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TEXTO ILUSTRADO ODE Biologia Molecular e Ingenieria Genética (CTL Kee M Meu aK TOC UCKKI CHET) José Luque Angel Herraez eo. TEXTO ILUSTRADO DE Biologia Molecular e Ingenieria Genética Conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud José Luque Cabrera Catedrético de Universidad Angel Herréez Sanchez Profesor Titular de Universidad Departamento de Bioquimica y Biologfa Molecular Universidad de Alcala Alcala de Henares. Madrid ELSEVIER SCIENCE ‘Madrid - Barcelona - Amsterdam - Boston - Filadelfia Londres - Orlando - Sydney - Tokio - Toronto, Es una publicacién © MMI Elsevier Espafa, S.A. Velazquez, 24-5.° Deha 28001 - Madrid, Espaia An Elsevier Science Imprint Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.) Para que existan libros es necesario el trabajo de un importante colectivo (autores, traductores, dibujantes, correctores, impresores, editores...). EI principal beneficiario de este esfuerzo es el lector ‘que aprovecha su contenido. Quien fotocopia un libro, en las eircunstancias previstas por la ley, delinque y contribuye a la «no» existencia de nuevas ediciones. Ademés, a corto plazo. encarece cl precio de los ya existentes. Este libro esté legalmente protegido por los derechos de propiedad intelectual. Cualquier uso, fuera de los limites establecidos por la legiskacién vigente, sin el consentimiento del editor, es ilegal. Esto se aplica en particular a la reproduceiGn, fotocopia, traduccién. grabacidn o cualquier otro sistema de recuperacién de almacenaje de informacién. ISBN: 84-8174-505-7 Depésito legal: M-47839-2002 Impreso en Espatia por: Grifieas Marte, S.A. Prdlogo En la Presentacién de este libro, que tengo ol honor de prologar, los autores afirman que pretenden ceunir os con- ‘ceptos actuales de la Biologia Molecular y las modernas metodologias de la Ingenierfa Genética con vistas a su aplicacién a fa Patologia Molecular, humana’y animal, en sus diversos aspectos: etiologia, fisiopatologia, diagnéstico, pronéstico, terapéutica y prevencién de las enfermedades, y promocién de la salud. Y pretenden hacerlo desde una perspectiva pluridisciplinar e integradora dirigida, fundamentalmente, a los estudiantes que cursan las licenciaturas de Farmaci Medicina, Odontologia y Veterinaria, y las orientaciones biosanitarias de Biologia, Bloquimica y Quimica. Se trata, sin du- {da, de una empresa tan oportuna y ambiciosa, como comploja y dificil. Pero, a la vista del resultado alcanzado, puede afiimarse quo el éxito ha sido total. La elaboracion de un texto de las caractersticas mencionadas es oportuna y necesaria. En los titimos decenios, la Biologia ha experimentado un proceso de progresiva ‘molecularizacién’” que ha conducido a un nuevo paradigma biolé- gico que trata de entender lo que se ha denominado ‘la logique du vivant” (F. Jacob, 1970) o “the molecular logic ot the living state” (A. L. Lehninger, "Biochemisty’, 1970): las bases moleculares subyacentes a los procesos biolégicos. El reciente desciframiento del genoma de dlversos organismos, y muy especialmente del genoma humano, constituye una etapa fundamental que ha de hallar su continuidad en el no menos importante estudio de los proteomas. Siguiendo los pasos de la Biologia, la Medicina y la Veterinaria estan experimentando un proceso de “molecularizacién™ creciente que hha hecho emerger la que se ha llamado Patologia Molecular. Hoy en dia, el nivel molecular no es s6l0 un nivel de i vestigacién biomédica, sino también un nivel de actuacién diagnéstica, prondstica y terapéutica. Por ello, es imprescin- dible preparar adecuadamente a los futuros profesionales de la salud, ya que sélo si disponemos de protesionales ‘competentes podremos hacer frente con éxito a los rotas dol futuro, El ejercclo profesional de los aos venideros exigira ‘competencia para abordar a nivel molecular los problemas de la salud, Por ello, har falta profesionales que posean los Conceptos y los elementos de lenguaje molecular necesarios para comprender las bases moleculares de la salud y la en- ‘ermedad. Profesionales capaces de adquirr constantemente la informacién bioquimica necesaria para mantener su com- petencia, y capaces de aplicar dicha informacién a la solucién de los problemas que les concierman; profesionales con ‘capacidad de autoaprendizaje para poder susttur los conceptos caducos por los nuevos, haciendo uso de todas las posi- blidades que las modemas tecnologias de la informacién pondrén a su alcance. Para la formacién basica de tales pro- fesionales tienen gran valor los textos que resumen los nuevos elementos concepiuales de las diversas areas de la Biolo- gfa junto a las correspondientes téonicas y metodologias; ya que permiten que el estudiante adquiera una base sdlida ® partir de la cual podra ampliar los conocimientos acuciendo, luego, a las monografias especializadas, a las revisiones ©, incluso, a los articulos originales. Por todo allo, y por abarcar un campo hasta ahora insuficientemente cubierto, con- sideramos que la obra de José Luque y Angel Herréez responde a una necesidad urgente e importante. ‘Ahora bien, como hemos indicado, la empresa no era nada facil. Y no lo era por su cardcter de obra basica, dirigi- dda a estudiantes de varias licenciaturas y, por tanto, con formacién versa, y por su pretension de seguir un tratamiento pya eae) ans ps ones) “Tambor ass tic) fetomeratas (oniucdn) Copis de1 NA fom ol | Mis scones TRADUCCION [FRANSCRIPCION] ribonuclestidos (NTPs) ———=—__p [pp sermm sen Sep iam aa ae smomse patio comenlo trancenpiasas | SaiRs [FRADUCCION| Se iealva ce crore (coma erp por RNAS y ‘a min pe Fon RNA Ts rts om ence eet Sines Sie sesso Ca Zaina encima: epation sides neem Ica [un RSA componente da ribo 2 INTRODUCCION Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARIOTAS. Francis Crick intradujo el término “Dogma central de la genética molecular” para describir, incluso antes de Cconocerse su importancia real en los seres vivos, el flujo de la informacién genética y la ullizacién celular de dicha informacion. En conereto, la transmision de la Informacién contenida en la secuencia del DNA a las oéiulas y organismos descendientes mediante la replicacién, y su expresién en biomoléculas funcionales mediante los procesos de transcripcion y traduccién. Comprende, pues, el Conjunto de relaciones generales existentes entre el DNA, el RNA y las proteinas, Debe resaltarse que la representacién abreviada DNA > RNA — Proteina no indica la transformacién de una molécula en otra, tal como se indica normalmente en las rutas metabélicas, sino que cada elemento en la secuencia ‘porta la informacién necesaria para la sintesis del siguiente. En este sentido, es importante el concepto de plantilla 0 ‘molde molecular: aunque cada paso esta calalizado por una enzima, los sustratos (nuclestides, aminodcidos) no son ‘seleccionados por ella, sino que vienen especificados por la intervencién del molde, en conereto por su secuencia de nuclestides. El progreso en el conocimiento de los procesos de transmisién de la informacién genética obligé a la ampliacién de este esquema basico original para acomodar otros procesos que también ocurren, al menos en algunos organismos particulares, como es el caso de algunos virus: Siaess do una moléoula de FRNA como duplicado de un RNA eromosémco, Catalizade [por RNA replcasas Seda en ‘algunos virus, como el del ‘mastica del abaco, licack replicacion de! RNA ve ae replicacién plicac transmision de Ta { ) _tonsaioaon | (>) informacién genética (dogma central de la DNA RNA —Haduscion_ Proteina i ~__ Senet moleesley ) transcripcion inversa Formacin de DNA span dt RNA cromotiico, Calzada oa wanes inves. Por dh en los earevins 4.2 EL DNA COMO MATERIAL GENETICO: PASADO, PRESENTE Y FUTURO El conacimiento de la estructura de las Acidos nucleicos se inicia en el siglo XIX con el aislamiento en el nicleo celular de una nucleina formada por una parte dcida (hoy, DNA) y una parte basica (proteina), asi como con el estudio parcial de las propiedades de la nucleina y de su relacién con la herencia celular. Sin embargo, la estructura stlo se conocié a mediados del siglo XX, al mostrarse que el DNA era el componente cromosémico depositatio de la informacion genética. Cabe destacar en este sentido, como antecedentes clave, los experimentos de Oswald T. Avery, olin MacLeod y Maclyn McCarty, en 1944, y de Alfred D. Hershey y Martha Chase, en 1952, que constituyen un hito en el conocimiento del material genético a escala molecular. ‘Tras estas aportaciones iniciales, el verdadero inicio de la Biologia Molecular moderna lo constituyé la propuesta de estructura en doble hélice para el DNA, formulada, en 1953, por James D. Watson y Francis Crick. A partir de este ‘momento, casi todo el esfuerzo realizado se centra en el estudio del DNA genémico, desde el punto de vista estructural ¥ funcional, en procariotas y eucariotas, con una atencién especial a mamiferos en general y humanos en particular. Los ‘avances logrados, tanto tedricos como técnicos y aplicados, han sido enormes. A ello ha contribuido la aparicién de la Ingenieria genética, como principal area derivada de la biologia molecular. Queda pendiente para un futuro préximo la conclusion del Proyecto Genoma Humano (gendmica funcional), el andlisis de las funciones de cada gen (genémica funcional) y la diseccién de la estructura y funcién de las prote!nas (proteémica). Como expresién de estos nuevos ‘conocimientos, ha surgido una gran variedad de campos de actividad en las Ciencias de la Salud (Medicina, Farmacia y Veterinaria), tales como anticuerpos monoctonales, métodos inmunoquimicas, biochips para el diagndstico, clonacién ‘molecular y clonacién animal, farmacogenes, ingenieria de proteinas, proteinas recombinantes de interés diagnostico y terapéutico, sondas de hibridacién, terapia celular y terapia génica, transferencia de genes, vectores, virus, etc. Nuestto ‘objetivo no es descriir los aspectos concretos de estos campos, sino sélo poner de manifiesto las bases molecuiares ‘que les sirven de soporte, como punto de partida para un estudio detenido de cada campo en su correspondiente area ) . 01 4 10 100 1000 Peso ota del DNA (pg) Por otro lado, no existe correlacién alguna entre el tamario det genoma de distintas especies y el nimero de ‘cromosomas que fo componen. Por ejemplo, mientras que el genoma humano diploide (6,6 10" pb) esté repartido en 46 cromosomas (23 pares, n=23), las células de ratén, con un genoma menor (3 10° pb), poseen menor numero de ‘cromosomas (40); pot el contrario, en las células de cebolla un genoma 2 veces mayor que el humano (1,5 10" pb) ‘est contenido en solo 16 cromosomas. De forma similar, la mosca de la fruta, con un genoma (1,7 - 10° pb) mucho mayor que el de la levadura (1,6 - 10" pb), posee un niimero muy inferior de cromosomas (8 frente a 32). «4 304 ‘evi nematodes ae e (© Dicyostatum ‘Numero de cromosomas (2n) w4 ° Dreeophila 0 108 10 10° ‘Tamario del genoma (pb) Esta ausencia de correlacién entre cantidad de material genético y complejidad del organismo sugiere que el tamafio de los genomas de organismos superiores es muy superior al necesario y, por tanto, que una gran parte es 10 ccodificante, es decir, no esta organizado en genes, nunca traduce su informacién a un producto génico (RNA 0 proteina). Esta hipétesis ha sido confirmada al estudiar con detalle el genoma. Par ejemplo, se ha encontrado que los ‘genes tienen una longitud media de alrededor de 1.000 pb. Asumiendo esta cia, el genoma humano haploide podria ‘contener, en teoria, unos 3,3 millones de genos (pues cada aminodcido esta codificado por 3 nucleétides) y, sin OO —————————————————————————— 8 INTRODUCCION Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARIOTAS. embargo, se estima hoy en dia que sblo contiene unos 100.000, de modo que la proporcion codiicante s6lo alcanza alrededor det 3% de! DNA total. ‘Aungue la funcién de los genes esté bien establecida para una pequefia fraccién del total presente en el genoma humano, la Inexistencia de una correlacién entre cantidad total de DNA en el genoma y grado de complajidad del ‘organismo superior puso de manifiesto la necesidad de estudiar con mayor precision la organizacién estructural, a nivel ‘molecular, tanto del genoma (tema 10) como de los genes (tema 19). Los hechos més caracteristicas en relacion con la ‘complejidad del genoma nuclear son la presencia de grandes reglones que no codifican producto génico lguno (DNA ‘no codificanta) y la existencia de secuencias de DNA que se repiten un numero mas 0 menos elevado de veces (DNA repetitive). Como se estudiara con detenimiento posteriommente, hay que unir a ello la existencia de una enorme diversidad de secuencias (polimorfismo, tema 26) en distintas regiones del DNA, tanto sencilas como repetitivas, codificantes 0 no, 1.3.3 Magnitud y caracteristicas del genoma mitocondrial El genoma de organulos (mitocondrias en animales, mitocondrias y cloroplastos en plantas) es, posiblemente, un vestigo del cromosoma de bacterias arcalcas que accedieron al ctoplasma de eucariotas primitivos, para dar lugar tras la evolucion a dichos organulos. Se cree que la mitoconcria (organulo que aporta el 90% de la energia que necesian las células) surgié al acumularse el oxigeno en la atmésfera terrestre. Posiblemente, la mitocondria y el ndicleo de la célula eucerota se crearon a la vez, al Incorporarse por endoctosis células procarotas aerdbicas al interior do la cdlula ‘eucaritica anaerdbica y fusionarse ambas. Con el tiempo, la mayoria de los genes procaridticos. (genes protomitecondrales) se integraron en el genom nuclear, con lo que el eucariota primtivo anaerébico ya podia vir en una atmésfera aerdbica, rica en oxigeno; sdlo una pequefia fraccién de! genoma procaridtico primigenio permanecio en la mitocondra Las células animales poseen un niimero muy variable de mitocondrias, dependiendo del tejido. Cada mitocondria posee varias copias de un Unico cromosoma, situadss en la matriz mitocondrial y ancladas a la membrana interna. En ‘consecuencie, el nlmero de copias de DNA mitocondrial (mDNA) en una céluia oscla entre 200 y 100.000. El ‘eromosoma mitocondrial es bicatenari y circular, como el de procariolas, aunque de tamafo muy inferior: 16.569 pb en hhumanos, con una longitud de 5 yim y una masa molecular de 10 MDa; esto supone unas 3.000 veces menos que la tongitud del cromosoma nuclear més pequefio. Teniendo en cuenta el nimero de copias totale (2 del genoma nuclear y ‘mittiples, y muy variables, del mitocondrial), se puede calcular que el DNA mitocondrial total supone, dependiendo del telido, entre un 0,05 y un 20% del DNA toial de la celula, Finalmente, el cromosoma de cloroplastos es igualmenta Dicatenaro y circular, pro de mayor tamafo que el mitocondal. ‘diferencia del DNA nuclear, do gran compojitad, con rogiones codicantes y no codicantes, el {DNA os en su ‘asi tolaidad codiicante y no repeitv, En concreto, el cromosoma ritocondrial humano contiene un total de 37 genes: 2 para rRNA, 22 para tRNA y 13 para proteinas que forman parte de los complejos enziméticos respiratorios I, II, IV y V. Estas suponen solo el 5% de las proteinas mitoconériales, mientras que el resto estan codificades por DNA nuclear. me Tema 2 Componentes fundamentales de los acidos nucleicos 24 Componente acido: Fosfatos.. 241.1 Monofosfates... 242 Difosfatos... 24.3 Taifosfatos. . 2.14 Tipos de enlaces fostaio. 22 23 Bases nitrogenadas mas frecuentes: 2 tipos.. 2 232 _Otras bases de interés biolégico y ciinico. 1B 23.3 Propiedades fisicoqulmicas de las bases purinicas y Pirie. 4 23.3.1 Existencia de dipoles. 14 2.33.2 Hidrofobicidad 14 233.3. Disposicion coplanar de los enlaces de cada anillo. (EN y CH 6). 14 2.33.4 Tautomeria o isomeria dinémica 14 2.3.35 Caracter basico... 16 233.6 Absorcién de la luz en el ultravioleta 7 Los acidos nucieicos (DNA y RNA) estan constituides por la unién de numerosos nucleotides, de 4 tips. Como introduccién a su estudio, se consideran algunos aspectos de interés para cad uno de los componentes estructurales de dichas unidades, los nucleétidos: Fosfato(s) Nucledtido: +. Aziicar Nucleésido Base nitrogenada ms 2.1 COMPONENTE ACIDO: FOSFATOS 2.1.1 Monofosfatos El osfato inorganico (P), mezcla de las especies quimicas resultantes de la disociacién de la moléoula de acido fosfoico, aparece como anién a pH acido, como dianion a pH fisiolégico y como trianién a pH alcalino. En la célula, el fosfato se encuentra en forma libre (P,) 0 formando parte de numerosos compuestos organicos (R-P), por ejemplo, ios udedtides. 40 COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS ACIDOS NUCLEICOS “Tres eaulibrios de dsoincii en nein dt pH Acido fostérico: Gaon 2 oth or? wothon BE" oho ortofsfirice)! §— Ho—F—on "== oho == noSt—o" == “oro HPO, bu 1H & & —————osfato inorgénico (P;) ——— alcohol R-O! (> mezcla de las 3 formas iénicas del 4c. fosférico, on diferente proprcion segin el pH) Dos equlibvis de disociacién en fancién del pt: or R-o8P-07s= R081 a bu — fosfato orginico (R-P)—~ (Compuesto orgénico fosftado) 2.1.2 Difosfatos El difosfato © pirofosfato (PP)) se presenta a pH fsiolégico como trianién (una de las 4 formas iénicas del écido plrofostérico). Es estable en disolucion a pH neutro 0 alcalino; sin embargo, dentro de la célula es inestable por accion de las pirofosfatasas, formande 2 P;. Aparece combinado fundamentalmente en nucledsides-difosfato (por ejemplo, ADP), oto Castro equlibvios de dsoiacin en fms dl pl: (+ merc de as 4 formas ibnicas dt. pirofostric, ‘en diferente proporién seine pl) oo ° erie OO oud on 2) ~pirfosfato orginico (R-PP)— ‘(Compuesto orgnieo pirofosfatado) 2.41.3 Trifosfatos El trifosfato (PPP,) se presenta a pH fisiolégico como tetraanién. No aparece en forma libre, sino formando parte, ‘esencialmente, de nucledsidos-trifesfato (por ejemplo, ATP). acide trifostorieo oa Hto-f ou ——trifostato orginico (R-PPP) —— Tealees