Procedee microscopice de investigare celular prin folosirea anticorpilor

Dr. Ctlin Gabriel MANOLE

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Definiia noiunii de anticorp

ANTICRP s. m. protein specific elaborat de organism ca rspuns la ptrunderea unui antigen. (< fr. anticorps) (DEX)

N.B. Prin antigen nelegem orice protein strin de organismul care produce anticorpul.
O imunoglobulin, n forma literei Y, produs de limfocitele B, folosit de sistemul imun pentru identificarea i neutralizarea particulelor strine.

Epitop Paratop

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Definiia noiunii de anticorp

Interacioneaz specific cu o secven de aminoacizi (EPITOP) din structura unei proteine (ANTIGEN) Fiecare bra al anticorpului conine un paratop, care este specific pentru un singur epitop.

Epitop Paratop

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Structura general a anticorpilor

1. Regiunea Fab 2. Regiunea Fc 3. Lan greu 4. Lanurile uoare 5. Paratop 6. Regiune balama

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Metode de utilizare a anticorpilor n microscopie

Imunomarcare pentru microscopia optic
Imunohistochimia Imunofluorescena

Imunomarcare pentru microscopia electronic

Imuno-electrono-microscopia

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Metode de imunomarcare pentru microscopie

Metoda direct Metoda indirect

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Imunomarcarea
Reprezint totalitatea tehnicilor care folosesc anticorpi pentru localizarea antigenelor corespunztoare
pe seciuni tisulare
Crioseciuni Seciuni la parafin

pe celule n cultur

Face posibil vizualizarea distribuiei i localizrii componentelor celulare n microscopie optic

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Principiul metodei
Recunoaterea specific a unui antigen (Ag) de ctre un un anticorp (Ac) Ac sunt purificai din serul animalelor de laborator Ac vor fi cuplai cu un sistem de detecie ENZIM creia i se furnizeaz un SUBSTRAT care va fi transformat ntr-un compus colorat (IMUNOHISTOCHIMIE) Vizualizare n microscopie optic, cu lumin direct MOLECULE FLUORESCENTE (IMUNOFLUORESCEN) Vizualizare n microscopie de fluorescen

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Metoda direct - anticorp primar marcat -

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Metoda indirect anticorp primar nativ i anticorp secundar marcat

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

IMUNOHISTOCHIMIA

Imunohistochimia
Enzim Proxidaza de hrean
Horseradish peroxidase (HRP)

Substrat 3,3'-diaminobenzidin (DAB)

Culoare Brun-negru

Forfataza alcalin
Alkaline phosphatase (AP)

Combinaie de clorur de tetrazoliu (nitro blue tetrazolium chloride NBT) i 5-bromo-4-cloro3-indolil-fosfat (BCIP)

Negru violet

http://www.ihcworld.com/products/ihc-detection-system/Chromogen.htm

BCIP/NBT

DAB+ kit
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Ce structuri celulare pot fi marcate ?

Structuri membranare Organite celulare

Componente nucleare

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Ac pentru ribozomi

Ac pentru mitocondrii

ovar

colon
ficat

ficat

Ac pentru Ac pentru 2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti componente ale membranei plasmatice componente ale inveliului nuclear

Evaluarea proliferrii celulare

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Evaluarea apoptozei

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

IMUNOFLUORESCENA

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Fluorescena
O variant de luminiscen O molecul capabil de fluorescen (fluorofor, sau fluorocrom) excitat cu lumin de o anumit lungime de und, va emite o radiaie electomagne-tic cu o lungime de und superioar, n spectrul vizibil Parametrii:
Spectru de absorbie/excitaie Spectru de emisie

Intensitate
Durat
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Spectrul electromagnetic

Microtubuli ADN

Ribozomi ADN

Filamente de actin

ADN (cromozomi)

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Microtubuli (fus de diviziune)

Imuno-electrono microscopia

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Date generale
Metoda a fost introdus pentru prima oar n 1971 de ctre Faulk & Taylor Folosete anticorpi adsorbii pe particule de aur (5-30 nm) Dup caracteristicile anticorpului primar i structura celular creia se adreseaz marcarea se poate realiza:
pre-includere post-includere

Metoda mai scump i mai laborioas

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Scop
- Cea mai bun metod pentru detectarea i localizarea proteinelor n diferite compartimente celulare datorit puterilor de mrire i de rezoluie superioare

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Prolactin n granule de secreie

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Evidenieri pentru caveolin 1

IMUNOHISTOCHIMIE

n endoteliul aortic

http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2800001_jkms-25-16-g005&req=4

n celule endoteliale din ficat

IMUNOELECTRONOMICROSCOPIE
http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/BerndCV/Lab/EpithelialInfoWe b/Transcytosis.html

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968432811001417