Capitolul 3 : Principiile preparrii produselor sanguine labile

1. Produsele sanguine labile - avantajele utilizrii lor In trecut, terapeutica transfuzional se baza, n mare parte, pe utilizarea sngelui total. Chiar dac se continu s se recurg la sngele total n anumite cazuri limitate, tendina n terapeutica transfuzional modern este de a utiliza produsul sanguin labil specific ,care este indicat clinic. Prin produse sanguine labile se neleg constituenii terapeutici ai sngelui, pe care i putem obine prin centrifugare, filtrare si congelare, punnd n aplicare metodologia clasic a bncilor de snge. Transfuziile sanguine au drept scop esenial: conservarea capacitii de transport a oxigenului si bioxidului de carbon; remedierea tulburrilor de sngerare si coagulare; corectarea deficitului imunologic;

meninerea volumului sanguin cu plasm sau cu derivaii si. Este evident, c un singur produs, sngele total, nu este cel mai potrivit s rspund acestor cerine, dect dac pacientul sufer de carene multiple; dar, chiar si n acest caz, pierderea progresiv a calitilor sngelui n timpul depozitrii face sngele total impropriu, pentru a remedia aceste carene. Trebuie s i se administreze pacientului compuii care i lipsesc. excluznd ali compui, lucru care va duce la evitarea unui aport inutil, si poate chiar nefast, de compui n numr excesiv. Trecerea de la flacoanele de sticl la sistemele de pungi de plastic multiple, pentru prelevarea sngelui, a facilitat n mare msur, prepararea produselor sanguine labile de nalt calitate. Considerentele de conservare sunt unul din principalele motive care duc la utilizarea produselor sanguine labile. Condiiile optime de depozitare si, din plecare, durata de conservare, variaz dup tipul de produse sanguine labile. Globulele roii i conserv mai bine proprietile dac sunt refrigerate; crioconservarea este cea care permite pstrarea optim a funciilor si eficacitii precursorilor hematopoetici si prin congelare, constituenii plasmatici i pstreaz mai bine calitatea. Pe de alt parte, se admite n prezent faptul c este optim conservarea plachetelor atunci cnd sunt meninute la temperatura ambiental si cnd sunt agitate continuu. Astfel, se observ c se satisfac numai exigentele conservrii globulelor roii, atunci cnd sngele total este refrigerat, de fapt, majoritatea celorlalte produse sanguine labile i pierd, n acest caz, eficacitatea terapeutic. Terapeutica pe baz de produse sanguine labile prezint, de asemenea, avantaje logistice, etice si economice. Eliminarea leucocitelor sporeste substantial calitatea pdusului. In particular, un volum considerabil crescut de plasm poate fi colectat. Majoritatea pacienilor care au nevoie de transfuzie, nu au nevoie de o unitate ntreag de plasm si n nici un caz n raportul 1 la 1 . Se poate, astfel, produce o cantitate mai mare de derivai plasmatici ,utiliznd pentru transfuzie globule roii, mai degrab dect snge total. 2. Metode de preparare : Produse sanguine labile se pot produce n timpul prelevrii, prin tehnica aferezei. In acest fel pot fi obinute plasma, leucocitele si plachetele. 0 alt soluie const n a preleva sngele total conform metodei tradiionale, produsele sanguine labile obinndu-se prin tratamentul

28

sngelui total, care va urma donrii. Precursorii hematopoetici se pot colecta pornind de la mduva osoas, de la sngele periferic sau de la sngele fetal. utiliznd diferite tehnici, alese n funcie de origine. Dat fiind faptul c exist riscul de alterare a activitii si funciilor produselor sanguine labile, condiiile de conservare si intervalul de-timp care precede tratamentul au o important capital. ntrzierile n preparare sau condiiile proaste de conservare pot afecta negativ calitatea produselor finale.

3. Alegerea anticoagulantului si a sistemului de pungi : Sngele total este recoltat ntr-o pung coninnd o soluie anticoagulant, care conine nutriment celulari, precum glucoz si adenin. Primele faze de centrifugare priveaz eritrocitele reziduale de aproximativ jumtatea acestor nutrimente Astfel, pare mult mai logic s se furnizeze nutrimente adaptate celulelor prin intermediul unui mediu de resuspensie, mai degrab dect s fie incorporate n soluia anticoagulant iniial. Precursorii hematopoetici sunt recoltai n soluie anticoagulant coninnd citrat si heparin; nutrimente, precum glucoza, pot fi prezente n soluia anticoagulant pentru a permite conservarea n intervalul cuprins ntre momentul prelevrii si crioconservare. Produsele de plastic utilizate pentru recoltarea sangelui, afereza si prepararea componentelorvor corespunde cerintelor respective din Farmacopeia Europeana cu privire la hemocompatibilitatea si corespunderea lor scopului tehnologic respectiv. Polivinil cloridul (PVC) se consinera satisfacator pentru stocarea concentratului eritrocitar. Trebue sa fim siguri in biocompatibilitatea unor plastificatori utilizati.Pentru stocarea plachetelor la +22 C se cere o pearmibilitate sporita pentru Oxigen. Aceasta poate fi asigurat de materiale plastice cu proprietati chimice si fizice alternative. Trecerea plastificatorilor in sange sau componentele lui nu trebue sa prezinte risc pentru recipient. Orice trecere trecere in continutul pungilor de adezivi de la etichete sau alte elemente auxiliare trebue sa fie in limitele acceptabile pentru securitatea produselor. Vor fi luate masuri pentru minimizarea nivelului rezidual de substante toxice dupa sterilizare, de exemplu etilen oxid. La implementarea oricarui plastic nou este necesal efectuarea unor explorari adecvate in preparerea componentelor si/sau stocarea lor. Se recomanda a include urmatorii paremetri: Concentrat eritrocitar: glucoza, pH, hematocritul, hemoliza, ATP, fragilitatea osmotica, potasiul extracelular si 2,3-bisphosphoglycerat; Plachete: glucoza, pH, concentratia trombocitelor, eliberarea LDH, fenomenul turbulentei, eliberarea beta-tromboglobulinului, agregarea, PO2, PCO2, acumularea acidului lactic, rezistenta la socul hipotonic si concentratia optimala de plachete; Plasma: Activitatea Factorului VIII si altor factori labili de coagulare, ded exemplu complexul trombin antitrombin. Aceste investi necesita a fi efectuate in mod normal de producator inainte de implementarea noilor materiale si rezultatele puse la dispozitia serviciului de sange. Evaluarea noilor materiale plastice pot fi completate cu datele clinice despre supravituirea posttransfuzionala in vivo a eritrocitelor autologe si prin restabilirea nivelului de plachete, supravietuirea lor si majorarea numarului lor.

29

Pentru a putea opera n sistem nchis, n timpul tuturor operaiilor de separare, este convenabil s se utilizeze o configuraie de pungi multiple, gata pregtit sau cu conexiune steril, care va trebui s fie conceput si aranjat astfel nct componenii dorii s poat fi preparai n condiiile de sterilitate necesare. Chiar dac este recomandat numai utilizarea sistemelor nchise pentru toate etapele de preparare a produselor sanguine labile. uneori se poate dovedi necesar utilizarea sistemelor deschise, din motive de constrngeri locale ntr-un mediu special conceput ,pentru a reduce la minimum riscul de contaminare bacterian. Cnd sunt utilizate sistemele deschise trebuie supravegheat ca procedura s se desfoare n condiii sterile. Produsele preparate astfel, trebuie transfuzate ntr-un interval de 24 ore, dac sunt tratate si conservate la +4 C sau un interval de 6 ore, dac sunt conservate la temperatura ambiental.

4. Principii de centrifugare : Viteza de sedimentare a celulelor sanguine este n funcie de mrimea lor. ct si de diferena de densitate dintre ele si lichidul de suspensie (vezi tabelul 3a). Ali factori care au un rol n aceast privin sunt vscozitatea lichidului, deformabilitatea celulelor , care depind de temperatur. Temperatura optim, n privina acestor factori. este de +20C sau mai mult

Tabelul 3a : Volumul si densitatea componenilor sanguini: Densitate medie Plasm Plachete Monocit e Limfocit e Neutrofil e Eritrocit e 1026 1058 1062 1070 1082 1100 Vol. mediu al fluidului (10-" L) 16 740 230 270 87

La nceputul centrifugrii. lichidul de suspensie este constituit numai din plasm si soluie anticoagulant. Globulele roii si leucocitele se sedimenteaz mai repede dect plachetele, pentru c amndou posed un volum mai important dect cel al plachetelor. Intr-o etap ulterioar, n funcie de durata centrifugrii si viteza acesteia, majoritatea globulelor roii si a leucocitelor se depun n jumtatea inferioar a pungii, n timp ce partea superioar conine plasm bogat n plachete. Dac se prelungete centrifugarea, plachetele se sedimenteaz, antrenate de o for proporional cu ptratul numrului de turaii pe minut si cu distanta fiecrei celule fat de centrul rotorului, n timp ce leucocitele, care se gsesc ntr-un mediu de densitate mai mare (sediment celular), se deplaseaz spre suprafa. La finalul centrifugrii ,plasma acelular se gsete n partea superioar a pungii si globulele roii n partea inferioar. Plachetele se acumuleaz deasupra concentratului si majoritatea leucocitelor se gsesc imediat dedesubt, n cei10mL care formeaz partea superioar a concentratului globular. Precursorii hematopoetici au caracteristici analoge celulelor mononucleare. Dar contaminanii lor pot fi celule imature sau maligne de descendent hematopoetic diferit n general, de talie mai mare i de densitate mai mic dect celulele mature.

30

Viteza si durata centrifugrii trebuie s fie alese n funcie de compusul care se vrea a fi obinut : spre exemplu, dac se dorete s se obin plasm bogat n plachete, centrifugarea trebuie oprit nainte de a ncepe sedimentarea plachetelor. Dac centrifugarea este fcut la vitez redus, uoarele abateri de la durata de centrifugare nu atrag consecine. Dac este nevoie, din contr, de plasm acelular, trebuie procedat la o centrifugare la vitez ridicat, un interval de timp suficient pentru a obine separarea de plasm deplachetat si concentrat eritrocitar. Este necesar normalizarea cu grij, pentru fiecare centrifug, a condiiilor optime unei bune separri. Exist posibilitatea de a alege ntre mai multe metode de centrifugare pentru a obine produse sanguine labile plecnd de la snge total. Tabelul 3b prezint schematic 5 metode de realizare a primei faze de separare a sngelui total si d o compoziie aproximativ a constituenilor iniiali obinui. Alegerea metodei de separare iniial influeneaz n mare msur procedurile de tratament ulterior al fraciunilor brute, ceea ce d natere unui sistem de metodologii interdependente pentru prepararea unui ansamblu de produse finale. De fiecare dat cnd un procedeu de preparare a unui compus sanguin este specificat, trebuie fcut referire la metoda de separare iniial.

5. Separarea 5.1. Separarea dup centrifugare iniial Dup centrifugare se retrage cu grij sistemul de pungi din centrifug. Punga primar se plaseaz ntr-un sistem de extracie a plasmei si se transfer straturile superioare, una cte una, n pungile satelite, n sistem nchis. Trebuie ales ntre a separa sau nu, stratul leucoplachetar de concentratul globular pentru a-l transfera ntr-o pung separat. Separarea stratului leucoplachetar prezint avantajul c, concentratul eritrocitar obinut este parial deleucocitat si va rmne srac n agregate n timpul depozitrii. Tabelul 3b prezint o estimare a rezultatelor care pot fi obinute n urma utilizrii centrifugrii iniiale (4 opiuni) sau filtrrii iniiale (1 opiune). Dup tehnica aleas pentru a prepara compuii: metodele l si li vor fi urmate de o nou centrifugare a plasmei bogat n plachete pentru a obine plasm acelular si concentrat placheta; metoda III va fi urmat de prepararea concentratului placheta pornind de la stratul leucoplachetar. 5.2. Separarea dup filtrarea iniial Sngele total poate fi filtrat. pentru a fi deleucocitat ,nainte de a proceda la centrifugarea de nalt vitez. Aceast operaie permite obinerea unei separri n plasm practic acelular si concentrat eritrocitar deleucocitat (si deplachetat). Tabelul 3b: 5 metode de separare iniial a sngelui total si compoziie aproximativ a constituenilor obinui (cifrele se raporteaz la o donare normal de 450 ml +1 0% + 60-70 ml anticoagulant) Metoda Filtrare iniial ' 1 IV V Da

31

Separare in:

plasm + strat leuco plachetar + eritrocite

Plasma + eritrocite

Plasma + strat Plachetar + eritrocite

Plasma + eritrocite

Plasma + eritroci deleuco citate

Fractiuni brute rezultate: - plasm,volum - plachete - leucocite Globule roii: Hematocrit - plachete leucocite Strat leucoplachetar hematocrit - globule roii - plachete - leucocite

200-280 ml 70-80% '5-10%

200-80 ml 70 - 80 % 5-10%

270320mL 10-20% 2-5%

270 330 ml 10-20% 2-5%

240290 ml < 1% < 0,01 % 8090% <1% <0,01%

75-80% 5-15% 25-45%

65-75% 20-30% 90-95%

85-90% 10-20% 25- 45%

80-90% 80-90% 95 - 98 %

50-70% 10-15% 10-25% 60-70%

40-60% 10-15% 80-90% 50-70%

Eliminarea stratului leucoplachetar are avantajul c se pot repune n suspensie eritrocitele rmase ntr-o soluie conceput pentru a oferi condiii optime de depozitare, cum ar fi soluia "salin-adenin-glucoz-manitol" (SAGM). Repunerea n suspensie poate fi fcut din nou n sistem nchis. Este astfel posibil s se congeleze plasma acelular si s se conserve sub form de plasm proaspt congelat pentru utilizare ca atare sau ca materie prim pentru prepararea altor produse. 5.3. Alte principii de separare

Centrifugarea zonal Se poate provoca sedimentarea celulelor sanguine exercitnd asupra unui flux sanguin o for centrifug mai mult sau mai putin perpendicular pe direcia fluxului. Eficacitatea separrii depinde de raportul dintre fora centrifug si viteza de curgere. Cnd acest raport este crescut, plasma obinut este srac n plachete, dimpotriv, cnd acest raport este sczut, plasma este bogat n plachete. Exist mai multe aparate pentru aferez n care acest principiu este pus n evident pentru producia de plasm srcit n celule sau bogat n plachete. Centrifugarea zonal i gsete aplicare suplimentar n eliminarea proteinelor plasmatice din suspensia de celule sanguine. Se introduce o unitate de celule sanguine n bolul de centrifugare, apoi se menine un flux de lichid de splare, pn ce concentraia proteic a fluentului scade suficient. Atunci se oprete centrifugarea si se recolteaz o suspensie de globule roii "splate". Se procedeaz n acelai fel pentru a aduga crioprotectorul nainte de congelare si pentru a nltura acest protector, dup congelarea suspensiilor de celule sanguine n mediu crioconservant.

32

Centrifuagarea n gradient de densitate Centrifugarea n gradient de densitate a sngelui, a celulelor mduvei osoase sau a celulelor leucoplachetare depuse suprafaa unui mediu de densitate 1, 077 g/ml separ celulele n funcie de densitate: celulele mono-nucleate se menin la suprafa n timp ce globulele roii si granulocitele formeaz un sediment ,dup ce au traversat mediul de separare. Centrifugarea n gradient de densitate este utilizat n general, pentru separarea celulelor de densitate diferit. dar si pentru separarea celulelor asociate n rozet la eritrocite, celule care nu sunt asociate.

Centrifugarea n contra-curent felutriaie Celulele supuse concomitent unui flux lichid si unei forte centrifuge aplicate n sens contrar au tendina de a se separa n funcie de dimensiunile lor. Aceast proprietate a fost folosit n separatorii celulari pentru a obine concentrate de plachete de aferez cu coninut sczut de leucocite, coninut care, n cazul anumitor aparate, poate s scad pn la valoarea specific deleucocitrii, aproximativ <106 /leucocite/unitate. Centrifugarea n contra-curent se aplic de asemenea , utilizndu-se centrifugi speciale. pentru a separa subpopulaiile de celule mononucleate extrase din snge sau din mduv osoas. Filtrarea

In prezent, exist 2 mari tipuri de filtrare pentru a obine produse sanguine labile: separarea plasmei de snge prin filtrare prin flux transversal; eliminarea leucocitelor din suspensiile celulare prin filtrarea n profunzime sau prin filtrarea de suprafa. I Filtrarea n flux transversal: Atunci cnd sngele curge de-a lungul unei membrane ai crei pori, prin dimensiunea lor, permit trecerea proteinelor plasmatice, dar nu si trecerea celulelor sanguine, se poate obine plasm acelular prin filtrare. Au fost puse la punct dispozitive de plasmaferez, n care un sistem de pompare preleveaz snge din vena donatorului. l amestec. cu procent constant, cu o soluie anticoagulant si l dirijeaz de-a lungul unei membrane permeabile la plasm (sistem de membrane plate sau de fibre goale n interior). Asupra sngelui se exercit dou presiuni: o presiune paralel cu membrana, pentru meninerea unui flux de snge de-a lungul acesteia si o alta perpendicular pe membran (presiune de filtrare propriu-zis). Acest sistem mpiedic celulele s se acumuleze contra membranei atunci cnd plasma este retras din snge(hematocritul n sistem poate trece de la 0,40 la 0,75). In anumite dispozitive, se mrete viteza de curgere a sngelui de-a lungul membranei printr-o aciune turbionar suplimentar sau provocnd micri ale membranei. Atunci cnd se ajunge la un anumit volum celular extracorporal se restituie celulele donatorului si se ncepe ciclul urmtor pn la obinerea volumului dorit de plasm celular.

33

II Filtrarea n profunzime si n suprafa Datorit proprietilor specifice ale plachetelor si granulocitelor si datorit deformabilitii sczute a limfocitelor, este mai uor s se capteze celulele ntr-un pat filtrant constituit din fibre. dect s se capteze globulele roii. Au fost recunoscute 4 sisteme de captare, pentru filtrele utilizate n deleucocitarea concentratelor de globule roii: a) activarea plachetar care determin celulele s se fixeze pe fibrele situate n partea superioar a filtrului, urmat de interaciunea plachetelor fixate si de granulocite. b) activarea granulocitelor provocat de un alt tip de fibre care determin aceste celule s se fixeze n partea median a filtrului. c) Obstrucia de ctre limfocite a porilor si ramificaiilor materiei fibroase, foarte fin. n straturile inferioare ale filtrului. In prezent, se utilizeaz paiete injectate si mulaje de materie fibroas. prezentnd diferite dimensiuni de pori si grosimi de fibre. folosite pentru prepararea filtrelor de leucodepletie destinate concentratelor eritrocitare. d) Tratamentul n suprafa al materiei din care sunt constituite filtrele poate mpiedica activarea plachetelor si poate permite pregtirea filtrelor capabile s reduc contaminarea concentratelor plachetare de ctre leucocite. numai prin filtrare. Filtrele folosite pentru leucodepleia globulelor roii si a plachetelor prezint diferene importante de eficacitate si de capacitate de filtrare. Dincolo de proprietile filtrelor, rezultatul filtrrii este influenat si de numeroi parametri (de exemplu, viteza de curgere, temperatura, amorsarea sau splarea), dar si de proprietile compusului de filtrat (ex.: antecedentele de stocare a compusului, numrtoarea leucocitar si plachetar). Atunci cnd o tehnic de filtrare este standardizat, trebuie stabilite limite pentru fiecare variabil susceptibil s afecteze eficacitatea titrrii si Modalitile Operaionale Normalizate ( Proceduri operaionale standard - SOP) trebuie s fie validate in ntregime in condiiile de utilizare. III. Componentele saracite in leucocite Introducerea procedeelor de eliminare a leucocitelor atat prin filtrare cat si prin tehnici speciale de centrifugare necesita a fi validate cu atentie. Validarea va fi efectuata de specialisti, tinand cont de instructiile producatorului pentru eliminarea leucocitelor si alte aspecte a asigurarii calitatii componentelor. Pentru a compara si selecta filtre destinate eliminarii leucocitelor, producatorii vor prezenta date privind performantele lor in conditiile determinate. Producatorii vor prezenta de asemenea date privind performantele sangelui in dependenta de modificatii ale diferitor tipuri de filtre si loturi. Se va elabora un model matematic pentru calculul cantitatii de mostre pentru necesare pentru validarea si controlul procesului de eliminare a leucocitelor. Dupa validarea completa a procesului, se va utiliza controlul statisticpentru controlul ulterior al procesului in vederea detectarii oricaror devieri ale procesului si/sau proceduripor. Pot aparea unele probleme la donarea sangelui de catre donatorii cu anormalitati ale eritrocitelor (tallasemie ?) cand o eliminare adecvata a leucocitelor nu poate fi obtinuta si se impune o procedura de control al calitatii mai detalizat (numerarea leucocitelor la fiecare donare). procesul de filtrare. Necesita investigatii suplimentare calitatea eritrocitelor dupa

34

Tehnici de imuno-absorbie Izolarea specific a unui tip particular de celule mononucleate, n timpul preparrii celulelor suse, se efectueaz deseori cu ajutorul tehnicilor de imuno-absorbie. Se procedeaz fie prin eliminarea specific a celulelor contaminnd prepararea celulelor suse ("selecie negativ"), fie prin izolarea precursorilor hematopoetici ("selecie pozitiv") Se folosesc diferite tipuri de anticorpi monoclinali n urmtoarele tehnici: fonnarea de rozete imune, de bile magnetice sau bile biotinilate. In timpul etapelor succesive ale preparrii precursorilor hematopoetici totul trebuie s fie conceput in aa fel nct s se reduc la minim pierderile de celule in spatiile moarte ale tuburilor, coloanelor, camerelor si pungilor. Splarea produselor sanguine labile La aceast metod se recurge ocazional. cnd sunt necesare celule fr proteine.

6. Crioprecipitarea Anumite proteine plasmatice, n particular F VIII, fibronectina si fibrinogenul, se pot izola, profitndu-se de solubilitatea lor redus la o temperatur sczut. In practic se procedeaz la congelarea de uniti plasmatice, la decongelarea si centrifugarea acestora la temperatur sczut. Condiiile de congelare, decongelare si centrifugare care trebuie s fie respectate n prepararea de crioprecipitat, sunt expuse n amnunt la Capitolul 16:"Crioprecipitat".

7.

Congelarea si decongelarea plasmei

7.1. Principiu Congelarea este o etap critic n conservarea factorului VIII plasmatic. n timpul congelrii ,se formeaz gheat pur si soluiile plasmatice sunt concentrate n apa rmas. Cnd se depete stadiul de solubilitate a substanelor, fiecare din ei formeaz cristale, dar acest fenomen poate fi influenat de folosirea anticoagulanilor. Studii complementare privind acest aspect sunt n desfurare. Formarea gheii depinde de viteza de extracie a cldurii, n timp ce deplasarea substanelor depinde de gradul lor de difuziune. n cazul congelrii lente, ritmul formrii gheii nu este suficient de rapid pentru a mpiedica difuzarea substanelor, exist o concentraie progresiv de substane n mijlocul unei uniti plasmatice. Toate substanele fiind deplasate simultan, moleculele factorului VIII sunt inactivate datorit expunerii lor la efectele unei puternice concentraii de sruri, o perioad prelungit. In caz de congelare rapid, dimpotriv, formarea gheii prinde n vitez deplasarea substanelor si mici legturi de cristale solidificate sunt reinute ntr-un mod omogen. n ghea. fr a exista contact prelungit ntre srurile puternic concentrate si FVIII. Pentru a se obine randamentul maxim al F VIII, plasma citratat trebuie s fie congelat la -30 C sau mai putin. n timpul congelrii are loc o diminuare a factorului VIII, atunci cnd solidificarea plasmei dureaz mai mult de 1 or. Se poate proceda la un control, msurndu-se coninutul total de proteine al unui eantion n form de pivot. de plasm congelat; acest coninut trebuie s fie

35

identic coninutului total proteic al plasmei nainte de congelarea ei. Viteza de congelare este optim atunci cnd extracia de cldur este de 38Kcal./or si pe unitate de plasm, cu controlul prin utilizarea de termocupluri. Pentru ca aceste tehnici s poat deveni elementele unei practici cotidiene coerente, trebuie ca personalul bncilor de snge s cunoasc bine att raionamentul care le susine , ct si limitrile si potenialele capcane . 7.2. Metode de congelare In timpul congelrii plasmei, viteza de rcire trebuie s fie ct mai mare posibil, iar ideal ar fi s se ajung la o temperatur, n mijlocul plasmei, de -30C sau mai sczut, n maximum 60 minute. In lips, viteza minimal de congelare tolerat trebuie s aduc temperatura nucleului produsului la -30C intr-un interval de 4 ore. Experiena a demonstrat c dureaz mai multe ore, uneori, ntr-o temperatur ambiant de -30C, cu transfer de cldur prin aer. Durata trebuie s fie redus la cel putin de 1 or si, dac este posibil, la mai putin de o jumtate de or, spre exemplu, cu ajutorul urmtoarelor mijloace: trebuie ca plasma s fie dispus n mod regulat, pentru ca expunerea la sursa de frig s fie maxim (de ex: pungi aezate pe orizontal sau n forma pe care ar fi avut-o dac erau verticale); imersia n mediu de foarte joas temperatur; dac se utilizeaz mediu lichid, trebuie s se asigure c solventul nu poate s treac prin recipient/ Referinte la conditiile de stocare sunt facute in cap.3, 13.3. 7.3. Metode de decongelare Unitile congelate trebuie manevrate cu grij. pentru c pungile se pot sparge foarte uor. Trebuie verificat dac nu sunt deteriorate nainte de a ncepe decongelarea. pentru a se evita defectele sau scurgerile. Recipientele care prezint scurgeri se nltur. Produsul trebuie decongelat imediat dup extragerea sa din stocuri, ntr-un mediu controlat la +37C, dup o procedur validat. Dup decongelare, toat plasma trebuie inspectat pentru a verifica dac nu prezint nici un crioprecipitat insolubil la finalul renclzirii. Produsul nu trebuie utilizat dac prezint materii insolubile. Pentru a-i conserva produii labili, plasma trebuie utilizat imediat dup decongelare si n nici un caz in mai mult de 6 ore dup aceasta. Plasma nu poate fi congelat. Decongelarea plasmei face, inevitabil, parte din anumite procedee actuale de inactivare viral. Compusul final, recongelat dup tratament, trebuie utilizat imediat dup decongelare, n scopuri clinice si nu poate fi recongelat.

8. Utilizarea unui sistem deschis si de dispozitive cu conectare steril Orice inovaie n prepararea unui produs sanguin labil, care implic un sistem deschis, trebuie s fac obiectul unor teste repetate ce vizeaz, n timpul fazei de punere la punct, meninerea sterilitii tii. Testele de sterilitate de rutin nu par a avea dect o valoare limitat ca modalitate de control al calittii. Produsele sanguine labile care au fost preparate n sistem deschis trebuie folosite ct mai repede posibil. Produsele sanguine labile care au fost preparate cu ajutorul

36

dispozitivelor cu conectare steril validate. pot fi stocate.ca si cnd ar fi fost pregtite n sistem nchis. 9. Alte metode 9.1. Produse sanguine tratate cu radiaii ionizante Prezenta limfocitelor viabile n produsele sanguine poate antrena o reacie mortal a grefonului mpotriva gazdei, n cazul bolnavilor grav imunodeprimai, spre exemplu la pacienii aflai sub tratament imunosupresiv si la copiii cu sindrom imunodeficient sever. Alte categorii de pacieni prezint acest risc rar de complicaie, spre exemplu n urma unei transfuzii intrauterine, unei transfuzii ntre membrii unei familii si n urma transfuziei de produse sanguine labile respectnd compatibilitatea n sistemul HLA. Limfocitele pot fi fcute neviabile prin expunere la o radiaie ionizant. Acest tratament nu antreneaz nici o deteriorare semnificativ pentru celelalte produse sanguine labile si un produs sanguin labil iradiat poate, astfel, fr risc, s fie administrat tuturor pacienilor. Protocolul ar trebui s garanteze c nici o parte a compusului nu primete o doz inferioar valorii de 25 Gray sau peste 40 Gray. Durata de expunere trebuie s fie normalizat pentru fiecare surs de iradiere si ajustat la intervale adaptate. Concentratele de globule roii pot fi iradiate n orice moment timp de 14 zile dup prelevare si pot fi stocate apoi pn n ziua 28 de la prelevare. Tunnd seama de pierderea crescnd de potasiu suportat de hematii dup iradierea lor. aceste celule prevzute pentru transfuzii intrauterine sau neonatale massive trebuie utilizate n primele 48 ore care urmeaz iradierii. Plachetele iradiate pot fi utilizate pn la data de perimare iniial. Se recomand, n mod special, s se utilizeze etichete sensibile la radiaii care atest c produsul sanguin labil a fost bine iradiat. 9.2. Produse sanguine f r citomegalovirus Citomegalovirusul (CMV) este un agent infectios curent,care poate ti transmis n timpul transfuziei de produse sanguine. Riscul de infecie este maxim n cazul produselor proaspete coninnd leucocite mono i polinucleare. lnfecia cu CVM este deseori asimptomatic n cazul persoanelor sntoase. Anticorpii apar n general, la 4 pn la 8 sptmni dup infecie, si prezenta lor poate fi evidentiat de teste de depistare clasice. Aceast infecie fiind curent, testul trebuie repetat pentru fiecare donare ce provine de la un donator anterior seronegativ. Dac n general nu este semnificativ clinic la primitorii al cror sistem imunitar nu este slbit, infecia cauzat de acest virus poate antrena boli grave (chiar mortale. n cazul anumitor pacieni care nu au fost expui mai nainte la acest agent patogen , precum: - primitorii de grefe - pacienii grav imunodeprimai - transfuzii intrauterine - femei insarcinate negative la anti-CMV

37

- nou nscuii prematuri sau /si cei care prezint deficit ponderal Acestor pacienti li se vor adminictra componente selectate sau procesate astfel ca sa minimalizeze riscul de infectare cu CMV. Utilizarea componentelor de la donatori antiCMV negativi sau produse saracite in leucocite semnificativ reduc riscul de transmitere a infectiei cu CMV la pacienti cu imunodeficite. Tot odata nici o metoda sau cmbinatia lor nu poate elimina cazurile de transmitere a infectiei in cazurile de infectie precoce cu CMV viremie. 10. Definiii si norme minimale Produsele sanguine labile servesc la corectarea unui deficit cunoscut jar fiecare preparare trebuie s fac obiectul unui control strict de calitate. Scopul este de a prepara produse "pure", dar este uneori dificil si costisitor s se obin un grad ridicat de puritate, lucru care poate chiar s nu fie necesar n fiecare caz. Cu toate acestea, este absolut imperativ s se precizeze calitatea si s se poate proceda la diferite tipuri de preparate , pentru a oferi clinicienilor un sistem de alternative relativ larg n materie de transfuzie, conforme cu nevoile pacienilor. Spre exemplu. se pot prepara concentrate de globule roii comportnd concentraii variabile de leucocite si plachete contaminante. 0 preparare, unde peste 70% leucocite si peste 90% plachete au fost retrase, convine pentru majoritatea primitorilor, dat fiind faptul c microagregatele nu se vor putea forma n timpul conservrii. Dac pacientul are anticorpi ndreptai mpotriva antigenelor leucocitare sau dac este de prevzut c acesta va avea nevoie de un numr mare de transfuzii, depletia leucocitar va trebui s fie mult avansat. Pentru punerea la punct a protocolului transfuzional adaptat, trebuie definite cu grij toate produsele si trebuie fixate norme minimale. Clinicienii ar trebui s fie informai n legtur cu proprietile tuturor produselor labile.

11. Introducerea preparrii produselor sanguine labile n bncile de snge Laboratoarele care nu au deloc experien n materie de preparare a produselor sanguine labile ar trebui s-si autorizeze personalul s participe la stagii de formare si s mearg la bnci de snge care stpnesc la perfecie aceast tehnic. Trebuie s se cumpere echipament pentru ca serviciul dup vnzare si ntreinerea masonilor s fie asigurate convenabil si trebuie s se aleag o metod care s permit obinerea rezultatelor dorite. Toate etapele procedurii trebuie s fie clar explicate ntr-un manual care s se gseasc pe masa de lucru . nainte de a fi utilizat n mod curent o metod trebuie s fie validat n ntregime si trebuie stabilit un mod operaionali normalizat (MON). Trebuie controlat cu grij fiecare unitate pregtit pn cnd este sigur c s-a obinut, n mod efectiv, calitatea dorit. Produsele preparate n mod curent trebuie s fac obiectul controalelor regulate de calitate.

12. Controlul produselor - asigurare de calitate In toate privinele , prepararea produselor sanguine labile trebuie s urmeze principiile Bunelor Practici de Preparare (BPP). Controlul produselor are drept scop s ajute banca de snge la meninerea nivelului ridicat si uniform al calittii produselor preparate. Astfel, rezultatele

38

clinice se vor ameliora, ncrederea n terapia cu produse sanguine labile va creste. iar aplicarea unui program terapeutic cu produse labile, va fi facilitat. Lipsa de rigoare, abaterile n raport cu modurile operaionale normalizate sau erorile de manevrare n timpul tratrii sngelui vor mpiedica obinerea produsului sanguin labil de calitatea dorit. Descrierea metodologiei si controlul produselor sunt complementare; de aceea, un mod operaional normalizat este de asemenea, necesar. Rezultatele controlului produselor trebuie sa fac obiectul unei evaluri continue si trebuie luate msuri pentru a corecta defectele constatate n cadrul procedeelor sau echipamentelor. In capitolele urmtoare, se vor defini si descrie produsele sanguine labile. Se vor expune principiile ce trebuie respectate pentru a prepara. conserva si transporta produsele n bune condiii. n sfrit, se vor formula linii directoare privind controlul calittii. 13. Conservarea produselor sanguine labile Aceste produse trebuie s fie conservate n aa fel nct s se permit conservarea n mod optim a viabilitii si a activitii lor n timpul ntregii perioade de stocare. Riscul de contaminare bacterian diminueaz sensibil dac se folosesc numai sisteme nchise de separare si conservare. Operaiunile curente de conservare, de punere n circulaie si de retur. trebuie s fac n acelai timp obiectul unui control continuu; n sfrit, transportul produselor sanguine labile trebuie s se desfoare n mod sigur si controlat.

13.1. Material Produsele sanguine labile sunt conservate ntre +20C si +24C, ntre +2 si + 6C sau la diferite temperaturi sub 0C. Indiferent de tipul de instalaie de stocare reinut. trebuie ca naintea cumprrii ,s se ia n considerare urmtoarele aspecte: I. refrigeratoarele si congelatoarele trebuie s aib capacitate excedentar; spaiul pe care l ofer trebuie fie uor de inspectat; II. funcionarea lor trebuie s fie fiabil. iar temperatura s fie repartizat uniform n unitate; III. aparatele trebuie prevzute cu dispozitive de nregistrare a temperaturii si alarmei; IV. aparatele trebuie s se curee uor si s reziste la detergeni puternici; de asemenea, trebuie s respecte normele de securitate a muncii. 13.2. Stocare ntre +2C si +6C Utilizarea refrigeratoarelor pentru stocare trebuie redus la nivelul sngelui total, produselor sanguine labile,la tuburile pilot si la reactivi test. Este convenabil s se rezerve un spaiu separat pentru: - unitile destinate pentru a fi puse n circulaie; - unitile selecionate anumitor pacieni inclusiv donrile autologe - unitile conservate n ateptarea finalului testelor - uniti perimate si respinse. Spaiul rezervat fiecruia din aceste tipuri de compui trebuie s fie clar indicat. Temperatura interioar a unitii trebuie s se nregistreze continuu. Captatorul termografului trebuie s fie plasat ntr-o pung de snge umplut cu o soluie de glicerol de 10% pn la 250mL sau un

39

volum echivalent volumului normal pentru un compus stocat. Aceast pung trebuie aezat n partea superioar a spaiului congelat. In marile camere frigorifice este nevoie de 2 captatoare. Sistemele de alarm trebuie, de preferin, s trimit semnale concomitent acustice si optice, iar verificarea s aib un caracter regulat. Ideal ar fi ca refrigeratorul pentru compui sanguini s fie racordai simultan la reeaua electric normal. dar si la un generator de rezerv.

13.3. Stocarea compuilor congelai de plasmei Punctul eutectic al plasmei este de -23C.Pentru a tine cont de fluctuaiile de temperatur n timpul utilizrii ei, un centru de transfuzie trebuie s aib un congelator capabil s coboare temperaturile la -30C sau mai putin. Congelatoarele pot, de asemenea, pstra produse plasmatice si serice nonterapeutice. E convenabil s se prevad spatii separate pentru' diferitele tipuri de produse si s se delimiteze bine aceste spatii pentru evitarea erorilor. Trebuie evitat utilizarea congelatoarelor cu decongelare automat pentru a fi sigur c temperatura va fi sczut n timpul decongelrii. Temperatura n congelator se nregistreaz continuu. Sistemul de alarm emite semnale acustice si optice si se verific regulat. Ideal ar fi ca refrigeratorul pentru compui sanguini s fie racordai simultan la reeaua electric normal, dar si la un generator de rezerv.

13.4. Stocare ntre +20C si +24C Plachetele se conserv la +20C - +24C. Se recomand utilizarea unei instalaii nchise care s permit controlul temperaturii. Dac acest lucru lipsete, spatul ales trebuie s permit meninerea temperaturii cerute. Plachetete se conserv n agitatoare care trebuie: s asigure un amestec satisfctor n pung, dar si schimburi de gaze prin perete; s evite plierea pungilor; s aib o vitez constant care s asigure evitarea formarii de emulsie. Instalaia nchis trebuie s fie datat cu un termograf si cu sistem de alarm. In lipsa acestora. se utilizeaz un termometru de control la locul de conservare si se consult de cteva ori pe zi. Viteza agitatorului se verific regulat conform recomandrilor fabricantului.

13.5. Remarci asupra conservrii globulelor roii. Soluiile anticoagulante utilizate n timpul colectrii sngelui au fost concepute pentru evitarea coagulrii si pentru a permite stocarea globulelor roii pentru o perioad de timp. Initial destinate stocrii sngelui total, sunt de asemenea utilizate la prepararea produselor sanguine labile.Toate solutiile contin citrat de sodiu,acid citric si glucoz, iar altele contin n plus adenin, guanozin si fosfat. Citratul fixeaz calciul si mpiedic coagularea sngelui. iar glucoza se utilizeaz pentru globulele roii n timpul stocrii. Fiecare molecul de glucoz d dou molecule de adenozin trifosfatic (ATP) formate prin fosforilarea adenozin difosfat (ADP). ATP este o molecul

40

energetic care servete la conservarea funciilor globulelor roii, la meninerea supleii membranei, precum si la meninerea anumitor transporturi transmembranare. n timpul aciunii sale n reaciile consumatoare de energie, ATP este degradat de ADP. Adiionarea acidului citric la anticoagulant permite obinerea unei concentraii de ioni de hidrogen suficient de ridicat la nceputul stocrii la + 4C Fr acest adaos sngele ar fi prea alcalin la temperatura de stocare. In timpul depozitrii, aciditatea creste, ceea ce reduce glicoliza. Compoziia n nucleotide (ATP, ADP, AMP) descrete n timpul depozitrii. Adugarea adeninei ,constituent important al nucleotidelor, permite globulelor roii s sintetizeze AMP, ADP si ATP si s compenseze (sau s reduc) pierderile. Cnd se prepar concentrate de globule roii, o parte considerabil a glucozei si adeninei este sustras odat cu plasma. Dac nu se compenseaz dispariia lor (de exemplu, prin introducerea n anticoagulant a unei cantiti de adenin si de glucoz superioar celei normale sau prin adugarea separat printr-un mediu de suspensie conservant), nu se va putea obine o viabilitate suficient a globulelor roii, n cazul n care concentraia lor este prea ridicat. Concentratul de globule roii CDP - adenin normal nu trebuie s aib un hematocrit superior valorii de 70%. Este, atunci, suficient de fluid pentru a putea fi transfuzat fr o diluie prealabil. Plachetele si leucocitele pierd viabilitatea rapid la +4C . Formeaz microagregate care sunt prezente n cantitate considerabil deja dup 3-4 zile de stocare a sngelui total si mult mai mult n concentratele de globule roii. Aceste microagregate pot trece prin filtrele dispozitivelor de transfuzie obinuite. Sunt susceptibile de a antrena o reducere a funciei pulmonare, obstrund capilarele pulmonare, fenomen care poate avea important clinic n timpul transfuziilor masive. Extracia plachetelor n timpul preparrii produselor sanguine reduce formarea microagregatelor. De asemenea, srcirea n leucocite prin scoaterea nveliului leucoplachetar reduce frecventa reaciilor transfuzionale febrile si contribuie la obinerea eliminrii unei mari prti a leucocitelor n caz de folosire a fibrelor prevzute pentru acest efect. Recurgerea la o soluie de conservare sau la un mediu de suspensie permite meninerea viabilitii globulelor roii ,chiar si atunci cnd 90% din plasm a fost retras. In timp ce clorura de sodiu, adenina si glucoza sunt necesare pentru viabilitate, alte zaharuri servesc la stabilizarea mai bun a membranei celulare si la prevenirea hemolizei.

13.6. Concentrate de globule roii Concentratele de globule roii pot fi stocate n stare lichid la o temperatur programat de +2C la +6C.Functionarea frigiderului de depozitare trebuie s fie controlat cu grij (vezi cap.23). Durata maxim de stocare (data de perimare) se noteaz pe fiecare recipient. Ea variaz dup tipul de preparare (concentraie celular, formula de anticoagulant, utilizarea unei soluii de conservare sau a unui mediu de suspensie etc) si trebuie determinat pentru fiecare tip pe baza unei durate medii de viat, 24 ore dup transfuzie, cu minimum 75% din globulele roii transfuzate. Concentratele de globule roii n stare congelat se prepar si se reconstituie dup o procedur aprobat, trebuie stocat la o temperatur egal sau inferioar celei de -80C si trebuie s dea cifre satisfctoare privind durata de viat post-transfuzional.

41

13.7. Concentrate de plachete Aceste concentrate sunt sensibile mai ales la condiiile de stocare. Metabolismul plachetelor si prin urmare, funcia si viabilitatea lor dup transfuzie, depind mai ales de buna oxigenare, de temperatura si de Ph-ul soluiei de suspensie. Pentru buna conservare a acestui produs labil, este necesar si utilizarea de recipiente speciale din plastic permeabil la gaz, temperatura(ntre +20C si +24C) si o agitare adecvate n timpul stocrii. 13.8. Concentrate de granulocite De regul. suspensiile granulocitare sunt preparate pentru un pacient determinat si se administreaz imediat. Dac o depozitare intermediar e inevitabil, aceasta va fi fcut la +20 C - +24 C pentru maximum 24 ore. 13.9. Componente din plasma Condiiile recomandate pentru stocarea plasmei proaspt congelate, a crioprecipitatului si a plasmei lipsite de crioprecipitat sunt prezentate n Tabelul 3c Produs Plasm proaspt congelat, Crioprecipitat si plasma lipsit de crioprecipitat Durat de stocare si temperatura 24 luni la mai putin -30 12 luni ntre -25Csi -30C 3 luni ntre -18C si -25C

Nota: Limitele temperatirilor recomandate se bazeaza pe conditiile practice de congelare. In mod normal temperatira de pastrare a produsului nu trebue sa depaseasca punctul eutectic de 23 C (in timpul deschiderii congelatorului, etc.). Relatia exacta intre durata stocarii si temperatura nu e determinata. Plasma preconizata pentru fractionare (vezi monografia Farmacopeiei Europene). 1 4. Punere n circulaie si transport: Produsele sanguine labile se transport prin intermediul unui sistem care a fost validat pentru meninerea temperaturii de stocare recomandat pentru durata maximal propus si ntre valorile extreme de temperatur ambiant n timpul transportului. Recipientele destinate transportului trebuie bine izolate si uor de curat si manevrat. In cazul folosirii unui vehicul frigorific special, se respect principiile aplicabile controlului frigiderelor. In mod subsidiar, sistemele de transport rutier sau feroviar, cu intervenia refrigeratoarelor controlate, pot fi avute n vedere. Aceste produse congelate nu trebuie s intre n contact direct cu pungile de snge. Temperaturii produselor eritrocitare se menin ntre +2C si +6C. Sistemele de transport validate trebuie s asigure ca la captul unei durate de transport de maximum 24h temperatura s nu depeasc +10C. Temperatura produselor plachetare se menine ntre +20C si +24C, iar plasma congelat se transport n stare congelat la o temperatur ct mai apropiat posibil temperaturii de depozitare recomandate. In timpul deplasrilor ,e bine s se controleze temperatura cu ajutorul unui indicator. La destinatie, dac nu e necesar pentru o transfuzie imediat, produsul se depoziteaz n condiiile recomandate.

42

Temperatura la destinaie se controleaz astfel: se scot dou pungi din recipient si dup ce se plaseaz un termometru ntre ele, se reunesc cu ajutorul benzilor de cauciuc. Pungile se reaeaz rapid n recipient si se nchide capacul. Temperatura se citete dup 5 minute. Temperatura pungilor cu globule roii nu trebuie s fie inferioar celei de +1C si nici superioar celei de +10C. Altfel, un dispozitiv electronic de detectare se poate utiliza pentru a lua msuri exacte la suprafaa unei pungi. Produsele sanguine labile returnate nu trebuie repuse n circulaie n scop transfuzional, dac punga a fost deteriorat sau deschis. dac produsele nu au fost meninute permanent n intervalul de temperatur adecvat sau , dac se constat scurgeri, schimbri anormale de culoare sau o hemoliz excesiv. Se recomand oferirea unor informaii complete privind identificarea, data punerii n circulaie si asupra condiiilor de transport.

15. Informaii asupra compuilor: Informaii succinte despre produselor sanguine labile ar trebui comunicate clinicienilor, cu date privitoare la compoziia acestora, indicaii, stocare si practica transfuzional.

43