TEMA VI: GENTICA MOLECULAR

1. Maduracin del RNA 2. Cdigo Gentico 3. Traduccin del mRNA: Sntesis de Protenas 4. Regulacin de la Expresin Gnica

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE

Regulacin de la expresin gnica -Describir los niveles que existen en la regulacin de la expresin gnica en la clula y su importancia funcional. -Citar que secuencias y protenas regulan la unin de la RNA polimerasa al promotor procariota y eucariota. -Dibujar un esquema que resuma los 4 posibles tipos de regulacin transcripcional, teniendo en cuenta la presencia de efectores. -Conocer las estructuras tpicas de los factores de transcripcin como hlice-giro-hlice, dedos de zinc, regin bsica-cremallera de leucina, y hlice-lazo-hlice bsica. -Definir opern, protena represora y protena activadora en el contexto de la regulacin de la expresin gnica en procariotas. -Explicar cmo y porque se inducen los genes del operon lac en presencia de lactosa y en ausencia de glucosa. -Describir las caractersticas generales de la regulacin transcripcional en eucariotas. -Dar algn ejemplo de modificaciones en los nucleosomas que regulan la transcripcin. -Conocer la influencia de la metilacin del DNA en la regulacin de la transcripcin. -Enumerar el orden de sucesos en la activacin de la transcripcin de un promotor eucariota tpico. -Dar algn ejemplo de regulacin de la transcripcin en eucariotas inducida por ligandos. -Describir los mecanismos bsicos de regulacin traduccional. -Entender como se forman los micro-RNAs y cual es su importancia biolgica. -Conocer que es el proteasoma y el esquema general de degradacin de protenas ubiquitinadas. -Dar un ejemplo de regulacin del desarrollo embrionario por localizacin diferencial de mRNAs.

A: Textos recomendados

NELSON D.L. y COX M.M. Lehninger. Principios de Bioqumica. 5 ed. Ed. Omega, 2009. WATSON J.D., MYERS R.M., CAUDY A.A. and WITKOWSKI J.A. Recombinant DNA: Genes and Genomes- a short course. 3rd ed. Ed. W.H. Freeman and Company, 2007.

Recursos en la Web
Molecular & Cellular Biology Education Project Virtual Cell Animation Collection Lac Operon : The Movie http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/lacOperon/movie-flash.htm

REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA

1. Niveles de regulacin de la expresin gnica 2. Regulacin de la transcripcin: generalidades 3. Regulacin de la transcripcin en procariotas 4. Regulacin de la transcripcin en eucariotas 5. Regulacin de la traduccin 6. Degradacin de protenas: ubiquitina y proteasoma

1. NIVELES DE REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA

El inicio de la va es un punto de control eficaz (favorable energticamente)

La concentracin de protena viene determinada por siete procesos

El problema fundamental de la qumica fisiolgica y de la embriologa es comprender por qu todas las clulas de los tejidos no expresan en todo momento todas las potencialidades inherentes a su genoma F. Jacob y J. Monod J. Mol. Biol. (1961)

2. REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN: GENERALIDADES.

PROMOTOR PROCARIOTA
RNA pol

70

Secuencia rica en AT

1. La secuencia del promotor determina la afinidad de la RNA polimerasa y condiciona la tasa de transcripcin en los genes constitutivos o housekeeping. 2. La expresin de los genes regulables depende de protenas reguladoras que favorecen o interfieren la interaccin de la RNA polimerasa con el promotor (induciendo o reprimiendo la expresin gnica).

PROMOTOR EUCARIOTA

RNA pol II
TBP

Secuencias reguladoras

La RNA polimerasa presenta baja afinidad por el promotor y requiere, generalmente, un conjunto de factores de transcripcin que se unen a diferentes secuencias reguladoras situadas: -En la regin promotora -En regiones muy alejadas del promotor (secuencias potenciadoras o enhancers). Las secuencias de los promotores eucariotas son muy variables y pueden carecer incluso de caja TATA o de la secuencia Inr.

PROTENAS REGULADORAS DE LA TRANSCRIPCIN:

-FACTORES DE ESPECIFICIDAD: forman parte de la maquinaria de la RNA polimerasa y modulan la especificidad de la misma para un promotor o conjunto de promotores determinados.
procariotas RNA pol

32

E. coli tiene 7 subunidades , que permite el reconocimiento de distintos promotores por la RNA polimerasa. Cuando las bacterias estn sometidas a estrs trmico se sustituye la subunidad 70 por la subunidad 32 que dirige a la RNA polimerasa a una serie de promotores con una secuencia consenso diferente, controlando la expresin de genes especficos.

En eucariotas algunos factores de transcripcin generales, como la protena de unin a TATA (TBP) pueden considerarse factores de especificidad.

-REPRESORES: impiden el acceso de la RNA polimerasa al promotor, o bloquean su movimiento una vez que se ha unido. En procariotas el sitio de unin del represor se denomina operador, y se encuentra generalmente cerca del promotor. Se denomina regulacin negativa. -ACTIVADORES: potencian la interaccin de la RNA polimerasa con el promotor, unindose a secuencias en el promotor (procariotas y eucariotas) o a secuencias alejadas del promotor o enhancers (eucariotas). Se denomina regulacin positiva.

La unin de represores y activadores al DNA esta regulada por seales moleculares (EFECTORES).

Los efectores pueden activar o inhibir la transcripcin actuando tanto sobre los represores como sobre los activadores.

PROTENAS REGULADORAS DE LA TRANSCRIPCIN

1) Se unen a secuencias de DNA especficas Suelen unirse a repeticiones invertidas de una secuencia corta (palndromo). Frecuentemente se unen varias subunidades. Ejemplo: Unin del represor Lac al operador

Las cadenas laterales de los aminocidos (en el factor de transcripcin) interaccionan con grupos dadores o aceptores de enlaces de H en las bases del DNA formando enlaces de hidrgeno.

2) Tienen dominios de unin caractersticos: Hlice-giro-hlice Dedo de zinc Regin bsica-cremallera de leucina Hlice-lazo-hlice bsica
Para interaccionar con las bases en el surco mayor del DNA, una protena requiere una estructura relativamente pequea que sobresalga de forma estable de la superficie de la protena.

Ejemplos: represor Lac (procariotas) protenas homeodominio (eucariotas)

Hlice-giro-hlice (HTL: Helix-Turn-Helix):

Dominio de 20 aminocidos formado por dos hlices (de 7-9 aminocidos) separadas por un giro . Una de las hlices sobresale de la protena y se sita en el interior del surco mayor del DNA (hlice de reconocimiento).
DNA hlice HTL

giro hlice de reconocimiento

Dominio de unin al DNA del represor Lac

Rojo : puentes de H Naranja: interacciones hidrofbicas

Dedo de zinc (Zinc Finger):

Dominio de unos 30 aminocidos, cuatro de ellos (4 Cys o 2 Cys y 2 His) coordinan un tomo de zinc y estabilizan una estructura protuberante en forma de dedo.

La interaccin de un dedo de zinc con el DNA es dbil. Muchas protenas tienen varios dedos de zinc (en la figura superior 3 dedos de zinc).

El lazo alargado esta sujeto en su base por un in Zn2+ que estabiliza la estructura. El dedo de zinc se une al surco mayor del DNA mediante la hlice de uno de los lados del dedo.
Ejemplos: TFIIIA, Sp1, receptores de hormonas esteroides
Las protenas con dedos de zinc tambin se pueden unir al mRNA actuando como represores de la traduccin.

Regin bsica-cremallera de leucina (bZIP: Basic Leucine-Zipper):

Hlice anfiptica con la presencia de una leucina cada siete posiciones que contribuye a formar una cara hidrofbica que podr interaccionar con otras protenas que presenten este tipo de dominio. Presentan tambin una regin bsica de interaccin con el DNA.

Los aminocidos bsicos (K, R) interaccionan con los fosfatos cargados negativamente del DNA.

Regin bsica

Ejemplos: fos, jun, C/EBP, CREB.

Cremallera de Leucinas

Hlice-lazo-hlice bsica (bHLH: Basic Helix-Loop-Helix):

Regin de unos 50 aminocidos importante tanto en la unin al DNA como en la dimerizacin de las protenas. Una subunidad esta formada por dos hlices a anfipticas separadas por un lazo de longitud variable (hlice-lazo-hlice, HLH), diferente del motivo hlice giro hlice (HTH). La primera de las hlices presenta una zona terminal bsica que interacciona con el DNA, la segunda hlice forma dmeros de manera similar a las cremalleras de leucina.
Leucinas Subunidad 1 C-terminal Subunidad 2 C-terminal

hlice hlice bsica lazo

Subunidad 2 N-terminal

Subunidad 1 N-terminal

Ejemplos: SREBP, myo D, myc, Max.

3. REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN EN PROCARIOTAS.

Mecanismo general de regulacin de la expresin gnica basada en OPERONES. ESTRUCTURA GENERAL DE UN OPERN

El opern es una unidad de expresin gnica constituida por un conjunto de genes que suelen estar metablicamente relacionados, un promotor nico y secuencias adicionales que regulan el promotor. La transcripcin conjunta de estos genes da lugar a un nico mensajero policistrnico (que puede codificar para distintas protenas).
mRNA policistronico A B C

EJEMPLO: OPERN DE LA LACTOSA (LAC)

Se representa solo 1 operador, pero hay otras 2 regiones capaces de unir el represor

DNA

(Regulacin positiva)

-galactosidasa
(Unin del represor)

Galactsido permeasa

Tiogalactsido transacetilasa

Cuando hay lactosa en el medio se inducen los genes que pueden metabolizarla

-Galactosidase

REGULACIN DEL OPERN POR LACTOSA

(Explicacin en 4 pasos)

Regulacin negativa

O1

O2

2) El represor Lac es un tetramero 1) El gen I se transcribe a partir

de su propio promotor dando lugar al represor Lac que se une fuertemente a O1 y de forma secundaria a O2 y O3. Para reprimir el opern se da unin a 2 sitios formando un lazo.

LACTOSA

3) Al suministrar lactosa se induce el operon lac.

La lactosa se transforma en alolactosa (un ismero de la lactosa) que se une al represor y provoca un cambio de conformacin en el represor Lac disocindolo del operador.

4) Se induce la expresin de los genes Z, Y, A.

-galactosidasa

Galactsido Tiogalactsido permeasa transacetilasa

REGULACIN DEL OPERN POR GLUCOSA Y LACTOSA

En realidad la regulacin del opern tambin depende de la [glucosa]. No tiene sentido inducir genes del metabolismo de la lactosa si hay glucosa disponible en el medio. Cuando hay glucosa se incrementa la [cAMP], que se une a la CRP.

Deficiencia de lactosa
Protena receptora de cAMP (CRP)

Abundancia de lactosa

(Transcripcin muy dbil)

Regulacin positiva:

CRP

Regulacin negativa:

Represor Lac

La CRP interaccionan con la RNA polimerasa

4. REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN EN EUCARIOTAS

4.1 CARACTERISTICAS GENERALES LOS PROMOTORES EUCARITICOS SE ENCUENTRAN GENERALMENTE INACTIVOS EN CONDICIONES BASALES

1. Acceso a promotores restringido por la estructura de la cromatina

-La cromatina muy condensada (heterocromatina) es transcripcionalmente inactiva. -La cromatina menos condensada (eucromatina) es parcialmente activa. Gran parte de la eucromatina est silenciada por metilacin de citosinas en sitios CpG y por la presencia de histonas, impidiendo de esta forma el acceso de la maquinaria de transcripcin.

2. Los mecanismos de activacin predominan sobre los de represin.

- Es ms rentable activar selectivamente un programa gentico concreto que mantener inhibido todo el genoma. La estructura de la cromatina hace redundante tener represores.

3. Combinatoria de factores de transcripcin muy compleja.

-El riesgo de que protenas reguladoras puedan unir a secuencias inespecficas aumenta con el tamao del genoma. La presencia de varios factores de transcripcin uniendo a secuencias concretas y formando un complejo activo garantiza la especificidad.

4. Transcripcin y traduccin separadas.

-En los eucariotas la transcripcin tiene lugar en el ncleo y la traduccin en el citoplasma. Hay por tanto una separacin de ambos procesos en el espacio y en el tiempo, que estn sometidos a distintos mecanismos de regulacin.

4.2. MODIFICACIONES EN LOS NUCLEOSOMAS REGULAN LA TRANSCRIPCIN

1) Composicin de los nucleosomas: Una disminucin de histona H1 o bien un incremento de las histonas H3,3 y H2AZ favorecen la transcripcin. 2) Modificaciones covalentes de histonas: Mediante metilacin (puede activar o inhibir) y acetilacin (generalmente activa) en residuos especficos del dominio amino-terminal de las histonas se regula la transcripcin. 3) Reposicionamiento de los nucleosomas: El movimiento de nucleosomas (dependiente de ATP) hace que queden ms espaciados y permite la unin de factores de transcripcin.

Es posible obtener mltiples combinaciones de histonas modificadas. Se ha propuesto que podra existir un cdigo de histonas que determina los genes activos inactivos. Estos cambios suelen ser muy estables. Se piensa que el ambiente podra causar cambios epigenticos en el DNA o en las histonas que se transmitiran a la descendencia.

Nucleosoma: 147 bp DNA + 8 histonas (H2A, H2B, H3, H4)

PROTENAS DE MODIFICACIN Y REMODELACIN DE LA CROMATINA

La accin de activadores y coactivadores sobre las histonas facilita el deplazamiento del nucleosoma exponiendo el sitio de unin para la RNA polimerasa II.

Nucleosoma

4.3. REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN POR METILACIN DEL DNA

La metilacin de las bases en el DNA (mediada por metiltransferasas) se hereda y puede producir inactivacin de la regin promotora en los genes. La metilacin del DNA se suele producir en citosinas de las secuencias 5CpG. Las metilcitidinas pueden sufrir desaminacin espontanea dando lugar a timidina, lo que incrementa el porcentaje de mutaciones.

Puede ser reparado por la maquinaria celular

No es reconocido como una base alterada y puede dar lugar a una mutacin puntual (substitucin de C por T).

4.4. ACTIVADORES Y COACTIVADORES QUE FACILITAN LA TRANSCRIPCIN

Para unir de forma eficaz la RNA polimerasa II al promotor se necesita normalmente: 1) Activadores de la transcripcin Se unen a secuencias especficas y pueden activar a muchos promotores o a unos pocos. A menudo son sensibles a la unin de molculas seal (en respuesta a cambios en el ambiente celular). Adems existen protenas HMG (grupo de alta movilidad) que se unen de forma no especfica al DNA y permiten la formacin de lazos para que los activadores interaccionen con la RNA pol II. 2) Protenas de modificacin y remodelacin de la cromatina 3) Coactivadores Actan indirectamente, no se unen al DNA pero permiten (o en algunos casos interfieren) la comunicacin entre activadores y el complejo de la RNA pol II. Entre los complejos coactivadores esta el mediador, formado por 20-30 polipptidos que se une fuertemente al dominio carboxilo terminal (CTD) de la RNA pol II. Los complejos coactivadores funcionan cerca de la TATA. 4) Factores de transcripcin basal Para formar el complejo de preinicio (PIC) en la secuencia TATA, se debe unir primero la protena de unin a TATA (TBP), y despus otros factores de transcripcin (TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH, adems de la RNA pol II.

PROMOTORES EUCARITICOS Y PROTENAS REGULADORAS

(Favorecen el plegamiento del DNA)

Intermediarios entre los transactivadores y la RNA polimerasa Activacin Unin al DNA

4.5. COREOGRAFA DE LA ACTIVACIN DE LA TRANSCRIPCIN

El orden de sucesos en la activacin de la transcripcin en un promotor de Pol II tpico es: 1) Unin del activador a una secuencia especfica. 2) Modificacin y remodelacin de la cromatina. 3) Interaccin con el mediador. 4) Unin de TBP en la TATA. 5) Unin de otros factores de transcripcin, incluida la RNA pol II: formacin del complejo de preinicio (PIC) 6) La fosforilacin del dominio carboxilo-terminal (CTD) de la RNA pol II por TFIIH provoca el inicio de la transcripcin.

El mediador estabiliza la unin de la RNA pol II y los factores de transcripcin asociados

REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA POR EL RECEPTOR DE HORMONAS ESTEROIDEAS

Secuencias de DNA donde se une el receptor: Mecanismo de activacin transcripcional por hormonas esteroideas:

Forma un dmero con el receptor del cido retinoico o con el receptor de la vitamina D

Estructura del receptor:

El receptor se suele unir al DNA en forma de dmeros.

2) Dominio de unin al DNA con dos dedos de zinc.

1) Unin de ligando (hormona) al extremo carboxilo.

REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA POR PPAR

PPAR: Peroxisoma proliferator activated receptor (Receptor activado por proliferadores peroxisomales)

Los PPAR son factores de transcripcin que al unirse a su ligando especfico (T) forman heterodmeros con el receptor nuclear RXR. El dmero se une a regiones especficas del DNA conocidas como elementos de respuesta, estimulando la transcripcin de los genes que contienen estos elementos.

REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA POR FOSFORILACIN

La fosforilacin de factores de transcripcin por protenas quinasas (activadas en vas de sealizacin) puede activar inhibir a estos factores de transcripcin, regulando as la expresin gnica.

5. REGULACIN DE LA TRADUCCIN
1) En eucariotas la transcripcin y transporte de un mRNA hacia el citoplasma requiere un tiempo. Sin embargo, la traduccin de un mRNA reprimido (almacenado en el citosol) producir una rpida sntesis de protena. 2) En algunas clulas (eritrocitos inmaduros, oocitos inmaduros) no hay transcripcin y el control traduccional es esencial. 3) La regulacin traduccional es responsable de formar gradientes de protena durante el desarrollo.

Destacaremos 4 mecanismos de regulacin traduccional: 1) Represores de la traduccin: Protenas que se unen al 3UTR o 5UTR de los mRNA e interaccionan con factores de inicio de traduccin o con la subunidad ribosmica 40S. 2) Fosforilacin de factores de inicio de traduccin. 3) Protenas de unin que impiden la interaccin entre eIF4E y eIF4G reprimiendo as la traduccin. En mamferos se denominan protenas de unin eIF4E (4E-BP). (Cuando 4E-BP se fosforila es inactivo, permitiendo la traduccin) 4) Represin dirigida por RNA

INTERACCIN DE PROTENAS REPRESORAS CON EL mRNA

5UTR 3UTR

Uno de los mecanismos ms importantes de regulacin de la traduccin en eucariotas tiene lugar por la unin de protenas represoras en la regin 3UTR del mRNA. Estas protenas interaccionan con factores de iniciacin o con el ribosoma para inhibir la traduccin.

REGULACIN DE LA TRADUCCIN MEDIANTE FOSFORILACIN

Los factores de crecimiento inducen la fosforilacin de diversos factores de iniciacin de la traduccin (eIF4G, eIF4B) activando la sntesis de protenas. La fosforilacin de 4E-BP tambin activa la traduccin.

En situaciones de estrs se suele inhibir la traduccin mediante: Activacin de quinasas que fosforilan eIF2. Activacin de caspasas (un tipo de proteasas) que proteolizan factores de iniciacin de la traduccin.

REPRESIN DIRIGIDA POR RNA

PROCESAMIENTO miRNA
Micro-RNA (miRNA): pequeos RNA de 70 nucletidos con secuencias complementarias internas que forman estructuras en horquilla

APLICACIN MDICA
1) Podemos introducir RNA duplex en una clula

2) Se generan pequeos RNA de interferencia (siRNA) Procesamiento de los miRNA

3) Que degradan o silencian el mRNA diana Una de las hebras del miRNA maduro se asocia con mRNA diana provocando inhibicin de la traduccin o degradacin del mRNA

2% de los genes animales son miRNA 1/3 de los mRNA pueden estar regulados por los miRNA

Los miRNA regulan:

- Desarrollo - Muerte celular - Patrn espacial - Patrn neuronal - Diferenciacin celular - Proliferacin celular y supervivencia en cncer

6. DEGRADACION DE PROTENAS: UBIQUITINA Y PROTEOSOMA

UNIN A UBIQUITINA DEGRADACIN POR EL PROTEOSOMA

20S 26S 19S

La ubiquitina es una protena de 76 aminocidos que se une covalentemente a residuos de lisina a travs de una ruta dependiente de ATP en la que intervienen tres enzimas diferentes.

Las protenas ubiquitinadas son degradadas por un gran complejo denominado proteasoma 26S.

El proteasoma 26S puede ser complementado con complejos reguladores que cambian en funcin de las condiciones celulares.
Por ejemplo, la partcula 19S se puede reemplazar por otro regulador alternativo, degradando a otras protenas no ubiquitinadas

DESARROLLO TEMPRANO EN DROSOPHILA

El huevo de Drosophila junto con 15 clulas nodriza, esta rodeado por una capa de clulas foliculares. A medida que se forma la clula huevo se depositan distintos mRNA en la zona anterior y posterior. Ejemplo: bicoid (anterior) y nanos (posterior)

Bicoid Factor de transcripcin que activa genes de segmentacin. Es tambin un represor de la traduccin.

Nanos Represor de la traduccin