CAPITOLUL 2 ROLUL GENELOR KNOCKOUT N NELEGEREA MECANISMELOR BOLII

2.1. Introducere Lezarea genelor int la oareci reprezint a nou tehnologie care revoluioneaz cercetarea biomedical, constituind un puternic instrument pentru producerea modelelor animale pentru studiul dezvoltrii umane i a bolilor ereditare. Chiar dac proiectul genomului uman a ajutat la stabilirea celor aproximativ 35000 de gene candidate, doar o mic parte din aceste gene au fost caracterizate precis pentru funcia lor in vivo. Genele int au un mare impact n ncercrile de a elucida rolul funcional al acestor gene. Beneficiul major al acestei tehnologii este acela de a permite analiza funciei proteinei produs de o anumit gen in vivo. Astfel funcia genei poate fi determinat n toate tipurile de celule normale, lund n considerare i interaciunile complexe ntre molecule sau celule. Este astfel posibil determinarea produsului genei n condiii de repaus al corpului, dar i n diferite situaii patologice i fiziologice. Multe modele de gene knockout la oareci simuleaz fenotipul bolilor umane. Modelele de oareci modificate genetic reprezint oportuniti unice pentru dezvoltarea i testarea diferitelor strategii terapeutice nainte ca acestea s fie introduse n clinic. n viitor, ingineria genetic pe modele animale va fi indispensabil pentru realizarea unor descoperiri importante n ceea ce privete mecanismele moleculare care stau la baza semnalizrii celulare, dezvoltrii, dar i a patogenezei, diagnosticului, prevenirii i tratamentul bolilor.

2.2. Gene knockout la oareci Modelele animale sunt deosebit importante pentru cercetarea biomedical deoarece ajut la ntelegerea patogenezei bolilor i permit dezvoltarea de strategii terapeutice care s permit studiul eficacitii noilor tratamente cu consecine asupra costului i timpului alocat trialurilor clinice [Malakoff D., 2000; Smithies O., 1993]. n unele cazuri, lipsa de modele animale a mpiedicat progresul n direcia dezvoltrii de terapii eficiente pentru bolile genetice. oarecii de laborator au devenit rapid cele mai utilizate mamifere n biomedicin datorit dimensiunilor reduse, ciclului de reproducere scurt, informaiei lor genetice cunoscute i mai ales datorit posibilitii de a induce modificri genetice precise n celulele stem embrionare i de a le transfera la linii de oareci. Prin urmare manipularea genetic a oarecilor este actualmente larg rspndit, oarecii fiind utilizai ca modele animale ce ne ajut s nelegem dezvoltarea, prevenirea i tratamentul bolilor. Multe alte specii ca Drosophila [Gloor GB., 2001], viermele nematod Caenorhabditis elegans [Jorgensen EM, Mango SE., 2002] i petele zebr [Udvadia AJ, Linney E., 2003] au fost utilizai n experimente de mutagenez pentru studiul proceselor de dezvoltare i transducie a semnalelor. Dintre mamifere oarecii s-au dovedit a fi cele mai bune modele animale, deoarece ei sunt capabili s mimeze fenotipic bolile i afeciunile umane. Motivul pentru generarea de gene knockout la oareci purttori de gene inactivate sau mutante, este de cele mai multe ori bazat pe supoziii sau necunoaterea funciilor proteinei codificate de gena candidat, modelului ei de expresie, studiilor farmacologice sau a locilor cromozomiali implicai, n cohortele de pacieni din cadrul studiului. n urma publicrii schiei genomului uman, muli cercettori au adoptat strategii pe oareci knockout pentru a contura, in vivo, funciile genelor de interes i implicarea lor fiziopatologic n producerea bolilor. Procesul de dezvoltare a oarecilor knockout cu o gen modificat
2

ncepe de la ADN-ul genei. Dac secvena de nucleotide a genei sau un fragment mare din gen este necunoscut, nu se poate realiza designul vectorilor int. ADN-ul celor mai muli oareci poate fi obinut din bazele de date ce conin bioinformaii despre ADNul din genomul oarecilor, proiect care a fost completat cu succes n 2002 [Blake JA i colab., 2003]. Informaiile despre ADN-ul genelor permit construirea de vectori int care ofer posibilitatea de manipulare a genomului celulelor stem embrionare i de inducie a unor alterri n gena de interes.

2.2.1. Celulele stem embrionare n anii 60 dup ce primele experimente de deleie genic au fost efectuate n celulele stem embrionare (ES) ale murinelor [Thomas KR i colab., 1987], s-a obinut un numr remarcabil de oareci knockout. O condiie obligatorie pentru realizarea acestui obiectiv a fost posibilitatea de obinere a murinelor. Celulele embrionare au caracteristici ce le face uor de cultivat. Celulele ES sunt linii de culturi celulare, colectate iniial din masa celular intern a blastocitilor la 3.5 zile postcoitus la stadiul de blastul de dezvoltare (figura 2.1.). Deoarece aceste celule provin din stadii timpurii ale dezvoltrii ele sunt celule pluripotente. Toate genele lor pot fi activate i toi produi lor genici pot fi sintetizai. De asemenea ES pot fi subcultivate cu o eficien rezonabil, permind ca un numr crescut de celule s fie folosite n procese ca transfecia i recombinarea secvenelor omooage. n plus, celulele ES ale oarecilor pot fi meninute ntr-un stadiu nedifereniat, n monostraturi de tip fibroblastic i cnd mediul de cultur este mbogit cu factor inhibitor leucemic. n ciuda acestui tratament, celulele ES pstreaz capacitatea lor de a contribui la toate tipurile de esuturi i toate liniile celulare cnd sunt reintroduse ntr-un blastocist gazd [Nagy A, i colab., 1993].

Figura 2.1. Diagrama izolrii i multiplicrii celulelor stem embrionare

Figura 2.2. Secvena de nlocuire a vectorului pentru selecia pozitiv-negativ n celulele ES. Vectorul conine caseta de expresie a genei de rezisten Neo i gena HSV Tk. Dup recombinarea omoloag caseta de selecie pozitiv la medicament este ncorporat n locusul int i caseta de selecie negativ este nlturat. Alela (-) indic alela mutant dup recombinarea omoloag. R indic situsurile enzimei de restricie utilizate pentru excizia ADN nainte de detecia recombinrii omoloage prin tehnica Southern blot cu ajutorul unei sonde specifice derivat din afara regiunii int.

2.2.2. Vectori int Pentru a stabili modelul de oarece knockout, este realizat o construcie de ADN, numit vector int ce conine forma mutant a genei de interes (figura 2.2). Iniial, primii vectori int utilizai pentru a leza funcia genei int prin deleia de secvene specifice i nlocuirea lor cu ADN heterolog, erau o gen de selecie pentru medicamente sau o gen marker pentru analiza expresiei genei int [Zhang H. i colab., 1994].Cum este artat n figura 2.2 vectorul int cuprinde trei elemente principale ordonate specific: i) o regiune 5' omoloag genei int, ii) o gen marker de rezisten la medicamente pentru selecia pozitiv a celulelor care integreaz vectorul int, iii) o regiune 3' omoloag genei int. Secvenele ADN de la nivelul regiunilor 3' i 5' din vectorul int reprezint substratul pentru crossing-overul reciproc sau pentru mecanismul de conversie genic care trasfer caseta marker de selecie n locusul endogen. Secvenele omoloage provin din fragmente genomice clonate ale genei int i delimiteaz sevenele genei int, care sunt nlocuite de caseta marker de selecie pentru a genera locusul mutant. Pentru a deveni int ADNul genomic izogenic trebuie utilizat mpreun cu cel al celulelor ES n vederea construirii intelor. Specificitatea i lungimea secvenei ADN care delimiteaz regiunea int poate fi maximalizat pentru o recombinare omoloag eficient, ce presupune de exemplu nlturarea secvenelor repetitive. Cnd construcia a fost complet, vectorul este liniarizat la sfritul regiunilor omoloage 5' sau 3', astfel nct capetele ADN-ului s poat servi ca substrat pentru iniierea recombinrii omoloage cu locusul int. Dup transfecia vectorului int liniarizat n celule ES, se face o selecie a medicamentelor, pentru a mbogi aceste celule ES, care s-au integrat n vectorul int i se exprim ca gene sensibile la medicament. Caseta de exprimare a genei marker include toate secvenele, de reglare necesare pentru transcriere. Cei mai frecvent utilizai markeri de selecie au fost gena neomicin fosfotransferaza (Neo), care confer rezisten la analogul de neomicin G418. Metoda utilizat pe scar larg pentru a mbogi
6

clonele de celule ES pentru recombinare omoloag este o strategie a genelor int care implic un vector conceput pentru a fi utilizat ntr-o dubl selecie de droguri, protocol cunoscut ca selecie pozitiv-negativ (Fig. 2.2). n afar de selecia pozitiv a markerului Neo poziionat ntre regiunile 5 i 3 omoloage ale genei int, este inclus o gen caset suplimentar de selecie negativ amplasat la captul regiunilor omoloage. Gena de selecie negativ cel mai frecvent folosit este gena caseta de expresie a virusului herpes simplex timidin kinaza (Tk), care confer sensibilitate la guanozin analog al ganciclovirului. Produsul genei Tk fosforileaz ganciclovirul, i i permite acestuia s fie ncorporat n ADN-ul replicat acionnd ca un inhibitor de sintez al ADN-ului (Fig. 2.3). ntr-un experiment tipic de gene-int, vectorul de selecie pozitiv/negativ va fi aleatoriu integrat de ctre capetele liniare n genomul multor celule, care pstreaz ambele casete de selecie Neo i Tk i confer rezisten la neomicin i sensibilitate pentru ganciclovir. Totui, n cazul n care n celule ES a aprut recombinarea omoloag ntre vectorul int i gena omoloag, caseta Neo-CAS va fi integrat n locusul int n timp ce caseta Tk se pierde i aceste celule vor supravieui fiind pozitive, dar i sensibile la gancicliovir . Prin folosirea schemei de selecie pozitiv/negativ, numrul absolut al coloniilor de celule ES care supravieuiesc seleciei duble de medicamente este de aproximativ 10 ori mai mic dect numrul de colonii care supravieuiesc doar seleciei pozitive. Reducerea numrului de colonii fiind un screening pentru evenimentele genei int. Empiric, nu toate clonele de ES care supravieuiesc seleciei pozitiv/ negativ sunt recunoscute ca prezentnd recombinri omoloage ce vor fi evideniate prin tehnica Southern blot care utilizeaz sonde specifice pentru locusul int n celulele ES (Fig. 2.2), motiv pentru care acestea, ar putea conine gena marker de selecie negativ care dobndete mutaii de inactivare, nainte de integrarea aleatorie a vectorului int n genomul celulei ES.

Figura 2.3. Mecanismul toxicitii celulare a ganciclovirului utilizat pentru selecia negativ n screening-ul celulelor stem embrionare cu recombinare omoloag.

2.2.3. Selectarea celulelor stem embrionare recombinate Vectorul int liniar este introdus n celulele stem embrionare prin amestecare cu prealabil cu aceste celule ntr-o cuvet de electropermebilizare, anterior construirii unui cmp electric. Cmpul electric deschide porii membranei celulelor ES, permind intrarea vectorului int. Cnd curentul electric este ntrerupt , membrana celulelor ES revine la situaia normal. Secvena ADN construit difuzeaz prin citoplasm i intr n
8

nucleu. Toate celulele ES care au suferit electropermeabilizare sunt crescute n culturi celulare care conin soluie de antibiotic. Dup transfecie, recombinarea omoloag dintre vectorul int i locusul endogen din celulele ES este rar, iar prezena de gene marker pentru selectarea medicamentelor permite mbuntirea recuperrii celulelor ES recombinate. Coloniile de celule ES crescute vizibil i dezvoltate n prezena unor compui de selecie sunt recoltate ca i candidate probabile ce pot s conin gene mutante n genomul lor. Celulele ES care au suferit recombinari omoloage vor fi genetic heterozigote, la nivelul locilor cromozomiali vizai. Astfel, n planificarea oricrui experiment cu gene int, este important s avem o strategie de genotipare, strategie care va face uor discriminri ntre tipul slbatic (wild type) i locii mutani din celulele cu evenimente de recombinare omoloag. La selectarea regiunilor omoloage din gena int pentru clonare n vectorul int, este important de a se anticipa utilizarea analizei Southern blot (sau analiza PCR), considernd disponibile situsurile enzimei de restricie pentru a genera fragmente de diagnostic. Succesul acestor analize este dependent de selecia sondelor ADN din afara regiunilor de recombinare i de alegerea situsurilor de restricie care vor conduce la identificarea fragmentelor de restricie care sunt unice pentru alelele mutante i respectiv alelele de tip slbatic (Fig. 2.2).

2.2.4 Injectarea celulelor ES recombinate n blastociti i transferul blastocistului la primitori pseudonsrcinai Coloniile de celule ES ce prezint recombinrile omoloage presupuse sunt individualizate prin tripsinizare i colectate cu un ac fin, subire care este conectat la un micromanipulator. Blastocitii destinai microinjectrii cu celule ES sunt prelevai de la femele donatoare. Cu un ac ascuit se penetreaz brusc i precis blastocistul i se elibereaz 15-25 celule ES, prin presiune pozitiv. Embrionii injectai trebuie implantai la femele. Succesul de transfer al embrionilor depinde de calitatea mediului gazdei materne. mperecherea cu oareci masculi este necesar pentru modificrile hormonale
9

necesare stabilirii sarcinii. Femelele nu pot purta embrionii lor adevrai i sunt puse s se mperecheze cu oareci vasectomizai. Femele de oareci au ovulaie spontan i pot fi fals nsrcinate prin mperecherea cu masculi vasectomizai n timpul estrului, i vor afia profilul hormonal al unei femele gravide normal.

Figura 2.4. Figura de sus. Clone celulare multiple de celule stem embrionare ce cresc formnd monostraturi de fibroblati. Fibroblatii provin de la embrioni de oareci transgenici purttori ai casetei de selecie Neo, conferind rezisten la geneticin pentru selecia pozitiv. Fibroblatii sunt iradiai pentru a preveni proliferarea lor ulterioar, dup pregtirea acestora din embrioni, Figura de jos. Injectarea celulelor ES n blastocist. Celule ES individualizate sunt ncrcate ntr-o pipet de injectare. (1), vrful ascuit al pipetei ptrunde n cavitatea blastocistului (2) cu grij i ncet se mpinge vrful de injecie al pipetei n embrion fr ruperea sau neparea peretelui 10

opus(3), celulele ES sunt expulzate prin presiune pozitiv, (4), acul este retras din embrion (5), i blastocitii injectai sunt colectai pentru transferul la femele recipient( surogat) (6).

2.2.5. Himera i puii F1 i F2 Succesul microinjectrii celulelor stem embrionare n blastocist duce la formarea unui embrion care conine celule din blastocistul iniial i n plus celulele embrionare implantate n blastocist. Celulele de origini diferite cresc mpreun pentru a forma un nou embrion. oarecele hibrid rezultat are esuturile i organele formate dintr-un amestec de celule derivate din celulele de origine (de obicei cu provenien din oareci C57/BL6 cu blana neagr) i celule ES (de obicei cu provenien din oareci SV129 cu blana galben/maronie). Hibridul este denumit himer pentru c acesta conine celule din dou surse independente. Blana hibrizilor himerici este un amestec de galben-maroniu i negru. Dac nici o celul ES nu este ncorporat n stadiul de blastocist, puii vor avea blana neagr. Aspectul blnii este un marker precoce util pentru succesul unei mutaii. oarecii himer sunt identificai odat ce culoarea blnii devine detectabil. Cnd ncorporarea celulelor mutante este numai la nivelul celulelor somatice, care se dezvolt n esuturi nonreproductive, himerele vor exprima mutaia, dar puii lor nu. transmis la generaia urmtoarea de pui de himer (Fig.2.5). Pentru a detecta trasmiterea pe linie germinal se realizeaz ncruciarea ntre himer i oareci de tip slbatic. Himera este ncruciat cu rase de oareci normali, ca C57/BL6. Puii F1, rezultat al ncrucirii, sunt analizai pentru exprimarea mutaiei (Fig. 2.5). Un pui de oarece F1 care primete gena mutant de la progenitorul himeric este heterozigot pentru gena mutant. Tehnica Southern blot i tehnica PCR cu sonde specifice se efectueaz pe ADN-ul genomic dintr-un mic eantion de esut de la coada puiului de oarece, n scopul identificarii heterozigoilor pozitivi. Fiecare heterozigot pozitiv este un potenial fondator pentru o linie de oareci mutani. Puii heterozigoi F1 identificai sunt mperecheai unul cu cellalt pentru a produce o generaie F2. Teoretic, populaia F2 va urma principiile de segregare mendelian, rezultatul fiind 25% homozigoi mutani, 25% homozigoi control tipul slbatic i 50% heterozigoi mutani.
11

Cnd

ncorporarea are loc n celule care se dezvolt din celulele germinale mutaia int este

n cazul n care deleia genei este letal, homozigoii mutani nu vor supravieui. n cele din urm, lipsa produsului genei la homozigoii mutani este evideniat prin anticorpi specifici prin tehnica Western blot folosind esut unde proteina este, de obicei, exprimat.

Figura 2.5. mperecherea oarecilor himer, cu oareci de tip slbatic( wild type) pentru obinerea de heterozigoi mutani. Clonele de celule stem embrionare puttoare a unei alele de tip slbatic i unei alele mutante (+/-) sunt injectate n blastociti.Se observ analiza Southern blot caracteristic pentru clonele de celule ES. Blastocitii injectai sunt transferai la female recipient care vor da natere la himere. De obicei celulele ES purttoare de mutaii dominante care determin culoarea maroniu-glbuie a blnii (rasa SV129), sunt injectate la blastociti de la oareci de ras neagr (rasa C57B16). Prin urmare, gradul de hibridizare poate fi uor recunoscut prin contribuia culorii maroniu/glbuie la culoarea blnii. Himerele sunt apoi, mperecheate cu oareci C57B16 de culoare neagr. n cazul transmiterii mutaiei pe linie germinal, oarecii heterozigoi F1 (+/-) vor fi cu blana 12

maroniu-glbuie.Ca urmare a mperecherii oarecilor heterozigoi ntre ei, un sfert din oareci vor fi homozigoi F2, dac viabilitatea nu este compromis de mutaii.

Se genereaz apoi o linie de oareci cu gena mutant. oarecii homozigoi cu mutaie nul au deficiente ambele alele, iar heterozigoii au deficient doar una din cele dou alele ale genei. Genotipul este -/- pentru mutaie nul, +/-pentru heterozigoi i +/+ pentru alela de tip slbatic obinuit, de control (wild-type). Fenotipul reprezint setul de caracteristici determinate de mutaie i se refer la caracteristici biochimice, anatomice, fiziologice i comportamentale. Caracteristicile oarecilor mutani sunt identificate, n comparaie cu oarecii de control normali, iar cele relevante pentru bolile umane sunt cuantificate. Aceste caracteristici specifice bolii sunt apoi folosite ca variabile de test pentru evaluarea eficienei tratamentelor. Tratamente general acceptate sunt administrate la oarecii mutani. Un tratament care previne sau nltur caracteristicele bolii la oarecii mutani este folosit pentru mai multe teste suplimentare ca un tratament potenial terapeutic pentru boli genetice umane.

13

Figura 2.6. Diagrama fluxului pentru genele knockout

2.3. Expresia genelor esut specifice Tehnologia convenional de gene knockout este limitat de moartea embrionar sau postnatal imediat ntruct rolul unor astfel de gene nu poate fi investigat. n plus, rolul unei anumite gene n esuturile adulte poate fi mascat la orice oareci knockout, generai prin anomalii sau compensri de dezvoltare, sub forma intensificrii sau atenurii expresiei altor gene. Implementarea de situsuri specifice de recombinare, cum ar fi sistemul bacteriofag P1 LoxP / CRE, permit dezvoltarea unui knockout condiionat de absena unei anumite gene numai ntr-un esut specific sau dup un stadiu de dezvoltare specific [Gu H. i colab., 1993]. Enzima CRE este izolat de la bacteriofagul P1 i acioneaz ca un situs specific de recombinare. Secvena recombinat de ctre CRE, denumit LoxP, const din dou scurte repetiii de ADN (situsul de recunoatere CRE ) i o secven intermediar, ntre cele dou. Dou secvene LoxP cu aceeai orientare vor conduce la excizia ADN-ului cuprins ntre cele 2 secvene de ctre CRE lsnd intact un situs LoxP (Fig. 2.7). n contrast, n cazul n care dou situsuri LoxP sunt orientate opus, CRE va inversa acest segment intermediar de ADN. Construciile int pentru inseria situsurilor LoxP n ADN-ul genomic sunt similare cu cele utilizate pentru realizarea de gene knockout convenional n celule ES (Fig. 2.2). n plus fa de aceste aspecte, design-ul construciei de gene knockout condiionat necesit un numr important de considerente suplimentare: knockoutul convenional este, de obicei, conceput astfel nct caseta Neo lezeaz transcrierea genei endogene. n knockout-ul condiionat, gena endogen trebuie s funcioneze n mod normal, pn la recombinarea de ctre CRE recombinaza i, astfel, orice modificri trebuie s fie n afara regiunilor de codificare, adic introni, i nu trebuie s interfereze cu regiunile de reglare (Fig. 2.7). Situsul LoxP trebuie s fie introdus ntr-un mod n care splicing-ul, va avea ca rezultat excizia unei cantiti suficiente de ADN pentru ca gena s fie inactivat. Acest lucru poate fi deosebit de dificil pentru genele cu introni de
14

dimensiuni mari, n cazul n care numai cantiti mici de secvene codificatoare pot fi nlturate.

Figura 2.7. Knockout condiional utiliznd LoxP/ CRE. Locusul de tip slbatic i construcia int condiional prezint trei situsuri LoxP ce flancheaz caseta marker de selecie a tandemului Neo/Tk i exonul care va fi deletat. O prima int este recombinarea dintre aceast construcie i locusul ales. O clon recombinat pozitiv este aleas pentru a doua faz , ce cuprinde trasfecia cu vectorul ADNc - recombinaza CRE . Dup expunerea la CRE sunt posibile 3 evenimente recombinatorii. Populaia celular A prezint excizia complet i poate fi utilizat pentru injectarea blastocitilor pentru a genera knockout total la oareci. Populaia de celule B este forma n care caseta de selecie a fost eliminat, dar gena nu este nc deletat. Aceste celule ES sunt preluate pentru a stabili knockoutul condiional, unde exonul flancat este deletat mai trziu, adic dup ncruciarea 15

animalelor rezultate cu oareci transgenici ce exprim recombinaza CRE sub un promotor esut specific. Secvena palindromic parial de nucleotide a situsurilor LoxP este prezentat n partea inferioar.

Astfel, situsurile LoxP trebuie s fie poziionate pentru a nltura exonii care codific un important domeniu funcional i ca rezultat ar avea loc schimbarea cadrului de citire. Genele de rezisten incluse pentru selecia clonelor int conin de obicei mai multe kilobaze de ADN strin, care are potenialul de a influena expresia genei int nainte de recombinare. Pentru a minimaliza aceast potenial influen asupra expresiei genei, este posibil s se nlture gena de rezisten din clonele celulelor ES int in vitro, nainte de microinjectarea blastocitilor. Pentru a elimina genele de rezisten, un situs suplimentar LoxP trebuie s fie inclus pentru a flanca gena de rezisten (Fig. 2.7). ADN-ul genomic modificat ar include, astfel, trei situsuri LoxP, dou poziionate pe flancuri, nsoind gena de rezisten, precum i cel de-al treilea situs situat pentru producerea deleiei dorite, atunci cnd apar recombinari. Transfecia clonelor celulare int de celule ES cu un vector care conine ADNc al recombinazei CRE produce celule ES cu trei configuraii genomice alternative n plus fa de clonele non-recombinate (Fig. 2.7). Pentru a limita numrul evenimentelor de recombinare i pentru a facilita selecia dorit de clone, o selecie negativ poate fi realizat prin adugarea ganciclovirului n celule ES. Aceast strategie necesit utilizarea unei casete marker de selecie care conine att gena Tk ct i gena Neo de rezisten pentru selecie. Adaosul de ganciclovir n culturile celulare de ES va permite creterea clonelor cu : i) exonul de interes flancat de dou situsuri LoxP, i anume exonul delimitat pentru knockout-ul condiionat i ii) clonele de celule ES cu un singur situs LoxP, gata de utilizare pentru stabilirea knockout-ului general. Astfel, folosind trei site-uri LoxP i caseta marker de selecie Neo/Tk introduse n genomul celulei ES se produc ambele tipuri de clone clasice pentru: knockout-ul general i knockout-ul condiionat. Selecia clonelor n care gena de rezistena a fost deletat i ADN-ul genomic, cu modificri adecvate, a fost lsat intact, poate fi realizat prin screening folosind tehnica Southern blot. Cnd injectarea
16

blastocitilor i transmiterea pe linie germinal a celulelor ES cu knockout condiionat este realizat i oareci cu exonul flancat au fost obinui, recombinaza CRE este exprimat n esutul sau tipul celular de interes (Fig. 2.8). Recombinaza nltur specific exonul fundamental din alela modificat i creeaz o excizie CRE knockout dependent. Pentru a realiza acest lucru, o linie CRE transgenic care exprim recombinaza sub un promotor celular sau esut specific este ncruciat cu oareci knockout condiionat cu exonul flancat. Numai n celulele unde recombinaza CRE este exprimat, are loc excizia exonului, rezultnd o deleie a genei esut specific. ntre timp, linii de oareci CRE transgenici sunt disponibili, fiecare exprimnd recombinaza cu specific diferit. Astfel, sistemul de recombinare LoxP/CRE este un instrument puternic pentru deleia condiionat i specific celular a genelor. Introducerea acestui sistem la oarecii transgenici faciliteaz studiile cu privire la pierderea funciei genelor ntr-un anumit tip de celule. Prin inseria situsurilor Lox pe calea recombinarii omoloage n gena de interes i expresia recombinazei CRE int pentru un anumit tip de celule folosind un promotor esut specific, va fi posibil introducerea deleiilor predeterminate n genomul mamiferelor. 2.3.1. Recombinaza CRE ligand activatoare n ultimii ani, au fost dezvoltate tehnologii, care permit noi abordri n scopul de a controla temporal i esut specific mutaia dorit pentru expresia genelor inductibile la oareci transgenici i care pot fi combinate cu mai multe gene int convenionale. De exemplu, o metod pentru genele int condiionate este bazat pe supraexpimarea recombinazei CRE care ar putea permite inactivarea genei int flancat, esut-specific, n orice moment din timpul dezvoltrii i la oarecele adult (Fig. 2.8., figura de jos). Fuziunea domeniului de legare la ligand (LBD) al receptorilor de estrogen cu recombinaza CRE genereaz o recombinaz himeric a crei activitate este dependent de prezena receptorilor de estrogen sau de tamoxifen modulator al receptorilor de estrogen [Metzger D, 2001]. Pentru a obine gene int condiionate la oareci, n cazul
17

n care estradiolul endogen este prezent, s-a indus fuziunea recombinazei CRE cu LBD mutant al receptorilor de estrogen uman. LBD mutant al receptorilor de estrogen nu este legat de estradiol, ntruct acesta se leag de ligandul sintetic pentru tamoxifen. S-au produs linii de oareci transgenici ce exprim recombinaza CRE fuzionat cu LBD mutant al receptorului de estrogen sub controlul unor promotori diferii esut specific (P) (Fig. 2.8, figura de jos).

Figura. 2.8. Figura de sus. Strategie de reproducere pentru obinerea unor oareci cu knockout celular specific. oarecii care prezint alele nule , i n plus sunt purttori ai alelei unde gena sau exonul care vor fi deletai sunt flancai de dou situsuri LoxP ( exoni flancai) sunt fenotipic oareci heterozigoi. Cnd sunt mperecheai cu oareci transgenici care exprim recombinaza CRE (C) sub un promotor esut specific aceti oareci devin homozigoi mutani nuli n ceea ce privete acest esut. Figura de jos. Strategie de reproducere pentru obinerea de oareci cu knockout celular specific sub control temporal. Transgena-recombinaza CRE fuzionez cu ADNc domeniului de legare al ligandului receptorului de estrogen. Activarea recombinazei CRE este dependent de prezena 18

tamoxifenului, care poate fi furnizat oarecilor n apa potabil. Adaosul de tamoxifen permite knockoutul genei sau exonului de interes oricnd n punctul dorit.

Un astfel de oarece transgenic poate fi mperecheat cu un oarece ce prezint un exon flancat n interiorul genei care ar trebui deletat. Puii lor exprim ambele modificri, exonul flancat i recombinaza CRE ligand dependent, i li se administreaz tamoxifen. Exonul flancat este ulterior eliminat din genomul acestor esuturi, n cazul n care proteina recombinazei CRE de fuziune este exprimat. Exprimarea celular specific a recombinazei CRE fuzionat la un receptor de estrogen LBD mutant, la oarecii transgenici, poate fi astfel utilizat pentru eficientizarea recombinrii CRE mediat de tamoxifen (tamoxifen dependent), la nivelul locilor ce conin situsuri LoxP pentru a genera mutaii somatice situs specifice ntr-o manier spaio-temporal controlat. 2.3.2 Expresia sistemului tetraciclin/ doxiciclin inductibil Capacitatea de a controla expresia genei, i n cele din urm, a genei, int, la oarecii transgenici prin simpla administrare de substane exogene ofer un nou nivel de de control asupra sistemului CRE / LoxP, pentru a induce mutaii genice la oareci. Sistemul ce rspunde la tetraciclin este compus dintr-o protein tetraciclin represoare (TetR), fuzionat la un domeniu activator de transcriere pentru virusul herpes, precum i o secven tetraciclin operator (tetO) legate de un mic promotor pentru controlul transcripiei unei gene ce intervine dup legarea TetR de tetO [Gossen M, 2002]. Vectorii de exprimare TetR i promotorul minimal tetO ce dirijeaz transcripia genei n celulele de mamifere sunt disponibile n comer. Sistemul tetraciclin-responsiv poate fi folosit mpreun cu tehnologia CRE/LoxP pentru a permite controlul temporal al genei int la oareci, prin plasarea expresiei genei CRE sub controlul unui promotor minimal tetO. Pentru mai mult specificitate, un promotor esut specific poate fi folosit pentru a regla expresia genei TetR. Mai mult dect att, exist variaii Tet-off i Tet-on pentru controlul expresiei genei tet responsive, care depind de legarea de tetraciclin a TetR.
19

n versiunea Tet-off a acestui sistem, proteina transactivatatoare TetR, tTA, se va lega la promotorul tetO minimal n prezena tetraciclinei pentru a represa expresia genei. Cnd administrarea de tetraciclin este oprit, tTA nu se mai leag de de promotorul tetO minimal i transcrierea este indus de mai multe mii de ori n esuturile oarecilor transgenici. Dup cum este ilustrat (Fig. 2.9), este necesar s se genereze dou linii de oareci care sunt homozigoi pentru gena tTA i heterozigoi pentru locii mutani ,,de tip sandwich", i homozigoi pentru transgena CRE i respectiv, heterozigoi pentru pentru locii mutani ,,de tip sandwich". Prin reproducerea celor dou linii de oareci, 25% dintre pui vor fi homozigoi pentru locusul mutant condiional i heterozigoi att pentru transgena tTA ct i CRE. Pentru a menine expresia genei CRE reprimat i pentru a preveni recombinarea LoxP-mediat de la nivelul locilor int n timpul embriogenezei puilor, doxiciclina poate fi administrat n apa potabil. La ndeprtarea doxiciclinei, expresia genei CRE este dezinhibat, i determin recombinarea LoxP mediat, perturbnd genele int. Ca dezavantaj al acestui sistem a fost raportat inconstana, adic pierderi ale expresiei genei CRE n starea represat. n versiunea Tet-On a acestui sistem, expresia genei CRE controlat de promotorul tetOminimal este mai degrab indus, dect represat, de administrarea doxiciclinelor (Fig. 2.9). Astfel, rezult o form mutant a TetR, rtTA, care n mod normal represeaz promotorul minimal tetO. Dup adugarea de doxiciclin, rtTA este eliberat din tetO permind exprimarea genei CRE. De asemenea, acestui sistem, ca revers celui descris mai nainte, i lipsete o reprimare mic a promtorului tetO minimal.

20

Fig. 2.9. intele genei Tet-off inducibile. Linie de oareci heterozigoi pentru un locus int mutant condiional cu situsurile LoxP flancnd gena de interes i linie de oareci homozigoi pentru transgena care exprim proteina tetraciclin represoare.De asemenea, linia de oareci este ncruciat cu alta care este heterozigot pentru transgena CRE responsiv la tetraciclin.ncruciarea acestor linii produce progenitori care sunt heterozigoi pentru ambele transgene, pentru a menine represia genei CRE i care vor transmite locusul mutant condiional i locusul de tip slbatic conform transmiterii mendeliene. Eliminarea doxicilinei are ca rezultat exprimarea genei CRE i crearea unui locus int mutant. Alela de tip slbatic a locusului int endogen nu este ilustrat.

21

2.4. oareci transgenici Avnd n vedere c oarecii knockout au o gen cu deleie, oarecii transgenici pot avea o nou gen adugat sau o extracopie a unei gene existente, n scopul de a investiga supraexpresia genei. Tehnicile transgenice ncep cu dezvoltarea construciei genei de fuziune n care ADNul transgenic este dirijat de un promotor specific [Rossant J, 1995]. ADN-ul transgenic construit este apoi microinjectat n pronucleii ovocitelor fecundate de oarece, care au fost recoltate dup tratamente hormonale, de la femele de oareci la care a fost stimulat ovulaia. (Fig. 2.10).

Figura. 2.10. Diagrama producerii oarecilor transgenici 22

Celula ou este suficient de mare pentru a fi vzut la microscop. Prin procese de recombinare aleatorii, gena de fuziune construit se integreaz n genom. n cazul n care transgena este integrat n genomul celulei nainte de prima divizie, embrionii se dezvolt cu gene strine coninute n fiecare celul somatic i germinal. Oule microinjectate sunt transferate n oviductele femelei oarece fals nsrcinate, genetic normal. oarecele care se dezvolt din fiecare ou microinjectat este fondator de linie mutant. Probabil transgena se integreaz n locaii cromozomiale diferite n genomul fiecarui oarece fondator, care genereaz linii mutante. Utiliznd promotori esut specifici, se ncearc definirea situsului de ncorporare. ADN-ul modificat se introduce ntr-o locaie cromozomial omoloag cu ADN-ul promotorului. Transgena se introduce numai ntr-un cromozom. Astfel, embrionul, se dezvolt ca heterozigot pentru transgen. Heterozigoii sunt apoi mperecheai unii cu alii pentru a genera homozigoi transgenici, heterozigoi, i de tip slbatic (wildtype), dup modelul transmiterii mendeliene. ADNul realizat conine adesea o gen reporter controlat, de aceleai promotor, astfel c prezena genei reporter n celule indic prezena celular a transgenei. Concentraiile de gen reporter, de transgen i produs genic se analizeaz cantitativ pentru a determina supraexprimarea genei n esutul de interes. Cartografierea anatomic a localizrii genei reporter, transgenei i produsului genei este realizat pentru a descrie distribuia anatomic a expresiei transgenei n perioada de dezvoltare a animalului. 2.5. Lezarea genelor int la Drosophila Completarea cartografierii secvenializrii genomului [Adams MD, i colab., 2000] ofer acces nelimitat la toate genele de Drosophila melanogaster. Cu toate acestea i aproape dup un secol de genetic pe Drosophila, exist mai multe gene pentru care mutaiile corespondente nu sunt nc disponibile. Mijloacele pentru a depi aceste impedimente au fost situsurile selectate de traspozonii mutageni i de interferen ARNmediat. n timp ce transpozonii mutageni implic screeningul PCR complex, ARNi
23

genereaz numai fenocopii specifice mutaiilor cu pierderea funciei i nu provoac ntotdeauna un fenotip cu adevrat nul. Ca urmare, s-au dezvoltat metode de gene int knockout. Genele int n Drosophila sunt realizate prin tehnici elegante, care profit de recombinarea omoloag endogen germinal la aceste insecte zburtoare [Rong YS, i colab., 2002]. Tehnica se aseamn cu cea de knockout int n celulele ES la oareci i poate viza o mutaie n orice locus din genomul Drosophilei. Aceast metod implic trei componente: i) o transgen, care exprim o recombinaz de oc termic situs specific inductibil, (recombinaza FLP din drojdia de bere), ii) o a doua transgen, care exprim o endonucleaz de oc termic inductibil situs specific (I-SceI), iii) un vector transgenic donator care poart situsurile de recunoatere pentru ambele enzime (dou situsuri FRT de 18 de perechi de baze i respectiv un situs I-SceI ), n plus fa de gena int de tip slbatic, i gena alb ca marker de selecie pozitiv (permite screeningul descendenilor pentru ochi albi). Primul pas este introducerea aleatorie, a endonucleazei I-SceI inductibil de oc termic situs specific i a recombinazei FLP folosind un element de sistem P. Elementul P- este un element genetic mobil ce codific o transponaz care permite elementului P- inserarea n ADN. Vectorul donator (Fig. 2.11) este, de asemenea, introdus n mod aleatoriu n genom prin transformarea mediat de elementul P. Pentru recombinare, musculiele purttoare a ambelor transgene att a I-SceI inductibil de oc termic ct i a FLP sunt ncruciate cu musculie care poart gene care urmeaz s fie flancate intit de situsurile de recunoatere FRT. Prin oc termic, recombinaza FLP situs specific i endonucleaza (ISceI) situs specific, excizeaz apoi, in vivo, o molecul de ADN extracromozomial purttoare de rupturi dublu catenare recombinatorii n cadrul genei de interes. Prezena acestei rupturi dublu catenare (DSB) stimuleaz recombinarea omoloag ntre donorul excizat i locusul int omolog cromozomial (Fig. 2.11). Cteva categorii de recombinare la nivelul locusului int incluznd substituiile alelice i inseria ADN-ului donor sunt observabile la gameii femelelor. n multe cazuri, produsul inseriei este o duplicaie n tandem parial a genei int, cu ambele copii cu defecte, deoarece fiecare
24

are un fragment lips a genei (figura 2.11). Avnd n vedere c evenimentele de recombinare apar germinal, progenitorii sunt obinui cu gena knockout int n afara fiecrei celule.

Figura 2.11. Gene int la Drosophila. Vectorul int transgenic conine gena int ntr-o form trunchiat cu un situs rar pentru endonucleaza I-SCE-I, mpreun cu gena alb, pentru a permite selecia ochilor albi la Drosophila. Construcia este flancat de dou situsuri FRT care sunt recunoscute de recombinaza FLP. Recombinaza FLP mediaz excizia, iar endonucleaza I-SceI mediaz tierea intelor ADN extracromozomiale din vectorii donori transgenici. ADN-ul int, este de ateptat s se recombine cu locusul genei endogene pentru a produce o duplicaie n tandem nefuncional.

25

2.6. Inactivarea genelor int la petele zebr Recent genomul petelui zebra cu dimensiuni de 2 pn la 4 cm a fost complet secvenializat. Genomul haploid are 1,7x109 bp, comparativ cu genomul uman care are 3 x109 bp. Cartografierea comparativ arat conservarea extins a blocurilor de gene conservate, spaial localizate pe cromozomi (syntenies) ntre genomul petelui zebr i mamifere. Date directe despre funcia majoritii celor 30 000 de gene din genomul petelui zebr sunt facilitate de dezvoltarea rapid a tehnologiei pe baz de morfoline, care poate fi aplicat la acest model de organism. Morfolinele (Fig. 2.12) sunt oligonucleotide antisens modificate, care sunt eficiente i specifice inhibitorilor translaionali cnd sunt injectate n oule fecundate ale petelui zebr [Heasman J., 2002]. Ele se leag i inactiveaz secvene de ARNm selectate. Oligonucleotidele sunt asamblate n patru subuniti, fiecare dintre ele coninnd una dintre cele patru baze azotate: adenina, citozina, guanina i timina legate n poziia 6 la inelul morfolinelor, ceea ce confer o nalt rezisten nucleazic.

Figura. 2.12 . Structura chimic a morfolino oligonucleotidelor . Segmentul morfolino nucleotidelor cuprinde 2 subuniti unite printr-o subunitate de linkage.

26

Morfolinele conin 21-25 de baze ntr-o ordine specific. Oligonucleotidele sunt concepute pentru a se lega la regiunea 5' netranslatat i includ aminoacidul de iniiere metionin specific ARNm. Ele acioneaz prin intermediul unui bloc steric al complexului de iniiere translaional, iar datorit secvenei specifice i afinitii mari, ele au randament fiabil i reproductibilitate fenotipic. Pentru inactivarea unei singure sau mai multor gene, morfolinele sunt injectate n glbenuul de ou aflat n etapa embrionar, de 1 la 4 celule. Embrionii se dezvolt n afara mamei i, prin urmare, nu sunt resorbii n cazul n care mor n timpul embriogenezei datorit morii cauzate de inactivarea genelor. Dup fertilizarea oulor, organismul cu toate organele sale se dezvolt n termen de 24 de ore (echivalentul a aproximativ 9 zile la oareci). Embrionii sunt, de asemenea, complet transpareni facilitnd observarea celulelor condamnate la moarte. Embrionii au fost analizai morfologic la 1-5 zile dup injectarea de morfoline, adic ntr-un stadiu de dezvoltare, cnd petele zebr deja noat liber. n contrast cu genele int de la oareci, care n mod normal necesit luni sau chiar ani pentru determinarea funciei genei, inactivarea genelor int pe baz de morfoline la petele zebr permite determinarea funciei genei la nivel de zile. Modelul animalul este, deosebit de potrivit pentru gene importante implicate n procese privind dezvoltarea vertebratelor, cum ar fi somitogeneza i organogeneza. 2.7 . Deleia tulpinilor int de Caenorhabditis elegans Genomul acestui nematod a fost, de asemenea secvenializat i const din ase cromozomi ce au n total 97 Mb de perechi de baze (mrime haploid) i cuprinde 19 099 de gene. Nematodul adult, este format din exact 959 de celule somatice, ce includ 302 neuroni i 95 de celule musculare. Generaiile C. elegans au nevoie de un timp foarte scurt pentru a se dezvolta de la stadiul de ou fecundat pn la stadiul de adult matur. Trei zile de la fecundarea oului, viermele poate produce singur descendeni. Strategia de gene knock-out presupune deseori utilizarea sporadic de trimetilpsoralen,
27

care este mutagen pentru un numr foarte mare de viermi [Jansen G, 1997]. Expunerea la mutageni are ca rezultat mutaii aleatoare n celulele embrionare. De exemplu, un spermatozoid ar putea fi un mutant pentru o gen specific. Fertilizarea ovului de acest spermatoizoid va avea ca rezultat indivizi heterozigoi. Pentru c este un vierme hermafrodit care realizeaz singur fertilizarea, se vor produce ovule i spermatozoizi, care poart aceast gen mutant; un sfert din urmtorii si descendeni vor fi homozigoi pentru alela mutant, rezultatul fiind un fenotip specific. Un astfel de animal poate fi investigat n termen de trei zile, dac fenotipul mutant este complet. Screeningul viermilor expui la un mutagen se face dup cum urmeaz: viermi sunt mprii n mai multe subculturi mici, permindu-le s aib descendeni. O poriune din fiecare subcultur este pstrat n via n congelator, i ADN genomic este luat de la restul de cultur. Prin urmare, acest ADN este sintetizat de fraii viermilor congelai i poart aceleai mutaii ca i viermii congelai. Cu o foarte mic frecven (aproximativ 1 din 200 000 genomuri mutagene) mutageneza va produce o deleie mic (100-1000 bp) la nivelul oricrei gene. Dac primerii PCR ce flancheaz zona genei de interes sunt folosii pentru a amplifica probe de ADN genomic, deleiile dintre primeri pot fi detectate, generndu-se ampliconi PCR de dimensiuni mai mici dect cei din ADN-ul genomic de tip slbatic amplificat. Astfel, ADN-ul, reprezentnd mai multe mii de genomuri cu mutaii poate fi supus screening-ului i ampliconii generai ce prezint deleii din aceste genomuri vor fi detectai. Dup ce un fragment de ADN care conine o anumit deleie este astfel evideniat, se pot identifica subculturile de viermi n care a avut loc deleia; viermii congelai din aceast subcultur pot fi decongelai, i animalele vii purttoare ale mutaiei, pot fi identificate. Indivizii mutanii care au fost detectai, pot fi recuperai i crescui n continuare pentru a studia funcia genei. La sritul anului 2002 aproximativ 10% din genele lui C. elegans au fost identificate prin mutaii . O treime din aceste gene au corespondent la mamifere, i nelegerea funciilor la C.elegans ne va ajuta s stabilim dac acestea funcioneaz la animale mai evoluate.
28