STRUCTUR ACIZI NUCLEICI

Curs general

Moleculele vieii
Viata depinde de stocarea stabila i compacta a informaiei genetice ; Activitatile moleculelor celulare sunt guvernate de principiile de baza ale chimiei; Apa celular, ionii anorganici, i mici molecule organice reprezint aproximativ 75-80% din greutatea celulei vii; Macromoleculele (proteine, polizaharide, ADN) reprezinta restul.

Celule Procariote
Organisme unicelulare Dou tipuri pricipale: bacterii i archaea

Relaii structurale simple

Celule eucariote
Organisme unicelulare i multicelulare Plante i animale

Structural mult mai complexe: organite, citoschelet...

Structura celulei animale

Structura celulei vegetale

Complexitatea structural a organismului uman

Nucleul
Separ: ADN de citosol; transcriptia de translaie Caracteristici: - membrana extern; membrana intern; porii nucleari; nucleoli

La Eucariote ADN este mpachetat n cromozomi

Fiecare cromozom conine o singur molecul linear de ADN asociat cu proteinele. Intregul ADN compactat n cromozomii unui organism este localizat n genom. Secvenierea i alte tehnici au evideniat c peste 90% din genomul vertebratelor nu codific pentru ARNm sau alte tipuri de ARN. La organismele multicelulare acest ADN conine multe regiuni care sunt similare dar nu identice. Imagine de cromozomi n metafaz evideniai prin tehnica fluorescent de hibridizare in situ (FISH)

Acizii nucleici
Acizii nucleici sunt substane care au fost pentru prima dat izolate din nucleii celulelor. Exist acizi nucleici i n citoplasma celulelor. Dou tipuri de acizi nucleici: ADN (acid dezoxiribonucleic) localizat n principal n nucleul celulelor (cnd acesta este individualizat) ca n cazul eucariotelor); ARN (acizi ribonucleici), prezeni n principal n citoplasma celulelor dar i n nucleu. Acizii nucleici ADNi ARN au rol esenial n sinteza proteinelor, compui fundamentali ai celulei, suportul marii majoriti a activitilor biologice. ADN este suportul ereditii; ARN reprezint acidul nucleic care permite sinteza proteic

Structuri generale macromolecule

Toi acizii nucleici au o structur general comun

Principalele cinci baze din structura acizilor nucleici

A, G, T, C sunt prezente n ADN A, G, U, C sunt prezente n ARN

Structurile ceto-enol ale bazelor azotate

Forele de stivuire
Stivuirea inelelor de adenin din cristalul 9-metiladenin. Suprapunerea parial a inelelor reprezint o asociere tipic a bazelor n structuri cristaline i n dubla elice a acizilor nucleici

Terminologie nucleozide

Baze azotate
Nume
Baze Pirimidinice Citozin Uracil

Ribonucleozide
S/3L
Pyr Cyt Ura

Dezoxiribonucleozide
S/1L Nume
Y C U 2dezoxiribonucleozide pirimidinice 2.dezoxicitidina 2-dezoxiuridina

Nume
nuclozide Pirimidinice Citidin Uridin

S/3L
Pyd Cyd Urd

S/3L
dPyd dCyd dUrd

S/1L
dY/Yd dC/Cd dU/Ud

Timin
Baze Purinice Adenina Guanina

Thy
Pur Ade Gua

Ribozil-timin
nucleozide Purinice Adenozina Guanozina

Thd
Puo Ado Guo

T
R A G

(2-dezoxi)timina
2dezoxiribonucleozide purinice 2-dezoxiadenozina 2-dezoxiguanozina

dThd
dPuo dAdo dGuo

dT/Td
dR/Rd dA/Ad dG/Gd

Xantina
Hipoxantina

Xan
Hyp

Xantozina
Inozina

Xao
Ino

X
I

2-dezoxixantozina

dXao

dX/Xd

Conformaia nucleozidelor
conformaie envelope Conformaie C3-endo

conformaie twist

Conformaie C2-endo

Izomeri de rotaie n jurul legturii glicozidice

Orientrile sterice permise bazelor purinice i pirimidinice n raport cu ataarea lor la unitatea ribozic

Terminologie general nucleotide

Nume Nucleozid x- fosfat x- difosfat x- trifosfat Citidin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Uridin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat dtimin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Adenozin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Guanozin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Simboluri Nuc-5P Nuc-5PP Nuc-5PPP Cyd 5.P Cyd - 5PP Cyd - 5PPP Urd - 5P Urd - 5PP Urd - 5PPP dThd - 5P dThd - 5PP dThd - 5PPP Ado 5 P Ado - 5PP Ado - 5PPP Guo - 5P Guo - 5PP Guo - 5PPP NMP NDP NTP CMP CDP CTP UMP UDP UTP dTMP dTDP dTTP AMP ADP ATP GMP GDP GTP

Structura general nucleotide

Conformaia unei uniti nucleotidice este determinat de apte unghiuri de torsiune

Structura ATP

Complexul ATP-magneziu

Complexul ATP-magneziu

cAMP

UDP-glucoza

S-adenozilmetionina (SAM)

Reactii de transfer de grupari metil

Acetil-CoA

Acetil CoA

+ NAD(P)

NAD+ NADP+

FAD

Constituenii ADN i ARN

NMP majore Acid nucleic Pentoza Pyr U ARN D-riboza C G dA dG Pur A NMP minore Foarte diverse ARNt Derivai metilai ai A i C

ADN

2-deoxi D-riboza

dT dC

Structura general a acizilor nucleici

Formarea legturilor fosfodiester

ADN-dublu helix format din catene complementare

Informaia

genetic

este

purtat de molecule de ADN foarte lungi, i codificat n secvena linear de nucleotide A, T, C i G ;

Molecula de ADN, n form

de dubl elice, compus dintr-o pereche de catene complementare

formate din nucleotide care sunt

meninute mpreun prin legturi de hidrogen care se realizeaz ntre perechile de baze G-C i A-T ;

Tipuri de legturi de hidrogen (I)

mprechere de adenine n structura cristalului de 9metil-adenin

mperecheri Hoogsteen ntre A i T

mperechere ipotetic ntre C i T

mperecheri tip Watson-Crick

Alte tipuri de mperecheri

Tipuri de legturi de hidrogen (II)

Tipuri de legturi de hidrogen (III)

Tipuri de legturi de hidrogen (IV)

ADN - dublu helix format din catene antiparalele

Fiecare caten de ADN posed o polaritate chimic datorat legturii dintre glucide i gruprile fosfat, care alterneaz la nivelul scheletului. Cele dou catene ale unei molecule de ADN sunt antiparalele, adic posed

orientare invers;
Fiecare din cele dou catene pot servi ca matri pentru sinteza celeilalte catene. Astfel, aceeai informaie genetic este purtata de cele dou catene care formeaz dubla elice.

Dublul Helix caracteistici structurale

Structura ADN B
Imaginea se bazeaz pe studiile cu raze X realizate pe dodecamerul d(CGCGAATTCGCG)

Structura ADN B

Vedere pertenticular pe axa helixului. n schem legturile fosforice sunt marcate n albastru iar bazele n rou. Sint marcate n alb bazele, legturile fosfodiester i legturile de hidrogen dintre dou baze. Vedere de-a lungul axei helixului

Caracteristicile conformaiilor elicei ADN

Caracteristici
Sens de rsucire Numr pb/tur Pasul (nlinea pe ax)/pe plan de baze nclinare baze fa de ax/rotaia planului bazelor Diametru dPyd:pentoz legtura glicozidic dPuo: pentoz legtura glicozidic Fosa: mare mic

Conformaie B Conformaie A
drept 10,4 (10,0-10,7) 3,4nm 0,34 nm 10 360 2 nm conformaii
2E 3E

Conformaie Z
stng 12 (6 dinucleotide) 4,5 nm 0,37 nm 90 -600/dinucleotid 1,8 nm

drept 11 2,8 nm 0,26 nm 200 330 2,3 nm

2E

anti 2E anti Mare i profund ngust i profund

anti 3E anti ngust i profund Mare i profund

anti 2E syn ngust i profund

Structura ADN A

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN A

Vedere perpenticular pe axa helixului

Structura ADN Z

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN Z

Vedere perpenticular pe axa helixului

Trecerea ADN B n ADN Z

Trecerea ADN-B n ADN Z, reprezentat la nivelul unui fragment de 4 pb, implic rsucirea cu 1800 a fiecrei perechi de baze n raport cu lanul oz-fosfat

ADN sufer separri reversibile ale catenelor

Metode de determinare a mrimii acizilor nucleici

Metodele de determinare a dimensiunilor acestor macromolecule se bazeaz pe diferite caracteristici. Mrimea poate fi determinat prin mai multe metode: Microscopie electronic: datorit dimensiunilor lor acizii nucleici pot vizualizai prin aceast tehnic. Metoda se potrivete foarte bine moleculelor de ADN de mrime medie (cteva mii la 200 000 pb)

Electroforeza n gel:
Este o tehnic de separare a moleculelor n funcie de masa lor molecular. Condiiile de densitate de sarcin asemntoare sunt realizate n mod natural, de ctre scheletul oz-fosfat. De asemenea, dependena logaritmic, distan de migrare n funcie de mrime, este bine respectat. Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici de diferite dimensiuni sunt folosite geluri de agaroz cu poroziti variate (Figura 2.2). Pentru facilitarea estimrilor cantitative exist colecii de polimeri marcheri de mas molecular utilizai pentru etalonarea separrilor. De altfel, aceast metod de separare este omniprezent n manipulrile de biologie molecular. Electroforeza se poate realiza i n geluri de poliacrilamid pentru situaiile n care este necesar separarea moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor. Prin electroforeza n gel de poliacrilamid este posibil identificarea unor fragmente care difer numai printr-un singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte util n secvenializarea acizilor nucleici i n determinarea regiunilor de polimorfism normal sau patologic determinat de existena unor mutaii.

Mrimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat cu cea a unei proteine fibroase, colagenul, i celulele procariote i eucariote.
ADN/particule/ organisme Virusuri ADN SV40 fag X174 fag Procariote E. coli Eucariote Drosofila Om Colagen n de baze (kb) 5,2 5,4 48 4000 62 000 125 000 3x1000 amino acizi Mas (MDa) 3,2 3,6 32 2600 41000 80 000 0,33 Lungime (nm) 1,7x10-3 (1,7m) 1,8x10-3 (1,8 m) 17x10-3 (17 m) 1,36 21 41 0,3x10-3 (0,3 m) (nm) 2 2 2 2 2 2 1,5 1 2x4 2x23 numr de cromoz omi

Celule Bacteria E. coli Mamifere

2x10-3 (0,5x2 m) aprox 10x10-3 (10 m)

Moleculele ADN de mrime mare sunt analizate i prin:

a) metoda clasic de ultracentrifugare cu toate c forele de frecare existente ntre aceste molecule limiteaz cmpul aplicaiilor (molecule de pn la 1,5 x 106 pb); Prin aceast tehnic pot fi separate, n gradient de densitate de clorur de cesiu, urmtoarele: i) fragmente de ADN care au un coninut diferit n guanin i citozin; ii) ADN genomic bacterian; iii) ADN plasmidial; iv) ARN total, etc. Diferitele tipuri de ARN ribozomal de la eucariote i procariote poate fi separat foarte simplu prin ultracentrifugare n gradient de zaharoz

Separarea acizilor nucleici prin ultracentrifugare: a) Separare ADN prin ultracentrifugare n gradient de CsCl; b) separare ARN prin ultracentrifugare n gradient de zaharoz

Electroforez n cmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b) electroforegram obinut n urma separrii unor fragmente mari de ADN. Vizualizarea a fost realizat n urma colorrii cu bromur de etidium.

Polimerizarea nucleotidic

Structura unei molecule ARN: a) evidenierea nlnuirii nucleotidelor i vectorizarea catenei; b) reprezentrile prescurtat i simbolic.

Hidroliza acizilor nucleici

Degradarea unui polinucleotid poate s se refere la: i) legtura fosfodiester atunci cnd se produce o depolimerizare; ii) unitile nucleotidice dac se rupe legtura glicozidic i se degradeaz componentele. n ambele cazuri hidroliza poate fi de natur chimic sau enzimatic.

Hidroliza chimic a acizilor nucleici

Tratamentul acid afecteaz la fel ARN i ADN: Comportamentul ARN i ADN la hidroliz bazic este foarte diferit: Condiii ARN Acide pH 1,0 + nclzire pH 4,0 Alcaline Produi de hidroliz ADN pentoze + fosfai + baze baze purinice + AN apurinici NMP (2 sau 3) -

Produii de degradare chimic a acizilor nucleici

Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazic: 1. Hidroxilul din 2 este deprotonat de ctre ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atac gruparea fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2: 3; 3. Un al doilea hidroxid provoac hidroliza uneia sau alteia dintre legturile ester: se obin izomeri 2 i 3 fosfat.

Scindarea enzimatic
Enzimele care catalizeaz hidroliza legturii fosfodiester din structura acizilor nucleici, fosfodiesterazele, sunt numite i nucleaze. Acestea sunt prezente n toate celulele i sunt foarte utile n metabolismul acizilor nucleici i proteinelor. O parte dintre a ceste nucleaze sunt secretate de ctre pancreasul exocrin, n intestin, i particip direct la digestie hranei. Aceste enzime prezint niveluri de specificitate comparabile cu cele ale peptidazelor i proteazelor. Ele se pot clasifica n funcie de: a) modul lor de atac al catenei: i) exonucleaze, enzimele care acioneaz la nivelul extremitii catenelor; ii) endonucleaze, enzimele care atac n interiorul catenelor; b) specificitatea lor fa de substrat: i) pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN i nucleaze pentru ambele; ii) pentru tipul de structur: mono- sau dublu catenar; c) specificitatea lor de recunoatere a situsurilor: i) specificitate pentru baze; ii) specificitate pentru secvene; d) tipul de rupere a legturii fosfodiester: i) exonucleazele i endonucleazele de tip d scindeaz extremitatea 5 i duc la formarea de 3NMP; ii) exonucleazele i endonucleazele de tip p scindeaz extremitatea 3 i determin formarea 5NMP (Figura 2.8);

Scindarea enzimatic

Nucleaze Exonucleaze fosfodiesteraza (venin de arpe) fosfodiesteraza (splin) exonucleaza I (E. coli) exonucleaza III (E. coli) Endonucleaze endonucleaza S1 (Aspergillus oryzae) ribonucleaz T1 (Aspergillus oryzae) ribonucleaza A (pancreas) Deoxiribonucleaza II (timus)

Substrate1

Tietur tip2; specificitate p extremitatea 3 d extremitatea 5 p extremitatea 3 p extremitatea 3 p aleatoare p G/N d-Pyr/N d sPyr/dPur

Produi

ARN, ADN s ARN, ADN s AND AND

5-NMP 3-NMP 5-NMP 5NMP+ADNs

ARN,ADN s,d ARN s ARN s ADN s

5-NMP +ON n 5 P 5-NMP +ON n 3 P 3-NMP +ON n 3 P ON n 3 P

Exemple de enzime de restricie i situsurile recunoscute de acestea

Exemple de enzime de restricie i palindroamele recunoscute de acestea cu marcarea situsurilor de clivare i a axei de simetrie: a) obinerea de capete coezive; b) obinerea de capete drepte

Endonucleaza (sursa)

EcoRI (E. coli RY13) BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) HaeIII (Haemophilus aegypticus)

Numr de situsuri de tiere Virus SV40 fag X174 1 0 1 0 19 11

fag 5 5 >50

Metode spectrofotometrice
Determinarea absorbiei n ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru permite verificarea puritii unei soluii de ADN sau ARN. n urma determinrii densitii optice se va obine un pic la 260 nm. Pentru estimarea puritii este necesar calcularea raportului densitilor optice la 260 nm/280 nm care, n mod normal, trebuie s fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. n cazul ADN, un raport mai ridicat indic o contaminare cu ARN. Dac exist o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270 nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dac ADN i ARN sunt puri, cantitatea poate fi apreciat astfel:

unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenar unitatea DO (260 nm) = 33 ng/l pentru ADN monocatenar unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ARN

Utilizarea de mini-gelulri

Determinarea secvenei primare a acizilor nucleici Metoda chimic Maxam W. Gilbert

Metoda dideoxi a lui F. Sanger

Sinteza n faz solid a catenelor unui polinucleotid prin metoda fosforamidiilor

Denaturarea ADN

Msurarea absorbiei moleculelor denaturate

Determinarea Tm

Analiza denaturrii ADN

Renaturarea ADN

Estimarea absorbanei n funcie de structur i temperatur

Absorbana relativ a ADN monocatenar i bicatenar

Estimarea denaturarii termice

Electroforeza i autoradiografia ADN

Ultracentrifugarea

Ecuaiile Svedberg

Ultracentrifugarea ADN n gradient de CsCl

Ultracentrifugarea ARN n gradient de sucroz

Enzime de restricie

Super-helixurile ADN

Linking number

Writhing number

Forme suprarsucite

Structuri topoizomere

Topoizomeri i topoizomeraze

Separarea topoizomerilor ADN SV40 DNA evideniaz existena mai multor topoizomeri cu un numr diferit de suprarsuciri

Rolul topoizomerazelor n replicarea ADN Moleculele de ADN se pot ndoi i ncolci n spaiu conducnd la modificri de topologie cum ar fi formarea supra-rsucirilor Topoizomerazele sunt enzime care controleaz topologia ADN i realizeaz etape eseniale n diferite etape ale replicrii avnd drept rezultat nlturarea constrngerilor.

Topoizomeraze

Topoizomeraza de tip I relaxeaz ADN prin inducerea de tieturi la nivelul unei singure catene a duplexului ADN

Topoizomeraza de tip II modific topologia ADN prin scindarea si resudarea ambelor catene

Mecanism topoizomeraze

Modelul activitii catalitice a topoizomerazei II (ADN giraza) din E. coli

ADN giraza nltur super-rsuricirile pozitive care apar n mod normal la nivelul furcii de replicare

Separarea moleculelor de de ADN circular replicate este realizat de topoizomeraza de tip II

Topoizomeraza de tip II separ cromatidele lineare surori

Discuii
De ce T n ADN i U n ARN

De ce deoxiriboz n ADN i riboz n ARN

De ce 2 helixuri (catene ) n ADN i una n ARN

ADN de la diferite organisme: Virusurile Procariotele Eucariotele ADN din mitocondrii (ADNmt)

Tipuri de legturi de hidrogen care sunt specifice structurii secundare a ARN

Tipuri de baze modificate prezente n structura acizilor nucleici

Structura ARN de transport: a) Motivele elementare de structur 2-D; b) Structura teriar n form de L.

Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a) la archebacterii; b) eucariote, drojdii; c) mitocondrie de mamifer (bovine)

Structura ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide bazat pe compararea secvenelor de la diferite tulpini (se presupune ca aceasta structura este conservata evolutiv)

Sinteza moleculelor de ARNm: a) transcripia ARNm policistronic la procariote; b) transcripia i maturarea ARNm la eucariote; ARN transcris de la nivelul unei uniti complexe (albastru) poate fi procesat pe mai multe ci pentru a conduce la unul sau la mai multe uniti ARNm monocistronice funcionale. Liniile punctate marchez nlturarea intronilor.

Moleculele de ADN ARN posed conformaii diferite

Inversiunile repetitive formeaz structuri foldback

Schema unei molecule de ARNt ncrcat: a) schema general a structurii secundare a moleculei; b) modul de formare a legturii ntre ARNt i aminoacil

Recunoasterea codon anticodon

Tipuri de molecule de ARNt. Sunt marcate elementele de identitate majore n cele patru tipuri. Fiecare baz din structura ARNt este reprezentat de cercuri pline. Cercurile roii indic poziiile identice pentru recunoaterea ARNt de ctre aminoacil-ARNt sintetaz. Bazele din structura anticodonului care reprezint elemente de identificare sunt subliniate.

Diferitele tipuri de ARN

Moleculele de ARN mesager Moleculele de ARN de transfer: structura secundar sub form de frunz de trefl; structura teriar 3-D n L a moleculelor ARNt Moleculele de ARN ribozomal; particulele ribozomale Ribozimele Moleculele snARN

Comparaie ARNm la procariote i eucariote

Procariote: operonii bacterieni ARNm este policistronic; Eucariote: ARNm este monocistronic i conine exoni i introni.

Exemple de structuri adoptate de ARNr

Structura ribozomilor la procariote & eucariote

Structura general a ARNt

Exemple de molecule ARNsn

Structura cap de ciocan a unei ribozime

ADN mitocondrial i din cloroplaste

Se consider c mitocondriile au evoluat din bacterii care prezint o relaie simbiotic cu celulele ancestrale care conin un nucleu eucariot. Majoritatea genelor originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear n timpul evoluiei, pstrnd diferite gene n organitele diferitelor organisme; ADNmt de la mamifere conine numai aprox 16 kb; acesta nu conine introni i prezint numai o mic regiune necodant. ADNmt de la plante i drojdii este mult mai mare. Toate tipurile de ADNmt codific pentru ARNr, ARNt i pentru cteva proteine implicate n transportul mitocondrial al electronilor i n sinteza ATP; Majoritatea ADNmt este motenit mai degrab din ou (ovul) dect din sperm, mutaiile n ADNmt fiind motenite pe linie matern; Ribozomii mitocondriali se aseamn cu ribozomii bacterieni ca structur, sensibilitate la cloramfenicol i rezisten la cicloheximid; Codul genetic pentru ADNmt de la animale i fungi difer de cel bacterian i de cel al genomului nuclear prin aceea c numeroi codoni codific pentru aminoacizi sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par s foloseasc codul standard nuclear i bacterian; Mutaiile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil datorit necesitii crescute de ATP a acestor esuturi. n general pacienii prezint un amestec de mitocondrii care conin ADNmt normal i mutant n celule (heteroplasmie). Severitatea fenotipic este mai mare cu ct proporia de ADNmt este mai mare; ADN din cloroplaste este circular i conine aproximativ 120-160 kb, n funcie de speciile de plante. Acestea codific pentru aproximativ 120 de proteine i folosesc codul genetic standard.

ADN mitocondrial uman