Sunteți pe pagina 1din 11

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mure LP5

Reacii antigen anticorp


Componentele structurale ale virusurilor joac rol de antigen, provoac rspuns imun din partea organismului infectat, ceea ce rezult n producere de anticorpi. Reacia antigen anticorp este specific, antigenul poate fi legat numai de anticorpul ce s-a produs ca rspuns la stimulul antigenic respectiv. ag + ac ag-ac

Aceste reacii pot fi folosite pentru: detectarea unui antigen necunoscut cu ajutorul unui anticorp cunoscut (metode de diagnostic directe) detectarea anticorpilor din serul bolnavilor cu antigene cunoscute (serodiagnostic, metode de diagnostic indirecte).

ag? + ac ag + ac?

ag-ac ag-ac

n cazul n care antigenul corespunde anticorpului, se formeaz complexul imun antigenanticorp. n funcie de cum se vizualizeaz/detecteaz formarea complexului imun exist mai multe metode bazate pe reacii antigen-anticorp: reacii de precipitare: complexele imune formeaz precipitat reacii de aglutinare: complexele imune formeaz aglutinat RFC se detecteaz consumarea complementului (acesta se leag de complexele imune) reacii n care elementul cunoscut este marcat se detecteaz elementul marcat din complexul imun format

-1-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

1. Reacii de precipitare
Pot avea loc n medii lichide (metode folosite n bacteriologie) sau n medii solide (metode folosite n virusologie) Reacii de precipitare n mediu lichid Reactii de precipitare n amestec (n toat masa lichidului) testul Ramon titrarea toxinei difterice o se pun n contact, n amestec n tuburi, cantiti egale din componenta care trebuie titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti variabile de Ac la care titrul este cunoscut o cantitatea maxim de precipitat se gsete n tubul unde exist echivalen ntre titruri o cunoscnd titrul Ac, se poate afla titrul toxinei testul VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin) + n diagnosticul sifilisului Reactii de precipitare n inel reactia Ascoli diagnosticul retrospectiv al infeciei crbunoase o se pun n contact suspensia preparat din fragmentul de organ (conine Ag) cu serul anticrbunos (conine Ac), n aa fel nct s nu se amestece o precipitatul se formeaz la zona de contact dintre cele 2 coloane de lichid stabilirea grupelor Lancefield la streptococi beta hemolitici

2. Reacii de aglutinare
Antigenele: de natur corpuscular, aglutinogene, Anticorpii: aglutinine Antigenele corespund cu anticorpii + sunt prezente n cantiti echivalente: se formeaz aglutinatul (reea tridimensional de complexe imune), vizibil cu ochiul liber sub forma de grunji.

Reacii de aglutinare pe lam se aplic pentru stabilirea structurii antigenice a speciei bacteriene izolate, includerea acesteia n serogrupe, serotipuri se folosesc seruri aglutinante specifice

-2-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

pe o lam de microscop curat i degresat se pun: o la o extremitate a lamei o picatur de ser fiziologic steril, n care suspensionm o cantitate mic din colonia de cercetat; va rezulta o suspensie omogen o la cealalt extremitate o pictur de ser aglutinant (conine Ac cunoscut) reacie pozitiv n pictur vor aprea grunji reacie negativ pictura rmne omogen

Reacii de aglutinare pe suport Elementul cunoscut al reaciei imune este ataat de un suport: hematie hemaglutinare pasiv (hematia nu particip direct n reacia ag-ac) particul latex - latexaglutinare proteina A extras din tulpina de stafilococ Cowan coaglutinare

-3-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

3. Reacia de fixare a complementului (RFC)


Complementul: se leag de complexul imun lizeaz hematiile din complexul imun

Reacie pozitiv: lipsa hemolizei hematiile se depun la fundul eprubetei

Reacie negativ: hemoliz

ac?

ag

sistem hemolitic (eritrocit + ac = CI)

complement

-4-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

4. Metode imunoenzimatice (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay)


Permit detectarea antigenelor libere i a anticorpilor. Este posibil determinare cantitativ. La reacii particip: un reactant imunologic cunoscut ataat de un suport solid (plci cu godeuri, lame, baghete). Se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A) un reactant imunologic marcat enzimatic - peroxidaza substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de culoare detectabil

spectrofotometric (determinare cantitativ) substane pentru stoparea reaciei (baze sau acizi puternici)

Reaciile au loc n aparate automate, semiautomate. ntre reacii splare cu soluii tampon Detectarea antigenelor anticorpi specifici

anticorpi marcai enzimatic

antigen? substrat cromogen

Detectarea anticorpilor stoparea reaciei

anticorp antiglobulinic marcat anticorp?

antigen cunoscut

-5-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

5. Reacia de imunofluorescen (RIF)


Fluorocromii: se leag covalent de proteine (imunoglobuline) = conjugat emit fluorescen dac se expun la raze UV izotiocianatul de fluorescein (galben-verzui), rodamina (portocalie) nu sunt stabili n timp

Metoda direct Preparatul de examinat se monteaz pe lam. Se adaug conjugatele. n cazul n care se gsesc ag corespunztoare anticorpilor marcai, se formeaz complexele imune. Prin splare se ndeprteaz conjugatele nelegate. Preparatul se examineaz la microscopul cu fluorescen. Puncte fluorescente pe fond ntunecat: n preparatul examinat au fost prezente antigenele cutate (rezultat pozitiv). Absena punctelor fluorescente: n preparat nu au fost prezente antigenele cutate (rezultat negativ).
antigen din preparatul montat pe lam

anticorp marcat cu fluorocrom

Metoda indirect La preparatul montat pe lam se adaug anticorpi specifici nemarcai. . n cazul n care exist antigene corespunztoare anticorpilor, se formeaz complexele imune. Prin splare se ndeprteaz ac nelegai. Se adaug anticorpi antiglobulinici marcai cu fluorocrom. Dac exist n preparat complexe imune, conjugatele se vor lega de imunoglobuline. Examinarea: la fel ca la metoda direct.
anticorp antiglobulin marcat cu fluorocrom anticorp specific antigenului cutat n preparat

-6-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

Identificarea microorganismelor prin detectarea acizilor nucleici


Genomul conine secvene specifice pentru fiecare microorganism, detectarea prezenei acestora ntr-un produs patologic sau n culturi celulare are valoare diagnostic.

1. Metode de hibridizare
Principiu: fragmente monocatenare de oligonucleotide marcate (sonde), avnd secven cunoscut (caracteristic unui virus) se vor ataa pe baza complementaritii de secvene complementare situate pe acizii nucleici ale microorganismului de identificat. Etape de lucru: extragerea acizilor nucleici denaturarea acizilor nucleici i fixarea acestora pe un suport hibridizare: adugarea sondelor (marcate enzimatic, cu fluorocrom sau cu substane radioactive) i ataarea acestora de secvenele omoloage eliminarea sondelor nefixate vizualizarea hibridizrii

Vizualizarea se face n funcie de tipul marcajului folosit.


A T C G G C T A T G C A A T C G G C T A

denaturare

a. FISH (Fluorescent in situ hybridization) Marcajul folosit este element fluorescent

FISH pentru 16S rRNA bacterian -7-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

b. Metoda Southern blot Se detecteaz secvene specifice de nucleotide de ADN. Etape: extragerea ADN-ului denaturarea ADN-ului se obin lanuri monocatenare fragmentarea lanurilor cu enzime de restricie (acestea acioneaz n locusuri determinate, rezultnd fragmente de lungime diferit, caracteristice) separarea electroforetic a fragmentelor n gel de agaroz (separarea se face n funcie de mrimea fragmentelor) transferarea pe membran de nitroceluloz adugarea sondelor marcate cu substane radioactive ataarea de secvenele omoloage se ndeprteaz sondele n exces, nelegate vizualizare prin autoradiografie

Probele 3,4,8,10 secvene de ADN prezente Proba 6 secven de ADN prezent, dar clivat de enzima de restricie n 2 componente de greutate molecular mai mic Probele 1,2,5 nu prezint secvena de ADN cutat

-8-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

c. DNA microarray Folosete principiul hibridizrii Poate detecta expresia a mii de gene simultan Aplicabilitate: determinarea nivelelor de expresie a genelor, determinarea secvenelor de acizi nucleici

Pe principiu similar se bazeaz metodele: Northern blot se detecteaz ARN, este necesar revers-transcriptaza Western blot (protein immunoblot) se detecteaz proteine

1 markeri proteici 2-6 probe

-9-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

2. Reacia n lan a polimerazei (PCR polimerase chain reaction)


Se detecteaz secvene specifice de acid nucleic dup o prealabil amplificare. Etapele de lucru - detectarea ADN-ului extragerea ADN-ului amplificare: se realizeaz n aparatul PCR i const din mai multe cicluri identice denaturare (940C) alinierea primerilor (500C) 2 secvene de oligonucleotide care se leag prin complementaritate pe cele dou catene la o anumit distan ntre ele. sinteza lanurilor complementare (720C ) elongaie; este necesar prezena enzimei polimeraz (Taq) i a nucleotidelor se formeaz lanurile complementare astfel se dubleaz cantitatea de ADN reluarea ciclului de n ori se obin 2n copii ale secvenei de identificat

vizualizarea produilor de amplificare produii de amplificare obinui se separ electroforetic colorare cu bromur de etidiu vizualizare cu raze UV prelucrare computerizat

Multiplex PCR se amplific mai multe gene odat Real time PCR RT-PCR - este necesar revers-transcriptaza

-10-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP5

3. Metode de tipizare molecular (genotipare)


Metodele sunt folosite pentru diferenierea diferitelor tulpini bacteriene din cadrul aceleiai specii, avnd utilitate practic de exemplu n stabilirea clonalitii tulpinilor izolate n context de epidemie i identificarea sursei de infecie (anchet epidemiologic). Metodele au putere discriminatorie mare. a. PFGE pulse field gel electrophoresis Extracia ADN-ului i nglobarea n gel de agaroz (discuri) Digestia ADN-ului cu enzima de restricie Electroforeza fragmentelor de macrorestricie n gel de agaroz Colorare cu bromur de etidiu Vizualizarea fragmentelor n lumin ultraviolet

b. MLST- multilocus sequence typing permite tipizarea la nivelul mai multor locusuri genetice odat. are putere discriminatorie foarte mare permite evidenierea variaiilor genetice la nivel de specie baze de date cu evidena geografica a diferitelor tulpini http://www.mlst.net/

-11-