Sunteți pe pagina 1din 13

Ultrasound-assisted hydrolysis and gas chromatographymass spectrometric determination of phenolic compounds in cranberry products

Metoda de hidroliza cu ultrasunete-asistat i cromatografia de gaze-spectrometrie de mas (GC-MS) are a fost dezvoltat pentru determinarea de fenoli n produse de afine. nainte de separare GC-MS i caracterizare, de polifenoli n probele au fost hidrolizat de acid clorhidric cu ultrasunete de asisten, se extrage cu acetat de etil, iar derivatised cu N, O-bis (trimetilsilil) trifluoracetamid (BSTFA) + 1% trimetilclorosilan (TMCS) reactivi.Aplicarea ultrasonication semnificativ accelerat hidroliza acid a fenoli conjugate. O separare de baz de 20 de fenoli i a standardului intern a fost realizat n 25 min. Curbele de calibrare standard a fost linear la concentraia gama de 0.0 - 50 lg / ml i detectare limite erau 0.06-.70 lg / mL. Douzeci de fenoli s-au identificat n probe de afine i toate dintre ele au avut loc n principal n forme conjugate. Dintre acestea, benzoic Acid, quercetina i myricetin erau fenoli mai abundent. Totalul Fenolii au fost 12,4 mg / g, n fructe de afine, 9,1 mg / ml la 100% suc de afine, i 11,1 mg / g n sosuri de afine, respectiv. 1. Introducere Afine american este un proeminent cultur agroalimentare fabricate n Massachusetts, Wisconsin, Michigan, Canada, New Jersey, Oregon, i Washington.Recolta este de aproximativ 500 milioane de lire sterline anual, care este transformat n trei categorii de baz: fructe proaspete (5%), produse sos, concentrat de suc, i diverse aplicaii (35%), i sucuri (60%) (Zuo, Wang, si Zhang, 2002). Componentele fenolice sunt considerate a fi ingrediente principale responsabile pentru efectele benefice pentru sntate de afine. Astfel, este important s se identifice i quantitate fenoli n produse naturale de afine. O serie de metode de analiz au fost propuse pentru separarea i determinarea aceti compui. Cele mai multe dintre metodele raportate se bazeaz pe mare de performan de lichid cromatografie (HPLC) tehnici cu UV spectrofotometrie. Hkkinen colab. (1999) flavonoide determinate (quercetin i myricetin) i acizi fenolici (p-cumaric, cafeic, ferulic, p-hidroxibenzoic, acizii galic i elagic) simultan n fructe de afine prin metoda HPLC-UV. Chen, Zuo, i Deng (2001, 2007) a raportat pe o extracie n faz solid (SPE), urmat

prin separarea ulterioar a analiza HPLC compui fenolici i glicozide lor din fructe de afine. Aceste Autorii au constatat ca Acidul benzoic, quercetina i myricetin erau fenolic major compui i c compui fenolici exista predominant n forme conjugate, cum ar fi glicozide i esteri. Recent, masa spectrometria (MS) a devine o tehnica de detectare mai populare datorit puterii sale asupra identificrii UV-VIS spectrofotometrie i alte tehnici de detectare (Chen et al, 2001;. Ferguson, Kurowska, Freeman, Chambers, si Koropatnick, 2004; Wang, Du, & Francis, 1978; Zuo, Wang, Lin, Guo, i Deng, 2008).Tehnica GC permite separarea complet i cuantificarea multe compui i derivai ai acestora simultan n cadrul comparativ timp scurt. Grup Zuo a dezvoltat metoda GC-MS pentru determinarea simultan de compui fenolici n afine fructe i suc (Zuo colab., 2002), precum i metoda dezvoltat de asemenea, simplificat n mod eficient procesul de extracie i purificare i a fost aplicat cu succes pentru a separa, caracteriza i cuantifica poteniale componentele antioxidante fenolici din afine produse. Cu toate acestea, hidroliza compuilor fenolici conjugate a fost consumatoare de timp i necesit adesea mai mult de 16 ore n timpul procesului de pretratare a elibera fenoli conjugate. n ultimele decenii, radiatii cu ultrasunete, un tip de frecven joas (20 kHz-1 MHz) de energie, a fost intens studiat pentru mbuntirea aproape toate procesele de preparare a probei i de pretratare cum ar fi curarea, degazare, digestia, leiere, cristalizare, precipitaii, i de extracie (Bermejo, Capelo, Mota, Madrid, & Camara, 2004; Capote, 2006; Jiao & Zuo, 2009; Martinez-Ortega,

Garcia-Parrilla, si Troncoso, 2004; Zuo et al, 2008;. Zuo, Zhang, Wu, Fritz & Rego, 2004; Zuo, Zhang, Wu, Rego, i Fritz, 2008; _Ilker Mistik & Mge Ykseloglu, 2005). ncepnd cu Luna, Duchin, i Cooney (1979) a raportat primul care conduce aplicarea cu ultrasunete pentru o crete de hidroliz bifazic de benzoat de metil n alcalin mediu, capacitile de tehnica de ultrasunete pentru a accelera Procesele de hidroliz au strnit entuziasm n muli cercettori (Chen et al, 2008;. Liu, Quan, Fu, Li, i Yang, 2004;. Liu et al, 2008 Tuulmets i SALMAR, 2001). Cu toate acestea, a fost raportat nici un studiu privind efectul asupra ultrasonication hidroliza conjugate compui fenolici n produsele de afine. Obiectivele acestui studiu au fost: (i) pentru a investiga efectele ultrasonication privind procesul de hidroliz fenoli conjugate; (ii) de a oferi o metod eficient de hidroliz care va fi potrivit pentru eliberarea de compui fenolici conjugate din afine Produsele, (iii) o metod de a optimiza GC-MS pentru separare, caracterizare, i cuantificarea compuilor fenolici n produse de afine. 1.Parte experimatal Doi.1.Reactivi Fenolic i acizii benzoici, m-metilic al acidului benzoic (intern standard), benzoic, o-hidroxibenzoic, p-hidroxibenzoic, transcinnamic, m-hidroxibenzoic, p-hidroxibenzoic, p-hidroxifenilacetic, o-ftalic, 2,3-dihidroxibenzoic, vanillic, o-Hydroxycinnamic, 2,4-dihidroxibenzoic, p-cumaric, ferulic, cafeic, iar acizi sinapic, trans-resveratrol, (?)-epicatechina, catechine, quercetin, i myricetin au fost achiziionate de la Organics Acros (Springfield, NJ). Metanol, n-hexan, acetat de etil i s-au obinut

din Pharmcoproducts (Brookfield, NJ) i N, O-bis (trimetilsilil) ? trifluoracetamid (BSTFA) + 1% trimetilclorosilan (TMCS) reactiv a fost achiziionat de la Supelco (Supelco Park, PA). Toate produsele chimice au fost de calitate analitic i au fost folosite fr n continuare purificare. Doi.doi .Preparea standardelor de calibrare si a curbelor Douzeci de soluii standard de stoc fenolici au fost pregtite proaspt zilnic la concentraia de 1,00 mg / ml i acid m-metilbenzoic (standard intern) soluie stoc se prepar la 50,0 lg / ml n metanol anhidru. De lucru Soluiile standard care conin 20 standarde fenolici au fost preparate n triplicat, la concentraii de 0,00, 5,00, 10,0, 25,0, 50,0 i lg / ml prin combinarea i diluarea stoc soluiile standard individuale n metanol. ntr-o separat Analiza, 100 LI a fiecreia dintre soluiile standard de stoc i 20 lL de soluii stoc de standard intern se pipeteaz ntr-un ml 2 minivial i se usuc sub un curent de azot gazos nainte de derivare pas. Curbele de calibrare au fost construite de liniar regresie a raportului dintre suprafaa vrfurilor standardului individual intern Standardul (10,0 LG / ml), n funcie de concentraia. Doi. 3.extractia componentiol fenolici Toate probele produse de afine au fost achiziionate de la un local de supermarket inclusiv uscate de afine fructe (Ocean Spray Craisens; Middlebore, MA), 100% suc de afine (RW Knudsen-familie; Orrville, OH) i tot sos de afine boabe (Wegmans, Rochester, NY) i se pstreaz la 4? C pn la utilizare n acest studiu. 2.4. Extracia de fenoli libere din produsele de afine aizeci de grame (60,0 g) de afine fructe craisens a fost bine

sol n ap distilat-deionizat (200 ml) cu un electric mare vitez amestector i apoi se filtreaz printr-8 lm de Whatman filtru de hrtie. Un mililitru de Filtratul se aciduleaz prin adugare 0,05 M HCI pentru a menine pH-ul la 2 i extras cu 5 ml etil acetat de trei ori. Extractele de acetat de etil (15 ml), s-au centrifugat i decantat ntr-un pahar de 20 ml flacon urmat de trecerea prin MgSO4 anhidru ambalat ntr-o Pasteur pipeta pentru a ndeprta apa rezidual i apoi complet se usuc sub un curent de azot gazos. aizeci de grame de boabe ntregi sos de afine a fost plasat n 200 ml balon cotat i a adus pn la semn cu ap distilat, apoi agit energic timp de 30 s i se filtreaz printr-8 lm de hrtie de filtru Whatman. Un mililitru de afine sos filtrat sau 1,00 ml de 100% afine Soluia diluat suc se aciduleaz, se extrage, centrifugate, transferat, i se usuc aa cum este descris mai sus n pretratarea fructe de afine craisens probe. 2.4.1. Hidroliza ultrasunete-asistat i extracie de conjugat fenoli din fructe de afine O tehnica de ultrasunete-asistat a fost dezvoltat pentru hidroliza de compui fenolici conjugai nainte de extracie. Douzeci miligrame de acid ascorbic se dizolv n 9,00 ml distilat ap deionizat ntr-un tub de testare de 30 de sticl i 1,00 ml de preparat a fost adaugat in suc de afine filtrate de craisens de fructe de afine. De aceast soluie, 5 ml de 6 N HCl s-au adugat ncet, n 5 min n tub. Gaz pur azot a fost folosit pentru a ndeprta aerul din tub i apoi tubul a fost limitat ermetic. Probele de fructe afine erau pregtit separat, cu opt piese echivalente. O parte a fost utilizat

de s-au angajat hidroliz de nclzire convenional i altele pentru studii de hidroliz cu ultrasunete asistate. n hidroliza tradiional, Soluia de prob se nclzete i se pstreaz la temperatura de 35? C pe plac de nclzire timp de 16 h, cu un agitator magnetic sub atmosfer N2. n ultrasunetestudii de hidroliz asistate, apte soluiile de prob echivalente au fost plasate individual n baia cu ultrasunete (Semntura ultrasunete Curat Model de 75, 90 W, cu timer digital, de cldur i de control al puterii, VWR, South Plainfield, NJ, USA), la 35? C timp de 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 min. Temperatura a fost meninut prin nclzire i circulaie a apei. Toate soluiile de eantion dup hidroliz erau lsat s se rceasc i se extrage cu 5 ml acetat de etil de trei ori. Extractele de acetat de etil au fost deshidratate peste MgSO4 i se usuc sub un curent de azot gazos. 2.4.2. Extracia din totalul fenoli dup hidroliza cu ultrasunete-asistat n suc de afine i sos de probe Total boabe sos de afine sau de 100% probe de suc de afine, preparat folosind 1,00 ml de afine sos filtrat sau 1,00 ml de 100%, soluie de suc de afine, a fost hidrolizat sub ultrasunete iradierea timp de 90 min la temperatura de 35? C, i apoi se extrage cu acetat de etil solveni, i se usuc sub un curent de azot gazos. 2.5. Derivatizarea a standardelor i a probelor Reziduurile uscate de extracte de acetat de etil de toate produsele afine au fost dizolvate n 200 lL de metanol i transferat ntr-o 2 ml mini-flacon. 20 LI a m-metil benzoic etalon intern de acid Soluiile mam se pipeteaz ntr mini-flacon i se usuc cu o curent de azot. Pentru analiza din total fenoli i unele gratuite Fenolii cu concentraie ridicat, cum ar fi acidul benzonic, quercetin,

i myricetin, diluarea a fost fcut nainte de derivare. Calibrarea standarde i reziduurile eantion de afine au fost sililai de adugarea a 50 lL de piridin i 50 LI a reactivului derivare BSTFA + 1% TMCS cu nclzire la 70? C in sigilat 2 minivials ml pentru 4 h. Probele au fost analizate folosind silanizai GC-MS. Mare exces de BSTFA + 1% TMCS asigurat c derivare a fost complet. Sa avut grij s se asigure condiii anhidre n timpul procesul de pregtire i derivare din cauza de nalt sensibilitatea trimetilsilil (TMS) derivai fa de umiditate. 2.6. Gaz analiza spectrometrie de cromatografie-masa Analiza GC-MS a fost efectuat pe un Hewlett-Packard (HP) Modelul GC 5890 Series gaz cromatografie II echipat cu un HP 5971 serie masa detector selectiv i un HP 7673 GCautosampler. Probele au fost separai pe 30 m? 0.32 mm diametru interior, 0.25 LM film de DB-5 de siliciu coloan capilar (J & W Scientific, Folsom, CA, USA) pe GC-MS.Temperatura coloanei a fost iniial a avut loc la 80? C timp de 1 min, apoi programat pentru 220? C cu un debit de 10? C pe minut, 220-310? C cu un debit de 20? C pe min i cu un timp de ateptare final 6 min. Heliu a fost folosit ca purttor de gaz i de presiune coloana meninut la 13 psi.injector i temperatura detectorului s-au meninut la 280 i 305? C, respectiv, iar volumul de injecie a fost de 1 lL n modul nedivizat. Temperatura interfa a avut loc la 280? C. Spectrele de mas au fost scanate la m / z 50-650 la o rat de 1,5 scanri / uri. impact electronic energia de ionizare a fost de 70 eV. 2.7. Identificare i cuantificare Cele Fenolii din mostrele de afine au fost identificate de ctre potrivire timpii de retenie i a datelor spectrale de mas cu calibrare

standarde. Toate quantitations au fost efectuate prin metoda standardizarea intern folosind m-metilic al acidului benzoic, la o concentraie de 10,0 lg / ml.Cantitativ a acestor compui a fost bazat pe raportul dintre suprafaa vrfurilor compusului interesat pe zona de vrf a standardului intern. Toate standardele de calibrare i fructe de afine, suc, probe de sos au fost efectuate n trei exemplare.

3. Rezultate i discuii 3.1. Separarea cromatografic i identificarea fenolic Compui nainte de determinarea compusilor fenolici din afine produse, eficiena de separare i de detectare de fenoli utiliznd tehnica GC-MS-TIC a fost testat pe un amestec etalon a derivailor TMS de compui fenolici. Toate 20 fenolic i compui benzoic studiate n aceast lucrare conine polar hidroxil grup funcional, i au volatilitate relativ sczut i nu sunt corespunztor pentru analiza direct GC capilar. BSFTA + 1% TMCS a fost ales ca reactiv derivare a converti analiilor n volatile derivai trimetilsilil. Piridina, care este un solvent organic aprotic i o baz Lewis, s-au dovedit a fi n msur s faciliteze sililare de grupe hidroxil cu BSTFA + 1% TMCS din piridina poate activa grupele hidroxil i elimina acidul format n sililare reacie i apoi conduce derivare a gruprii hidroxil la exhaustivitatea (Zuo i Zhang, 2005). Instrumentul parametri cum ar fi programul de temperatura i debitul gazului purttor rata, au fost optimizate pentru a obine buna rezolutie dintre t oate cele 20 fenolic compui ntr-un timp scurt de eluie. Cromatograma GC-MS-TIC derivailor TMS de compui fenolici cu standard intern este ilustrat n fig. 1. O separare baz de 20 de compui fenolici i standard intern a fost realizat n 25 min folosind metoda descris. Identitatea 20 de componente au fost stabilite de timpi de retenie GC i de la nregistrate spectrele de mas. Timpii de retenie i masa caracteristic Ionii de derivai TMS de compui fenolici studiate au fost enumerate n tabelul 1. Ca un exemplu, spectrele de mas de sililat Acid trans-cinamic fost ilustrat n fig. 2.
3.2. Analiza cantitativ Evalurile cantitative ale compuilor fenolici erau n funcie de raportul dintre suprafaa vrfurilor la standardele interne. Amestecuri Standarde din cele 20 de compui fenolici n concentraii cuprinse ntre 0.0050.0 lg / ml au fost pregtite pentru curbele de calibrare. Aa cum este prezentat n Tabelul 1, toate curbele de calibrare a fost linear la concentraia

game testat cu coeficienii de corelare> 0,99. Detecie Limitele msurat ca trei ori zgomotul de fond erau 0.052 - 0.697 lg / ml pentru derivatele TMS de compui fenolici, i limitele de detecie a crescut cu creterea Greutatea molecular a compuilor fenolici din BSTFA + 1% TMCS eficiena derivatizarea variat cu cantitatea i localizarea grupelor funcionale hidroxil din compui fenolici (Zhang & Zuo, 2005).

3.3. Efectele ultrasunete, prin hidroliz, de fenolic conjugat Compui O mulime de studii au artat c compuii fenolici liberi sunt rareori prezente in plante derivate din alimente. Cele mai multe ori, ele apar ca esteri, glicozide si complexe legate (Chen & Zuo, 2007 Fenton, Leung, si Clandinin, 1980; Krygier, Sosulski, si Hogge, 1982; Maillard & Berset, 1995). Cele mai multe dintre procedeele descrise n literatura de specialitate pentru a analiza compusilor fenolici legat n produsele alimentare ia Avantajul de hidroliz acid pentru a elibera compui fenolici legat folosind o metod de Hertog modificat (Chen et al, 2001;. Hertog, Hollman, & Venema, 1992; Nardini & Ghiselli, 2004; Zuo et al, 2002).. n condiii normale, aproape nici glicozide fenolici ar putea fi hidrolizat n ap datorit puternice glicozidice i valori sczute ale pKa ale acizilor fenolici. n general, acizii puternici folosit pentru a se adaug pentru a atinge hidroliz unde apa nu are efect. Acizii sunt considerate un catalizator pentru a declana i de a accelera hidroliza reacie. Dei studiile noastre anterioare au artat c toate compui fenolici conjugai au fost hidrolizeaz n convenional Condiiile hidroliz acid, un timp ndelungat hidroliz din aproximativ 16 h a fost nc necesare pentru a finaliza hidroliz (Chen et al, 2001.; Zuo colab., 2002). Pentru a examina posibilele efecte accelerator de ultrasunete pe hidroliza compuilor fenolici conjugate,

studii comparative de hidroliza de afine probe de fructe au fost efectuate cu i fr ultrasunete-ajutor. Acidul ascorbic a fost adugat pentru a preveni oxidarea fenolic acizi. Dup hidroliz, acizii fenolici eliberate au fost extrase i analizate prin GC-MS. Eficiena (msurat prin media Concentraiile de compui fenolici hidrolizate) ale hidroliza cu ultrasunete asistate a fost comparat direct cu de hidroliz convenional (16 h la 35? C). Efectele ultrasonication timp pe eliberarea de compui fenolici legat n Probele de fructe de afine au fost prezentate n Fig. 3. Datele au indicat c ultrasonication de 90 min sau mai mult, a dus la rezultate similare obinut prin hidroliza convenional, iar degradarea fenoli nu a fost respectat. Nu este greu de neles c iradiere cu ultrasunete poate accelera pauza a conjuga obligaiuni n esteri fenolici, glicozide si complexe legate de la ridicat de energie eliberat prin prbuirea imploziv acustice bule de cavitaie n mediul de reacie, i un omogen Reacia sonochemical este de obicei localizat n regiunea de cavitaie, care este fie n interiorul cavitii sau n lichid coaj nconjurtoare bula de cavitaie (microreactor). Ca sonochemical acceleraia unei reacie omogen polar probabil apare n vecintatea bulelor colaps, accesoriu rata intrinsec de reacie n site este cel mai informativ pentru investigarea i de nelegere a efectelor sonicare (Mason & Lorimer, 1988). n plus, nclzirea folosind radiaii cu ultrasunete se bazeaz Fig. 4. cu privire la efectul direct al undelor ultrasonice pe molecule de dipol

rotaie i conducie ionic. Molecule polare absorbi cu ultrasunete radiaii puternic, deoarece acestea au un moment de dipol permanent (Tuulmets & Raik, 1999). 3.4. Determinarea compuilor liber i total fenolici din afine Produsele Separarea i cantitativ a compuilor fenolici n Produsele afine sunt dificil din cauza lor chimice similare structurile i complexitatea probelor de afine. Un pre-curare i procedeu de fracionare nainte de analiza cromatografic este de obicei necesare pentru identificarea sigur i cuantificarea. n acest de studiu, compui fenolici n suc de afine, sosuri, i fructe Probele s-au extras cu acetat de etil. Compui fenolici total (Gratuit + legat) n probele de afine au fost determinate dup hidroliza prin utilizarea a dezvoltat tehnica de ultrasunete-asistat. Fig. 4 ilustreaz cromatograma de separare GC a TMS derivai ai compuilor fenolici liber i total ntr-un merior eantion de fructe. Rezultatele cantitative ale fenolic liber i total Compuii sunt prezentate n tabelul 2. Toate cele 20 de compui fenolici cu excepia p-hidroxifenilacetic acidului au fost identificate n merior produse care apar ca form liber, care este n bun concordan cu Rezultatele noastre anterioare publicate (Chen et al, 2001;. Zhang & Zuo, 2004 Zuo et al, 2002).. Numrul total de compui fenolici, suma de liber i forme conjugate ale tuturor compuilor fenolici, au fost 12,4 mg / g n fructe de afine, 9,1 mg / ml la 100% suc de afine, i 11,1 mg / g n sosuri afine, respectiv. Toate rezultatele cantitative de ambii compui liber i total fenolici n produse de afine indic faptul c numai cantiti minore de compui fenolici apar

n stare liber n produsele de afine. Toi compuii fenolici sunt prezente predominant n forme conjugate, care poate fi eliberat prin hidroliz. Acidul benzoic, quercetina i myricetin au fost mult mai abundente dect ali compui fenolici, i o-Hydroxycinnamic, p-cumaric, cafeic, ferulic i acizi, i epicatechin au fost prezente n cantiti moderate n produsele de afine. Rezultatele prezentate aici indica faptul c coninutul att liber i acid benzoic legat n afine este mai mare dect cele anterior raportate (Chen et al, 2001;.. Zuo et al, 2002). Acest lucru poate fi datorit diferenelor de sursa de fructe, maturitate i lungimea de depozitare timp, precum i diferenele de procedurile utilizate pentru obinerea probe. Consumul de produse din fructe de afine poate reprezenta o cantitate semnificativ din totalul consumului alimentar de fenolic. 4. Concluzii Un hidroliza cu ultrasunete-asistata, extracie acetat de etil, BSTFA + 1% TMCS derivare, urmat de separarea GC-MS Si metoda de Caracterizare a Fost optimizat a scris Determinarea de compusi fenolici din Fructe de afine, suc, si mostrele sosuri. Rezultatele obinute version Interkultureller Austausch www.grenzenlos.or.at Studiu indica faptul ultrasunete oal acceleraie hidroliza de fenoli conjugat din afine Produse si o scurta Timpul de hidroliza de 16 h Necesar principiul tehnica de hidroliz convenional la mai putin de 1,5 h. .. Microarray Timpul Este REDUS considerabil. Douzeci de compusi fenolici, including benzoic, o-hidroxibenzoic, p-hidroxibenzoic, trans-cinamic, m-hidroxibenzoic, p-hidroxibenzoic, p-hidroxifenilacetic, o-ftalic, 2,3-dihidroxibenzoic, vanillic, ohydroxycinnamic, 2,4-dihidroxibenzoic, p-cumaric, ferulic, cafeic,

SI acizi sinapic, trans-resveratrol, (?)-epicatechina, catechina, quercetina, SI myricetin, au Fost identificate si Simultan cuantificate pe Baza timpilor de retenie GC SI Simultan nregistrate spectrele de masa. Metoda a raportat o sensibilitate ridicat, selectivitate si o Bun repetabilitate si poate fi folosit ca standard de ONU Metoda a scris controlul Calitatii produselor de afine.metoda poate fi aplicat si in Determinarea fenoli version Alte alimente derivate din Plante si in fluide Umane a scris biodisponibilitatea acestora SI Studii farmacocinetice.