ULBS FACULTATEA DE TIINE AGRICOLE INDUSTRIA ALIMENTAR I PROTECIA MEDIULUI Program Master ACSA An studiu: I

Tema miniproiect la disciplina Met bioch de control...

Titlu

Titular disciplina Prof.Univ. Dr. N. Darie

Student masterand Toader Alina -Elena

SIBIU, 2013

DETERMINAREA ACTIVITII -GLUCANAZEI SECRETATE DE BOTRYTIS CINEREA Autor:Toader Alina-Elena

Abstract: Botrytis cinerea is a mold responsible for fruit rot, especially grapes, and the case in which they will be subjected to winemaking filtration or clarification processes will be influenced in a negative way. This phenomenon is explained by the fact that during the development of the grapes, Botrytis cinerea produces a glucan (-1, 3 glucan), witch once arrived into wine formed stable colloidal systems, resulting in increased viscosity and consequently clogging filters. Because in the grape must respectively in the wine no polysaccharide specific enzymas(-glucanase) to split macromolecules in fracmente smaller soluble is recommended and permitted the addition of enzyme preparations witch beta-gucanazis activity. Rezumat: Botrytis cinerea este un mucegai responsabil pentru putregaiul fructelor,n special al strugurilor,iar n eventualitate n care acetia vor fi supui vinificaiei, procesele de limpezire respectiv filtrare vor fi influenate ntr-un mod negativ.Aceast fenomen se explic prin faptul c n timpul dezvoltrii pe struguri , Botrytis cinerea produce un glucan (-1,3 glucan),care o dat ajuns n vin formeaz sisteme coloidale stabile, ducnd la creterea vscozitii i implicit colmatarea filtrelor.ntruct n mustul de struguri i respectiv n vin nu exist enzime specifice acestui polizaharid (-glucanaza) care s scindeze macromoleculele n fracmente mai mici,solubile se recomand i se permite adugarea unor preparate enzimatice cu activitate betagucanazic.

1. CONSIDERAII GENERALE

1.1 Date despre sursa analizat :Vinul obinut din struguri afectai de Botrytis cinerea: Limpiditatea este o caracteristic esenial a vinurilor.Lipsa acesteia constituie att un inconvenient comercial, dar i o predispoziie accentuat la boli i defecte. Limpiditatea vinurilor obinute din strugurii ce au fost atacai de Botrytis cinerea este ameninat, prin formarea de ctre glucanul secretat a unor sisteme coloidale greu de ndeprtat.[Ovidiu Tia,2002] Acest glucan poate ajunge n vin n concentraii de sute de mg/l, n timp ce numai cteva mg/l sunt suficiente pentru a provoca mari probleme la limpezirea natural a vinului sau la filtrare. Efectul de colmatare a filtrelor este agravat i de prezena etanolului, care favorizeaz formarea de legturi de hidrogen ntre lanurile de polimer, obinndu-se astfel o structur tridimensional reticulat.n aceste condiii, pentru a reduce puterea colmatant se pot aplica tratamente cu

ultrasunete sau agitarea puternic a vinului, pentru a rupe legturile dintre lanuri.[Oenologie.ro ,2013]

1.2 Date despre analit i sursa lui de provenien Analit: D-glucoza eliberat de ctre enzima -glucanaz Sursa de provenien: polizaharidul secretat de Botrys cinerea n timpul dezvoltrii pe struguri,mucegaiul Botrytis cinerea formeaz un glucan (-1,3 glucan) care posed la fiecare a treia unitate de glucoz un rest de -1,6-glicozid. (C.rdea, 2007)

Fig.1.1.1 Beta glucan.(Wikipedia,2013)

Descriere -1,3 glucan: -glucanii pot fi definii ca fiind plozaharide, ce au n componena sa doar molecule de glucoz unite prin legturi -glicozidice (poduri eterice de oxigen care leag unitile monozaharid ntr-un polizaharid) [Wikipedia,2013].Aceste macromolecule, care au o structur liniar, sunt polare i formeaz soluii coloidale n ap, ngreunnd procesul de vinificaie.[Viorel Stoian i Delia Maria Stnescu,2006] Deoarece n must nu exist o enzim capabil s scindeze polizaharidul secretat de Botrytis cinerea a fost izolat -1,3-glucanaza, dintr-un microorganism antagonist lui Botrytis i anume Trichoderma Tratamentul cu aceast enzim a vinului ce provine din strugurii avariai, este permis n UE,i se recomand a se efectua la finele fermentaiei alcoolice, iar dup hidrolizarea glucanului se trateaz vinul cu bentonit pentru a se ndeprta enzima [Oenologie. ro,2013]

Fig. 1.1.2 Glucanul secretat de Botrytis cinerea [International Oenologic Codex Beta Glucanases Activity,2010

Descriere glucoz (analitul int): Glucoza este un monoglucid,o hexoz (conine 6 atomi de carbon), avnd formula general: C6H12O, fiind molecula principal ce st la baza structurii -glucanului secretat de Botrytis cinerea., elibert prin aciunea -glucanazei asupra polizaharidului.[Wikipedia.org,2013] Prezena glucozei n proba de analizat n urma tratrii acesteia cu preparatele ezimatice menionate indic activitatea beta-glucanazic,ceea ce denot faptul c vinul a fost obinut din recolte avariate. Fig 1.1.4 Molocula de gucoz 1.2Metoda de analiz propus n microproiect Metoda aleas pentru identificarea activitii -glucanazei este Metoda Bertrand,n corelaie cu Metoda specrofotometric, pentru o interpretare ct mai corect a rezultatelor

2. CONSIDERAII I INVESTIGAII PRACTICE

2.1 Principiul metodei const n cuantificarea glucozei eliberate de ctre -glucanaz plecnd de la o soluie standardizat de glucan. Se utilizez o soluie standard de glucan, produs de ctre Botrytis cinerea, asupra creia acioneaz enzima -glucanaz (botritisgluconaz), elibernd glucoza, care n soluie bazic,i prin fierbere reduce acidul 3,5-dinitrosalicilic n acid 3-amino-5-nitrosalicilic,gruparea aldehidic din glucoza reducnd gruparea nitro din acidul 3,5-dinitrosalicilic (DNS), rezult un compus colorat rosu (acidul 3-amino-5-nitrosalicilic), care se spectrofotometreazaPentru a mri sensibilitatea reaciei de culoare se adaug fenol, iar pentru stabilizarea culorii se utilizeaz sulfitul acid de sodium. Concentraia de glucoz din prob se determin prin comparaie cu soluii etalon de glucoz [C.rdea,2007,Scritube.ro,2013] 2.1.1 Reacia global

2.1.2 Aplicabilitate Metoda Bertrand are numeroase aplicaii n industria alimentar dintre menionm: industria vinului, industria crnii(identificarea amidonului din produsele din carne),industria laptelui, industria zahrului(dozarea glucidelor din melas,aprecierea calitii zahrului, dozarea cantitii de zahar etc).Pentru o interpretare cat mai precis a rezultatelor se apeleaz la metoda specrofotometric., o metod optic de determinare a concentraiilor constituenilor existeni intro prob dat. (Medeea Teodora Grosu,2013) 2.1.3 Enun 2.2 Tehnica de lucru(.(C.rdea,2007) 2.2.1 Aparatura necesar Spectrofotometru pentru msurtori la 515 nm, echipat cu cuve cu traiectul optic de 1 cm; Cronometru; Baie de ap electric; Baie cu ultrasunete; pH-metru; Agitator magnetic standard; Agitator magmetic submersibil, reglat la 300 rot./min; Micropipete; Baloane cotate, flacoane conice,vase cilindrice; Eprubete i suport;

2.2.2 Reactivi Substrat (soluie standard de glucan, cu un coninut n glucan bine determinat); Soluie 1M hidroxid de sodiu; Soluie tampon de acid citric 0.2 mol/L, ph=4; Reactivul de culoare (acidul dinitrosalicilic cu fenol); Soluia de glucoz, concentraie 0.3%; Soluia mam de glucam de lucru, concentraie 0.1% pH =4; Soluia standard de enzim -glucanaz(se dizolv 0.5 g de preparat enzimatic standard cu 25 ml solie tampon de acid citric 0.1 mol/L,pH=4 ntr-un balon cotat de 100 ml,i se aduce la semn cu ap distilat) Soluie standard pentru alte preparate enzimatice. Proba alb cu reactivul de culoare(proba martor) ntr-un balon cotat de 50 de ml se adaug 7 ml reactiv de culoare cu fenol,i 3 ml ap distilat,i se nclzete pe baia de ap n fierbere, fix 10 minute.Dup rcire ntr-o baie cu ghea, timp de 5 minute, balonul este transferat pe o baie de ap la temperatura de 20C, i se adaug ap distilat, fr ns a se ajunge la semn.Dup circa 10 minute la 20C, balonul se aduce la semn cu ap distilat.

ntocmirea curbei de etalonare a glucozei Se dizolv 2g de glucoz cu ap distilat,ntr-un balon cotat de 200 ml.Din aceast soluie se vor face urmtoarele diluii: Tabelul 2.2.2.1 ntocmirea curbei de etalonare a glucozei Cantitatea de Nr.diluiei V soluie Coninutul n glucoz(g) din curent/100 ml glucoz/100 ml prob (0,5 ml) 1 2 ml 20 mg 100 g 2 5 ml 50 mg 250 g 3 10 ml 100 mg 500 g 4 15 ml 150 mg 750 g 5 20 ml 200 mg 1000 g 6 30 ml 300 mg 1500 g 7 40 ml 400 mg 2000 g Fig.2.2.2.Soluii de glucoza obinute pentu calibrare[Science in School] Modul de lucru: n baloane cotate de 50 ml si introduce 0,5 ml din fiecare diluie, la care se adaug 7 ml reactive de culoare cu fenol i 2.5 ml ap distilat.Baloanele sunt supuse nclzirii pe o baie de ap n fierbere timp de de 10 minute.Ulterior sunt trecute pe o baie cu ghea unde sunt lsate pentru nc 5 minute i de aici se transfer pe o alt baie de ap la 20C.Se adug ap distilat, fr a se ajunge la semn.Se lasa timp de 10 minute pe baia de ap, dup care baloanele cotate sunt aduse la semn cu ap distilat. Dup 15 minute se vor msura absorbanele soluiilor, la lungimea de und de 515 nm, fat de proba martor. Prin raportatrea absorbanelor la cantitile de glucoz, se obine curba de etalonare,asa cum se poate observa n figura de mai jos:

Proba alb cu enzime n baloane cotate de 50 ml se pipeteaz cte 0.5 ml din soluiile standard de enzime,la care se adaug 7 ml reactiv de culoare cu felol.Se agit cu atenie i se adug 2.5 ml soluie de substrat ( glucan n soluie 0.1%).Dup agitarea manual, probele sunt supuse nclzirii pe o baie de ap n fierbere,timp de exact 10 minute.Ulterior sunt rcite pe o baie de ap cu ghea timp de 5 minute, de unde sunt trecute pe o alt baie de ap cu temperatura de 20C.Baloanele vor fi completate cu ap distilat fr a se ajunge la semn. Dupa 10 minute la aceast temperatur, baloanele vor fi aduse la semn. Se va msura absorbana soluiilor la 515 nm, fa de proba martor( reactivul de culoare) Msurarea activitii preparatelor enzimatice Pentru fiecare prob de analizat, se adaug 10 ml substrat(glucan soluie 0.1%), se adaug ntr-un pahar Erlenmayer i se nclzete pe baia de ap la 40 C,timp de 5 minute.Probele vor fi agitate cu ajutorul unui agitator magnetic submersibil, reglat la 300 rot./min.Dup 5 minute se va aduga la primul eantion 2 ml soluie de enzime i se pornete cronometrul. Se va aduga n continuare cte 2 ml soluie de enzime, la toate celelalte eantioanele, cu un decalaj de 30 secunde pentru fiecare prob.Probele vor fi agitate cu ajutorul agitatorului submersibil, reglat la 300 ro./ min.Dup exact 15 minute se va preleva 3 ml din fiecare prob,i se vor trece n baloane cotate de 50 ml ,peste care se va adauga cte 7 ml reactive de culoare cu fenol.n continare baloanele cotate sunt supuse nclzirii pe o baie de ap n fierbere, timp de exact 10 minute, rspectndu-se decalajul de 30 secunde ntre probe. Probele vor fi rcite pe o baie de ap cu ghea, dup care vor fi transferate pe o alt baie de ap cu temperatura de 20 C, se adug ap distilat, iar dup 10 minute de meninere la aceast temperatura,baloanele vor fi aduse la semn cu ap distilat.n urmtoarele 15 minute se vor msura absorbanele la lungimea de und de 515 nm, fa de proba martor. Diferen absorbanei ntre proba martor i absorbana datorat activitii enzimatice, trebuie s fie cuprins ntre 0,1 i 0.6 uniti.Dac valorile sunt mai mari (depesc curba de etalonare), se repet analiza cu diluiile enzimatice corespunztoare. Calculul rezultatelor Activitatea enzimatic a preparatelor enzimatice se calculeaz astfel: Activitatea -glucanazei,U/g sau ml= (G x 200)/(15xE)x1/Gf n care: G= cantitatea de zaharuri reductoare(glucoz)libere din proba de analizat.Calculele se fac pe baza curbei de etalonare a glucozei,n g; E= cantitatea de enzim diluat la 100 ml,n grame sau ml; 200=factorul de diluie; 15=timpii de reacie;

Gf=factorul de glucan (n mod real =1,7)

2.3 Discuii -Exactitatea, precizia metodei analitice n discuii

-Interferene: Vinul afectat este tratat cu aceste preparate enzimatice la sfrsitul fermentaiei alcoolice, presupunndu-se c n mediu de reacie nu exist alte glucide reductoare, acestea fiind metabolizate integral de ctre drojdii.Cu toate acestea exist posibilitate remanenei unei anumite cantiti de zaharuri reziduale ce pot influena negative analiza. Un alt inconvenient pe carea metoda l prezint este acela ca n timpul analize, o parte din zaharurile reductoare poate fi pierdut.[ Gail Lorenz Miller,1959] -Domeniul de valori normale (prelucrarea prealabil a probei)

-Recomandri analist: tipul de analiz care se poate face 2.4 Prerea personal a analistului asupra metodei alese Este o metoda laboriosa,care necesit un timp ndelungat de lucru,nsa este o metod de mare precizie care se utilizeaz chiar i n caz de litigiu Metoda de analiz descris poate oferi o alternativ util la metodele existente pentru determinarea zaharurilor reductoare, caracterizndu-se printr-o sensibilitate ridicat spre deosebire de metodele clasice bazate pe reducerea cuprului.[Gordon E.Anthon and Diane M. Barrett,2002]

III. CONCLUZII

IV.BIBLIOGRAFIE Prof.univ.Constantin rdea.Chimia i analiza vinului ,Ed.Ionescu de la Brad, Iai, 2007, pag.:251-255 International Oenologic Codex Beta Glucanases Activity . Deternination of BetaGlucanases ( 1-3, 1-6 ) Activity in Enzyme Preparation (Oeno 340/2010) , 2010 www.oiv.int/oiv/files/6%20.../6%20.../E-COEI-1-ACTGLU.pdf Wikipedia The Free Encyclopedia,Beta-Glucan,1.01.2013, http://en.wikipedia.org/wiki/ Beta-glucan Prof.Univ.Dr.Viorel Stoian i Ing.Delia Maria Stnescu.Tez de doctorat:Studiul tratamentului enzimatic asupra caracteristicilor i calitii vinurilor roii,2006, http://www.biblioteca-usamvb.ro/fisiere/file/teze-doctorat/1862.pdf Oenologie.ro,Compoziia chimic a vinului,06.01.2013, http://www.disciplina. oenologie. go.ro/site/disciplina_oenologie_go_ro/tematica_anul_5.htm Medeea Teodora Grosu,Specrofotometrie,10.01.2013, http://ro.scribd.com/doc/ 94781 723/SPECTROFOTOMETRIE-REFERAT Prof.univ dr.ing Ovidiu Tia Tehnologii de obinere a vinurilor Editura Universitii Lucian Blaga, Sibiu2002 Scritube.ro, http://www.scritube.com/stiinta/chimie/Parte-experimentala15412777.php Nataa Gros,Tim Harrison,Ireana Strumbelj Drusany i Alma Kapun Dolinar,Revista SCIENCE in SCHOOL.Spectrometria la scoal:experimente practice applicative.
http://www.scienceinschool.org, http://www.scienceinschool.org/print/1253

Gordon E.Anthon and Diane M.Barrett. Determination of Reducing witch 3-Methyl-2benzothiazolinonehydrazone,2002 http://www.sdasinfo.org.cn/zjk/%E5%A4%96%E6%96%87% E5%AD%A6%E7%A7%91%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%BA%93/2008sd001.pdf Gail Lorenz Miller. Use of Dinitrosalycylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Publicat n Analitical Chemistry martie 1959,34(3), pag 426-428 http://pubs.acs. org/doi/pdf/10.1021/ac60147a030