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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 85-96

COMPOSITION CHIMIQUE ET ACTIVIT ANTIMICROBIENNE DE LHUILE ESSENTIELLE DE CLADANTHUS MIXTUS (*)

Badr SATRANI ( 1 ) , Mohamed GHANMI ( 1 ) , Abdellah FARAH ( 2 ) , Abderrahm an AAFI ( 1 ) , H assan FOUGRACH ( 3 ) , Brahim BOURKHISS ( 4 ) , Dalila BOUSTA ( 2 ) , Mohamed TALBI ( 3 )

Les parties ariennes de lAstrace Cladanthus mixtus rcolte en pleine floraison dans la fort de la Mamora au Maroc donnent 0,47 % dessence par hydrodistillation. Par CPG et CPG/SM, trente six composs ont t identifis reprsentant 91,9 % de lessence totale. Lalcool de santoline (37,7 %), l-pinne (4,8 % ), la camphnilone (4,8 % ), lalcool de yomogi (4,5 %), le germacrne (3,3 %), le 1,8-cinole (3,2 %) et le cubnol (3,2 %) sont les principaux constituants. Lhuile essentielle est active in vitro contre les bactries Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus et Micrococcus luteus et les champignons Penicillium parasiticus, Aspergillus niger et Trametes pini.

(*)

(1) (2) (3) (4)

Manuscrit reu le 20 fvrier 2007. Centre de Recherche forestire, BP 763, Agdal, 10050 Rabat, Maroc. badrsat@yahoo.fr, mghanmi@yahoo.fr, abderrahman_aafi@yahoo.fr Institut national des Plantes mdicinales et aromatiques, BP 7048, 30007 FsEzohour, Fs, Maroc. hybride_farah@yahoo.fr Laboratoire dcologie et dEnvironnement, Facult des Sciences Ben MSik, BP 7955, 20100 Casablanca, Maroc. bbourkhiss@yahoo.fr Laboratoire de Biotechnologie microbienne, Facult des Sciences, Universit Ibn Tofal, 14000 Knitra, BP 133, Maroc. bbourkhiss@yahoo.fr

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INTRODUCTION
Des tudes rcentes ont montr que les huiles essentielles et leurs constituants prsentent un potentiel important en tant quagents antimicrobiens et dans plusieurs domaines industriels et mdicaux [2,8]. La Camomille sauvage, Cladanthus mixtus, appele aussi commercialement Camomille du Maroc [1] est une Astrace champhyte bisannuelle nombreuses tiges dresses, termines par des capitules ligules blanches, ornes de jaune leur base. Cette espce est une sialophyte qui abonde dans les vides des bioclimats semi-aride et subhumide sur les sols sableux de l'tage thermomditerranen. Au Maroc, elle se rencontre dans deux zones disjointes, la premire entre Tanger, Ouezzane, Souk Larbaa, Moulay Bousselham et Azilah, et la seconde entre Knitra, Sidi Slimane, Khmisset et Rabat [1]. Cette espce est caractrise par une odeur frache balsamique. Elle donne une huile essentielle dodeur camphre recherche en cosmtique, parfumerie et mdecine [14]. La Camomille sauvage est conseille au Maroc comme anxiolytique et rquilibrante du systme nerveux central, dune grande valeur dans les dpressions nerveuses, et pour les insuffisances hpatiques et gastriques lgres et les colites colibacillaires [14]. Une premire description (aspect et analyse physico-chimique) de lhuile essentielle de Cladanthus mixtus du Maroc a t ralise par Trabaud et Sabetay [26 ]. Une autre contribution a permis didentifier lalcool de santoline comme lun des constituants majoritaires [24]. Dans ce travail, le rendement et la composition chimique de lhuile essentielle de Cladanthus mixtus ont t prciss et une ventuelle activit antibactrienne et antifongique a t recherche.

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MATRIEL ET MTHODES
Matriel vgtal Les chantillons de Cladanthus mixtus (L.) Oberpr. et Vogt (= Chamaemelum mixtum (L.) All. = Ormenis mixta (L.) Dumort. subsp. multicaulis (Braun-Blanq. et Maire) Maire) [7] proviennent de la fort de la Mamora situe au nord-ouest du Maroc. La rcolte des chantillons a t ralise en pleine floraison en juin 2005. Seules les parties ariennes (feuilles, fleurs, rameaux et tiges) ont t collectes en dbut de matine. Elles ont t conserves 72 heures lombre temprature ambiante (25C) avant lhydrodistillation. Hydrodistillation Lextraction de lhuile essentielle a t effectue par hydrodistillation dans un appareil de type Clevenger [5]. Trois distillations ont t ralises par bullition une heure trente de 200 g de matriel vgtal frais avec un litre deau dans un ballon de 2 litres surmont dune colonne de 60 cm de longueur relie un rfrigrant. Le rendement en huile essentielle a t dtermin par rapport la matire sche, value partir de trois chantillons de 30 g schs 48 heures ltuve 60 C. Lhuile essentielle a t stocke 4C lobscurit en prsence de sulfate de sodium anhydre. Elle est dilue dans du mthanol (1 %, v/v) avant de procder aux analyses CG et CG/SM. Analyse chromatographique Les analyses ont t effectues sur un chromatographe en phase gazeuse rgulation lectronique de pression Hewlett-Packard srie HP 6890, quip dune colonne capillaire HP-5 (5 % phnyl mthyl siloxane, 30 m x 0,25 mm, paisseur du film : 0,25 m), dun dtecteur FID (270C) aliment par un mlange H2 / air et dun injecteur split-splitless (275C). Le mode dinjection est split (rapport de fuite : 1/50, dbit : 66 ml/ min). Le gaz vecteur utilis est lazote avec un dbit de 1,7 ml/min. La temprature de la colonne est programme de 50 250C raison dune monte de 4C/min. Lappareil est pilot par un systme informatique HP ChemStation. Le volume inject est 1 l.

88 Lidentification des constituants a t ralise en se basant sur leurs indices de Kovts (IK) par couplage dun chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard srie HP 6890 avec un spectromtre de masse HP 5973. La fragmentation est effectue en impact lectronique sous un champ de 70 eV. On utilise une colonne capillaire de type HP-5 (5 % phnyl mthyl siloxane, 30 m x 0,25 mm, paisseur du film: 0,25 m). Le gaz vecteur est lhlium dont le dbit est fix 1,7 ml/min. La temprature de la colonne est programme de 50 250C raison de 4C/min. Lappareil est reli un systme informatique grant une bibliothque de spectres de masse NIST 98. Microorganismes tudis Quatre bactries (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus et Staphylococcus aureus) et trois champignons (Aspergillus niger, Penicillium parasiticus et Trametes pini) ont t choisis pour leurs frquences leves contaminer les denres alimentaires et pour leur pathognicit. Les souches bactriennes sont des lots de lATCC (American Type Culture Collection). Elles sont entretenues par repiquage sur glose nutritive favorable leur croissance pendant 24 heures lobscurit 37C. Les trois moisissures appartiennent la collection de la mycothque du laboratoire de mycologie du Centre de Recherche Forestire. Elles sont cultives sur le milieu nutritif PDA (Potato Dextrose Agar) pendant sept jours 25C lobscurit. Procdure microbiologique Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de lhuile essentielle ont t dtermines selon la mthode rapporte par Remmal et al. [19] et Satrani et al. [21]. Du fait de la non miscibilit de lhuile essentielle l'eau et donc aux milieux de culture, une mise en mulsion a t ralise grce une solution d'agar 0,2 % afin de favoriser le contact germe/compos. Des dilutions sont prpares au 1/10e, 1/25e, 1/50e, 1/100e, 1/200e, 1/500e et 1/1000e dans cette solution d'agar. Dans des tubes essais contenant chacun 13,5 ml de milieu solide TSA (Tryptic Soja Agar) pour les bactries et de PDA pour les moisissures, striliss lautoclave (20 minutes 121C) et refroidis 45C, on ajoute 1,5 ml de chacune des dilutions de faon obtenir les concentrations finales de 1/100, 1/250, 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/5000 et 1/10000 (v/v). Puis on agite

89 convenablement les tubes avant de les verser dans des botes de Petri. Des tmoins, contenant le milieu de culture plus la solution d'agar 0,2 % seule, sont galement prpars. L'ensemencement se fait par stries l'aide d'une anse de platine calibre afin de prlever le mme volume d'inoculum. Ce dernier se prsente sous forme de bouillon de culture de 24 heures pour les bactries et sous forme d'une suspension dans l'eau physiologique de spores provenant d'une culture de sept jours dans le PDA pour les moisissures. Lincubation se fait lobscurit 24 heures 37C pour les bactries et sept jours 25C pour les champignons. Chaque essai est rpt trois fois.

RSULTATS

Procdure microbiologique La distillation de Cladanthus mixtus fournit 0,47 0,02 % dhuile essentielle. Trente six constituants reprsentant environ 92 % de lessence ont t identifis (Tableau I). Il sagit de monoterpnes et de sesquiterpnes. Les monoterpnes prdominent (69,4 %) avec lalcool de santoline (37,7 %) comme constituant majoritaire. Suivent l-pinne et la camphnilone (4,8 %), lalcool de yomogi (4,5 %), le 1,8-cinole (3,2 %) et le thymol (2,12 %). On remarque que lessence de Cladanthus mixtus est domine par les alcools terpniques avec environ 57 % contre seulement environ 24 % des hydrocarbures terpniques. Les principaux sesquiterpnes sont le germacrne D (3,3 %), le cubnol (3,21 %), lactate de caryophyllne (2,4 %) et le (E)--farnesne (2,26 %). Activit antimicrobienne Lhuile essentielle a montr une forte activit contre tous les microorganismes tests (Tableau II). Chez les bactries, Escherichia coli et Staphylococcus aureus ont manifest une certaine rsistance jusqu 1/5000 (v/v). Les champignons ont t tous compltement inhibs 1/2000 (v/v).

90 Tableau I : Composition chimique de lhuile essentielle des parties ariennes de Cladanthus mixtus rcoltes au Maroc dans la fort de la Mamora. Constituants santolinatrine -pinne verbnne sabinne myrcne alcool de yomogi p-cymne limonne 1,8-cinole alcool de santoline -terpinne camphnilone myrcnol camphre pinocarvone bornol (Z)-pinocarvol thymol -cubbne (E)-caryophyllne -elmne (E)--farnesne -gurjunne germacrne D bicyclogermacrne -muurolne -cadinne (E)-nrolidol germacrne D-4-ol oxyde de caryophyllne 1,10-di-picubnol cubnol 14-hydroxy-9-pi-(E)-caryophyllne -bisabolol actate de caryophyllne actate de (Z)--santalol Total Formule C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H18O C10H14 C10H16 C10H18O C10H18O C10H16 C10H14O C10H16O C10H16O C10H16O C10H18O C10H16O C10H14O C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H26O C15H24O C15H24O C15H26O C15H26O C15H24O C15H26O C15H24O C17H26O2 Indices Pourcentage de Kovts 908 0,31 939 4,80 967 0,32 976 0,27 991 0,85 998 4,54 1026 0,80 1031 1,42 1033 3,24 1037 37,68 1062 1,41 1083 4,78 1118 1,81 1143 1,23 1162 1,42 1165 0,60 1183 1,80 1290 2,12 1390 0,35 1418 0,82 1433 1,41 1458 2,26 1473 0,60 1480 3,27 1494 0,36 1499 0,55 1513 0,62 1564 0,71 1574 1,53 1581 0,74 1614 1,12 1642 3,22 1664 0,65 1683 0,54 1700 2,44 1823 1,30 91,89

91 Tableau II : Activit antibactrienne et antifongique de lhuile essentielle de Cladanthus mixtus.

Concentration (v/v) Bactries Bacillus subtilis Escherichia coli Micrococcus luteus Staphylococcus aureus + + + + + + 1/ 100 1/ 250 1/ 500 1/ 1000 1/ 2000 1/ 5000 1/ Tmoin 10000

Champignons Aspergillus niger Penicillium parasiticus Trametes pini - : Inhibition, + : croissance + + + + + + + + +

DISCUSSION ET CONCLUSION
Le rendement en huile essentielle, qui dpend de nombreux facteurs (stade de croissance, conditions pdoclimatiques, technique dextraction, etc.) nest que de 0,47 %. Il peut tre nettement suprieur chez dautres Astraces Anthmides comme lArmoise [22]. Lhuile essentielle de Cladanthus mixtus est caractrise par lalcool de santoline (38 %). Ce compos est aussi prdominant (32 %) dans lhuile essentielle de Camomille sauvage du Maroc analyse par Toulemonde et Beauverd [24-25]. Lalcool de santoline se rencontre aussi dans les huiles essentielles dautres Anthmides comme Achillea cartilaginea (29 %) [20] et A. ligustica (11 %) [11]. Le profil trouv par Toulemonde et Beauverd [24] est cependant nettement diffrent, avec des composs relativement abondants non dtects dans cette tude : (E )-pinocarvol (3,0 %), bisabolne (2,5 %), alcool dArtemisia (2,3 %), actate de bornyl (2,2 %).

92 Toulemonde et Beauverd [24-25] ont signal la prsence dun plus fort pourcentage d-pinne (15,0 contre 4,8 %). Lalcool de yomogi est aussi observ dans les huiles essentielles dAnthemis carpatica [3 ] et Tanacetum santolinoides [10 ] avec respectivement des taux de 18,5 et 4,5 %. Lanalyse de lessence des feuilles dAnthemis melampodina a permis didentifier le santolinatrine comme compos majoritaire avec 27,3 % [12] contre seulement 0,3 % dans ce travail. Les huiles essentielles extraites des parties ariennes (tiges, feuilles et fleurs) de lAstrace marocaine Cladanthus arabicus Cass. prsentent une composition diffrente de celles de C. mixtus avec comme constituants majeurs le sabinne, l-pinne, le -pinne, le myrcne, l-phellandrne et le p-cymne [9]. Lactivit antimicrobienne de lhuile essentielle analyse peut tre attribue principalement son constituant majoritaire, lalcool de santoline (38 %). En effet, Filippi et al . [11 ] ont attribu lactivit de lhuile essentielle dAchillea ligustica lalcool de santoline, deuxime constituant en importance de lessence de cette Anthmide. Les alcools terpniques sont particulirement actifs contre les cellules microbiennes car solubles dans les milieux aqueux et ils provoquent dimportants dgts sur les parois cellulaires des microorganismes [4,8,13,15]. Les alcools possdent une activit microbicide plutt que microbiostatique [6,15-16]. Les bactries ont t donc plus vulnrables que les champignons lhuile essentielle. Ce rsultat est rapprocher du fait que les terpnols sont abondants par rapport aux hydrocarbures terpniques. En effet, il a t signal que les terpnols sont plus efficaces contre les bactries que contre les champignons [17]. Signalons par ailleurs que Tantaoui et Errifi [23] ont observ une synergie entre le chlorure de sodium (7,5 %) et lhuile essentielle de Cladanthus mixtus (0,4 %) pour linhibition de la croissance dAspergillus niger et entre le chlorure de sodium (5 %) et lessence de Camomille (0,1 %) dans le cas de Zygorrhynchus sp. Une synergie a t galement releve entre lhuile essentielle de Camomille (0,13 %) et les acides propionique (0,075 %), laurique (0,05 %) ou olique (0,15 %) pour linhibition de la croissance de Zygorrhynchus sp.

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RFRENCES
1Aafi (A.), Achhal (A.K.), Benabid (A.), Rouchdi (M.) - Richesse et diversit floristique de lcosystme de chne-lige de la fort de la Mamora. - Acta Bot. Malacitana, 2005, 30, 127-138. Baser (K.H.C.), Demirci (B.), Demirci (F.), Koak (S.), Akinci (.), Malyer (H.), Gleryz (G.) - Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Achillea multifida. - Planta Med., 2002, 68(10), 941-943. Bulatovic (V.M.), Menkovic (N.R.), Vajs, (V.E.), Milosavljevic (S.M.), Djokovic (D.D.) - Essential oil of Anthemis carpatica. - J. Ess. Oil Res., 1997, 9(4), 397-400. Carson (C.F.), Mee (B.J.), Riley (T.V.) - Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage and salt tolerance assays and electron microscopy. - Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46 , 1914-1920. Clevenger (J.F.) - Apparatus for the determination of volatile oil. - J. Am. Pharm. Assoc., 1928, 17(4), 346-351. Cox (S.D.), Mann (C.M.), Markham (J.L.) - Interactions between components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. - J. Appl. Microbiol., 2001, 91(3), 492-497. Dobignard (A.) - Index synonymique et bibliographique de la flore d'Afrique du Nord (en prparation). In Conservatoires botaniques de la ville de Genve, South African National Biodiversity Institute, Base de donnes des plantes fleurs dAfrique. 2006. http://www.villege.ch/cjb/bd/africa/index.php?langue=fr Dorman (H.J.D.), Deans (S.G.) - Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. - J. Appl. Microbiol., 2000, 88, 308-316.

2-

3-

4-

5-

6-

7-

8-

94 9El Hanbali (F.), Mellouki (F.), Akssira (M.), El Hassani (B.), Blazquez (M.A.), Boira, (H.) - Composition and antibacterial activity of essential oils of Cladanthus arabicus Cass. (Asteraceae). - J. Ess. Oil-Bearing Plants, 2005, 8(2), 213-217.

10 - El-Shazly (A.), Dorai (G.), Wink (M.) - Composition and antimicrobial activity of essential oil and hexane-ether extract of Tanacetum santolinoides (DC.) Feinbr. and Fertig. - Z. Naturforsch. C, J. Biosci., 2002, 57(7-8), 620-623. 11 - Filippi (J.J.), Lanfranchi (D.A.), Prado (S.), Baldovini (N.), Meierhenrich (U.J.) - Composition, enantiomeric distribution and antibacterial activity of the essential oil of Achillea ligustica All. from Corsica. - J. Agric. Food Chem., 2006, 54(17), 6308-6313. 12 - Grace (M.H.) - Chemical composition and biological activity of the volatiles of Anthemis melampodina and Pluchea dioscoridis . Phytother. Res., 2002, 16(S1), 183-185. 13 - Griffin (S.G.), Wyllie (S.G.), Markham (J.L.), Leach (D.N.) - The role of structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial activity. - Flavour Fragr. J., 1999, 14(5), 322-332. 14 - Haddad (P.S.), Depot (M.), Settaf (A.), Chabli (A.), Cherrah (Y.) Comparative study on the medicinal plants most recommended by traditional practitioners in Morocco and Canada. - J. Herbs, Spices Med. Plants, 2003, 10(3), 25-45. 15 - Hammer (K.A.), Carson (C.F.), Riley (T.V.) - Antifungal activity of the components of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. - J. Appl. Microbiol., 2003, 95(4), 853-860. 16 - Inouye (S.), Tsuruoka (T.), Uchida (K.), Yamaguchi (H.) - Effect of sealing and tween 80 on the antifungal susceptibility testing of essential oils. - Microbiol. Immunol., 2001, 45, 201-208. 17 - Knobloch (K.), Pauli (A.), Iberl (B.), Weigand (H.), Weis (N.) Antibacterial and. antifungal properties of essential oil components. J. Ess. Oil Res., 1989, 1(3), 119-128.

95 18 - Peyron (L.) - Aspect international du march des plantes aromatiques et mdicinales. - Actes Journe Rflexion Plantes Arom. Md., Casablanca, 16 Nov. 2000, 2000, p. 17-25. 19 - Remmal (A.), Bouchikhi (T.), Rhayour (K.), Ettayebi (M.), TantaouiElaraki (A.) - Improved method for determination of antimicrobial activity of essential oils in agar medium. - J. Ess. Oil Res., 1993, 5(2), 179-184. 20 - Sadyrbekov (D.T.), Suleimenov (E.M.), Tikhonova (E.V.), Atazhanova (G.A.), Tkachev (A.V.), Adekenov (S.M.) - Component composition of essential oils from four species of the genus Achillea growing in Kazakhstan. - Chem. Nat. Comp., 2006, 42(3), 243-245. 21 - Satrani (B.), Farah (A.), Fechtal (M.), Talbi (M.), Blaghen (M.), Chaouch (A.) - Composition chimique et activit antimicrobienne des huiles essentielles de Satureja calamintha et Satureja alpina du Maroc. - Ann. Fals. Exp. Chim., 2001, 94(956), 241-250. 22 - Sefidkon (F.), Jalili (A.), Mirhaji (T.) - Essential oil composition of three Artemisia spp. from Iran. - Flavour Fragr. J., 2001, 17(2), 150-152. 23 - Tantaoui-Elaraki, (A.), Errifi, (A.) - Antifungal activity of essential oils when associated with sodium chloride or fatty acids. - Grasas Aceites (Seville), 1994, 45(6), 363-369. 24 - Toulemonde (B.), Beauverd (D.) - Contribution l'tude d'une camomille sauvage du Maroc : l'huile essentielle d'Ormenis mixta. Parfums, Cosmet., Aromes, 1984, 60, 65-67. 25 - Toulemonde (B.), Beauverd (D.) - La camomille sauvage du Maroc : l'huile essentielle d'Ormenis mixta . - Bellakhdar (J.) (Ed.) Actes 1st Colloq. Int. Plant. Arom. Med. Maroc, 1984. Rabat, Morocco: Cent. Natl. Coord. Planif. Rech. Sci. Tech., 1985, 169-176. 26 - Trabaud (L.), Sabetay (S.) - Moroccan oil of camomile. - Perfum. Ess. Oil Rec., 1939, 30, 13-14.

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ABSTRACT
Chemical composition and antimicrobial activity of Cladanthus mixtus essential oil Aerial parts of the asteraceous species Cladanthus mixtus were water-distilled and gave 0.47% essential oil. Thirty-six representing 91.9% of the total oil compounds were identified by GC and GC/MS. Santolina alcohol (37.7%), -pinene (4.8%), camphenilone (4.8%), yomogi alcohol (4.5%), germacrene (3.3%), 1,8-cineol (3.2%) and cubenol (3.2%) were characterised as the main constituents. The oil showed strong in vitro activity against the bacteria Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus and the fungi Penicillium parasiticus, Aspergillus niger and Trametes pini.

Key-words: antibacterial activity, antifungal activity, Cladanthus mixtus, essential oil, santolina alcohol. __________