Determinacin de la capacidad antioxidante y compuestos bioactivos de frutas nativas peruanas Determination of antioxidant capacity and bioactive compounds in native

peruvian fruits

Ritva Repo de Carrasco1, Christian Ren Encina Zelada1 1 Facultad de Industrias Alimentarias, Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. LA Molina s/n, Lima 12, Per. Telf.: 9962-14357, ritva@hotmail.com

RESUMEN En el tomate de rbol se destac el contenido relativamente alto de fibra cruda 4,5 g/100 g de fruta. El tomate de rbol ( y el aguaymanto ( ) tuvieron mayor contenido de protenas (1,9 g/100 g para ambos frutos) que las otras frutas estudiadas. En cuanto a compuestos fenlicos, la papaya de monte es la fruta que present mayor contenido de estos compuestos (167 mg de equivalente cido glico/g de fruto). El contenido de betalanas en tuna roja ( ) fue de 68,95 mg/1000 mL. El aguaymanto tuvo el mayor contenido de cido ascrbico (43,3 mg/100g), seguido por la papaya de monte (31,41 mg/100g) y el tomate de rbol seguida por la tuna roja 16,09 mg/100g y 22,75 mg/100g, respectivamente. El contenido de carotenoides fue mayor en el tomate de rbol (4 mg -caroteno/100 g) seguido por el aguaymanto con 2,64 mg caroteno/100 g. La tuna roja present una capacidad de inhibicin del radical DPPH mucho mayor que las otras tunas estudiadas (77,65 %). Comparando las diferentes frutas en cuanto a capacidad antioxidante medido por el mtodo del DPPH, fue el de la papaya de monte (1936 228 g equivalente trolox/g de fruto); seguido por el tomate de rbol (853 52 g equivalente trolox/g de tejido); y la mayor capacidad antioxidante medida por el mtodo del ABTS fue el de la papaya de monte (2141 71 g equivalente trolox/g de fruto); seguido por el aguaymanto (1066 28 g equivalente trolox/g de fruto). Finalmente, se concluy que el estado de madurez influye en forma directamente proporcional al contenido de compuestos bioactivos en el aguaymanto, los que a su vez generan una mayor capacidad antioxidante en el fruto mientras ms maduro est. Palabras clave: Frutas nativas peruanas, Physalis peruviana, Cyphomandra betacea, Carica pubescens, Opuntia ficus indica, capacidad antioxidante, compuestos bioactivos.

ABSTRACT In the case of the tree tomato ( ) the relatively high crude fibre content stood out (4,5 g/100 g of fruit). The tree tomato and golden berry had higher protein content (1,9

g/100 g for both fruits) than the other fruits. Regarding to the mineral analysis, the prickle pears are very good sources of phosphorus as well as calcium. On the other hand, the tree tomato is an excellent potassium source followed by golden berry and papaya( ). In addition golden berry is a relatively good source of iron and zinc. The mountain papaya is a very important source of phosphorus surpassing to the other fruits. All the samples presented significant difference as far as the content of total phenolic compounds, but mountain papaya is the fruit that presented the highest content of these compounds (167 mg of gallic acid equivalent/g of fruit). The content of betalains in red prickle pear was of 68,95 mg/1000 mL. Golden berry had the highest vitamin C content (43,3 mg/100g) followed by mountain papaya (31,41 mg/100g). The lowest content of this vitamin was in the tree tomato followed by red prickle pear, 16,09 mg/100g and 22,75 mg/100g, respectively. The content of carotenoids was the highest in the tree tomato, (4 mg -carotene/100 g) followed by golden berry with 2,64 mg -carotene/100 g. Red prickle pear presented much greater capacity of inhibition of radical DPPH than the other varieties (77,65%). Comparing the different fruits regarding to the measurement of the antioxidant capacity, the mountain papaya (2141 71 g equivalent trolox/g of fruit) had the highest value followed by golden berry (1066 28 g equivalent trolox/g of fruit), tree tomato and red prickle pear. Finally, it was found that the grade of maturity had a direct effect to the antioxidant capacity. Key words: Peruvian native fruits, Physalis peruviana, Cyphomandra betacea, Carica pubescens, Opuntia ficus indica, antioxidant capacity, bioactive compounds.

INTRODUCCIN En el rea andina se cultivan muchas frutas poco conocidas en otras regiones, como son el tomate de rbol o sacha tomate, aguaymanto, tuna y papaya de monte. Estas frutas se consumen principalmente en forma natural sin mayor grado de procesamiento; no existe tampoco mucha informacin sobre su composicin qumica. La revalorizacin de frutas nativas, poco conocidas o desconocidas fuera de sus regiones de origen, sera de gran beneficio para el poblador rural del interior del Per que se encuentra entre los grupos poblacionales ms pobres de Latinoamrica. Entre estas frutas nativas existen fuentes importantes de vitaminas, azcares, materias gelificantes (pectinas), materias antioxidantes, cidos, aromas y sabores que esperan su identificacin y posterior explotacin por la industria para elaborar productos novedosos y competitivos en el mercado. El aguaymanto es originaria del Per y existen diversas referencias histricas que indican que fue domesticado, cultivado y muy apreciado por los antiguos peruanos. La Physalis peruviana posee diferentes nombres comunes, dependiendo de la regin: capul, aguaymanto, awaymanto, bolsa de amor, cereza del Per, uchuva, etc. El fruto es una baya carnosa, jugosa, en forma de globo con un dimetro entre 1,25 - 2,5 cm y contiene numerosas semillas1. La tuna, originaria de Amrica, fue llevada por los espaoles a Europa y desde all distribuida hacia otros pases del mundo. Esta gran dispersin geogrfica dio origen a muchos ecotipos con caractersticas locales propias. Su produccin, cultivo y/o crianza es altamente rentable, as como la de su husped, la cochinilla. Se ha realizado la

caracterizacin qumica de la tuna italiana y un estudio de almacenamiento de jugo de tuna; trabajaron con tres variedades: roja, amarilla y blanca y encontraron que las tunas tienen una acidez baja y un relativamente alto contenido de azcar y vitamina C2. El tomate de rbol es originario de la vertiente oriental de los Andes, especficamente Per, Ecuador y Colombia. Pertenece al grupo de las frutas semicidas, siendo conocida con diversos nombres en distintas regiones. Es una baya aromtica de forma ovoide, punteada en su extremo inferior y con un cliz cnico, que mide alrededor de 8 cm de largo y 5 cm de dimetro. Los colores de la pulpa varan entre naranja, rojo y amarillo; dicha pulpa es ligeramente firme, suave y jugosa, con un sabor agridulce. La pulpa cercana a la cscara es firme, mientras que la pulpa interna es suave y jugosa con un sabor agridulce1. Carica pubescens, llamada tambin papaya de la sierra, papayita arequipea o papaya de monte. Requiere de climas templado - clido. El fruto es una baya, de pericarpio delgado, jugoso, de color amarillo (pulpa y piel), pasando por color verde durante la madurez. El centro es hueco y se encuentra totalmente ocupado por las semillas envueltas en un tejido mucilaginoso; presenta una forma oblongo - ovoide de 5 a 10 centmetros de largo por 3 a 6 centmetros de ancho y tiende a ser ovalada, con los extremos aguzados1. La presente investigacin tiene los siguientes objetivos: - Determinar el contenido de fibra cruda de las siguientes frutas nativas: tuna, aguaymanto, tomate de rbol y papaya de monte. - Determinar el contenido de compuestos bioactivos y capacidad antioxidante en las frutas nativas antes mencionadas. - Determinar cmo el estado de madurez del aguaymanto influye en el contenido de sus compuestos bioactivos y capacidad antioxidante, y determinar el estado de madurez que conlleva un mayor contenido de compuestos bioactivos. PARTE EXPERIMENTAL Lugar de ejecucin El presente trabajo de investigacin se realiz en los laboratorios de Fsico-Qumica, Instrumentacin y Biotecnologa, Microbiologa y Planta Piloto de Alimentos, de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina. Materiales y reactivos Muestras: aguaymanto procedente del valle del Mantaro (Huancayo); papaya de monte procedente de Arequipa; tuna de tres colores: roja, verde y anaranjada, procedentes de Ayacucho; tomate de rbol, procedente de Junn. Reactivos: ABTS (2,2'-azino-bis(3-thylbenzthiozoline-6-sulphonic acid) adquirido de Sigma Chemical Co., DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil) de Aldrich Chemical Co., persulfato de potasio de grado analtico de Harleco 7574, etanol absoluto y hexano

de J.T. Baker, metanol de Mallinckrodt, acetona, folin-ciocalteu, carbonato de sodio anhidro al 1 N, 2,6 diclorofenol indofenol de Ferak 33095, cido l(+)-ascrbico para anlisis de Riedel-di Han 33034, cido metafsforico, cido actico glacial 100% de Merck, cido ctrico anhidro extra puro de Schardau y alcohol de 96GL Mtodos de anlisis - Anlisis proximal: humedad, protenas, lpidos, fibra cruda, cenizas4. - Contenido de minerales (Fe, Ca, Zn y P) 3. - pH3. - Acidez titulable3. - Contenido de slidos solubles3. - Capacidad antioxidante4,5. - Compuestos fenlicos totales6. - Carotenos7, expresado como mg -caroteno/100 g de muestra - Betalanas8, los resultados se expresaron como mg de betalanas/1000 ml - cido ascrbico, determinado por el mtodo de titulacin con 2,6 diclorofenol indofenol (James9) expresado como mg cido ascrbico/100 g muestra. Metodologa experimental Preparacin de las muestras: Se trabaj con frutas sanas y firmes que fueron lavadas con agua destilada; el aguaymanto entero fue licuado durante 30 segundos; la papaya de monte se cort en mitades para eliminar el muclago interno y se procedi a licuar durante 1 minuto; las tunas fueron peladas y licuadas durante 30 segundos; el tomate de rbol fue separado en cscara, pulpa y pepas; cada uno de stos fue licuado durante 1 minuto; todas las frutas fueron inmediatamente usadas para la preparacin de extractos. Preparacin de los extractos: A. Fenoles totales y capacidad antioxidante con los mtodos DPPH y ABTS: Para todas las muestras se pes 2,5 gramos de muestra y se aadi 12,5 mL de metanol; se homogeniz la muestra con un agitador magntico durante 15 minutos y se almacen el extracto durante 24 horas a 4C en oscuridad; luego, se procedi a centrifugar el homogenizado durante 20 minutos a 5000 rpm; el sobrenadante se guard para anlisis posteriores y el precipitado fue eliminado. Para los ensayos con DPPH, se tom alcuotas del extracto obtenido: para aguaymanto, tomate de rbol y tuna se tom 150 mL y para papaya de monte 50 mL. Para los ensayos de ABTS, se tom 50 mL del extracto de aguaymanto y papaya de monte y 150 mL del extracto de tuna y tomate de rbol . B. Vitamina C: Los extractos para la determinacin de vitamina C en frutas se prepar segn Luximon-Ramma10. C. Betalanas: Para obtener el extracto de tuna roja para el anlisis de betalanas, se sigui el mtodo indicado por Osborne11; primero se realiz una inactivacin enzimtica a 100C por 5 minutos; luego se pel y se cort en rodajas y se someti a una extraccin con agua acidulada (cido ctrico al 0,2%) relacin 1:2; se procedi a la

precipitacin de la goma con alcohol a 96GL (1:2), y se filtr; la solucin filtrada se guard para posteriores anlisis. D. Determinacin del estado de madurez en el contenido de compuestos bioactivos: Para tal fin, se trabaj con el aguaymanto y segn la norma tcnica Colombiana 458012, en la cual se indica una clasificacin objetiva relacionando el contenido de grados brix y la acidez en la materia prima, tal como se indica en el Anexo 1, indicndose los estados de madurez cero, uno, dos-tres, cuatro, cinco y seis y poder conocer cmo el estado de madurez influye en el contenido de los compuestos bioactivos; se trabaj con el estado de madurez dos-tres junto, dado que fue el estado de madurez utilizado para la determinacin de un estado de madurez intermedio, necesario para la elaboracin de frutas en almbar (objetivo de otra investigacin), dado que para la elaboracin de ese producto no se puede trabajar con un fruto inmaduro (estado de madurez cero y uno) ya que no tiene desarrollada las caractersticas sensoriales para ser agradable al consumidor, como tampoco se puede trabajar con un fruto sobremaduro (estado de madurez cuatro, cinco y seis) dado que estos frutos no resisten el tratamiento trmico necesario para la pasteurizacin de la conserva. Anlisis estadstico Los resultados fueron procesados por un Anlisis de Variancia (ANOVA) y la significancia estadstica por la Prueba de Tukey. Las diferencias en p < 0,05 fueron consideradas significativas. El programa empleado fue SAS System V8. RESULTADOS Y DISCUSIN Anlisis proximal y qumico En la tabla 1, se puede apreciar la caracterizacin de las frutas en cuanto a su pH y grados brix. En el cuadro se aprecia el porcentaje de slidos solubles promedio para cada uno de los frutos evaluados. Se menciona que la cantidad de slidos solubles que contiene el jugo de una fruta ctrica es tambin un ndice del grado de madurez de la misma18. La norma tcnica de Colombia12 del aguaymanto establece como un grado brix mnimo para el estado de madurez intermedia (dos y tres, Anexo 1) de entre 13,2 y 14,1; mostrando as que nuestro fruto tiene un menor contenido de slidos solubles, lo que posiblemente se deba a las diferencias entre el aguaymanto producido en Colombia y con el proveniente del valle del Mantaro. En las tablas 2, 3 y 4 se presentan los resultados de anlisis proximal, del contenido de minerales, as como el contenido de compuestos bioactivos y capacidad antioxidante, respectivamente. Todas las frutas tienen alto contenido de agua, entre 78,4 y 93,7% destacando la papaya de monte con el mayor contenido de agua y la tuna roja con el menor contenido. En cuanto al contenido de protena en frutas, el tomate de rbol y aguaymanto, tenan mayor proporcin (1,9 g/100 g).

Entre las tres variedades de tuna, la tuna verde tiene el mayor contenido de protenas (1,5 g/100 g), mientras que la tuna roja y anaranjada presentaron 0,9 g/100 g. Al respecto, se sealan que los frutos, en especial los que poseen caractersticas ctricas, tienen un bajo contenido de protena y de grasa, dentro de los cuales se puede considerar al aguaymanto13. El tomate de rbol tiene un alto contenido de fibra cruda (4,5 g/100 g). Todas estas frutas, como las frutas en general, son fuentes insignificantes de grasas, pero son fuentes importantes de carbohidratos. Los principales carbohidratos de las frutas son los azcares. Se seala que los carbohidratos en los frutos, especialmente los que poseen caractersticas ctricas, estn conformados por monosacridos (glucosa y fructosa), oligosacridos (sacarosa) y polisacridos (celulosa, almidn, hemicelulosas y pectinas) 3. El tomate de rbol y las tunas tienen alto contenido de fibra y podran ser utilizados en alimentos nutraceticos ricos en fibra. Este es un aspecto muy interesante, porque la fibra alimentaria tiene propiedades positivas para la salud: reduccin del nivel de colesterol en sangre, proteccin contra diferentes enfermedades, como los cardiovasculares y diferentes tipos de cncer, etc. En cuanto al contenido de minerales en las frutas, se puede observar que las tunas son fuentes importantes de fsforo, destacando en este aspecto la tuna verde (332 mg/100 g). Estas frutas son tambin fuentes, relativamente buenas, de calcio. Asimismo, cabe destacar el alto contenido de potasio que presentan el tomate de rbol y el aguaymanto. Las frutas nativas son fuentes importantes de nutrientes, como vitaminas (vitamina C, betacarotenos) y minerales (fsforo, potasio). El aguaymanto present un alto contenido de carotenoides (2,64 mg - caroteno/100 gramos muestra). Las tunas rojas y anaranjadas son ricas en pigmentos, que fueron identificados como betalanas. Los investigadores franceses encontraron que la cscara de tuna era rica en calcio y potasio 2,09 % y 3,4 % b.s.14. Todas las muestras presentaron diferencia significativa en el contenido de compuestos fenlicos, pero la papaya de monte es la fruta que present el mayor contenido, como se puede apreciar en la tabla 4, donde tambin se muestra la relacin que tiene el contenido de compuestos fenlicos y la capacidad antioxidante, segn la materia prima evaluada. Las frutas, aparte de ser fuentes importantes de ciertas vitaminas, contienen

otros componentes, principalmente pigmentados, como son los compuestos fenlicos, los que poseen capacidad antioxidante; son capaces de inhibir los radicales libres. El contenido de compuestos fenlicos es mayor que el contenido en frutas ctricas y meln, pero menor que en uvas y grosellas encontradas por Vinson 15. Segn estudios se hall que los tallos de tuna contenan 3,7 mg de compuestos fenlicos totales/g como cido glico16. En el caso de la papaya de monte se encontr una mayor cantidad de compuestos fenlicos (167 mg/100g) que en la papaya tropical (57,6 mg/100g) 11. El contenido de betalanas en tuna roja fue de 68,95 mg/1000 ml. Se encontr que la tuna venezolana (Opuntia boldinghii) tena 0,59 mg/100ml de betalanas18. El contenido de vitamina C en la tuna peruana fue tambin mayor que en la tuna venezolana. La papaya de monte tena menor cantidad de vitamina C que la papaya tropical (31,41 mg/100g y 92,9 mg/100g), respectivamente10. En la tabla 4 se presenta la comparacin de los contenidos de carotenoides en tomate de rbol, aguaymanto y papaya de monte. El tomate de rbol es la fruta que presenta mayor contenido de carotenos. Otros estudios presentan diferentes contenidos de carotenoides en diversas frutas y hortalizas hallados por varios autores en todo el mundo; as tenemos al camote (de 0,02 a 21,8 mg de -caroteno/100 g), mango (de 0,6 a 2,9 mg de -caroteno/100 g), meln (de 1,6 a 12,6 mg de -caroteno/100 g), mangos brasileos (157 g/g de -caroteno), papaya (de 0,4 a 10 g/g) y naranja brasilea y papaya roja fueron de 1,2 a 6,1 g/g y 2,1 a 10 g/g, respectivamente18.

Datos expresados como promedio desviacin estndar (n = 3)

a

g equivalente trolox / g de tejido mg de equivalente cido glico / 100 g muestra c mg cido ascrbico / 100 g muestra d mg -caroteno / 100 gramos muestra e mg de betalanas / 1000 ml - valor no determinado
b

La misma letra en la misma columna indica que no hay diferencia signicativa (p<0,05) Los resultados promedios de carotenoides totales (2,64 mg de -caroteno/100g, lo que equivale a 4400 UI de vitamina A) obtenidos para el aguaymanto se presentan en la tabla 4. En este caso, el aguaymanto con estado de madurez intermedia utilizado como materia prima para la elaboracin de conserva, presenta un nivel moderado de caroteno13. Sin embargo, en la mayora de las frutas y vegetales que contienen

carotenoides, la maduracin se ve acompaada por un aumento de la biosntesis de carotenoides, como por ejemplo en el damasco, mango, naranja, meln, papaya, etc.; razn por la cual el valor pudo ser algo menor19. Respecto al tomate de rbol, tuvo un valor de 4 mg -caroteno / 100 gramos muestra, el cual no slo se considera el mayor en los frutos evaluados, sino tambin, que se estara hablando de un frutal con un nivel algo ms que moderado de -caroteno; mientras que la papaya de monte se considerara como un fruto de nivel bajo en caroteno18. Determinacin de la capacidad antioxidante En la figura 1 se puede apreciar la capacidad antioxidante de las tres tunas estudiadas; la tuna roja (77,65%) tiene la mayor capacidad antioxidante en comparacin que las otras; le sigue la tuna anaranjada (41,65%) y finalmente la tuna verde con un valor de 34,20% como porcentaje de inhibicin del radical DPPH. La capacidad antioxidante est directamente relacionada con el contenido de pigmentos de la fruta. Se determin la capacidad antioxidante de tallos de tuna, utilizando el mtodo de radical DPPH, obteniendo una inhibicin casi total en 40 minutos de reaccin. En ambos ensayos (DPPH y ABTS) se encontr que la papaya de monte, present mayor capacidad antioxidante que las dems frutas16. La tuna roja fue la fruta que present menor contenido de capacidad antioxidante En las figuras 2 y 3 se muestra el porcentaje de inhibicin del radical DPPH y ABTS, respectivamente, para cada tipo de fruto evaluado; la capacidad antioxidante de un alimento depende de la naturaleza y concentracin de los antioxidantes naturales presentes en l. El tomate tiene el menor valor de capacidad antioxidante, a pesar de tener grandes cantidades de licopeno, probablemente porque el licopeno y los carotenoides, en general, son eficientes en la extincin (quenching) de singletes de oxgeno, y no tanto en el atrapamiento de radicales peroxlicos19.

La capacidad antioxidante de un alimento se debe a la actividad antioxidante de sus diferentes compuestos, entre los cuales estn los compuestos fenlicos, carotenos, antocianinas, cido ascrbico, etc. Por lo tanto, se puede decir, a partir de estas tablas, que existen compuestos fenlicos, carotenos y cido ascrbico presentes en el aguaymanto, los que tendran algn potencial antioxidante, el cual tiene un efecto sinrgico entre los compuestos bioactivos que conforman el fruto. Se seala que los compuestos lipoflicos (carotenoides) son mejores queladores que reductores, es decir, los mtodos de cuantificacin de capacidad antioxidante lipoflica, tanto por ABTS como por DPPH, no cuantificara verdaderamente dicho valor, adems del efecto sinrgico que existira entre los compuestos lipoflicos e hidroflicos presentes en el aguaymanto, tomate de rbol, papaya de monte y tuna 19. Las frutas evaluadas que presentaron una alta capacidad antioxidante con el mtodo de ABTS tambin lo presentaron con el mtodo de DPPH, excepto el tomate de rbol. Este mecanismo similar que presentaron (figura 4) muestra una buena correlacin entre estos dos ensayos con un coeficiente de correlacin = 0,9765, indicando que ambos mtodos son practicables para la determinacin de la capacidad antioxidante de las materias primas evaluadas. La mencionada correlacin en el ploto de los valores antes indicados y mientras el R2 sea ms cercano a 1, mejor ser su correspondencia.

La tabla 5 muestra los coeficientes de correlacin del DPPH y ABTS con relacin a los compuestos bioactivos de las frutas estudiadas. El contenido de carotenos, correlacion negativamente con la capacidad antioxidante indicando que a mayor contenido de carotenos la capacidad antioxidante disminuye.

Determinacin del efecto del estado de madurez en los compuestos bioactivos del aguaymanto El aguaymanto fue clasificado en funcin a su madurez en 6 estados segn lo recomendado por la norma tcnica Colombiana12, la cual se presenta en el Anexo 1. En la tabla 6 se presentan los resultados de compuestos bioactivos en las frutas de aguaymanto en diferentes estados de madurez. Segn la tabla 6 se ve claramente que mientras el aguaymanto aumenta en madurez, sus compuestos bioactivos (contenido de cido ascrbico, compuestos fenlicos y carotenos totales) aumentan, obtenindose de esta forma una mayor capacidad antioxidante.

Se debe mencionar que la evaluacin de la capacidad antioxidante mediante el mtodo del DPPH se realiz utilizando como solvente al metanol; es decir, se cuantific la capacidad antioxidante de compuestos hidrfilos presentes en el aguaymanto (cido ascrbico y compuestos fenlicos), mientras que para la evaluacin mediante el mtodo del ABTS se evalu utilizando como solvente al metanol inicialmente y luego una mezcla de isopropanol/hexano, es decir se cuantific la capacidad antioxidante de compuestos hidrfilos (cido ascrbico y compuestos fenlicos) y compuestos lipfilos (carotenoides) de la fruta antes mencionada, razn por la cual en el segundo caso se obtuvo una mayor capacidad antioxidante, dado que la capacidad antioxidante total de un fruto es la sumatoria de su capacidad antioxidante en la fase hidroflica y fase lipoflica. Se seala que la capacidad antioxidante de un alimento se debe a la actividad antioxidante de sus diferentes compuestos bioactivos, entre los cuales tenemos a los compuestos fenlicos, carotenos, antocianinas, cido ascrbico, etc21,22. Por lo tanto, se puede decir que son los compuestos fenlicos, carotenos y cido ascrbico presentes en el aguaymanto, los que aportan su potencial antioxidante, existiendo a su vez un efecto sinrgico entre los compuestos bioactivos que conforman el fruto 22. Adicionalmente, como se muestra en la figura 5 (Anexo 1), al aumentar el contenido de carotenos, que se observa con el aumento del color amarillo, aumenta la capacidad antioxidante del fruto. Se menciona que la madurez influye directamente en el contenido de compuestos bioactivos, dado que se generan durante la madurez procesos de biosntesis los que generan mayor contenido de carotenoides, compuestos fenlicos, cido ascrbico, etc.; compuestos bioactivos que al encontrarse en mayor cantidad en el fruto conllevan a dar una mayor capacidad antioxidante al fruto; as tenemos que en la misma investigacin se obtiene como conclusin que la actividad antioxidante se incrementa con la maduracin del fruto, encontrando un aumento en el contenido de fenoles totales, acido ascrbico, licopeno y - caroteno en frutal de pimienta22.

CONCLUSIONES - El tomate de rbol (4,5 g fibra/100 g fruta) tuvo el mayor contenido de fibra cruda, seguida por la variedad de tuna anaranjada (3,9 g fibra/100 g fruta); tuna verde (3,7 g fibra/100 g fruta); aguaymanto (3,6 g fibra/100 g fruta); tuna roja (3,5 g fibra/100 g fruta) y papaya de monte (0,6 g fibra/100 g fruta). - La mayor capacidad antioxidante medida por el mtodo del DPPH fue el de la papaya de monte (1936228 mg equivalente trolox/g de tejido); seguido por el tomate de rbol (85352 g equivalente trolox/g de tejido); el aguaymanto (72998 g equivalente trolox/g de tejido) y finalmente la tuna roja (48235 g equivalente trolox/g de tejido). - La mayor capacidad antioxidante medida por el mtodo del ABTS fue el de la papaya de monte (214171 g equivalente trolox/g de tejido); seguido por el aguaymanto (106628 g equivalente trolox/ g de tejido); el tomate de rbol (83835 g equivalente trolox/g de tejido); y finalmente la tuna roja (65140 g equivalente trolox/g de tejido). - El mayor contenido de compuestos fenlicos fue el encontrado en la papaya de monte (1670,3 mg de equivalente cido glico/100 g muestra); el aguaymanto (1543 mg de equivalente cido glico/100 g muestra); el tomate de rbol (1300,8 mg de equivalente cido glico/100 g muestra) y finalmente la tuna roja (525 mg de equivalente cido glico/100 g muestra). - El mayor contenido de cido ascrbico lo tuvo el aguaymanto (43,30,5 mg cido ascrbico/100 g muestra); seguido por la papaya de monte (31,411,3 mg cido ascrbico/100 g muestra); la tuna roja (22,750,6 mg cido ascrbico/100 g muestra) y finalmente el tomate de rbol (16,091,6 mg cido ascrbico/100 g muestra). - El mayor contenido de carotenos fue en el tomate de rbol (4,000,01 mg bcaroteno/100 g muestra), seguido por el aguaymanto (2,640,03 mg b-caroteno/100

g muestra) y finalmente la papaya de monte (0,720,02 mg b-caroteno/100 g muestra). - La tuna roja tuvo un contenido de 68,950,6 mg de betalanas/1000 ml de fruta. - El estado de madurez en el aguaymanto influye en forma directamente proporcional con su contenido de compuestos bioactivos, lo que a su vez repercute en que la capacidad antioxidante sea mayor en el fruto mientras va madurando. - El mayor contenido de compuestos bioactivos en el aguaymanto fue para un estado de madurez seis con un 51,65 mg cido ascrbico/100 g muestra; 2,34 mg de caroteno/100g muestra; una capacidad antioxidante en el extracto hidroflico medido por el DPPH de 489,05 mg equivalente trolox/g de tejido y una capacidad antioxidante en el extracto hidroflico medido por el ABTS de 520,72 mg equivalente trolox/g de tejido y de 590,84 mg equivalente trolox/g de tejido en el extracto lipoflico.

LA LINAZA COMO FUENTE DE COMPUESTOS BIOACTIVOS PARA LA ELABORACIN DE ALIMENTOS

Flaxseed as a source of bioactive compounds for food processing

Fernando Figuerola 1, Ociel Muoz

1

y Ana Mara Estvez

Instituto de Ciencia y Tecnologa de Alimentos, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile. ffiguero@uach.cl. 2 Departamento de Agroindustria y Enologa, Facultad de Ciencias Agronmicas Universidad de Chile.

Abstract Flaxseed is the seed from flax (Linum usitatissimum L.) and has traditionally been used as an oilseed. Over the last few decades, interest has grown in this product, due to the recognized potential benefits that some of its components offer to maintain health and prevent some non-transmissible chronic diseases. The compounds with biological activity include alfa-linolenic acid, lignans, and dietary fiber. To better utilize those components, the seed needs to be ground, which increases their bioavailability. Seed processing, either via fractioning into the main anatomical components or by obtaining a meal or gum, is very complex with some difficulties still remaining. Studies have shown that rheological properties of the gum permit its use to add texture to some foods, and that the meal may be used in bakery products, pasta, and dairy products, while maintaining the concentration of its bioactive compounds. Resumen La linaza corresponde a la semilla del lino (Linum usitatissimum L.) y se ha utilizado tradicionalmente como oleaginosa. En las ltimas dcadas ha surgido un gran inters

por ella debido al reconocimiento de que algunos de sus componentes ofrecen potenciales beneficios para a la mantencin de la salud y la prevencin de algunas enfermedades crnicas no transmisibles. Entre estos compuestos con actividad biolgica destacan, el cido alfa linolnico, los lignanos y la fibra diettica. Para el mejor aprovechamiento de dichos componentes la semilla debe molerse, de manera de aumentar su bio-disponibilidad. El procesamiento de la semilla, tanto para fraccionarla en sus componentes anatmicos principales, como para la obtencin de harina o goma, es complejo y hasta el momento no estn resueltas todas las dificultades que conlleva. Se han realizado algunos estudios que indican que la goma, por sus propiedades reolgicas, se puede utilizar en diversos alimentos para proporcionar textura y que la harina se puede introducir en la elaboracin de productos de repostera, pastas y de productos lcteos, los cuales mantienen la concentracin de los compuestos bioactivos provenientes de la linaza.

Antecedentes generales
Las enfermedades cardiovasculares, cncer, y diabetes son las principales causas de muerte en muchos pases. Los consumidores estn, cada da ms, interesados en consumir una dieta saludable, que pueda reducir el riesgo de estas enfermedades crnicas y ayudar a manejar los sntomas de la menopausia. El efecto de los factores dietticos en la promocin de la salud y en la prevencin de enfermedades es un tema de gran inters en la investigacin actual. Hoy da, hay un gran inters en los componentes funcionales de los ingredientes alimenticios, debido principalmente a que diversos estudios han demostrado que las especies reactivas de oxgeno, en especial los radicales libres, son parte de la etiologa de las enfermedades degenerativas (Rajesha et al., 2006). Los alimentos funcionales son alimentos que se asemejan a los tradicionales, pero que se diferencian de ellos en que ofrecen beneficios ms all de su valor nutricional y energtico, en la promocin y prevencin de algunas enfermedades crnicas como enfermedades cardiovasculares, cncer, desrdenes del sistema autoinmune, diabetes,artritis y arritmia (Shahidi, 2002). ltimamente, se ha puesto mucha atencin a la linaza como alimento funcional, debido a su exclusivo perfil de nutrimentos y a su potencialidad para afectar el riesgo y desarrollo de enfermedades cardiovasculares y algunos cnceres, especialmente los dependientes de hormonas como el de pecho y prstata (Morris y Vaisey-Genserb, 2003; Ramcharitar et al., 2005).

La Linaza
La linaza se ha reconocido desde tiempos prehistricos, en Asia, norte de frica, y Europa como una fuente de alimentos y su cultivo, destinado a la obtencin de alimentos y fibra, es muy antiguo. Actualmente se le cultiva en alrededor de 50 pases, la mayora de los cuales estn en el hemisferio norte. Canad es el principal productor, seguido por China, Estados Unidos e India. La produccin en Chile es muy pequea y la mayora de lo que se consume, ya sea como suplemento diettico o como ingrediente para repostera, se importa desde Canad. Histricamente, la produccin de linaza se orient hacia la produccin de aceite de uso industrial; sin embargo, actualmente hay un nuevo inters por consumir la semilla molida debido a su potencial

beneficio para la salud. Aunque hay importante evidencia que respalda el consumo de linaza, mucha gente an desconoce las ventajas de su consumo y sus posibles aplicaciones en alimentos (Daun et al., 2003; Morris y Vaisey-Genserb, 2003; Oomah, 2003; Wanasundara y Shahidi, 2003; Hall et al., 2006). La linaza o semilla del lino (Linum usitatissimum L.) es rica en compuestos que se cree que proporcionan beneficios a la salud humana (cido - linolnico, lignanos y polisacridos diferentes al almidn) y que se han propuesto que, a travs de su efecto anti hipercolesterolmico, anti-carcinognico, y controlador del metabolismo de la glucosa, pueden prevenir o reducir el riesgo de varias enfermedades importantes que incluyen la diabetes, el lupus, la nefritis, la ateroesclerosis y los cncer dependientes de hormonas. Adems, se ha sealado que el consumo de linaza aumenta la produccin de lignanos en los mamferos. Estos efectos, junto con su alto contenido de protenas, hacen de la linaza un ingrediente alimentario muy atractivo y uno de los alimentos funcionales ms importantes del siglo XXI (Babu y Wiesenfeld, 2003; Oomah, 2003; Thompson, 2003a; Shearer y Davies, 2005).

Caractersticas de la semilla de linaza

La semilla de linaza es de 4 a 6 mm de longitud, aplanada, de forma oval y con un extremo aguzado. La cubierta de la semilla es de apariencia suave y brillante, y su color puede variar entre marrn oscuro y amarillo claro. El peso de 1000 semillas es de 5 1 g y su peso del hectolitro flucta entre 55 y 70 kg (Daun et al., 2003; Oomah, 2003). La semilla tiene dos cotiledones aplanados, que constituyen la mayor proporcin del embrin; este ltimo est rodeado por las cubiertas de la semilla y por una delgada capa de endosperma. La testa tiene una capa exterior que contiene la mayora de la fibra soluble y dos interiores ricas en fibra y lignanos. Desde un punto de vista estructural, la testa, endosperma y cotiledones representan el 22, 21 y 57 %, respectivamente (Daun et al., 2003; Oomah, 2003; Wiesenborn et al., 2003). Existen variedades de semillas de color amarillo o doradas y de color marrn; a pesar de la creencia de que el color externo de la semilla es un indicador de la composicin qumica de la linaza, no se han encontrado variaciones que sustenten que haya una diferencia entre ellas ms all de las causadas por la condiciones de cultivo (Daun et al., 2003; Morris y Vaisey-Genserb, 2003). Composicin qumica de la linaza La linaza tiene alrededor de 40% de lpidos, 30% de fibra diettica y 20 % de protena. La composicin proximal vara considerablemente entre las variedades y de acuerdo a las condiciones ambientales en las que haya crecido la planta. En los cotiledones se encuentra el 87% de los lpidos y el 76% de la protena de la semilla, en tanto que en el endosperma est slo el 17% de los lpidos y el 16% de la protena (Babu y Wiesenfeld, 2003; Daun et al., 2003; Oohma, 2003). La linaza es una semilla oleaginosa, fuente importante de cidos grasos omega 3, especialmente linolnico (ALA) que puede constituir hasta el 52% del total de cidos grasos; de compuestos fenlicos conocidos como lignanos; de una goma coloidal y de protena de buena calidad. Estos compuestos, aunque estn ubicados en diferentes partes de la semilla, interactan entre si durante la extraccin y el procesamiento, lo

que plantea grandes desafos para su utilizacin (Oomah, 2001; Oomah, 2003; Hall et al., 2006). Protenas El contenido de protenas de la mayora de los cultivares de linaza flucta entre 22,5 y 31,6 g/100 g. Las condiciones de procesamiento (descascarado o desgrasado) afectan el contenido de protenas del producto derivado de la linaza. La cscara tiene menores contenidos de protena, por lo que, la harina sin cscara y desgrasada tiene un alto contenido proteico. Como en muchas otras semillas, el contenido de globulinas es mayoritario, llegando al 77% de la protena presente, en tanto que el contenido de albminas representa al 27% de la protena total. La protena de linaza es relativamente rica en arginina, cido asprtico y cido glutmico; los aminocidos limitantes son lisina, metionina y cisteina (Daun et al., 2003; Hall et al., 2006). Lpidos El aceite, que constituye el componente principal de la linaza (35 a 43 g/100g base materia seca) ha sido por aos el objetivo principal del procesamiento de esta semilla. La torta remanente de la extraccin de aceite (55%), todava se considera en algunas partes como un subproducto de bajo valor (Daun et al., 2003; Oomah, 2003). Los cotiledones son el principal tejido de almacenamiento de aceite, el que est constituido principalmente (98%) por triacilgliceroles y se encuentra en glbulos de aceite de 1,3 m de dimetro. Tambin en la fraccin lipdica se encuentra un 0,9 % de fosfolpidos y un 0,1% de cidos grasos libres. Aunque la cscara es relativamente pobre en lpidos (22%), su aceite es rico en cido palmtico. En los cotiledones predomina los cidos linolnico, linoleico y oleico (Hall et al., 2006). Hidratos de Carbono La linaza contiene muy pequeas cantidades de azcares solubles (1 a 2 g/100g). La mayora de los hidratos de carbono presentes en esta especie, pertenecen al grupo de la fibra diettica. Se destaca entre otros granos por ser una excelente fuente de fibra diettica soluble e insoluble, la que en total puede llegar hasta 28% del peso seco de la semilla. La relacin entre fibra soluble e insoluble flucta entre 20:80 y 40:60. En la fraccin soluble, se encuentra un hidrocoloide conocido como muclago (8% del peso de la semilla). Existe muy poca informacin de la variacin del contenido de fibra diettica entre variedades y segn las condiciones de cultivo (Daun et al., 2003). Otros compuestos Entre los minerales, destaca el contenido de potasio, fsforo, hierro, zinc y manganeso. La semilla contiene adems, vitaminas del grupo B. Como muchas semillas oleaginosas, contiene tocoferoles y tocotrienoles, estando muy relacionado su contenido con la presencia de cido linolnico. Tambin la mayora de las variedades de linaza contienen esteroles como estigmasterol, campesterol y avenasterol; y, carotenoides como lutena, -caroteno y violaxantina (Hall et al., 2006). Por otra parte, la linaza tiene entre 0,8 y 1,3 g/ 100g de cidos fenlicos, de los cuales aproximadamente 0,5 g/100g estn en forma esterificada, y de 0,3 a 0,5 g/100g estn en la forma eterificada, habiendo variaciones importantes entre variedades y por las condiciones ambientales. Los cidos fenlicos ms abundantes en la harina de semilla

descascarada son el trans-ferlico (46%), trans-sinpico (36%), p-cumrico (7,5%) y transcafico (6,5%). La goma de linaza tambin puede tener cantidades considerables de cidos fenlicos (Daun et al., 2003; Hall et al., 2006). Una de las caractersticas ms interesantes de la linaza es su contenido de fenoles complejos como es el caso de los lignanos. El lignano de mayor inters es el secoisolaciresinol (SDG), aunque tambin estn presentes isolariciresinol, pinoresinol y mataresinol y otros derivados del cido ferlico (Daun et al., 2003). Compuestos Antinutricionales La linaza contiene algunos compuestos antinutricionales como es el caso de muchas otras plantas; el cido ftico y los glucsidos cianogenticos son los principales, aunque en la literatura no se han informado efectos adversos provocados por el consumo de linaza (Hall et al., 2006). El cido ftico, un poderoso agente quelante de cationes y acomplejador de protenas y almidn, est en cantidades que varan entre 0,8 y 1,5 g/100g del peso seco de la semilla dependiendo de cada variedad y las condiciones de crecimiento de la planta; estos valores son semejantes a los encontrados en man y en frjol soya, pero bastante inferiores a los de otras oleaginosas (2 a 5,2 g/ 100g). El cido ftico, que representa entre el 60 y el 90% del fsforo presente en la semilla, constituye la principal forma de almacenamiento de este elemento y se estima que juega un papel preponderante en la viabilidad y vigor de la semilla. Se han informado efectos negativos como la reduccin de la absorcin de calcio, zinc, y hierro y de la digestibilidad de las protenas; y positivos, como la disminucin de la respuesta glicmica por el consumo de almidn y de la incidencia de cncer de colon en ratas (Daun et al., 2003). Los glucsidos cianogenticos tienen la capacidad de liberar cianuro por hidrlisis acida o enzimtica. En la semilla de linaza los principales glucsidos presentes son linustatina y neolinustatina, y pequeas cantidades de linamarina y lotasutralina, estando localizados principalmente en los cotiledones. Como en casi todas las plantas, el contenido en la linaza vara con la variedad, condiciones ambientales y la edad de la semilla, reducindose el contenido desde 5,0 g/100g en las semilla inmaduras a 0,1 g/100g en las maduras. La hidrlisis ocurre cuando la semilla se daa, debido a que durante la ruptura celular se liberan enzimas que actan sobre los sustratos cianogenticos. El efecto metablico que tiene el consumo de glucsidos cianogenticos en los seres humanos depende de la cantidad consumida, la frecuencia de consumo, el estado nutricional y de salud de la persona y de la presencia de otros componentes en la dieta que puedan interactuar con ellos. Algunos tratamientos, como el tostado en microondas y la ebullicin en agua reducen la aparicin de cianuro en un 83 y 100%, respectivamente. Es importante destacar que el uso de la linaza habitualmente es como un ingrediente menor en panes, queques o cereales para desayuno, por lo que los glucsidos cianogenticos no representan un problema para el consumo, especialmente porque luego del horneado no se ha detectado presencia de cianuro en ellos (Daun et al., 2003; Hall et al., 2006). En la linaza, existen muy pequeas cantidades de inhibidores de tripsina y no se ha detectado inhibidores de amilasas o hemaglutininas (Daun et al., 2003).

Compuestos bio-activos de la linaza y beneficios de su consumo

La semilla de linaza contiene diversos compuestos que pueden ofrecer beneficios para la salud tales como reduccin del riesgo de desarrollo de enfermedades cardiovasculares, mitigacin de los efectos de la diabetes, patologas renales, obesidad, cncer de colon y recto, reduccin del nivel de colesterol srico y promocin de la evacuacin intestinal. Entre ellos, es importante destacar a la fibra diettica, los lignanos, el aceite y las protenas (Payne, 2000; Ogborn, 2003; Oomah, 2003; Stavro et al., 2003; Hall et al., 2006). La localizacin dentro de la semilla, su complejidad y las posibles interacciones de los diversos componentes que poseen actividad biolgica son un gran desafo para el procesamiento de este ingrediente alimentario (Oomah, 2003). cido alfa linolnico (ALA) La linaza es una de las principales fuentes de cido alfa linolnico, un cido graso omega 3 ubicado principalmente en los cotiledones de la semilla, que ha demostrado reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares; por esta razn, la linaza es una valiosa fuente de lpidos para mejorar la relacin entre cidos grasos n-6 y n-3. Sin embargo, la opinin de los expertos respecto del valor del consumo de ALA est dividida, dado que la conversin de ALA en cido eicosapentaenoico (EPA) y en cido docosahexaenoico (DHA) en los seres humanos es baja (0,2 a 6%)(Cunnane, 2003; Daun et al., 2003; Stavro et al., 2003 Hall et al., 2006). Fibra diettica La fibra diettica est constituda por diferentes polisacridos que incluyen a la celulosa, hemicelulosas, pectinas, -glucanos y gomas. Su consumo juega un importante papel en la salud humana y las dietas ricas en ella se han asociado a la prevencin, reduccin y tratamiento de algunas enfermedades como divertivulosis, cncer de colon y enfermedades coronarias. Los efectos fisiolgicos de la fibra diettica se relacionan con sus propiedades fisicoqumicas y tecnolgicas, como capacidad de retencin de agua, capacidad de hinchamiento, viscosidad, formacin de gel, capacidad de ligazn de sales biliares, las que son mas tiles en la comprensin del efecto de la fibra diettica que la composicin qumica por si sola. Estas propiedades dependen de su relacin fibra insoluble / fibra soluble, tamao de partcula, condiciones de extraccin y fuente vegetal de origen (Gallaher y Schneeman, 2001; Figuerola et al., 2005). La linaza tiene, en las capas externas de la semilla, una gran cantidad de fibra diettica (28% de su peso), con una relacin de 75% de fibra insoluble y 25 % de fibra soluble o muclago. La alta viscosidad de esta fibra promueve la evacuacin, reduce el riesgo de cncer de colon y recto, ayuda a reducir el colesterol srico y la obesidad y puede afectar la secrecin de insulina y el mecanismo de mantencin de la glucosa en el plasma (Payne, 2000; Babu and Wiesenfeld, 2003; Oomah, 2003; Stavro et al, 2003; Goh et al., 2006; Hall et al., 2006). Los beneficios de la fibra diettica estn bien documentados y en los ltimos aos los consumidores estn ms conscientes del importante papel que ella desempea en la dieta de los seres humanos. Dados los beneficios que tiene la fibra diettica soluble y el potencial uso del muclago de la linaza como goma alimenticia, esta porcin ha recibido ms atencin que la fibra insoluble de la linaza (Daun et al., 2003). El muclago est compuesto por dos polisacridos, uno neutro (aproximadamente 75%) y otro cido. El polmero neutro

esta formado por una cadena central de -D-xilosa unidas con enlaces 1-4, que tiene cadenas laterales de arabinosa y galactosa en posicin 2 y 3. El polmero cido est formado por una cadena principal de residuos de (1>2)--L ramnopiranosil y de cido (1>4)- D-galactopiranosilurnico, con cadenas laterales de fucosa y galactosa. El componente principal del polmero neutro es la xilosa (62,8%) y el del polmero cido es la ramnosa (54,5%), por lo que la relacin ramnosa/xilosa se usa frecuentemente para estimar la relacin entre polisacridos cidos/neutros. Esta relacin flucta entre 0,3 y 2,2. Los estudios realizados acerca de la composicin del muclago de linaza indican que la composicin de monosacridos del muclago vara significativamente entre diferentes cultivares de linaza. Los cultivares con mayor contenido de polisacridos neutros muestran mayor viscosidad aparente y formacin de geles ms firmes. Pero, el muclago de la linaza es un hidrocoloide complejo polidisperso y los diferentes comportamientos reolgicos observados en los cultivares est causado tanto por las diferencias en la proporcin entre polmeros neutros y cidos como por el peso molecular y la conformacin estructural de los polisacridos (Daun et al., 2003; Goh et al., 2006; Hall et al., 2006). Lignanos Los lignanos de las plantas son compuestos fenlicos con un esqueleto de 2,3dibencilbutano (Thompson, 2003a). La linaza es la fuente alimenticia ms rica en los precursores de lignanos, diglucsido de secoisolariciresinol (SDG) y materesinol, los cuales son fitoestrgenos que por accin del cido gstrico y de la glucosidasa bacteriana (de aerbicos facultativos del gneroClostridia) del tracto digestivo, se transforman en enterolactona y enterodiol, respectivamente, conocidos como lignanos de los mamferos. Estos ltimos poseen mayor capacidad antioxidante que sus precursores. Tambin se encuentran presentes en la linaza otros lignanos, como el lariciresinol, hinoquinina, arctigenina, cido divainillin tetrahidrofurano nordihidroguayartico, isolariciresinol y pinoresinol, pero el ms abundante es el SDG en cantidades entre 1410 y 2590 mg/100g de semilla seca. El contenido de lignanos en la linaza est muy influenciado por factores genticos y en menos grado por las condiciones ambientales (Meagher et al., 1999; Metzler, 2003; Thompson, 2003b; Zimmerman et al., 2006; Hu et al., 2007). Los beneficios para la salud de los lignanos de la linaza residen en su capacidad antioxidante como secuestradores de radicales hidroxilos, y como compuestos estrognicos y anti-estrognicos por su similitud estructural con el 17--estradiol. La actividad antioxidante del lignano de la linaza (SDG) est relacionada con la supresin de las condiciones oxidantes de las especies reactivas de oxgeno. El diglucsido de secoisolariciresinol y su aglucona secoisolariciresinol muestran una muy alta capacidad antioxidante y efectos protectores del dao al ADN y a los liposomas especialmente en las clulas epiteliales del colon expuestas a estos compuestos, durante el metabolismo de las bacterias del colon que los transforman en lignanos de mamferos (Rajesha et al., 2006; Hu et al., 2007). De este modo, la incorporacin de linaza en alimentos y en dietas para animales tiene grandes ventajas, ya que ayuda en la inhibicin de enfermedades y en la promocin de la salud. Debido a que estas sustancias han mostrado tener efectos anti-cncer, se sugiere que el consumo de linaza reducira el riesgo de desarrollar cncer de pecho y de prstata y su accin antioxidante reducira el riesgo de las enfermedades coronarias (Metzler, 2003; Stavro et al., 2003; Thompson, 2003b; Hall et al., 2006; Hyvrinen et al., 2006a; Rajesha et al., 2006). Sin embargo, todava no se establece completamente la cantidad y frecuencia de consumo de linaza que asegure los beneficios sealados. Esto se debe en parte, a que

no hay informacin completa respecto de la bio-disponibilidad de los lignanos, incluyendo su absorcin, distribucin, metabolismo y excrecin debido a las dificultades existentes en los anlisis de lignanos en las semillas, en los fluidos y tejidos corporales (Thompson, 2003a). Dado el gran nmero de investigaciones realizadas respecto de los beneficios para la salud en conjunto con la seguridad del consumo de linaza, se puede decir que esta semilla puede ser un ingrediente alimentario efectivo en el mejoramiento del estado de salud de las personas. La recomendacin ms frecuente es de 1 a 3 cucharadas por da de grano molido, teniendo en cuenta que una cucharada (aproximadamente 8 g) entrega 3,3 g de lpidos; 1,8 g de ALA; 1,6 g de protena; y 2,2 g de fibra diettica total. Sin embargo, sera deseable que la recomendacin de cantidades diarias de consumo la hiciera un organismo autorizado (Morris y Vaisey-Genserb, 2003; Hall et al., 2006).

Procesamiento de la linaza
Hasta hace poco tiempo, los nicos ingredientes derivados de la linaza disponibles para la industria de alimentos eran el aceite de linaza, y la semilla entera o molida, principalmente porque la estructura fsica de la semilla hace difcil la separacin de las fracciones y los componentes qumicos, por lo cual es necesario contar con operaciones que mejoren sus propiedades tecnolgicas y nutricionales (Daun et al., 2003). Para la elaboracin de nuevos productos derivados de linaza es muy importante la seleccin adecuada de la variedad, ya que se requiere contar con una alta estabilidad oxidativa (Oomah, 2003). Molienda Se recomienda que la semilla de linaza se consuma molida ya en este estado, la digestibilidad y biodisponibilidad de sus componentes son mayores. No existen estudios clnicos acerca de la digestibilidad ni de la contribucin nutricional de la semilla entera de linaza a la dieta. En general, se acepta que las semillas enteras tienden a pasar por el tracto gastrointestinal sin ser digeridas debido a que la cubierta de la semilla es resistente a la accin de las enzimas digestivas. La masticacin destruye en un cierto grado la cubierta de la semilla y expone los nutrientes del interior a la accin digestiva; sin embargo, es difcil evaluar el grado de masticacin necesario para una buena digestin. Aunque por lo anterior, se recomienda el consumo habitual de linaza molida, la semilla entera proporciona una textura crocante a productos de repostera, cereales de desayuno, barras de cereales y ensaladas (Morris y Vaisey-Genserb, 2003). La molienda de semilla de linaza conlleva dificultades, especialmente si se utilizan molinos de rodillo, debido al alto contenido de aceite del grano lo que causa adherencia del material en la superficie del rodillo. Se ha utilizado con xito, a nivel experimental, para producir harina integral, molinos cortadores centrfugos y molinos de martillos (Wiesenborn et al., 2003). Descascarado La cscara y los cotiledones de la semilla se pueden utilizar en forma separada como ingredientes funcionales para el desarrollo de alimentos. Se han intentado diversos procesos comerciales para la separacin de la cscara y los cotiledones, con

rendimientos de alrededor de 40 % de cada fraccin, con un 20% de material no separado (Daun et al., 2003), sin embargo todava ninguno de ellos se aplica a nivel industrial. Uno de los procesos ms exitosos se basa en el descascarado abrasivo de la semilla que permite obtener una fraccin rica en cscara. El equipo de abrasin consiste en molinos de piedra semejantes a los equipos de pulido de arroz. Para mejorar el rendimiento del descascarado es necesario acondicionar el grano mediante un secado previo de la semilla hasta 2,7% de humedad, ya sea en horno caliente (52 C por 72 horas), por microondas o en lecho fluidizado, lo que produce mejores rendimientos de proceso. Las fracciones de cscara pueden usarse como una muy buena fuente de secoisolariciresinol (SDG), ya que adems de ser ricas en fibra diettica, son ricas en lignanos y medianas en protenas y lpidos (Oomah et al., 1996; Oomah y Mazza, 1997; Oomah and Mazza, 1998; Madhusudhan et al., 2000; Wiesenborn et al., 2003; Hall et al., 2006). Los cotiledones que se obtienen se pueden usar para la extraccin de aceite. Esta fraccin tiene una mucho menor capacidad de absorcin de agua y viscosidad que la harina integral de linaza (Wiesenborn et al., 2003; Hall et al., 2006). Extraccin de la goma Las investigaciones ms recientes sobre goma de linaza, se refieren a las condiciones de extraccin y su efecto en la composicin y propiedades reolgicas de la suspensin, as como al efecto de la variedad sobre sus propiedades. La fibra insoluble est constituida por lo polmeros estructurales de la pared celular (Daun et al., 2003; Hall et al., 2006). El muclago de linaza es un material semejante a una goma, est asociado a la cscara del grano y est constituido por polisacridos cidos y neutros. Las condiciones ptimas para la extraccin de la goma son: agua entre 85 y 90 C a pH 6,5 a 7,0 y con una relacin agua: semilla de 13:1. La suspensin se liofiliza o se seca por atomizacin, obtenindose rendimientos de 13 a 14 %. La goma de linaza tiene buena capacidad espumante, estabilidad, resistencia a la presencia de sales y viscosidad estable en un amplio rango de pH (Hall et al., 2006) Propiedades tecnolgicas El uso potencial de ingredientes provenientes de plantas depende de la versatilidad de sus propiedades tecnolgicas que se definen como cualquier propiedad de un ingrediente que tenga impacto en su utilizacin. Estn influenciadas, tanto por diversos factores intrnsecos tales como la composicin del alimento o matriz del cual se extraen, como por factores ambientales como la composicin del alimento en que se incorporan. Estas propiedades afectan las condiciones de proceso, la aplicabilidad del ingrediente, el uso en la formulacin o diseo de alimentos y la calidad y aceptabilidad del alimento elaborado (Martnez-Flores et al., 2006). En los ltimos aos ha habido un creciente inters por conocer las propiedades tecnolgicas de las harinas de plantas las que estn determinadas por las caractersticas fsicas y qumicas y la interaccin entre componentes (protenas, hidratos de carbono, pectinas, gomas). Estas propiedades son uno de los criterios principales utilizados para decidir el uso, utilidad y aceptabilidad de las harinas en los sistemas alimenticios. Las propiedades de hidratacin, dispersabilidad, densidad aparente, absorcin de agua y aceite, capacidad de ligazn, hinchamiento, emulsificacin, formacin de espuma, gelificacin y viscosidad afectan directamente las

caractersticas finales del sistema alimenticio. El desempeo exitoso de una harina vegetal depende de sus caractersticas tecnolgicas y de la calidad sensorial que ella imparte al producto final (Kaur y Singh, 2005; Kaur et al., 2007). La semilla de linaza tiene potencial para ser usada para la extraccin de goma y para la produccin de harina rica en protenas y fibra. Las propiedades tecnolgicas de la goma de linaza se relacionan con su alta capacidad espesante, espumante, de hinchamiento, de ligazn y emulsificante. Estas capacidades estn afectadas por el tamao y orientacin molecular, la asociacin entre molculas, el tamao de partcula, la concentracin y el grado de dispersin. La goma tiene propiedades que se asemejan mucho a las de la goma arbica y adems presenta la capacidad de formar geles dbiles termo-reversibles de establecimiento en fro a pH entre 6,0 y 9,0, por lo cual puede mostrar algunas propiedades de flujo al someterla a suficiente presin. La mxima estabilidad de la espuma se logra con concentraciones de 1%. La pureza de la goma afecta la viscosidad de la suspensin en forma significativa. Las gomas con mayor viscosidad intrnseca muestran mayor potencial para la estabilizacin de emulsiones aceite en agua. Se ha encontrado una alta variabilidad gentica, as como tambin un marcado efecto de las condiciones ambientales y de cultivo en la propiedades reolgicas de la goma de linaza (Daun et al., 2003; Chen et al., 2006; Hall et al., 2006). La harina de linaza tiene agradables caractersticas sensoriales como sabor a nuez, color dorado, buena textura que la hacen atractiva como ingrediente de diversos alimentos. Durante la elaboracin de la harina se generan compuestos voltiles y se liberan algunos compuestos fenlicos que le dan un suave amargor. Sin embargo, no existe informacin disponible de sus propiedades tecnolgicas y su comportamiento en un sistema alimenticio complejo (Hall et al., 2006; Goh et al., 2006; Hyvrinen et al., 2006a)

Uso de la linaza en la elaboracin de productos

La semilla de linaza entera se puede tostar, extruir, dilatar o laminar para mejorar su aplicabilidad en diversos alimentos. El tostado a altas temperaturas, cercanas a 180 C cambia las propiedades organolpticas de la semilla; se desarrollan nuevos aromas y sabores, disminuye su brillo, se oscurece su color ya que aumenta la participacin del rojo y disminuye la del amarillo. El tostado, adems, puede ayudar a la remocin de algunos compuestos antinu-tricionales. Sin embargo el contenido de perxidos, propanal y hexanal aumenta durante el almacenamiento en mayor grado en las semillas tostadas que en las semillas naturales (Hall et al., 2006; Martnez-Flores et al., 2006; Oomah, 2006). La harina de linaza se puede usar en diversos tipos de alimentos, como productos de repostera, cereales de desayuno, snack, barras nutritivas, bebidas nutricionales, helados y postres (Pszczola, 2002; Babu y Wiesenfeld, 2003; Morris y Vaisey-Genserb, 2003; Goh et al., 2006; Hyvrinen et al., 2006a). El nivel de harina de linaza que se puede incorporar en la elaboracin de alimentos est determinado por los cambios organolpticos y tecnolgicos que ocurran en ellos. El xito en el fraccionamiento de la semilla en sus diferentes componentes, puede aumentar los niveles de incorporacin en los alimentos. Todava no hay suficiente informacin acerca de las condiciones de proceso que mejoren las caractersticas de las harinas y su impacto en la calidad de los productos elaborados (Hyvrinen et al., 2006a; Oomah, 2006). En experiencias realizadas en panificacin se encontr que al agregar 5 % de harina de linaza, la

firmeza de la masa se mantiene, aumenta la absorcin de agua y la curva del farinograma se debilita. La firmeza del pan aumenta y disminuye la calidad de la miga y la corteza, pero su volumen es mayor y tiene mayor vida til; por otra parte no se observaron cambios en el contenido de lignanos. En el caso de muffins, con 10 % de harina de linaza, se logran productos con buena apariencia, color, sabor, textura y aceptabilidad (Ramcharitar et al., 2005; Hall et al., 2006). Considerando las temperatura interna de los productos horneados, es esperable que no ocurra un dao significativo en los componentes de mayor valor nutricional de la linaza tales como ALA, lignanos, goma, fibra y protena, lo cual se ha confirmado parcialmente en forma experimental (Morris y Vaisey-Genserb, 2003 Hyvrinen et al., 2006a). Por su parte, Manthey et al. (2008) estudiaron el efecto del uso de harina de linaza en la elaboracin de pasta refrigerada, encontrando que las pastas resultantes eran menos firmes durante la coccin, pero que sin embargo, tenan un menor desarrollo de hongos, levaduras y bacterias durante el almacenamiento refrigerado de 7 semanas, debido aparentemente a un efecto bacteriosttico y fungisttico de los componentes de la linaza. Al introducir harina de linaza en yogurt, el contenido de lignanos se mantiene y no se afecta negativamente la fermentacin ni el almacenamiento durante 21 das a 4 C. En queso Edam, los liganos se mantienen estables durante la maduracin por 6 semanas a 9 C (Hall et al., 2006; Hyvrinen et al., 2006b).

Conclusiones
La linaza, a pesar de ser una semilla conocida desde hace mucho, no se usa ampliamente en la formulacin de alimentos. Esta semilla posee importantes cantidades de compuestos bioactivos, como cido alfa-linolnico, lignanos y fibra diettica, los cuales tienen efectos potenciales en la prevencin de algunas enfermedades crnicas no transmisibles. Estas caractersticas convierten a la semilla de lino en una atractiva fuente de ingredientes para ser usados en la elaboracin de diferentes alimentos funcionales.

Liberacin de pptidos bioactivos por bacterias lcticas en leches fermentadas comerciales

Bioactive peptides released by lactic acid bacteria in commercial fermented milks

L.G. GonzlezOlivares, J. JimnezGuzmn, A. CruzGuerrero*, G. RodrguezSerrano, L. GmezRuiz y M. GarcaGaribay

Departamento de Biotecnologa Universidad Autnoma Metropolitana Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco No. 186. Col. Vicentina, Mxico D.F. 09340, Mxico. CP 09340, Mxico, D.F. *Autora para la correspondencia. Email: aec@xanum.uam.mx Tel: (55) 58 04 47 20; Fax: (55) 58 04 47 12

Recibido 16 de Marzo 2011. Aceptado 13 de Abril 2011.

Resumen El objetivo de este estudio fue determinar la concentracin y el perfil de pesos moleculares de los pptidos bioactivos encriptados en las protenas de la leche y liberados por la actividad proteoltica de bacterias lcticas en leches fermentadas comerciales, durante su almacenamiento refrigerado. La concentracin de pptidos vari de 0.05 mg/ml en LF3 (Lactobacillus casei) y LF4 (Lactobacillus acidophilus), a 0.227 mg/ml en LF5 (Lact obacillus casei y S. thermophilus) y LF1 (Lactobacillus casei) en el dcimo da de almacenamiento, en el cual se present el mximo de concentracin. Durante el almacenamiento refrigerado de todas las muestras, se encontraron pptidos de peso molecular menor a 14.4 kDa. La leche fermentada con Lactobacillus acidophilus yStreptococcus thermophilus (LF2) present la mayor diversidad de pptidos, y en sta se encontraron fragmentos an menores a 1.4 kDa, algunos de ellos con aminocidos aromticos, presentes en la estructura primaria de pptidos antihipertensivos. Estos resultados sugieren que la concentracin y diversidad de pptidos depende del microorganismo que fermenta la leche. El peso molecular de los pptidos encontrados se compar con los reportados en la literatura como pptidos bioactivos, y se encontraron semejanzas, lo que incrementa la probabilidad de tener pptidos de importancia fisiolgica en leches fermentadas. Palabras clave: leches fermentadas, pptidos bioactivos, efecto antihipertensivo, bacterias cido lcticas.

Abstract The aim of this study was to evaluate the release of bioactive peptides encrypted in milk proteins by proteolytic activity of lactic acid bacteria in commercial fermented milks in refrigerated storage. Peptide concentration varied from 0.05 mg / ml in LF 3 (Lactobacillus casei) and LF4 (Lactobacillus acidophilus) to 0.227 mg/ml in LF 5(Lactobacillus casei and S. thermophilus) and LF1 (Lactobacillus casei) after 10 days of storage, when the maximum concentration was reached. During refrigerated storage, all samples presented peptides with molecular weight lower than 14.4 kDa. The fermented milk LF2 (Lactobacillus acidophilu s y Streptococcus thermophilus)had the highest variety of peptides, and even peptides lower than 1.4 kDa were found, some of them with aromatic amino acids, which are present in the primary structure of antihypertensive peptides. These results suggest that the concentration and diversity of peptides depends on microorganism in the fermented milk. Peptides molecular weights were compared with those reported in literature for bioactive peptides, finding

similarities, thus increasing the expectations to have peptides with physiological importance in fermented milks. Keywords: fermented milks, bioactive peptides, antihypertensive effect, lactic acid bacteria.

1 Introduccin Durante dcadas las leches fermentadas se han considerado productos benficos para la salud, esto se ha atribuido a los microorganismos involucrados en la fermentacin. Estudios recientes han comprobado que estos beneficios tambin se deben a los diferentes productos liberados durante el proceso de fermentacin, tales como metabolitos y otras molculas biolgicamente activas (Leroy y De Vuyst, 2004; FigueroaGonzlez y col., 2010). Los probiticos se han definido como organismos vivos que al ingerirse afectan benficamente al husped mejorando el balance intestinal (Simmering y Blaut, 2001). Al modificar la microflora intestinal, los probiticos influyen directa e indirectamente en el estado de la salud a travs de produccin de vitaminas y cidos grasos de cadena corta, degradacin de sustancias alimenticias no digeridas, estimulacin de la respuesta inmune y proteccin frente a microorganismos enteropatgenos (Senok y col., 2005). Una gran variedad de especies y gneros pueden ser considerados como probiticos potenciales; sin embargo, comercialmente, las bacterias cido lcticas (BAL) son las ms importantes (Vasiljevic y Shah, 2008). La capacidad proteoltica de las BAL juega un papel muy importante durante la fermentacin de la leche, principalmente en el fraccionamiento de protenas a pptidos y aminocidos libres; algunos de estos pptidos presentan actividad biolgica por lo que son considerados pptidos bioactivos. A partir de leches fermentadas se han aislado numerosos pptidos con diversas actividades biolgicas. Se han descrito fracciones pptidicas con actividad inmunomodulante (LeBlanc y col., 2002), anticancergena (LeBlanc y col., 2005), hipocolesterolmica (Kawase y col., 2000), antimicrobiana (Hernndez y col., 2005), acarreadora de minerales (Lorenzen and Meisel, 2005), reguladora de actividad intestinal y del sistema nervioso (Rokka y col., 1997) y antioxidante (HernndezLedezma y col. 2005). Los pptidos bioactivos ms estudiados hasta el momento son aquellos implicados en el control de la presin arterial (Fitzgerald y Murray, 2006). El primer reporte de una leche fermentada, con actividad antihipertensiva comprobada, fue producida con una combinacin de Lactobacillus helveticus y Saccharomyces cerevisiae; sta contena dos tripptidos inhibidores de enzima la convertidora de angiotensina (VPP e IPP) (Contreras y col., 2009). Se ha reportado en varios estudios la existencia de pptidos bioactivos en diferentes leches fermentadas: pptidos moduladores de la motilidad intestinal en una leche fermentada con Lactobacillus casei ssp. rhamnosus; pptidos antihipertensivos en yogurt y kfir (Korhonen, 2009). En este mismo contexto se ha demostrado que diferentes bacterias lcticas(Lactobacillus, Lactococcus y Streptococcus) son capaces de producir pptidos bioactivos durante el proceso de fermentacin y durante el almacenamiento en refrigeracin (Phelan y col., 2009).

La presencia de estos pptidos bioactivos en productos alimenticios comerciales podra aportar beneficios adicionales para el consumidor. El objetivo de este trabajo fue determinar la concentracin y el perfil de pesos moleculares de los pptidos liberados durante el almacenamiento en fro de leches fermentadas comerciales conteniendo diferentes bacterias lcticas.

2 Materiales y mtodos 2.1 Leches fermentadas comerciales Se emplearon 7 leches fermentadas comerciales identificadas en la Tabla 1. Los productos se seleccionaron en base a los microorganismos utilizados para la fermentacin, considerando aquellas que tuvieran microorganismos probiticos (siendo el caso de las leches LF1 a LF6) mientras que la LF7 se seleccion por tener exclusivamente los microorganismos del yogurt. Los productos se compraron en supermercados en las condiciones que llegan al consumidor asegurndose que tuvieran 15 das antes de la fecha de caducidad. 2.2 Separacin de los pptidos presentes en las leches fermentadas almacenadas en refrigeracin Las leches fermentadas se almacenaron a 4C durante 15 d, tomando muestras en los das 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. Se tomaron 5 ml de muestra y se mezclaron con el mismo volumen de una solucin de cido tricloroactico (TCA J.T. Baker, Mxico) al 12% (p/v) para precipitar protenas (JimnezGuzmn y col., 2002). Se centrifugaron a 18000 rpm durante 15 min a 4C (centrifuga Beckman J2MI, EUA). El sobrenadante se refriger a 4C y se utiliz para las determinaciones posteriores. 2.3 Cuantificacin de pptidos solubles en las leches fermentadas La liberacin de pptidos solubles en las leches fermentadas se realiz mediante la tcnica reportada por Lowry y col., (1951), esto se hizo en los sobrenadantes obtenidos previamente. Se adicion 1 mL del sobrenadante de la leche fermentada a 5 mL de una solucin de carbonato de sodio al 2%, sulfato de cobre al 1% y tartrato de sodio y potasio al 2% en NaOH 0.1N; se dej reposar 10 min en la oscuridad. Posteriormente se adicionaron 0.5 mL del reactivo de Folin diluido 1:1 con agua destilada (preparado al momento de utilizarse), y se dej reposar 30 min en la oscuridad. Se midi la absorbencia en el espectrofotmetro Shimadzu UV 160 (Japn) a una longitud de onda de 590 nm. 2.4 Electroforesis desnaturalizante de las leches fermentadas Se realiz la electroforesis desnaturalizante de acuerdo a Laemmli (1970), con una concentracin de acrilamida de 15% (p/v). Se us un estndar de pesos moleculares de amplio rango (BioRad, EUA): miosina (200,000 Da); galactosidasa (116,250 Da); fosforilasa B (97,400 Da); seroalbmina (66,200 Da); ovoalbmina (45,000 Da); anhidrasa carbnica (31,000 Da); inhibidor de tripsina (21,500 Da); lisozima (14,400 Da) y aprotinina (6,500 Da). Los geles se tieron con Sypro Flamingo (BioRad, EUA). Se generaron los perfiles electroforticos para cada producto analizado a partir de los

geles de electroforesis, y la altura de los picos en la grfica corresponde a la concentracin de cada pptido. 2.5 Electroforesis desnaturalizante de pptidos de LF2 Se utiliz el mtodo de Schgger y von Jagow (1987) modificado para la mejor resolucin de pptidos de peso molecular menor de 10 kDa. Con el objetivo de concentrar los pptidos, los sobrenadantes se liofilizaron (liofilizadora Labconco DrySystem/Freezone 4.5). Los liofilizados se resuspendieron en 100 l de agua desionizada, se tom una alcuota de 40 l y se agregaron 20 l de solucin amortiguadora de corrida (Tris basetricina 0.1M), se incubaron por 30 min a 40C. La electroforesis se realiz en un gel con 20% (p/v) de acrilamida y 6% (p/v) de bisacrilamida, se inici con 30 V por 90 min, siguiendo con 95 V por 7 h. La fijacin de pptidos en el gel, se hizo con una solucin de 50% (p/v) metanol y 10% (p/v) cido actico por una hora. La tincin se hizo en una solucin de Sypro Flamingo (Bio Rad, EUA) por 30 min, se enjuag el gel con agua desionizada, para tomar posteriormente la imagen en GelDoc 100 (BioRad, EUA). Para determinar los pesos moleculares, se utiliz el estndar de polipptidos (BioRad, EUA): triosafosfato isomerasa (26,625 Da); mioglobina (16,950 Da); a lactoalbmina (14,437 Da); aprotinina (6,512 Da); insulina B oxidada (3,496 Da) y bacitracina (1,423 Da). Para la determinacin de la concentracin de pptidos, se tom como referencia la lactoglobulina (BLG) a una concentracin de 1 mg/ml. 2.6 Separacin de pptidos por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) de exclusin molecular Los sobrenadantes de las leches fermentadas fueron inyectados en un HPLC (Lab Alliance, EUA) en una columna de exclusin molecular (Biosep SEC 2000, Phenomenex, tamao de partcula 5 m, tamao de poro 145 , 300 x 7.8 mm). Se utiliz como fase mvil una solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8, se inyectaron 20 l de muestra. Se corri a temperatura ambiente, con una tasa de flujo de 1 ml/min durante 60 min. La deteccin se realiz a 210, 257 y 280 nm en un detector de arreglo de diodos (Spectra System UV 6000 LP). Las dos ltimas son las longitudes de onda donde los aminocidos aromticos tienen su mxima absorcin de luz, a 257 nm fenilalanina (Phe) y 280 nm para tirosina (Tyr) y triptfano (Trp), mientras que a 210 nm absorben los enlaces peptdicos (Creighton, 1990). 2.7 Anlisis estadstico Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos experimentales se sometieron a un anlisis de varianza (ANOVA), se hizo la comparacin de medias por el mtodo de Tukey's con un nivel de significancia de 0.05. Se utiliz el programa SPSS Statistics 17.0 (19932007 Polar Engineering and Consulting).

3 Resultados y discusin 3.1 Concentracin de pptidos solubles producidos en las leches fermentadas durante el almacenamiento

Al realizar la determinacin de pptidos solubles (Fig. 1), se encontr que la concentracin se increment hasta el da diez, a partir del cual se mantuvo constante hasta el final del estudio (p> 0.05) excepto para la LF4 y LF5 en donde se observ una disminucin en la concentracin de pptidos. Se observ que la mayora de las leches fermentadas (exceptuando LF4 y LF5) alcanzaron un mximo entre 1300 y 1600 g/ml, mientras que LF4 alcanz una concentracin de 2500 g/ml y LF5 por arriba de los 3000 g/ml; esta ltima corresponde a la combinacin S. thermophilus y L. casei Shirota. Por otra parte, se observ que todas las leches fermentadas siguieron la misma tendencia, lo cual sugiere una formacin y acumulacin constante durante los primeros das del almacenamiento, no importando la bacteria lctica utilizada en la elaboracin. Estos resultados coinciden con los reportados por Nielsen y col. (2009) quienes estudiaron la produccin de pptidos durante el almacenamiento en refrigeracin de leches fermentadas con Lactococcus lactis y Lactobacillus helveticus y en cultivos combinados de Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus.

En la Fig. 2 se muestra el gel de electroforesis de las leches fermentadas almacenadas durante 10 d en refrigeracin. Se observ que en cada una de las muestras se encontraron bandas con pesos moleculares menores a 14.4 kDa incluso menores a 6.6 kDa, que corresponden al tamao de varios pptidos reportados como bioactivos (Schanbacher y col., 1997; Meisel y Bockelmann, 1999; Korhonen y Philanto 2006; Phelan y col.,2009).

A partir del gel de electroforesis se calcul la concentracin de pptidos y se encontr que los productos que presentaron la mayor concentracin no mostraron la mayor diversidad de ellos. En LF1 y LF5, que tenan la mayor concentracin (0.205 y 0.227 mg/ml), slo se encontraron 9 y 10 bandas de pptidos respectivamente. En el caso de LF7 y LF4, 11 y 12 bandas respectivamente; en LF2 a pesar de haber tenido una concentracin de pptidos menor (0.073 mg/ml) present la mayor diversidad de ellos (15 bandas) por debajo de los 14.4 kDa, adems de que exhibi uno de los pptidos de menor peso molecular, que son los de mayor inters por ser de los pptidos ms reportados en la bibliografa como bioactivos entre los que se encuentran: antitrombticos, antihipertensivos, inmunomoduladores, acarreadores de minerales entre otros (Clare y Swaisgood, 2000). Otros autores han descrito la capacidad de las proteinasas de las BAL para hidrolizar ms del 40% de los enlaces peptdicos de las casenas (Juillard y col., 1995; Kunji y col., 1996; Mierau y col., 1997) generando un gran nmero de pptidos, que podran ser degradados por peptidasas para liberar algunos con propiedades bioactivas. Se compar el perfil de pptidos de las leches fermentadas y se observaron picos que coinciden entre ellas. En el caso de LF2, LF5 y LF7 que tienen en comn la presencia de Streptococcus thermophilus, se encontraron cinco picos que coinciden entre los tres productos. Lo mismo se observa entre los perfiles de LF 3 y LF5, fermentadas con la misma cepa de L. casei, donde se encontraron ocho picos que coinciden. Por otro lado, en el caso de LF4 y LF2 fermentadas con L. acidophilus (Fig. 3), se encontr la mayor cantidad de picos comunes (10 picos) lo que coincide con lo reportado por Vinderola y col. (2002) quienes observaron que en almacenamiento a 4C, la produccin de pptidos fue mayor en una leche fermentada con L. acidophilus y S. thermophilus comparada con leches fermentadas con otros probiticos solos o en otras combinaciones. Es importante destacar que es posible relacionar el tipo de pptido encontrado con el sistema proteoltico de la bacteria o del consorcio bacteriano utilizado en la fermentacin de la leche (LeBlanc, y col., 2002). En leches fermentadas en refrigeracin, se ha observado que algunos consorcios

bacterianos generan mayor produccin de pptidos y aminocidos libres que cuando se tiene una sola bacteria (Shihata y Shah, 2000).

3.2 Determinacin de pptidos solubles en LF2 elaborada con Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilus A partir de los resultados obtenidos se trabaj con LF2 debido a la variedad de pptidos generados comparado con el resto de los productos analizados. Con el fin de determinar si la concentracin de pptidos era igual para cualquier lote de leche LF2, se analizaron dos muestras con diferentes tiempos de elaboracin 15 y 10 das antes de caducar y no se encontr diferencia en la concentracin de pptidos en ambos productos (p> 0.05). Al realizar la electroforsis para pptidos de las muestras de LF2 en almacenamiento refrigerado, se encontraron bandas correspondientes a pptidos menores a 14.4 kDa (Fig. 4), se observ que en todos los carriles hubo aparicin de estas bandas, pero existen dos bandas en particular bien definidas una de 1.4 kDa (a) y otra menor a 1.4 kDa (b), que aparecieron en el da 1 y permanecieron hasta el da 13, estos resultados confirman la existencia de pptidos de bajo peso molecular que se haban encontrado en el anlisis por electroforsis desnaturalizante de las leches fermentadas. Esta formacin de pptidos puede deberse, en gran medida, a que existen an en el medio endopeptidasas pertenecientes a bacterias vivas o a enzimas liberadas por lisis celular (Nighswonger y col.,1996). Nielsen y col. (2009) encontraron, en estudios hechos durante el almacenamiento refrigerado en leches fermentadas, que la actividad proteoltica se mantuvo en refrigeracin a 4C y que an cuando no hubo un aumento considerable de la poblacin de BAL, la actividad proteoltica no se detuvo, permitiendo un aumento en la concentracin de pptidos de distintos pesos moleculares.

Los resultados obtenidos de la separacin e identificacin de las fracciones peptdicas de la leche LF2 por HPLC se muestran en la Tabla 2. En el primer da de monitoreo se identificaron 7 pptidos menores a 14.4 kDa y se observ que la concentracin total de pptidos permaneci constante (p> 0.05) hasta el da 5 a pesar de que s hubo un aumento en el nmero de pptidos. Se observ un aumento en la concentracin de pptidos en el da 7 y otro hasta el da 13 siendo ste el mximo obtenido (p< 0.05). Los pptidos generados pueden provenir de la hidrlisis de protenas o pptidos de peso molecular superior a 10 kDa por las enzimas del sistema proteoltico de las BAL (Ramchandran y Shah, 2008; Nighswonger y col., 1996). Los pptidos 7 y 11 fueron los que se encontraron en mayor concentracin al final del estudio, con pesos moleculares de 2.68 y 0.87 kDa respectivamente. Los pptidos encontrados menores a 2 kDa pueden estar relacionados con pptidos antihipertensivos, debido solamente a su peso molecular. Muchos autores han reportado pptidos de menos de 2 kDa biolgicamente activos (Meisel, 1998; Meisel, 2001; Clare y Swaisgood, 2000; Rokkay col., 1997). Comparando los cromatogramas del sobrenadante de la LF2 a las tres longitudes de onda (Fig. 5), slo se observaron cuatro pptidos con presencia de aminocidos aromticos. Dado que diferentes autores reportaron que los pptidos antihipertensivos, tienen en sus estructuras aminocidos aromticos (Rokka y col., 1997) se incrementa la posibilidad de encontrar pptidos antihipertensivos. Se ha visto que los aminocidos Trp, Tyr y Phe favorecen la unin y consecuente inhibicin de la enzima convertidora de angiotensina (ACEI) (Cheung y col.,1980). De igual manera se sabe que el sistema proteoltico de las BAL est ntimamente ligado a la acumulacin de pptidos de diferentes tamaos y tipos, dependiendo de las necesidades nutricionales de cada BAL, haciendo que las diferencias funcionales del aparato proteoltico entre L. acidophilus y S. thermophilus, sea una de las causas de encontrar esta diversificacin en las fracciones peptdicas (Poolman y col., 1995). An cuando la temperatura ptima

de las proteinasas y peptidasas de las BAL se encuentra entre 25 y 37C (Juille y col., 2005) la actividad contina en refrigeracin, tanto en el rompimiento de protenas como de pptidos (Nighswonger y col., 1996; Nielsen y col., 2009). Ms an se ha reportado (Matsumura y col., 1993; Miyoshi y col., 1991; Fujita y col., 2000) la importancia de la presencia de aminocidos aromticos, principalmente Phe, junto con prolina en pptidos con alta actividad inhibitoria de la ACE, en el extremo C terminal. Debido a los requerimientos nutricionales de las BAL, se tiene una acumulacin de pptidos de cadena corta (2 a 6 aminocidos) (Dave y Shah 1998; Gomes y col.,1998). Aunque los requerimientos nutricionales del estreptococo son diferentes (Letort y col., 2002) y tienen un sistema muy avanzado a manera de opern de produccin de aminocidos (leucina, isoleucina y valina) (Garault y col., 2000) tambin genera pptidos de bajo peso molecular en leches fermentadas, adems de que la nula necesidad de pptidos aromticos permite la acumulacin de estos en el medio de fermentacin (Akpemado y Bracquart 1983; Letort y Julliard 2001) a diferencia del lactobacilo, el cual tiene necesidades de fenilalanina y triptfano (Morishita y col., 1981). De igual manera la acumulacin constante de pptidos con aminocidos aromticos, se puede deber a una peptidasa intracelular especfica del estreptococo, que libera de manera constante pptidos con fenilalanina (Fernndez Espa y Rui 1999) cuyo sistema de transporte de oligopptidos tiene afinidad por pptidos de hasta 23 aminocidos, adems de poseer tres enzimas ligadoras en el sistema de transporte de oligopptidos (amiAl, amiA2 y amiA3) en lugar de una como en las dems BAL (OppA) (Garault y col., 2001; FernndezEspla y Rul 1999, Juille y col., 2005) que le permite excretar al medio pptidos de dos y tres aminocidos generados por la accin de dipeptidasas intracelulares (Rui y Monnet 1997; FernndezEspla y Rul, 1999). 3.3 Relacin de pptidos encontrados con pptidos bioactivos reportados Se pudo hacer una relacin de los pptidos encontrados en el estudio (con aminocidos aromticos en su estructura) con pptidos bioactivos reportados, tal y como lo hicieron Rokka y col. (1997); de esta forma se identificaron tres pptidos que podran tener actividad biolgica, principalmente antihipertensiva, ya que los pesos moleculares reportados son muy similares a los pesos moleculares determinados y en ellos hay presencia de Tyr, Phe y Trp (ver Tabla 3).

Conclusiones En todas las leches fermentadas estudiadas se observ la generacin de pptidos solubles durante el almacenamiento en refrigeracin independientemente del microorganismo utilizado en su elaboracin, y se observ que sigui un mismo patrn, con un mximo de concentracin en el da 10 que se mantuvo constante hasta el final del estudio, exceptuando la de las leches LF4 (Lactobacillus acidophilus) y LF 5 (Lactobacillus casei Shirota y Streptococcus thermophilus), en las que se present un descenso despus del da 10 hasta el da 15. El anlisis de pptidos por electroforesis desnaturalizante de todas las leches comerciales, revel que las leches que presentaron la mayor concentracin de pptidos fueron las que tenan Lactobacillus casei (LFly LF5). Mientras que, las leches que tenan Lactobacillus acidophilus (LF2 y LF4) presentaron la mayor diversidad de pptidos. La comparacin del perfil de pptidos permiti comprobar que los pptidos generados dependen del microorganismo utilizado en la fermentacin.