Protocolo para la extraccin de protenas AQPs

Las protenas totales fueron extradas pulverizando 200 mg de frondes (sin pecolo) en un mortero previamente enfriado y mantenido en hielo. Se agreg N2 lquido a la molienda hasta obtener un polvo.

Se recupera el tejido en un tubo eppendorf y se congela en N2 lquido. El macerado es disuelto en 1ml de TCA/Acetona y centrifugado 16000xg por 3 min. a 4C. Se descart el sobrenadante y se repiti el procedimiento 3 veces.

El pellet fue disuelto en 1 ml de solucin metanol/Acetato de amonio al 10% y centrifugado 16000xg por 3 min. a 4C. Se descart el sobrenadante y se repiti el procedimiento 3 veces.

El pellet fue disuelto en 1ml de solucin Acetona al 80% y centrifugado 16000xg por 3 min. a 4C. Se descart el sobrenadante y se repiti el procedimiento 3 veces.

Luego el pellet es secado a temperatura ambiente por 30 min, con el tubo eppendorf abierto.

Para extraer las protenas del pellet de macerado se disuelve en 1ml de solucin SDS:Fenol (1:1) en el cual se dej por 5 min. a temperatura ambiente. Luego es centrifugado 16000xg por 3 min. a 4C comprobando que el sobrenadante se haya separado en dos fases.

Para la precipitacin de protenas, se extrae la fase superior del sobrenadante y se disuelve en solucin de metanol/acetato de amonio al 10%. Esta solucin se almacen por 48 horas a -20C. Luego es centrifugado 16000xg por 3 min. a 4C, descartndose el sobrenadante.

El pellet es lavado dos veces en metanol al 100% y en acetona al 80%, donde despus de centrifugar a 16000xg por 3 min. a 4C se recupera el pellet.

El pellet fue resuspendido dos veces en buffer fosfato con Twen 80 e inhibidor de proteasas.