UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI, CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE CHIMIE I INGINERIE CHIMIC

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Conductor tiinific Prof. Dr. Constantin Mruoiu

Doctorand Ildik Bro (cs. Lung)

Cluj-Napoca -2012-

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

CUPRINS
LISTA DE ABREVIERI INTRODUCERE CONTRIBUII PERSONALE CAPITOLUL 1. CONSIDERAII GENERALE PRIVIND PLANTELE STUDIATE DIN FAMILIA LAMIACEAE 1.1. Descrierea familiei Lamiaceae 1.2. Satureja hortensis L. 1.2.1. Caracterizare general 1.2.1. Aciune i ntrebuinri 1.3. Ocimum basilicum L. 1.3.1. Caracterizare general 1.3.2. Aciune i ntrebuinri CAPITOLUL 2. COMPUI BIOACTIVI DE INTERES FARMACOLOGIC 2.1. Pigmenii porfirinici 2.2. Flavonoidele 2.3. Carotenoidele 2.4. Uleiurile volatile 2.5. Taninurile CAPITOLUL 3. METODE DE EXTRACIE I ANALIZ A COMPUILOR BIOACTIVI DIN PLANTE 3.1. Metode de extracie a compuilor bioactivi 3.1.1. Macerarea 3.1.2. Refluxarea 3.1.3. Extracia Soxhlet 3.1.4. Extracia cu fluide supercritice 3.1.5. Extracia asistat de ultrasunete 3.1.6. Extracia asistat de microunde 3.2. Metode de analiz a compuilor bioactivi 3.2.1. Metode cromatografice de analiz a compuilor bioactivi 3.2.1.1. Cromatografia pe strat subire
1

4 5 7

8 8 9 10 11 12 13 14 16 16 18 21 22 23

26 26 27 27 28 28 30 30 31 32 33

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

3.2.1.2. Cromatografia de lichide 3.2.1.3. Cromatografia de gaze 3.2.2. Analiza compuilor bioactivi prin spectrofotometria UV-VIS PARTE EXPERIMENTAL CAPITOLUL 4. ALEGEREA METODEI EFICIENTE DE EXTRACIE A UNOR COMPUI BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L. 4.1. Determinarea metodei eficiente de extracie a uleiurilor volatile din plantele studiate 4.1.1. Extracia uleiurilor volatile 4.1.2. Analiza calitativ a uleiurilor volatile 4.1.2.1. Analiza prin cromatografie pe strat subire 4.1.2.2. Analiza prin cromatografia de gaze cu detector de ionizare n flacr 4.1.3. Analiza cantitativ a uleiurilor volatile 4.1.3.1. Analiza prin cromatografie pe strat subire 4.2. Determinarea metodei eficiente de extracie a compuilor polifenolici din plantele studiate 4.2.1. Extracia compuilor polifenolici 4.2.2. Analiza calitativ a compuilor polifenolici 4.2.2.1. Analiza prin cromatografie pe strat subire 4.2.2.2. Analiza prin cromatografia de lichide de nalt performan 4.2.3. Analiza cantitativ a compuilor polifenolici 4.2.3.1. Analiza spectrofotometric 4.2.3.1.1. Analiza spectrofotometric a flavonoidelor totale 4.2.3.1.2. Analiza spectrofotometric a acizilor polifenolcarboxilici 4.2.3.2. Analiza prin cromatografie pe strat subire 4.2.3.3. Analiza prin cromatografia de lichide de nalt performan CAPITOLUL 5. INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA UNOR COMPUI BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L. 5.1. Creterea plantelor luate n studiu n cmp de microunde 5.2. Determinarea pigmenilor asimilatori 5.2.1. Determinarea pigmenilor clorofilieni 5.2.2. Determinarea pigmenilor carotenoidici
2

35 39 41

43 43 44 49 49 52 55 55 57 59 60 60 62 69 69 69 72 75 77

85 85 90 90 92

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

5.3. Determinarea influenei microundelor asupra uleiurilor volatile din plantele supuse iradierii 5.3.1. Analiza calitativ a uleiurilor volatile 5.3.1.1. Analiza prin cromatografie pe strat subire 5.3.1.2. Analiza prin cromatografia de gaze cuplat cu spectrometria de mas 5.3.2. Analiza cantitativ a uleiurilor volatile 5.3.2.1. Analiza prin cromatografia de gaze cu detector de ionizare n flacr 5.3.2.2. Analiza prin cromatografia de gaze cuplat cu spectrometria de mas 5.4. Determinarea influenei microundelor asupra compuilor polifenolici din plantele supuse iradierii 5.4.1. Analiza calitativ a compuilor polifenolici 5.4.2. Analiza cantitativ a compuilor polifenolici 5.4.2.1. Analiza spectrofotometric 5.4.2.1.1. Analiza spectrofotometric a flavonoidelor totale 5.4.2.1.2. Analiza spectrofotometric al acizilor polifenolcarboxilici 5.4.2.2. Analiza prin cromatografia de lichide de nalt performan 5.5. Studii privind modificarea caracterului antioxidant n timpul iradierii plantelor cu microunde 5.5.1. Prepararea probei 5.5.2. Determinarea caracterului antioxidant al plantelor iradiate i neiradiate 5.5.2.1. Metoda DPPH 5.5.2.2. Metoda ORAC 5.5.2.3. Metoda TROLOX CONCLUZII BIBLIOGRAFIE LISTA DE LUCRRI TIINIFICE ELABORATE A. Lucrri publicate pe tematica abordat B. Alte lucrri (publicate n extenso) C. Lucrri publicate n rezumat la conferine, simpozioane naionale i internaionale D. Brevete ARTICOLELE PUBLICATE PE TEMATICA TEZEI
3

97 97 97 99 102 102 109

113 113 116 116 116 117 118

119 119 120 120 122 124 127 129 139 139 140 141 146

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Cuvinte cheie: compui bioactivi, cromatografie, spectroscopie UV-VIS, extracie, microunde.

LISTA DE ABREVIERI
AAPH ABTS AUC BI BR CI CR DPPH diclorhidrat de 2,2-azobis (2-amidinopropan) acid 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic) aria de sub curb (area under curve) busuioc iradiat busuioc neiradiat (de referin) cimbru iradiat cimbru neiradiat (de referin) capacitatea de ndeprtare a acestui radical (2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl radical scavenging) FID GC HPLC detector cu ionizare n flacr cromatografia de gaze cromatografie de lichide de nalt performan (high performance liquid chromatography) IM IR M MAE MS NTS ORAC incinta cu microunde (de iradiere) incinta de referin macerare extracie n cmp de (assistat de) microunde (microwave-assisted extraction) spectrometrul de mas difenilboriloxietilamin metoda de analiz bazat pe capacitatea de a reaciona cu oxigenul (oxygen radical absorbance capacity assay) a unor specii radicalice PDA PEG TEAC TLC Trolox UAE UV VIS photodiode array detector polietilenglicol echivaleni trolox (trolox equivalent antioxidant capacity assay) cromatografie pe strat subire (thin-layer chromatography) acid 6 hidroxi-2,5,7,8- tetrametil croman- 2-carboxilic extracie asistat de ultrasunete (ultrasound-assisted extraction) ultraviolet vizibil
4

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

INTRODUCERE Progresele nregistrate n domeniul biologiei moleculare i al manipulrilor genetice ofer perspective promitoare pentru intensificarea biosintezei unor compui secundari, acionnd la nivelul genelor reglatoare. Cu toate c exist adesea diferene relevante n ce privete sinteza i acumularea metaboliilor secundari n diferite esuturi sau n faze diferite ale dezvoltrii plantei, genomul fiecrei celule conine informaia necesar pentru a declana ntregul potenial al metabolismului secundar caracteristic speciei. Studii recente [1-3] indic faptul c prezena radiaiilor de microunde are efecte asupra sistemelor vii, chiar la nivele de putere sub limitele normativelor. CONTRIBUII PERSONALE n cadrul tezei de doctorat intitulat Cercetri privind influena microundelor asupra compuilor bioactivi din Satureja hortensis L. i Ocimum basilicum L. s-a avut ca scop principal determinarea efectului microundelor asupra compuilor bioactivi prezeni n cele dou plante aromatice luate n studiu. 1. Principalul element de noutate al acestei teze const n creterea cimbrului i busuiocului n cmp de microunde de putere mic, n incinte anechoice identice i urmrirea variaiei cantitii de compui bioactivi n plantele iradiate comparativ cu cele de referin (crescute n acelai tip de incinte, dar fr cmp de microunde). 2. n acest sens s-a realizat un studiu privind stabilirea metodei optime de extracie a uleiurilor volatile i compuilor polifenolici (flavonoide i acizi polifenolcarboxilici), metod care ulterior a fost utilizat la extracia acestor compui din plante iradiate cu microunde i plante de referin. Stabilirea metodei optime de extracie a fost necesar, datorit cantitilor mici de compui bioactivi care se gsesc n plantele iradiate cu microunde i n plantele de referin, acestea avnd doar cinci sptmni de la rsrire. n studiul efectuat a fost introdus o metod nou de extracie extracia n cmp de microunde aplicat n pulsuri ntr-o instalaie de microunde conceput n cadrul INCDTIM, Cluj-Napoca. 3. Metodele de analiz clasice, utilizate pentru compuii bioactivi au fost aplicate extractelor obinute att din plante iradiate, ct i de referin.

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

4. Elementele de noutate, cu importan practic ridicat, constau n determinarea influenei microundelor asupra urmtoarelor clase de compui bioactivi din plantele studiate: pigmeni asimilatori, uleiuri volatile i compui polifenolici, literatura de specialitate neprezentnd, la ora actual, concluzii clare n ceea ce privete influena microundelor asupra compuilor bioactivi din plantele crescute n cmp de microunde de putere mic. 5. De asemenea, modificarea caracterului antioxidant al plantelor iradiate, comparativ cu cele neiradiate, reprezint un element de noutate al tezei. 6. n urma investigaiilor efectuate s-a ajuns la concluzia c n plantele iradiate cantitatea de uleiuri volatile i compui polifenolici crete, pe cnd cantitatea de pigmeni asimil atori scade fa de plantele de referin. Prin obiectivele, studiile i concluziile sale, lucrarea de fa se aliniaz tendinelor mondiale n domeniu. PARTE EXPERIMENTAL CAPITOLUL 4 ALEGEREA METODEI EFICIENTE DE EXTRACIE A UNOR COMPUI BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L. 4.1. Determinarea metodei eficiente de extracie a uleiurilor volatile din plantele studiate Busuiocul (Ocimum basilicum L.) i cimbrul de grdin (Satureja hortensis L.), plante aromatice, mult folosite n alimentaie datorit aromei distinctive puternice, au un coninut ridicat n uleiuri volatile. 4.1.1. Extracia uleiurilor volatile Urmtorii solveni i amestecuri de solveni au fost utilizai pentru extracia uleiurilor volatile: E1 hexan, E2 eter etilic, E3 etanol, E4 hexan - eter etilic (1:1, v/v), E5 eter etilic - etanol (1:1, v/v), E6 hexan - eter etilic - etanol (1:1:1, v/v). Tehnicile de extracie utilizate au fost: macerarea, extracia asistat de ultrasunete i extracia asistat de microunde.

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

4.1.2. Analiza calitativ a uleiurilor volatile Calitatea extractelor a fost determinat prin metode cromatografice (TLC, GC-FID). 4.1.2.1. Analiza prin cromatografie pe strat subire Au fost supuse analizei extractele de busuioc i cimbru obinute cu sistemul E6: hexan eter etilic etanol (1:1:1, v/v), prin cele trei tehnici: macerare, ultrasonare i microunde. Analizele TLC s-au realizat pe plci HPTLC Sil G F254. nainte de utilizare, plcile au fost condiionate cu metanol i uscate la 110C timp de 3 ore. Probele au fost aplicate cu un aplicator semiautomat Linomat 5, sub form de benzi de 5 mm. Volumele aplicate au fost 20 L pentru extractele de plante i 7 L pentru standarde. Sistemul toluen - acetat de etil (93:7, v/v) a fost utilizat ca i faz mobil. Vizualizarea plcilor s-a realizat prin pulverizare cu anisaldehid i nclzire timp de 3 min la 110C, cnd benzile se coloreaz n rou albstrui. Plcile astfel obinute au fost analizate la 365 nm, dar i n vizibil [187]. Din cromatogramele obinute pentru cimbru, respectiv busuioc, prin toate cele trei metode de extracie nu se observ nici o diferen din punct de vedere calitativ, ceea ce indic faptul c prin nici o metod nu se degradeaz uleiurile volatile. a
Linia de front

Timol Linalool Cineol Linia de start Figura 15. Identificarea cineolului, linaloolului i timolului din extractele de Ocimum basilicum L. i Satureja hortensis L. Faza staionar: HPTLC Sil G F254. Faza mobila: toluen - acetat de etil (93:7, v/v). Vizualizare: anisaldehid la n 365 nm (a) i n vizibil (b).

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

4.1.2.2. Analiza prin cromatografia de gaze cu detector de ionizare n flacr Analiza GC-FID s-a realizat cu un gaz cromatograf Shimadzu GC-2010 cu ionizare n flacr. Compuii au fost separai pe o coloan de metil silicon OV-17 (2 m). Temperatura cuptorului a fost programat astfel: 2 min la 80C, 4C/min pentru nclzire pe intervalul 80 200C, 1 min la 200C i apoi 20C/min pn la 260C unde s-a meninut 35 min. Temperatura detectorului i injectorului a fost de 240C, respectiv 260C. Ca i gaz purttor s-a utilizat heliu, cu un debit de 15 mL/min, iar volumul injectat a fost de 2 L [187-189]. Pe baza rezultatelor obinute prin GC-FID s-au ales condiiile eficiente de extracie a uleiurilor volatile din cimbru i busuioc: ultrasonarea n hexan - eter etilic (1:1, v/v) pentru cimbru i extracia n cmp de microunde n eter etilic - etanol (1:1, v/v) pentru busuioc. 4.2. Determinarea metodei eficiente de extracie a compuilor polifenolici din plantele studiate Extractul polifenolic obinut poate fi analizat att global - nespecific, prin determinarea polifenolilor totali ct i specific. 4.2.1. Extracia compuilor polifenolici De fiecare dat au fost supuse extraciei cte 0,5 g pulbere vegetal utiliznd cte 40 mL amestec hidroalcoolic de extracie de diferite concentraii (tabel 2). nainte de refluxare, ultrasonare i extraie n cmp de microunde, pulberea vegetal a fost lsat timp de 30 minute la macerare. Tabel 2. Compoziia sistemelor de extracie utilizate: amestec etanol - ap (v/v) ES1 100:0 ES2 90:10 ES3 80:20 ES4 70:30 ES5 60:40 ES6 50:50 ES7 40:60

Tehnicile de extracie utilizate: a) Macerarea s-a realizat n 14 zile, la temperatura de 30C. b) Refluxarea a avut loc la temperaturi mai mari de 70C, timp de 30 minute. c) Extracia asistat de ultrasunete, utiliznd o baie ultrasonic Elmasonic s-a realizat la temperatura de 70C, timp de 30 minute.
8

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

d) Extracia asistat de microunde s-a realizat n instalaia pentru procesare dinamic a substanei n cmp de microunde de putere [186]. Extracia s-a realizat la o putere de 900 W, la o temperatur fixat la 70C i la presiune atmosferic, cu un coeficient de umplere 40%, timp de 2 minute. Timpul total de extracie a fost mai lung dect timpul de aciune a microundelor, deoarece sistemul a avut nevoie de un timp suplimentar de rcire. 4.2.2. Analiza calitativ a compuilor polifenolici 4.2.2.1. Analiza prin cromatografie pe strat subire Identificarea compuilor polifenolici s-a realizat pentru extractele de Satureja hortensis L. obinute prin macerare, refluxare i extracie n cmp de microunde de putere [205]. Din extractele preparate (ES3-ES7) s-au aplicat cu ajutorul unei microseringi Hamilton cte 10 L pe placa cromatografic (10 X 10 cm HPTLC) cu silicagel. Att extractele, ct i standardele au fost aplicate sub form de band de 0,7 cm la 1,5 cm distan de marginea inferioar i lateral a plcii. Ca faz mobil s-a folosit sistemul: n-hexan - acetat de etil - acid formic (30:20:1,5 v/v). Pentru identificare s-au folosit soluii metanolice de luteolin (1 mg/mL) i acid rozmarinic (0,7 mg/mL). Plcile au fost developate pe o distan de 8 cm n camere cromatografice, saturate n prealabil timp de 15 minute. Vizualizarea plcilor s-a realizat dup pulverizarea plcilor cu NTS/PEG 400 (difenilboriloxietilamin /polietilenglicol 400) la 365 nm.
A B C

Luteolin Acid rozmarinic ES3 ES4 ES5 ES6 ES7 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7

Figura 23. Cromatograma extractelor de Satureja hortensis L. (ES3-ES7): A-macerare, B-refluxare, C-extracie n cmp de microunde, alturi de soluiile standard. Faza staionar: TLC Sil G. Faza mobila: n-hexan - acetat de etil - acid formic (30:20:1,5 v/v). Vizualizare: NTS/PEG 400 la 365 nm.

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

4.2.2.2. Analiza prin cromatografie de lichide de nalt performan La analiza calitativ a compuilor polifenolici s-au utilizat extractele de cimbru i busuioc obinute prin refluxare cu sistemul etanol ap (70:30, v/v). Analiza cromatografic s-a realizat cu un sistem Shimadzu, alctuit dintr-o pomp binar, degazor, autosampler, termostat setat la temperatura de 30C, detector PDA i MS. Separarea s-a realizat pe o coloan RP-18 cu o faz mobil de acetonitril i ap (cu acid formic 1%). Eluia ncepe cu un gradient liniar pornind cu acetonitril 5% pn la acetonitril 42% n 5 minute, urmat de o eluie cu un gradient liniar cu acetonitril pn la 35% n 25 minute. Debitul fazei mobile a fost de 0,43 mL/min, iar volumul de injecie de 10 L. n urma analizei calitative a extractului de Satureja hortensis L., prin compararea timpilor de retenie i lungimea de und maxim a substanelor etalon cu timpii de retenie i lungim ea de und maxim a compuilor din probe i dup masa lor molecular s-au identificat urmtorii compui: acid cafeic, acid rozmarinic, luteolina, naringenin i apigenina. n urma analizei calitative a extractelor de Ocimum basilicum L., prin compararea timpilor de retenie, a lungimilor de und corespunztoare maximelor substanelor etalon cu cele ale compuilor din probe i dup masa lor molecular s-au identificat urmtorii compui: acid cafeic, acid rozmarinic. 4.2.3. Analiza cantitativ a compuilor polifenolici Analiza cantitativ a compuilor polifenolici s-a realizat prin dou metode de analiz: spectrofotometrice i cromatografice. 4.2.3.1. Analiza spectrofotometric 4.2.3.1.1. Analiza spectrofotometric a flavonoidelor totale Coninutul total de flavonoide s-a determinat spectrofotometric n urma reaciei cu reactivul AlCl3 [206].

10

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.
Macerare Refluxare Microunde Ultrasonare
Cantitate flavonode totale [mg/g plant]
18 16 14 12 10 8 6 4 2

45
Cantitate flavonoide totale [mg/g plant]

Macerare Refluxare Ultrasonare Microunde

40 35 30 25 20 15 10 5 0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6

ES7

0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7

Figura 30. Diagrama comparativ a cantitii totale de extracie utilizat pentru Satureja hortensis L.

Figura 31. Diagrama comparativ a cantitii totale de extracie utilizat pentru Ocimum basilicum L.

de flavonoide n funcie de solventul folosit i tehnica flavonoide n funcie de solventul folosit i tehnica de

Pentru extracia flavonoidelor din Satureja horetnsis L., extracia prin ultrasonare, folosind amestecul de solveni EtOH-H2O (80:20, v/v), n timp ce pentru extracia flavonoidelor din Ocimum basilicum L., extracia prin ultrasonare, folosind amestecul de solveni EtOH-H2O (60:40, v/v), se arat a fi cea mai bun metod din punct de vedere al cantitii de compus extras i a timpului necesar pentru extracie. 4.2.3.1.2. Analiza spectrofotometric a acizilor polifenolcarboxilici Coninutul total de acizi polifenolcarboxilici (de tip acid cafeic) s-a determinat spectrofotometric n urma reaciei cu reactivul Arnow [207].
Coninut de acizi polifenolcarboxilici [mg/g plant]....

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6

Refluxare Ultrasonare Microunde

Coninut de acizi polifenolcarboxilici [mg/g plant]

20

Macerare

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5

Macerare Refluxare Ultrasonare Microunde

ES7

ES6

ES7

Figura 33. Cantitatea de acizi polifenolcarboxilici extrai din Satureja hortensis L. prin diferite tehnici utiliznd diferite sisteme de extracie.

Figura 34. Cantitatea de acizi polifenolcarboxilici extrai din Satureja hortensis L. prin diferite tehnici utiliznd diferite sisteme de extracie.

11

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Cantitatea de acizi polifenolcarboxilici extrai att din Satureja hortensis L., ct i din Ocimum basilicum L. difer de tehnica de extracie utilizat i de sistemul de extracie utilizat. Astfel, acizii polifenolcarboxilici din cimbru se extrag mai bine cu sistemul de extracie ES3, n timp ce din busuioc sistemul ES5 este cel mai eficient. Ca tehnic de extracie cea mai bun este macerarea, urmat de ultrasonare, refluxare i microunde. 4.2.3.2. Analiza prin cromatografie pe strat subire Din ecuaia dreptelor de calibrare ale acidului rozmarinic i a luteolinei s-au calculat concentraiile acestora n extractele de Satureja hortensis L., iar rezultatele obinute sunt comparate n diagrama prezentat n figurile 37 i 38.
Cantitate acid rozmarinic [mg/g plant] Cantitate luteolin [mg/g plant]

40 30 20 10 0 ES3 ES4 ES5 ES6

Macerare Refluxare Microunde

40

Macerare Refluxare Microunde

30

20

10

0 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7

ES7

Figura 37. Diagrama comparativ a coninutului de acid rozmarinic n extractele studiate.

Figura 38. Diagrama comparativ a coninutului de luteolin n extractele studiate.

Comparnd tehnicile de extracie, se poate observa c cea mai mare cantitate de luteolin i acid rozmarinic se extrage prin refluxare, urmat de macerare. 4.2.3.3. Analiza prin cromatografie de lichide de nalt performan Rezultatele obinute n urma analizei cantitative sunt reprezentate n graficele de mai jos.

12

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Cantitate [mg/g plant]

Cantitate [mg/g plant]

0.8 0.6 0.4 0.2 0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7 Ultrasonare Microunde Refluxare Macerare

6 4 2 0
ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6

Ultrasonare Microunde Refluxare Macerare

ES7
Ultrasonare Microunde Refluxare Macerare

Figura 44. Cantitatea de acid cafeic extras din Satureja hortensis L.

Figura 45. Cantitatea de acid rozmarinic extras din Satureja hortensis L.

Cantitate [mg/g plant]

10
Cantitate [mg/g plant]

0.4 0.3 0.2 0.1 0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7

5 Ultrasonare Microunde Refluxare Macerare

ES7

0
ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6

Figura 46. Cantitatea de luteolin extras din Satureja hortensis L.

Figura 47. Cantitatea de naringenin extras din Satureja hortensis L.

Cantitate [mg/g plant]

4 2 0 Ultrasonare Microunde Refluxare Macerare

ES1

ES2

ES3

ES4

ES5

ES6

Figura 48. Cantitatea de apigenin extras din Satureja hortensis L.

13

ES7

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

0.2

10
Cantitate [mg/g plant]

Cantitate [mg/g plant]

0.15 0.1 0.05 0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7 Ultrasonare Microunde Refluxare Macerare

8 6 4 2 0 ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6 ES7 Ultrasonare Microunde Refluxare Macerare

Figura 49. Cantitatea de acid cafeic extras din Ocimum basilicum L.

Figura 50. Cantitatea de acid rozmarinic extras din Ocimum basilicum L.

Compoziia acestor extracte, nu variaz din punct de vedere calitativ cu tehnica de extracie utilizat. Cantitatea extras, depinde de solventul de extracie folosit i de tipul de compus polifenolic extras, precum i de tehnica de extracie folosit.

CAPITOLUL 5 INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA UNOR COMPUI BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.
5.1. Creterea plantelor luate n studiu n cmp de microunde Plantele luate n studiu au fost crescute n laborator, din semine provenite de la firma ARO. La trei sptmni dup semnare, vasele cu plantele rsrite au fost introduse n dou incinte anechoice identice [209], una de referin i una n care acioneaz cmpul de microunde (figura 51). Acest lot a fost numerotat 1. Alt lot de plante (numai busuioc) a fost introdus n incinte, pentru iradiere, la 20 sptmni dup semnare (alt stadiu de dezvoltare) - lotul 2.

14

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Figura 51. Instalaie pentru stimularea dezvoltrii plantelor prin aplicarea unui cmp electromagnetic de mic putere.

n prima incint de referin (IR) s-a amplasat proba martor, iar n cea de-a doua (IM) proba iradiat cu microunde la frecvena de 2.45 GHz i putere de 14 dBm, radiaie provenit dintr-un router wireless, prin intermediul unei antene special concepute. Iradierea s-a efectuat pe o perioad de dou sptmni, de fiecare dat, dup care plantele au fost scoase din incinte i crescute n camer. 5.2. Determinarea pigmenilor asimilatori Determinarea clorofilelor i a carotenoidelor din plantele de referin i din cele supuse iradierii s-a efectuat doar pe busuioc, deoarece cimbrul a fost mai sensibil la prezena cmpului de microunde i mai multe plante au murit fie n camerele de iradiat, fie dup ce au fost scoase din ele. Probele de plante (1 gram) au fost omogenizate cu ajutorul unui Ultraturrax n prezena a 20 mL 90% aceton n ap i apoi lsate timp de dou ore sub agitare. Se repet extracia cu nc 10 mL 90% aceton n ap pn la decolorarea materialului vegetal. Probele se filtreaz i se nregistreaz spectrul n VIS cu ajutorul unui spectrofotometru UV-VIS de tip Jasco V-530. 5.2.1. Determinarea pigmenilor clorofilieni Calculul concentraiei pigmenilor clorofilieni se face prin citirea absorbiilor la lungimile de und 663, 648 i 470 nm, dup urmtoarele formule: clorofila a ( mg/g esut proaspt ) = ( 11,75 x A 663 2,35 x A 645 ) x 50/ 500 clorofila b ( mg/g esut proaspt ) = ( 18,61 x A 645 3,96 x A 663 ) x 50 / 500 Coninutul n clorofil a i b din probele analizate este prezentat n graficul de mai jos.
15

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 busuioc martor busuioc referin

Clorofila a Clorofila b

Cantitate [mg/g plant].

busuioc iradiat

Figura 58. Coninutul n clorofila a i clorofila b din plantele analizate.

Coninutul n clorofilele a i b este mai mare pentru planta martor luat din natur, dect restul probelor analizate, iar coninutul n clorofila a este ntotdeauna mai mare dect cel n clorofila b. De asemenea, coninutul n clorofilele a i b din plantele supuse microundelor a fost mai mic dect cele din plantele de referin. 5.2.2. Determinarea pigmenilor carotenoidici Pigmenii carotenoidici au fost analizai prin cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC). Sistemul HPLC a constat din pompe LC20 AT Shimadzu i detector Shimadzu PDA. S-a utilizat o coloan YMC C30 (25 cm x 4.6 mm, diametrul particulelor 5 m). Faza mobil a constat din dou amestecuri de solveni: A metanol/metil-tert-butil-eter/ap (81:15:4, v/v) i B format din aceeai componeni n raport de 6:90:4 (v/v). S-a folosit un gradient liniar de la 1% B la 100% B n 90 min. Identificarea carotenoidelor s-a bazat pe comparaia cu timpii de retenie ai standardelor i pe spectrele de absorbie.

Figura 60. Cromatograma HPLC pentru carotenoidele din extractul acetonic de busuioc neiradiat.
16

Figura 61. Cromatograma HPLC pentru carotenoidele din extractul acetonic de busuioc supus n prealabil la microunde.

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Se poate observa c pigmenii carotenoidici majoritari n probele studiate sunt -carotina i luteina, iar ca pigmeni minoritari zeaxantina i -criptoxantina . Extractul obinut a fost trecut n eter etilic, iar coninutul total de carotenoide a fost determinat spectrofotometric dup relaia de mai jos [210]: X (mg carotenoide) = (A x V x 1000)/ (2500 x l x 100) n care: A = absorbia probei citit la max = 450 nm; V = volumul probei (mL); 2500 = coeficient de absorbie molar (E1%) pentru carotenoide; l = 1 cm lungimea cuvei spectrofotometrului (drumul optic).
cantitate carotenoide totale [g/g plant]

80 70 60 50 40 30 20 10 0 busuioc martor busuioc referin busuioc iradiat

Figura 64. Coninutul n carotenoide totale din plantele analizate.

Se poate observa din graficul de mai sus c valorile obinute pentru carotenoidele totale n extractul obinut din planta martor luat din natur este mai mare dect la celelalte probe analizate. De asemenea, coninutul total de carotenoide din plantele supuse microundelor a fost mai mic dect cele din plantele de referin. 5.3. Determinarea influenei microundelor asupra uleiurilor volatile din plantele supuse iradierii Materialul vegetal obinut a fost prelucrat conform protocolului stabilit n capitolul 4, utiliznd metodele de extracie eficiente pentru uleiurile volatile. 5.3.1. Analiza calitativ a uleiurilor volatile Analiza uleiurilor volatile din plantele supuse iradierii cu microunde i din plantele de referin s-a realizat prin cromatografie pe strat subire i cromatografie de gaze cuplat cu spectrometria de mas.
17

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

5.3.1.1.Analiza prin cromatografie pe strat subire Analiza cromatografic a fost realizat conform punctului 4.1.2.1., utiliznd plci HPTLC Sil G F254, amestecul toluen acetat de etil (93:7, v/v) ca faz mobil, pulverizare cu anisaldehid i inspectare n domeniul VIS i UV la 365 nm.

Figura 65. Cromatogramele extractelor de busuioc, alturi de etaloane: C cineol, L linalool. Faza staionar: HPTLC Sil G F254. Faza mobila: toluen acetat de etil (93:7, v/v). Vizualizare: anisaldehid n vizibil (a) i la 365 nm (b).

Figura 66. Cromatogramele extractelor de cimbru, alturi de etaloane: C cineol, L linalool. Faza staionar: HPTLC Sil G F254. Faza mobila: toluen acetat de etil (93:7, v/v). Vizualizare: anisaldehid n vizibil (a) i la 365 nm (b).

La o studiere mai atent a amprentelor cromatografice se observ c: nu apar modificri n amprenta cromatografic, fiind prezeni aceiai compui bioactivi, adic iradierea cu microunde nu a dus la apariia de noi compui; se observ modificri ale concentraiei compuilor bioactivi n plantele radiate fa de cele neiradiate.
18

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

5.3.1.2. Analiza prin cromatografie de gaze cuplat cu spectrometria de mas Analiza GC-MS a extractelor obinute s-a realizat utiliznd un sistem cuplat GC-MS, Thermo Electron Corporation, Trace Ultra / Polaris Q, pornindu-se de la o temperatur de 60C, nclzind n 2 trepte: mai nti cu 10C/min pn la 120C, iar apoi cu 4C pn la 300C. Temperatura de injectare a fost de 250C, iar volumul injectat 2 L. Coloana capilar utilizat a fost DB5, 30 m.

a)

b)
Figura 67. Cromatogramele GC-MS ale extractelor de cimbru: a) planta de referin; b) planta iradiat cu microunde.

Din cromatograme se observ c extractele de cimbru conin o cantitate mare de timol i carvacrol. Cimbrul de referin i cel iradiat conin aceiai compui majoritari, dar n cantiti mai mari n cel iradiat (mai mult camphen, borneol, timol, carvacrol, leden-oxid etc).

19

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

a)

b)
Figura 68. Cromatogramele GC-MS ale extractelor de busuioc: a) planta referin; b) planta iradiat cu microunde.

n cazul busuiocului iradiat s-a gsit un coninut mare de terpene, sesquiterpene i diterpene, pe lng hidrocarburi i ali compui. La fel ca i n cazul cimbrului, planta iradiat e mai bogat n compui bioactivi, rezultat observat i prin celelalte tehnici de analiz utilizate. 5.3.2. Analiza cantitativ a uleiurilor volatile Determinarea cantitativ a uleiurilor volatile s-a realizat prin dou metode, una bazat pe trasarea curbelor de calibrare i determinarea concentraiilor din ecuaiile dreptelor, iar a doua, bazat pe determinarea procentului din fiecare ulei volatil aflat n compoziie. 5.3.2.1. Analiza prin cromatografie de gaze cu detector de ionizare n flacr Utiliznd curbele de calibrare nregistrate, s-a determinat i compoziia n ulei volatil g/g plant pentru cteva uleiuri volatile.

20

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Tabel 13. Cantitatea de ulei volatil determinat pe gram de plant. Limonen Terpineol Citronelol Timol Carvacrol Eugenol (g/g (g/g (g/g (g/g (g/g (g/g plant) plant) plant) plant) plant) plant) Busuioc iradiat, lot 1 4,33 1,13 6,12 156,76 Busuioc neiradiat, lot 1 2,87 1,10 1,15 81,00 Busuioc iradiat, lot 2 8,24 0,82 0,73 93,96 Busuioc neiradiat, lot 2 2,22 0,82 0,62 61,44 Cimbru iradiat 1218,84 7,05 Cimbru neiradiat 825,61 148,2 5.3.2.2. Analiza prin cromatografie de gaze cuplat cu spectrometria de mas S-au nregistrat prin GC-MS (figurile 71 i 72), cromatogramele extractelor i s-a determinat procentul de uleiuri volatile coninut n extracte.
_____ cimbru iradiat cu microunde _____ cimbru neiradiat

Planta

Figura 74. Cromatograma cimbrului iradiat i neiradiat cu microunde.

_____ busuioc iradiat cu microunde _____ busuioc neiradiat

Figura 75. Cromatograma busuiocului iradiat i neiradiat cu microunde, lotul 1.

21

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Pentru cromatogramele nregistrate s-a realizat integrarea tuturor picurilor, suma ariilor reprezentnd 100%. Pe baza ariilor determinate prin integrare s-a stabilit procentul cu care contribuie compuii identificai la compoziia extractelor obinute. Din cromatogramele nregistrate, att prin GC-FID, ct i prin GC-MS s-a constatat c: compoziia chimic a extractelor din plantele iradiate cu microunde i neiradiate este aceeai, dar cantitatea de uleiuri volatile difer. Aceasta difer i n funcie de stadiul de dezvoltare al plantei. n cazul busuiocului: - componenii majori sunt: metil-iso-eugenol, eugenol, limonen, linalool, metil pmetoxicinnamat, iso-ledena; - busuiocul iradiat conine o cantitate mult mai mare de metil-iso-eugenol (de 6,7 ori mai mare) i eugenol (aproape dublu) dect cel neiradiat; - busuiocul din lotul 2 conine borneol, care n lotul 1 este n urme. n cazul cimbrului: - componentul majoritar este timolul, nsoit de o cantitate foarte mic de carvacrol; - ambele tipuri de extracte conin cariophyllene n cantitate aproximativ egal; - n cimbrul iradiat crete foarte mult cantitatea de triciclene (de 6 ori). 5.4. Determinarea influenei microundelor asupra compuilor polifenolici din plantele supuse iradierii Pentru caracterizarea plantelor iradiate i neiradiate cu microunde compuii polifenolici au fost extrai cu metoda de extracie stabilit anterior. n acest sens 0,5 g de plant iradiat i neiradiat au fost extrase n 40 mL amestec etanol ap (80:20, v/v), n cazul Saturejei hortensis L., respectiv n 40 mL amestec etanol ap (60:40, v/v), n cazul Ocimum basilicum L. prin ultrasonare timp de 30 minute. Rezultatele obinute la plantele supuse tratamentelor cu microunde au fost analizate i interpretate comparativ cu datele nregistrate la plantele de referin, cultivate n condiii similare fr ns a fi supuse iradierii. 5.4.1. Analiza calitativ a compuilor polifenolici Cromatogramele obinute pentru extractele din planta iradiat i neiradiat sunt prezentate n figurile 76 i 77.
22

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.
mAU 330nm4nm (1.00) 1250 mAU 1750 330nm4nm (1.00)

1500

1000

1250

1000 750
acid rozmarinic
acid rosmarinic

750

500
acid cafeic

naringenin

0 2.5 5.0 7.5

luteolina

250

0 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0.0 2.5 5.0 7.5

10.0

luteolina naringenin

250

acid cafeic

500

12.5

15.0

17.5

min

a)

b)
obinute prin ultrasonare cu amestec EtOH H2O (80:20, v/v).

Figura 76. Cromatogramele extractelor de Satureja hortensis L.: a) neiradiat, b) iradiat

acid rozmarinic

2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750

acid cafeic

2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0
acid cafeic

500 250 0 2.5 5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

min

2.5

5.0

7.5

acid rozmarinic

mAU 330nm4nm (1.00)

mAU 330nm4nm (1.00)

10.0

12.5

15.0

17.5

min

a)

b)
ultrasonare cu amestec EtOH H2O (60:40, v/v).

Figura 77. Cromatogramele extractelor de Ocimum basilicum L.: a) neiradiat, b) iradiat obinute prin

n urma analizei calitative s-au identificat acidul cafeic i rozmarinic att n extractele de cimbru, ct i n extractele de busuioc. Pe lng aceti compui n extractele de cimbru s -au identificat luteolina i naringeninul. 5.4.2. Analiza cantitativ a compuilor polifenolici Analiza cantitativ a compuilor polifenolici s-a realizat prin dou metode de analiz: spectrofotometrie i cromatografie de lichide de nalt performan.
23

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

5.4.2.1. Analiza spectrofotometric a compuilor polifenolici Prin analiza spectrofotometric s-a determinat coninutul total de flavonoide i de acizi polifenolcarboxilici (de tip acid cafeic). 5.4.2.1.1. Analiza spectrofotometric a flavonoidelor totale
Cantitatea de flavonoide totale [mg/g plant]

7 6 5 4 3 2 1 0 planta neiradiat planta iradiat

Busuioc Cimbru

Figura 78. Diagrama comparativ a cantitii totale de flavonoide.

Se observ c n plantele iradiate cantitatea de flavonoide este mai mare dect n plantele de referin. 5.4.2.1.2. Analiza spectrofotometric a acizilor polifenolcarboxilici

Cantitate de acizi polifenolcarboxilici [mg/g plant]

Busuioc 3 Cimbru

0 planta neiradiat planta iradiat

Figura 79. Diagrama comparativ a cantitii de acizi polifenolcarboxilici de tip acid cafeic.

Cantitatea de acizi polifenolcarboxilici att n cimbru, ct i n busuioc crete n plantele iradiate fa de cele de referin.
24

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

5.4.2.2. Analiza prin cromatografie de lichide de nalt performan

Cantitate compui polifenolici [mg/g plant]

0.2

0.174 0.123 0.104

planta iradiat planta neiradiat

0.1
0.057 0.023 0.022 0.009 0.006

0 acid cafeic acid rozmarinic luteolina naringenin

Figura 80. Diagrama comparativ a cantitii de compui polifenolcarboxilici din Satureja hortensis L.
Cantitate compus polifenolic [mg/g plant]

12 10 8 6 4 2
0.163

planta iradiat plantade referin

10.785

6.829

0.024

acid cafeic

acid rosmarinic

Figura 81. Diagrama comparativ a cantitii de compui polifenolcarboxilici din Ocimum basilicum L.

Compuii majoritari att n cimbru, ct i n busuioc sunt acidul rozmarinic i acidul cafeic. De asemenea se poate observa c n plantele supuse iradierii cu microunde cantitatea de compui polifenolici este mai mare dect n plantele de referin. 5.5. Studii privind modificarea caracterului antioxidant n timpul iradierii plantelor cu microunde Determinarea caracterului antioxidant s-a efectuat doar pe busuioc, deoarece o mare parte din cimbru au murit nainte de a fi scoase din camere.

25

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

5.5.1. Prepararea probei Pentru determinarea caracterului antioxidant al busuiocului s-au luat n studiu frunze proaspete iradiate i neiradiate, din aceeai cultur din care s-au determinat polifenolii. Un gram de frunze proaspete s-a mojarat cu 1 g nisip cuaros dup care s-a adugat 25 mL etanol 80%. Amestecul s-a agitat timp de 1 h la 4C dup care s-a centrifugat la 10000 rpm timp de 15 minute. Supernatantul s-a ndeprtat, iar pelteul s-a reluat cu 5 mL etanol 80%, s-a agitat timp de 15 minute i s-a centrifugat urmnd aceeai procedur. Supernatantele s-au reunit n final. Fiecare prob s-a extras independent n triplicat, iar analizele s-au efectuat n aceeai zi. 5.5.2. Determinarea caracterului antioxidant al plantelor iradiate i neiradiate 5.5.2.1. Metoda DPPH Metoda DPPH este des utilizat datorit stabilitii, simplitii i reproductibilitii sale [213]. Activitatea antioxidant determinat prin testul DPPH pentru busuiocul iradiat este diferit de aceea a busuiocului de referin care prezint o activitate antioxidant mai sczut.

70 60

63.6 48.2

Trolox mM/g plant

50 40 30 20 10 0 busuioc iradiat busuioc referin

Figura 83. Activitatea antioxidant al extractelor alcoolice analizate prin metoda DPPH.

5.5.2.2. Metoda ORAC S-a utilizat metoda descris de Huang i colaboratorii [215]. Valorile ORAC au fost calculate aa cum sunt descrise de Cao i Prior [216].
26

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

60 50
TE mM/g plant

52.2 46

40 30 20 10 0 busuioc iradiat busuioc referin

Figura 85. Activitatea antioxidant a extractelor alcoolice analizate prin metoda ORAC.

Extractul de busuioc iradiat (52,2 mM TE/g plant) prezint o mai mare valoare ORAC n comparaie cu extractul de busuioc referin (46 mM TE/g). 5.5.2.3. Metoda TROLOX Pentru testul ABTS, protocolul urmeaz metoda propus de Arnao [212].
55.3 44.3

60 50
Trolox mM/g plant

40 30 20 10 0 Busuioc iradiat Busuioc referin

Figura 87. Activitatea antioxidant a extractelor alcoolice analizate prin metoda TEAC.

Extractul de busuioc iradiat are o activitate antioxidant semnificativ mai mare n comparaie cu valoarea TEAC obinut pentru extractul de busuioc referi.

27

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Concluzii
Teza de doctorat a avut ca obiectiv principal determinarea efectului microundelor asupra compuilor bioactivi prezeni n: Satureja hortensis L. (cimbrul de grdin) i Ocimum basilicum L. (busuiocul). n urma cercetrilor efectuate s-au constatat urmtoarele: Compoziia extractelor obinute prin macerare, refluxare, ultrasonare sau n cmp de microunde de putere nu variaz din punct de vedere calitativ cu tehnica de extracie utilizat. Cantitatea extras, depinde de solventul de extracie folosit, de tipul de compus bioactiv extras i de tehnica de extracie utilizat. Condiiile eficiente de extracie a uleiurilor volatile din cimbru i busuioc,utiliznd tehnicile GC-FID i TLC sunt: ultrasonarea n hexan - eter etilic (1:1, v/v) pentru cimbru i extracie n cmp de microunde n eter etilic - etanol (1:1, v/v) pentru busuioc. Aceste condiii au fost utilizate n continuare pentru analiza plantelor iradiate i neiradiate cu microunde. Metoda optim de extracie a compuilor polifenolici (flavonoide i acizi polifenolcarboxilici) este ultrasonarea timp de 30 minute cu un amestec de etanol ap (80:20, v/v) n cazul cimbrului i cu etanol ap (60:40, v/v) n cazul busuiocului, metod care a fost utilizat ulterior la extracia compuilor polifenolici din plantele iradiate i neiradiate cu microunde. Modificarea condiiilor de cretere a influenat att dezvoltarea plantelor, ct i compoziia compuilor biologic activi urmrii n acest studiu. n ceea ce privete dezvoltarea plantelor s-au observat urmtoarele: dezvoltare similar a plantelor iradiate comparativ cu cele neiradiate (referin) n primele dou luni dup iradiere; dup dou luni de la iradiere diferena dintreplantele iradiate i cele neiradiate a devenit vizibil. Plantele iradiate s-au dezvoltat mai puternic, au fost mai verzi, au nflorit mai repede cu 3 sptmni i au prezentat tendin de ramificare mult mai mare dect plantele referin. Coninutul n clorofilele a i b, precum i coninutul total de carotenoide din plantele supuse microundelor a fost mai mic dect cele din plantele de referin. Din cromatogramele obinute prin HPLC nu se observ modificri eseniale din punct de vedere calitativ, n extractul de busuioc iradiat, doar -criptoxantina dispare sau e numai n urme.

28

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Analiznd extractele de uleiuri volatile s-a constatat c timolul i carvacrolul sunt componenii majoritari ai cimbrului, iar n busuioc s-a gsit o cantitate mare de terpene, sesquiterpene i diterpene. Acest lucru a fost observat prin TLC, GC-FID i confirmat de GC-MS, existnd o bun corelare ntre cele trei tehnici de analiz. Metoda TLC a stabilit amprenta cromatografic a cimbrului i busuiocului, att iradiat ct i neiradiat i a condus la urmtoarele concluzii: n urma iradierii nu apar compui bioactivi noi; n general, plantele iradiate au un coninut mai ridicat de compui bioactivi; cantitatea de uleiuri volatile depinde de stadiul de maturizare al plantei (lotul 2 prezint o amprent mai intens dect lotul 1), n cazul stadiilor incipiente de dezvoltare se recomand urmrirea compuilor precursori uleiurilor volatile. GC-MS, ca i celelalte metode de analiz utilizate, a artat c n plantele iradiate coninutul n compui bioactivi este mai mare dect n cele de referin. Astfel, exist o bun corelare ntre cele trei metode. n cimbru s-au gsit ca i componeni majoritari timolul i carvacrolul, iar n busuioc s-a gsit o cantitate mare de terpene, sesquiterpene i diterpene. Cantitatea de uleiuri volatile difer i n funcie de stadiul de dezvoltare al plantei (busuioc). n planta iradiat cantitatea total de flavonoide i acizi polifenolcarboxilici (de tip acid cafeic) determinat spectrofotometric este mai mare dect n planta de referin. Acest lucru a fost confirmat prin HPLC. Astfel, cantitatea de flavonoide, respectiv acizi polifenolcarboxilici n cimbrul iradiat este de 35,7%, respectiv 0,89% mai mare dect n cimbrul de referin, n timp ce n busuiocul iradiat este de 24,3%, respectiv 11,59% mai mare dect n busuiocul de referin. Prin HPLC cantitatea compuilor polifenolcarboxilici identificai (acid cafeic, acid rozmarinic, luteolina, naringenina i apigenina) n extractele obinute din cimbrul i busuiocul iradiat este mai mare dect n plantele de referin. Extractul obinut din busuioc iradiat are o activitate antioxidant mai mare dect extractul din planta de referin, fapt dovedit prin cele trei metode de determinare utilizate: DPPH, TEAC, ORAC. S-a observat o strns legtur ntre variaia caracterului antioxidant i coninutul de polifenoli din extractele plantelor studiate, ambele nregistrnd o cretere n plantele iradiate cu microunde.

29

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

Bibliografie
1. L.M. Penafiel, T. Litovitz, D. Krause, A. Desta, J.M.L. Mullins, Bioelectromag., 18, 1997, 132-141. 2. T.A. Litovitz, L.M. Penafield, J.M. Farrel, D. Krause, R.Meister, J.M. Mullins, Bioelectromag., 18, 1997, 422-430. 3. G.J. Hyland, Eng. Sci. Educ. J., 7(6), 1998, 261-269. 186. E. Surducan, V. Surducan, Romanian Patent, RO- 122063, 2008. 187. M.L. Soran, C. Varodi, S.C. Cobzac, I. Lung, J. Essent. Oil Bear. Pl., 14(6), 2011, 699-707. 188. M.L. Soran, S.C. Cobzac, C. Varodi, I. Lung, E. Surducan, V. Surducan, Studia UBB Chemia, LV(3), 2010, 31-38. 189. M.L. Soran, S.C. Cobzac, C. Varodi, I. Lung, E. Surducan, V. Surducan, JPCS, 182, 2009, 012016. 205. I. Bro, M.L. Soran, R.D. Briciu, S.C. Cobzac, J. Planar Chromatogr. Mod. TLC, 22(1), 2009, 25-28. 206. XXX Farmacopea Romn X, Ed. Medical, Bucureti, 1993. 207. XXX Farmacopea Romn IX, Ed. Medical, Bucureti, 1976. 209. E. Surducan, V. Surducan, A. Halmagyi, Romanian Patent, RO 125068/28.02.2012. 210. G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander, Carotenoids, Volume 1A: Isolation and Analysis, Birkhuser Verlag, Basel, Boston, Berlin, 1995. 212. M. B. Arnao, A. Cano, J. F. Alcolea, M. Acosta, Phytochem Anal., 12(2), 2001, 138-143. 213. T. Katsube, H. Tabata, Y. Ohta, Y. Yamasaki, E. Anuurad, K. Shiwaku, Y. Yamane, J. Agric. Food Chem., 52(8), 2004, 2391-2396. 215. D. Huang, B. Ou, M. Hampsch-Woodill, J. A. Flanagan, R. L. Prior, J. Agric. Food Chem., 50, 2002, 4437-4444. 216. G. Cao, R. L. Prior, Methods Enzymol., 299, 1999, 50-62.

30

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

LISTA DE LUCRRI TIINIFICE ELABORATE

A. Lucrri publicate pe tematica abordat

1. Effect of microwave irradiation on polyphenolic compounds from Satureja hortensis L. I. Lung, M.L. Soran, C. Tudoran, C. Mruoiu Central European Journal of Chemistry (acceptat spre publicare) 2. Essentials Oils Determination from Satureja hortensis L. by Chromatographic Techniques M.L. Soran, C. Varodi, S.C. Cobzac, I. Lung Journal of Essential Oil Bearing Plants, 14(6), 2011, 699-707. 3. HPTLC Analysis of Thymol in Extracts of Satureja hortensis L. Obtained by Different Techniques M.L. Soran, I. Lung Journal of Planar Chromatography Mod. TLC, 23(5), 2010, 320-322. 4. Extraction and chromatographic determination of essentials oils from Ocimum basilicum L. leaves M.L. Soran, S.C. Cobzac, C. Varodi, I. Lung, E. Surducan, V. Surducan Studia Universitatis Babes-Bolyai, Chemia, LV(3), 2010,31-38. 5. HPTLC Quantification of Some Flavonoids in Extracts of Satureja hortensis L. Obtained by Use of Different Techniques I. Bro, M.L. Soran, R.D. Briciu, S.C. Cobzac Journal of Planar Chromatography Mod. TLC, 22(1), 2009, 25-28. 6. The extraction and chromatographic determination of the essentials oils from Ocimum basilicum L. by different techniques M.L. Soran, S.C. Cobzac, C. Varodi, I. Lung, E. Surducan, V. Surducan Journal of Physics: Conference Series, 182, 2009, 012016

31

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROUNDELOR ASUPRA COMPUILOR BIOACTIVI DIN SATUREJA HORTENSIS L. I OCIMUM BASILICUM L.

C. Lucrri publicate n rezumat la conferine, simpozioane naionale i internaionale (selecie)

1. Determination of phenolic compounds from Ocimum basilicum L. by different extraction methods I. Lung, M.L. Soran, M. Stan, E. Surducan, C. Mruoiu Second International Conference on Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences IC-ANMBES, 2012, 24 27 Mai, Braov, Romnia 2. Change the antioxidant character of basil by growth in microwave field I. Lung, M.L. Soran, C. Matea, C. Bele International Conference Processes in Isotopes and Molecules PIM, 2011 29 Septembrie 01 Octombrie, Cluj-Napoca, Romnia 3. Essentials Oils Determination from Satureja Hortensis L. By Chromatographic Techniques I. Lung, M.L. Soran, S.C. Cobzac 34th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, 2009, 28 Iunie 2 Iulie, Dresda, Germania 4. HPLC Analysis of flavonoids from Satureja Hortensis L. I. Bro, M.L. Soran, C. Bele, E. Surducan, V. Surducan, C. Tudoran 4th meeting on CHEMISTRY AND LIFE, 2008, 9-11 Septembrie, Brno, Cehia 5. Different extraction techniques of flavonoid bioactive compounds from Satureja hortensis L. and HPTLC analysis I. Bro, M.L. Soran, I. Spinu, S.C. Cobzac International Symposium for High Performance Thin-Layer Chromatography, 2008, 11-13 Iunie, Helsinki, Finlanda

32