mouton, oiseau) sensibilises par une lysat de T. pallidum. Une absorption pralable du srum dans un ultrasonat de trponmes de Reiter (sorbent) est effectue pour liminer les anticorps de groupe non spcifiques. Laboratoire de dpistage des transmissibles E.TS. de Strasbourg Rsultats Pour le dpistage, le srum est dilu au 1/80 e dans le sorbent avant dtre mis en raction. Si le dpistage est positif, le rsultat est exprim en maladies

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titre danticorps, obtenu par dilutions successives du srum de raison 2 : le titre danticorps correspond linverse de la dernire dilution donnant encore un raction positive. Le seuil de positivit du QTPHA est de 80 units. Intrt Le TPHA est technique simple raliser et trs spcifique. A la diffrence du VDRL, les titres sont peu influencs par un traitement efficace sauf sil est trs prcoce et ne permettent pas dvaluer lvolutivit de la maladie.

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TRAVAUX PRATIQUES
Les techniques du groupages sanguins sont relativement simples nanmoins ils ne sont pas toujours correctement excuts avec la cl du consquences qui peuvent tre trs graves. Il est donc indispensable de rappeler quelques principes fondamentaux quil ne faut pas ngliger savoir : bien sinstaller la paillasse bien connatre le matriel savoir se servir de ce matriel apprendre bien taler et lire correctement une agglutination

4. INSTALLATION A LA PAILLASSE
Le technicien doit tre install confortablement devant sa paillasse en ayant porte de main, tout le matriel dont il a besoin afin de navoir pas se dplacer constamment. A droite il doit disposer cellulose ou papier buvard bchers pour lavage cristallisoir flacon de srum & marqueur fiches de rsultats diffrentes pipettes utiliss. A gauche Rshuscope Pipette deau & Minuteur ou chronomtre Microscope En face portoirs rserves de tubes chantillons de sang tester plaque dopaline ractif centrifugeuses de paillasse. Autre matriel rfrigrateur

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5. BIEN CONNAITRE LE MATERIEL 5.1. PETIT MATERIEL

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conglateur tuve bain marie agitateurs balance de prcision de 0,1 300g

les tubes : ces tubes en verre ou en matire plastique et ont les dimension suivantes : 75 mm de hauteur, 12 10 mm de diamtre intrieur, et pour les micro tubes : 50 mm de hauteur, 5 6 mm de diamtre intrieur. Plaque dopaline ou de porcelaine blanche : 15 x 30 cm, 15 x 20 cm, certaines plaques comportent des godets. Lames porte objet pour lecture au microscope : sont prsentes en boites, prts lemploi. Cellule (papier buvard) dcoup en carr 15 x 15 cm, indispensable pour scher les pipettes ou dgraisser les plaques et les lames. Les pipettes o La pipette pasteur avec ttine est la plus couramment utilise. Elle est fabrique par tirement au bec Busen dune baguette de verre creux. La pipette pasteur est calibr de manire dlivrer 20 gouttes pour 1 ml. Le point trs important est ltanchit absolue de la zone par un lastique trs serr. La faon de tenir la pipette est trs personnelle chaque technicien. On peut tenir le corps entre le majeur et lannulaire de la main droite, de manire saisir la ttine entre le pouce et lindex. Il est trs important de pouvoir contrler la pression du pouce et de lindex sur cette dernire. A partir dune certaine exprience, cette sensation devient automatique pour le technicien. Rinage et schage de la pipette Ces deux oprations sont probablement les temps les plus importants de tout le travail technique en immunohmatologie. Rinage : la pipette dont la ttine est serre entre le pouce et lindex, est plonge dans un premier bcher ; par de pression sur la ttine, le liquide monte alors jusqu environ le deux tiers de la pipette. Le liquide est ensuite rejet dans le

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cristallisoir, par pression forte sur la ttine. Lopration est recommencer dans le deuxime bcher, une premire et une seconde fois. Toute pipete mal rince peut contaminer toutes les ractions des diffrentes manipulation. Le liquide ne doit jamais monter jusque dans la ttine. Schage : maintenir la pipette verticalement contre le tampon de cellulose. Ce dernier repose sur un plan dur. Par pression sur la ttine, le liquide est rejet dans la cellulose. Autres pipettes : pipettes gradues pipettes jauges micro pipettes automatique avec une gamme de pointe permettant des prlvements de 5 1000 ml. Les pipettes en matire plastique de 250 ml pour les lavages Cristallisoir : 20 cm de diamtre sur 8 cm de hauteur, permet de recueillir leau souille des rinage des pipettes et le matriel sale utilis (lames, tubes etc) Portoir en bois ou en plastique, parfois en acier Baguettes de verre vid : pour mlanger ou taler les ractifs Eau physiologique : 9% en flacon strile, peut tre prpare au laboratoire (9 g de Na Cl Q.S.P 1000 ml deau distille) Crayons marqueurs rsistants leau et spciaux pour le verre et le plastique Rhsuscope : il existe de nombreux modles. La source de lumire et de chaleur est fournie soit par des lampes, soit par des tubes lectriques au dessus desquels est glisse une plaque de verre dpoli.

5.2. LES CENTRIFUGEUSES

De trs ombreux types diffrents de centrifugeuse de paillasse sont actuellement disponibles. Il faut en pratique disposer dune petite centrifugeuse de paillasse simple et pour les grands laboratoires dune centrifugeuse plus labore disposant dune panoplie plus tendue de couronnes diffrentes verreries.

5.3. LES SYSTEMES DE CONSERVATION

Une temprature de 4 est ncessaire et suffisante pour conserver les ractifs. Il faut pour cela un

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simple rfrigrateur ou pour laboratoires une chambre froide.

des

grands

Les stocks de srums tests et quelque fois des chantillons ncessite des conglateurs de 20C 80C que natteignent pas la partie conglateur des rfrigrateurs.

6. BIEN ETALER AGGLUTINATION

ET

LIRE

CORRECTEMENT

UNE

6.1. SUR PLAQUE DOPALINE

Un mlange sur plaque dopaline doit tre tal sur un cercle de 2 3 cm de diamtre. A laide dune baguette de verre rode ou dun fond de tube, on effectue sur la plaque le mlange entre srum test et globule rouge en dcrivant une spirale excentrique jusqu taler sur une surface de 2 3 cm de diamtre. La plaque est alors habilement chaloup par une mouvement lent de relation oscillation. On pourra ainsi apprcier la vitesse de lagglutination, mais aussi reconnatre facilement une double avec son image typique comprenant du agglutination au milieu dune nappe dhmaties libres.

6.2. EN TUBE
Lagglutination en tube de Kahn ncessite gnralement une lgre centrifugation. Elle se lit alors en regardant le fond du tube inclin aprs centrifugation lgre, sur le fond blanc. Lagglutination en micro tube se lit aprs sdimentation spontane des hmaties. La lecture se fait alors aprs talement sur lame, au microscope, ou aprs talement sur plaque dopaline.

Comment taler sur une lame

La pipette pasteur dont la ttine est fortement press entre le pouce et lindex est introduite dans le tube en guidant sur le rebord. Grce une lgre dpression de la ttine, ou aspire ensemble le ractif et les globules rouges (culot). La pression entre le pouce et lindex doit tre maintenue alors constante de manire ce que le mlange agglutinants ractifs ne soit ni aspir ni refoul par la ttine. On dpose alors dlicatement le mlange sur la lame incline 45 en le laissant

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tomber de sorte quil sy coule sans traumatisme. La lame est alors chaloupe avec mnagement, et ltalement se fait donc spontanment.

Etalement sur plaque dopaline

On dpose le mlange ractif globules rouges sur la plaque o elle doit tomber, et non en y parvenant par capillarit. La ttine tant bien serre entre le pouce et lindex, on tale alors avec le bout de la pipette, de lintrieur vers lextrieur, par des traces circulaires excentriques, jusqu obtenir un cercle de 2 cm de diamtre.

7. QUELQUES MANIPULATIONS ELEMENTAIRES

7.1. SEPARATION DU SERUM ET DES GLOBULES ROUGES DUN PRELEVEMENT COAGULE
Lorsque le srum est bien exud et spar du caillot, il est possible de prlever la pipette pasteur la quantit ncessaire pour le groupage ABO (preuve srique), sinon on sparera le srum et les globules rouges pour centrifugation. Pour prparer la suspension dhmaties, le caillot est dcoll des bords du tube laide dune baguette de verre, puis le tube est agit lgrement : les hmaties se mettent ainsi spontanment en suspension dans leur propre srum.

7.2. LAVAGE DES HEMATIES

Il sagit de dbarrasser les hmaties de tout plasma ou de tout srum qui les environnent et de les mettre ensuite en suspension dans un milieu adquat (eau physiologique, srum humain compatible, solution basse force ionique). Pour ce faire, on utilise des centrifugations successives sparant les hmaties du plasma, puis du liquide surnageant. Aprs trois lavages, les hmaties sont pratiquement dbarrasses de toute trace de plasma ou de srum ambiant. Cependant, dans certains cas, il est ncessaire deffectuer un plus grand nombre de lavage (6 cm minimum).

TECHNIQUE

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Donner un tube hmolyse, un volume de globules rouges dplasmatis, on ajoute 5 (ou plus) volume deau physiologique ; Centrifuger pendant 5 minutes 3000 tours / munite : liminer le surnageant soit avec une troupe vide, soit avec un pipette pasteur, ainsi que la pllicule blanche superficielle riche en leucocytes et en plaquettes ; Remplir le tube avec un nouveau volume deau priphrique : mlanger lensemble par agitation ; Remplir nouveau le tube de srum physiologique et recommencer trois fois. Les globules rouges ainsi pourront tre :

soit remis en suspension soit traits par des enzymes protolytiques soit utiliss sous forme de culot globulaire (absorption, fixation lution)

7.3. PREPARATION ROUGES

DES

SUSPENSION

DE

GLOBULES

Selon les techniques utilises, les globules rouges sont mis en suspensions dans diffrents milieux, par exemple :saline, albumine, srum AB. Ces diffrentes suspensions doivent tre prpares si possible chaque jour et conserv 4C dans la journe. pour les techniques dagglutination sur plaque la temprature du laboratoire, exemple groupage ABO, suspension saline 10% (1 volume de globule rouge 10 volume deau physiologique) ; Pour les techniques fines dagglutination sur plaque la temprature du laboratoire, exemple ltuve dun A faible, suspension saline 5 % (1 volume de culot pour 20 volume de liquide physiologique) ; Pour les techniques dagglutination sur plaque chauffe, dtermination dun Rhsus par exemple : suspension 40% (2 volumes de culot + 5 volumes de liquide) ; Pour les techniques dagglutination en tube : suspension 2% (1volume de culot + 50 volumes de liquide) ou 5%.

8. UTILISATION DES REACTIFS

Les ractifs utiliss en immunohmatologie ne sont pas des produits chimiques stables, mais des

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produits biologiques fragiles parfois, dorigine humaine, donc prcieux. -

souvent

Pour lusage courant, ils ont gnralement conservs + 4C, mais certains dentre eux, comme les antiglobulines, auront intrt a tre conservs 20C, voire 80C. Il faut alors viter de les dcongeler et recongeler . Lors de la premire dconglation, on fractionnera le ractif en petite quantit correspondant une utilisation dune journe de travail. La distribution des ractifs doit viter toute souillure ; Il est impratif de se conformer au mode demploi indiqu par le laboratoire qui a produit le ractif, de mme que les conditions (temprature, temps dincubation etc) doivent respectes. Ne pas omettre dutiliser les tmoins ngatif et positif ; Savoir utiliser le hmaties pour tests afin dviter des erreurs o Bien laver les hmaties pour les dbarrasser de toutes trace de protines plasmatiques o Utiliser les hmaties tests des concentrations correctes.

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