Sunteți pe pagina 1din 4

Citogenetica moleculara - tehnicile FISH

Introducere Citogenetica se refera la un capitol al geneticii care cuprinde o gama vasta de metode de studiu si diagnostic dedicate cromosomopatiilor. Tehnicile clasice de analiza cromosomiala, printre cele mai utilizate fiind cariotiparea cu marcajul in benzi al cromosomilor umani, reprezinta o categorie de tehnici de baza in realizarea unui diagnostic cromosomial corect, atat prenatal fetal cat si postnatal. Analiza cromosomilor bandati a reprezentat timp de decenii unica alternativa de identificare a unor anomalii cromosomiale numerice sau de structura. Citogenetica conventionala prezinta uneori insa unele limitari, in principal reprezentate de: imposibilitatea evidentierii anomaliilor cromosomiale care se situeaza sub limita de rezolutie a microscopiei optice conventionale - impiedica in destule cazuri stabilirea unui diagnostic citogenetic corect, cu implicatii in acordarea sfatului genetic; durata necesara efectuarii analizelor de citogenetica clasica - intarzie, independent de vointa examinatorului, elaborarea unui rezultat si implicit capacitatea pacientului/pacientilor de a lua o decizie informata, ceea ce poate avea implicatii majore, in special in cazul diagnosticului prenatal. Tehnicile de citogenetica moleculara sau tehnicile FISH (fluorescent in situ hybridisation), prin care se realizeaza marcajul cromosomilor cu ajutorul unor coloranti fluorescenti, au inceput sa fie utilizate si diversificate incepand cu anii 80. Aceasta categorie de tehnici, cu prinde si tehnici de marcaj a unor molecule de ARN si/sau proteine pe langa marcajul aplicat unor molecule de ADN. In principiu, daca ne referim la ADN, este vorba despre modalitati prin care, un cromosom in intregime sau fragmente de cromosom pot fi marcate si detectate cu ajutorul unor coloranti fluorescenti denumiti fluorofori sau fluorocromi. Principiul tehnicii FISH Consta in hibridizarea ADN-ului in situ, adica pe lama de microscopie cu fragmente de ADN (sau ARN) artificial obtinute, denumite sonde, si care sunt marcate cu un fluorofor, pe baza de complementaritate a secventei intre zona de ADN tinta si secventa sondei de ADN. Prin urmare: daca fragmentul tinta se regaseste in genom, in acel loc, apare un semnal fluorescent dupa hibridizare, ce va fi detectat in lumina ultravioleta (UV); absenta fragmentului, duce la absenta hibridizarii si deci, la absenta semnalului fluorescent pe lama (exp. deletii cromosomiale). Marcarea sondelor se poate face: direct - cu un fluorofor atasat, sau indirect - prin atasarea unor haptene (molecule ce pot fi ulterior detectate printr-o reactie specifica cu un anticorp monoclonal marcat, dupa modelul unei reactii antigen-anticorp)

- tehnica presupune etape suplimentare pentru detectia fragmentului de ADN hibridizat in situ. Sondele utilizate in tehnicile FISH pot fi achizitionate sub forma de kit-uri care contin toate ingredientele necesare realizarii tehnicii sau pot fi obtinute in laborator (home made) si ulterior marcate, in cazul laboratoarelor care detin tehnologia si personalul necesar.

Etapele principale ale tehnicii FISH 1. 2. Prelevarea probei biologice; Realizarea: - preparatului cromosomial pe lama (asemanator unui cariotip clasic) sau - etalarea directa a celulelor recoltate de la pacient (marcajul unor regiuni din molecula de ADN nu impune neaparat ca acesta sa fie condensat sub forma de cromosom metafazic); 3. 4. 5. Denaturarea termica a moleculelor de ADN = separarea celor doua catene; Hibridizarea ADN-ului tinta cu sondele marcate - peste noapte, 37C, in atmosfera umeda; Eliminarea sondelor in exces, nehibridizate, de pe lama - prin spalarea acesteia cu solutii tampon specifice; 6. Detectia semnalelor fluorescente pe lama cu un microscop dotat cu unitate de fluorescenta (lumina UV); 7. Interpretarea si elaborarea unui diagnostic.

Stadiile ciclului celular in care se poate marca ADN-ul prin tehnica FISH Prin metodele clasice evidentierea cromosomilor si implicit analiza unor fragmente cromosomiale se poate face, in general, doar in metafaza. Tehnica FISH nu necesita obligatoriu prezenta ADN sub forma condensata (cromosom). Pot fi marcati: cromosomi in metafaza - presupune parcurgerea etapelor tehnicilor de cariotipare clasica, pentru obtinerea unor preparate cromosomiale pe lama de microscopie; cromosomi elongati, in prometafaza; fibra de cromatina; in interfaza.

Variantele tehnicii FISH Standard FISH - marcarea unui/unor fragmente de ADN specifice; M-FISH (multicolor FISH) - detectia simultana cu sonde diferite marcate fiecare cu alt fluorofor a unor fragmente sau perechi de cromosomi diferite; CM -FISH (centromeric multicolor FISH) - marcarea simultana cu fluorofori diferiti a centromerelor apartinand unor perechi diferite de cromosomi;

TM-FISH(telomeric multicolor FISH) - marcarea telomerelor diferitilor cromosomi; SKY- FISH (spectral FISH) - marcarea cu fluorofori diferiti a diferitelor fragmente pe acelasi cromosom; CGH (comparative genomic hybridisation) - tehnica destul de laborioasa si automatizata prin care se realizeaza compararea a doua tipuri de ADN (spre exemplu normal si tumoral) pentru detectia unor anomalii cromosomiale cantitative, imposibil de diagnosticat prin tehnicile clasice de ciotgenetica.

FISH versus citogenetica clasica Limitari ale tehnicilor clasice de citogenetica cu bandare G, Q sau R: o o Limita de rezolutie - pot fi detectate anomaliile cromosomiale peste 4-5 Mb; Necesita ADN sub forma de cromosom metafazic - presupune obtinerea de celule in faza de diviziune (asadar durata mare pana la obtinerea unui rezultat, datorita necesitatii culturii celulare) dificultatea de a elucida uneori rearanjarile cromosomiale, mai ales cele multiple, complexe. Rezolutia (limita de detectie a unor anomalii cromosomiale) prin tehnicile FISH cromosomi in metafaza 2-5 Mb; ADN in interfaza 0,2-2 Mb; fibra de cromatina sau cromosomi elongati (tehnici speciale) 5-500 Kb.

Tipuri de sonde utilizate in tehnicile FISH Sonde centromerice - marcheaza zonele pericentromerice cromosomiale; Sonde locus specifice - pot marca un anumit fragment de interes (locus); Sonde pentru painting cromosomial - marcajul in intregime a unui/unor cromosomi sau parti de cromosom;

Aplicatiile tehnicilor FISH Tehnicile FISH sunt aplicate astazi atat in diagnostic cat si in cercetare, datorita posibilitatii lor de a evidentia unele anomalii ale structurii moleculelor de ADN cu mare precizie si specificitate, astfel pot fi efectuate: determinari cantitative la nivelul ADN (CGH); detectia unor deletii si duplicatii de dimensiuni foarte mici (exemplu microdeletiile); localizarea unor fragmente de ADN in genom; punerea in evidenta a unor fragmente de ADN exogen; marcarea si detectia unor cromosomi in intregime sau a unor fragmente de cromosom; diagnosticul extrem de precis al unor anomalii cromosomiale (deletii, duplicatii, translocatii) si mai ales a unor anomalii cromosomiale complexe (multiple); diagnosticul unor rearanjari intracromosomiale (in interiorul aceluiasi cromosom); detectia precisa a perechilor de cromosomi (tehnicile M-FISH); diagnosticul unor aneuploidii de tipul trisomiilor sau monosomiei X (cu ajutorul sondelor centromerice);

diagnosticul sexului genetic (cu aplicatii mai ales in diagnosticul prenatal).

Avantajele tehnicilor FISH: rapide in comparatie cu tehnicile clasice de analiza a cariotipului prin bandare (utilitate deosebita mai ales in cazul diagnosticului prenatal al unor anomalii cromosomiale precum sindromul Down); permit un diagnostic precis si specific datorita principiului de hibridizare pe baza de complementaritate a secventelor intre ADN tinta si sondele marcate; posibilitatea diagnosticului unor anomalii cromosomiale complexe, permitand identificarea precisa a punctelor de ruptura si a fragmentelor cromosomiale implicate; permit diagnosticul de preimplantare al anomaliilor cromosomiale in cazul embrionilor obtinuti prin procedee de fertilizare in vitro (reproducere umana asistata).

Dezavantajele tehnicilor FISH: Costurile destul de ridicate (inca) ale sondelor de ADN marcate (costurile pot fi reduse in cazul in care laboratorul are posibilitatea de a-si prepara singur sondele utilizate in tehnica FISH); Necesita aparatura si software de analiza si interpretare a rezultatelor (costisitoare); Lamele trebuie citite rapid fiind vorba de tehnici de fluorescenta; Nu se poate aplica de rutina (datorita tuturor considerentelor enuntate anterior).

De retinut: tehnica FISH se aplica doar in situatii bine determinate, de obicei atunci cand se stie exact ce fragment se doreste a fi marcat: fie dupa determinarea cariotipului prin metode standard cu bandare G sau R, pentru clarificarea diagnosticului; fie de prima intentie in diagnosticul cromosomial (mai ales prenatal) - datorita faptului ca se poate determina rapid (fara cultivarea celulelor) numarul unor cromosomi dintr-o anumita pereche (ex. cromosomul 21) prin utilizarea sondelor centromerice. ofera informatii limitate la fragmentul/fragmentele sau cromosomul/cromosomii marcati si nu ofera informatii asupra intregului set cromosomial (cu exceptia cazului in care se marcheaza toate perechile de cromosomi in intregime) poate constitui un dezavantaj atunci cand nu se cunoaste anomalia cromosomiala posibila intr-un anume caz. In concluzie, la ora actuala, tehnicile FISH constituie tehnici foarte utile, sensibile si specifice de diagnostic al unor anomalii, insa in acelasi timp reprezinta mai degraba tehnici complementare tehnicilor de citogenetica clasica cu marcaj in benzi al cromosomilor umani.