Antibiograma

Antibiograma (ABG) = testarea sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolata dintr-un produs patologic la agentii antimicrobieni. Antifungigrama (AFG) = testarea sensibilitii fungilor la antifungice. Prin antibiograma selectam antibioticele cele mai active fata de microorganismul testat. Conditiile efectauarii antibiogramei 1. ABG se face dupa stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea in cultura pura si prin identificarea agentului patogen. 2. Prin antibiograma alegem antibioticul cel mai eficace fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate. 3. Daca tratamentul cu antibiotice este de lunga durata ABG se repeta ( microorganismul poate dobandi rezistenta pe parcursul tratamentului si se pot produce dismicrobisme care pot duce la infectii supra adaugate). PRINCIPIUL ANTIBIOGRAMEI Anibiograma se bazeaza pe efectul bactericid( omoara bacteria) sau bacteriostatic(opreste multiplicarea) al antibioticelor fata de speciile bacteriene. Metoda difuzimetrica Se efectueaza pe medii solide turnate in placi Petri pe care s-a insamantat in panza cultura bacteriana. Pe suprafata mediului se dispun rondele de antibiotice astfel incat in jurul acestora se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a Ab ( in imediata vecinatate a rondelei se realizeaza o concentratie care scade pe masura indepartarii de rondela.) Metoda da informati asupra sensibilitatii speciei testate fata de Ab utilizate, dar nu stabileste CMI ( cc. minima inhibitorie). Metodologia standardizat de lucru Mediul gelozat Mediul de testare universal recomandat este Muller-Hinton agar. Acest mediu nesuplimentat a fost ales pentru mai multe motive: a demonstrat o bun reproductibilitate de la un lot la altul conine puini inhibitori de sulfonamide i trimetoprim este un bun mediu de cultur pentru majoritatea germenilor nepretenioi, patogeni este folosit cu succes de muli ani, demonstndu-i calitile. Formula mediului este: Extract de carne..300,0g Hidrolizat de cazein17,5g Amidon1,5g AD..1000ml

Ab germeni pretentiosi Germenii pretenioi, cum sunt Haemophilus, Neisseria i streptococii nu pot crete satisfctor pe acest mediu nesuplimentat, dar ei pot fi testai prin metoda difuzimetric, prin suplimentarea mediului de baz Muller-Hinton cu factori de cretere specifici (adugarea de snge defibrinat sau chocolatizat, adugarea de factori X i V), incubarea n atmosfer de CO2 i prelungirea perioadei de incubaie. Pt. Mycobacterium tuberculosis se foloseste mediul Lowenstein Jensen. Turnare medii Grosimea mediului, de 4 mm, este important, deoarece AB difuzeaz n mediu att n suprafa ct i n profunzime, deci, o grosime mai mare duce la false rezistene (zone de inhibiie eronat mai mici), n timp ce o grosime mai mic de 4 mm duce la creteri false ale zonelor de inhibiie, deci false sensibiliti. Controlul mediilor Fiecare lot de mediu nou preparat trebuie testat pentru asigurarea unui pH mediu de 7,2-7,4 la temperatura camerei; valori sczute ale pH-ului pot altera rezultatele pentru aminoglicozide i macrolide (false rezistene), sau ale penicilinelor (false sensibiliti). Stocare medii Plcile cu mediu pot fi stocate la frigider mai multe zile, n pungi de plastic pentru a evita deshidratarea, iar nainte de utilizare vor fi introduse n incubator (10-30 min) pentru echilibrare termic i ndeprtarea condensului format. Inoculul Procedeele de inoculare Inoculul se prepara direct prin suspensia ctorva colonii n SF, sau bulion Muller-Hinton, pn la o turbiditate de 0,5 U Mac Farland (corespunztor cu 1-2 x 108 UFC) . Standardizarea turbiditii inoculului la 0,5 U Mac Farland se realizeaza cu un nefelometru standardizat produs de BioMrieux, sau cu densitometrul electric DENSIMAT (BioMrieux). Inocularea gelozei Muller-Hinton cu aceast suspensie se va realiza n rstimpul a 15 min. de la preparare, pentru a preveni modificarea turbiditii prin nceperea creterii bacteriene. Insamantarea culturii Inocularea se va realiza cu tampoane de vat sterile mbibate n suspensia bacterian, bine stoarse de excesul de lichid, prin tergerea ntregii suprafee a mediului gelozat n 3 direcii, prin rotarea plcii Petri , acoperind astfel ntreaga suprafa. Geloza Muller-Hinton astfel inoculat va fi lsat s absoarb toat cantitatea de inocul depus cca 5 min.( nu se vor depi 15 min. pentru a nu ncepe multiplicarea bacterian), dup care se pot aplica discurile cu AB.

Scopul final al inoculrii mediului este realizarea unei creteri bacteriene uniforme, sub form de colonii confluente (sau semiconfluente dup standardul francez, ce utilizeaz un inocul mai slab). Discurile de antibiotice n rstimpul celor 15 min. de la inoculare discurile de antibiotice vor fi aplicate ferm pe mediul gelozat, pstrnd o distan ntre discuri de minimum 24 mm (de la centru la centru) pentru a evita suprapunerea zonelor de inhibiie. Unele antibiotice ncep s difuzeze n mediu imediat dup aplicare, astfel c odat aplicate pe mediu ele nu mai pot fi mutate. Aplicarea discurilor se poate face fie individual, cu pense sterile, fie cu dispensere speciale care permit aplicarea concomitent a 8-16 discuri, n funcie de mrimea placii Petri utilizate (pe o plac Petri rotund de 90 mm ncap 6 discuri, pe una de 100 mm, 8 discuri, pe cea de 150 mm, 12 discuri, iar pe plcile ptrate de 120/120 mm, 16 discuri). Trusele de antibiotice Seturile de antibiotice utilizate set pentru stafilococi din infecii localizate (cuprinznd : P, OX, E, L, CM, RA,VA, GM, AN, NET, CIP, SXT) i pentru stafilococi din hemoculturi (aceleai plus TEC, LZD i furantoin, novobiocina n scop taxonomic) ; set pentru bacili gram negativ din infecii urinare (AM, AMC, CZ, CXM, CAZ, CRO/CTX, FOX, GM, NA, NOR, SXT, FT) i pentru bacili gram negativ din infecii sistemice (aceleai plus PIP, TZP, TIC, TCC, ATM, FEP, AN, NET, TM, IPM, CIP nlocuind NOR i fr FT, SXT) set pentru bacili gram negativ nefermentativi (ATM, CAZ, CFP, FEP, IPM, PIP, TZP, TIC, TCC, GM, TM, AN, NET, CIP, SXT, CS) set pentru pneumococi (OX, E, CM, VA, SXT, OFX, RA, suplimentat pentru tulpinile invazive rezistente la P, cu E-test la AMX, CRO/CTX, CXM, MEM) set pentru enterococi urinari (AM, FT, NOR, SXT, GMH, STRH) i enterococi din hemoculturi (AM, VA, TEC, LZD, E, CM, RA, CIP, GMH, STRH) set pentru Haemophillus (AM, AMC, CEC/CXM, CRO, SXT, RA, CIP IPM dac tulpin invaziv) Semnificatia prescurtarilor NB : AM-ampicilina, AMC-amoxi/clavulanic, AMX-amoxicilina, ATM-aztreonam, AN-amikacina, CM-clindamicina, CAZ-ceftazidim, CRO-ceftriaxon, CFPcefoperazona, CXM-cefuroxim, CZ-cefazolin, CIP-ciprofloxacina, CS-colistin, CTX-cefotaxim, CEC-ceclor, E-eritromicina, FOX-cefoxitin, FEP-cefepime, FTfurantoin, GM-gentamicina, GMH-gentamicina nalt concentraie, IPMimipenem, L-lincomicina, LZD-linezolid, MEM-meropenem, NET-netilmicina, NOR-norfloxacina, NA-acid nalidixic, OX-oxacilina, OFX-ofloxacina, Ppenicilina, PIP-piperacilina, Ra-rifampicina, SXT-biseptol, STRH-streptomicina nakt concentraie, TM-tobramicina, TIC-ticarcilina, TCCticarcilina/clavulanat, TEC-teicoplanina, TZP-piperacilina/tazobactam, VAvancomicina.

Incubarea Dup aplicarea discurilor de antibiotice i nedepind cele 15 min.(spre a se evita predifuzia AB), plcile sunt ntoarse cu capacul n jos (pentru a nu se umezi de la condens) i se introduc n incubator, la 350C, n atmosfer normal. Incubarea n atmosfer ce conine CO2 alteraz rezultatele testrii aminoglicozidelor, tetraciclinei i macrolidelor, deaceea germenii nepretenioi care nu au nevoie de o astfel de atmosfer pentru cretere, vor fi incubai n atmosfer normal; dealtfel, criteriile de interpretare sunt valabile pentru aceste condiii de incubare. Pentru germenii pretenioi care cresc numai n atmosfer cu CO2 n concentraie de 5%, ca i pentru germenii anaerobi, criteriile de interpretare au fost stabilite innd cont de aceste condiii de incubare. Toate plcile cu germeni nepretenioi se examineaza dup 16-18 ore de incubaie cu excepia stafilococilor i enterococilor, care necesit 20-24 de ore pentru detecia meticilinorezistenei i respectiv rezistenei la vancomicin. Dac plcile au fost corect inoculate, zonele de inhibiie sunt uniform circulare, iar coloniile crescute sunt confluente. Diametrul zonei de inhibiie complet este msurat, incluznd i diametrul discului, cu ajutorul unei rigle gradate, sau ubler. Citirea i interpretarea rezultatelor Msurarea diametrelor pe plcile cu Muller-Hinton se poate realiza prin transparen, pe dosul plcii, fr a o mai deschide, folosind o surs de lumin oblic cu rigla sau cu sublerul. Marginile zonei de inhibiie sunt acelea unde nu exist o cretere vizibil a germenilor. Interpretarea diametrelor msurate pentru fiecare disc se face n concordan cu criteriile stabilite de normativul ales. conform standardelor CLSI/NCCLS. Rezultatul se exprima in: S ( sensibil) I ( intermediar sensibil) R ( rezistent) Tulpinile de referin Setul de tulpini recomandate de CLSI/NCCLS i utilizate pentru controlul AB: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S.aureus ATCC 25923, E. faecalis ATCC 29212, recomandat pentru controlul discurilor cu concentraii nalte de gentamicin i streptomicin, E. coli ATCC 35218, recomandat pentru controlul inhibitorilor de -lactamaz, H. influenzae ATCC 49247 i ATCC 49766, Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 i S. pneumoniae ATCC 49619.

Controlul de calitate al testrii difuzimetrice Frecvena testrilor Toate loturile noi de mediu Muller-Hinton ca i cele de discuri trebuie testate cu tulpinile de referin nainte de a fi date n folosin pentru tulpinile clinice, iar controlul de calitate trebuie fcut regulat i ct mai frecvent (cu o ritmicitate de unul pe lun pentru controalele uzuale, si in plus altele pentru loturile noi sau pentru combinaiile deosebite germen/antibiotic). Nu sunt permise abateri de peste 3 mm ale diametrelor de inhibiie fa de cele standard, iar atunci cnd aceasta se ntmpl, se iau msurile corective necesare . Antibiograma difuzimetrica Antibiograma difuzimetrica Antibiograma difuzimetrica Metoda dilutiilor in medii lichide Urmareste derminarea limitei de sensibilitate a germenului fata de substanta data, indicand cc. de antibiotic necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale. Tehnica -la dilutii crescande de AB facute direct in mediu de cultura lichid, se insamanteaza cantitati egale de cultura bacteriana , stabilindu-se dilutia maxima de antibiotic in prezenta careia tulpina este inhibata. -pentru fiecare AB se face o dilutie de pornire - mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat 2% Metoda dilutiilor in medii lichide Se utilizeaza 10 tuburi cu bulion glucozat 1 ml in fiecare tub. In primul tub se adauga 1 ml din sol de antibiotic , se omogenizeaza si se trece 1 ml in al doilea tub si asa mai departe pana pana in tubul 9 din care se arunca 1 ml. Se insamanteaza tuburile cu cate o picatura din cultura de testat. Tubul 10 este martor Incubare 18-20 h la 370C, Metoda dilutiilor in medii lichide Citire Ultimul tub limpede reprezinta limita sensibilitatii germenului fata de antibioticul utilizat sau CMI= Concentratia Minima Inhibitorie. Daca se adauga un indicator de ph cresterea bacteriana este pusa in evidenta in 4 h prin virarea culorii indicatorului de ph-ului. METODA AUTOMATA : Se realizeaza cu analizorul MiniAPI conform indicatiilor din prospect specifice fiecarui tip de germene, respectiv utilizandu-se urmatoarele galerii de antibiograma: ATB Staph, ATB Strep, ATB GN, ATB Enterococ. Se urmaresc indicatiile de realizare a inocului, de incubare si de interpretare specifice, descrise in inserturi. Principiul este cel al unei antibiograme prin microdilutii cu puncte de ruptura.

Citirea se face automat prin softul analizorului MiniAPI, inclusiv interpretarea in sistem EXPERT. E-Testul Este varianta perfectionata a metodei difuzimetrice prin care se determina CMI a unui antibiotic. Metoda foloseste in locul microcomprimatelor cu antibiotic cate un epsilometru pentru fiecare antibiotic ( fasii de material plastic, gadate, imbibate cu cate un antibiotic). Gradatiile indica valorile CMI in mcg/ml. Pe suprafata mediului insamantat se depun radial la distante convenabile epsilometrele si se incubeaza. Zonele de inhibitie apar de-a lungul epsilometrului si au forma ovalara. Valoarea CMI se citeste pe epsilometru si corespunde gradatiei aflate la intersectia cu limita de inhibitie. ANTIFUNGIGRAMA Testarea sensibilitii la antifungice este n prezent standardizat numai pentru metodele cu macro i microdiluie i respectiv E-test. Deaceea n laboratoarele clinice obinuite se practic fie antifungigrama pe galerii automate de tipul celor MiniAPI, ce au ca principiu metoda microdilutiilor, fie E-testul.