Fraccionamiento de las clulas

Organelos y macromolculas pueden separarse por ultracentrifugacin

Las clulas pueden dividirse de varias maneras: pueden ser sometidos a un choque osmtico o vibracin ultrasnica, forzada a travs de un pequeo orificio, o molido en la licuadora. Estos procedimientos rompen muchas de las membranas de las clulas (membrana plasmtica y las membranas del retculo endoplsmico) en fragmentos que inmediatamente se sellan para formar pequeas vesculas cerradas.
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 Sin embargo, dejan intactos organelos, como ncleos, mitocondrias, el complejo de Golgi, lisosomas, peroxisomas. Un homogeneizado o extracto contiene la suspensin de clulas, variedad de membranas, organelos, cada uno con distintos, tamao, carga y densidad. Como el medio de homogeneizacin ha sido cuidadosamente elegido, los componentes, incluyendo las vesculas procedentes del retculo endoplasmtico, (microsomas) conservan la mayor parte de sus propiedades bioqumicas originales.
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La ultracentrfuga preparativa
La muestra se coloca en los tubos que se insertan en un anillo de agujeros cilndricos en un rotor de metal. La rpida rotacin del rotor genera enormes fuerzas centrfugas, que hacen que las partculas en la muestra se sedimente.

El vaco reduce la friccin, impide que el rotor se caliente, y permite que el sistema de refrigeracin mantenga la muestra a 4 C.
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La ultracentrfuga preparativa

Fraccionamiento de la clula por centrifugacin

Centrifugado repetido a velocidades cada vez ms elevados permite fraccionar homogeneizados de clulas en sus componentes, por el tamao y la densidad. Cuanto menor es el componente subcelular, mayor es la fuerza centrfuga para separarlo. Estos fraccionamientos celulares se realiza en una ultracentrfuga, en la que los extractos de clulas rotas se giran a altas velocidades.
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Los valores tpicos de los pasos de centrifugacin

baja velocidad 1000 veces la gravedad durante 10 minutos. clulas, ncleo, citoesqueleto

velocidad media 20.000 veces la gravedad durante 20 minutos. mitocondrias, lisosoma, peroxisoma
alta velocidad 80.000 veces la gravedad por 1 hora. Microsomas, pequeas vesculas. 150.000 veces la gravedad por 3 horas. Ribosomas, virus, macromolculas 7

muy alta velocidad

 Todas estas fracciones son impuras, pero muchos de los contaminantes pueden ser removidos al resuspender el precipitado y repetir el procedimiento de centrifugacin en varias ocasiones. La centrifugacin es el primer paso en la mayora de fraccionamientos, pero slo separa los componentes que difieren mucho en tamao.

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Comparacin de la velocidad de sedimentacin y sedimentacin de equilibrio

En la velocidad de sedimentacin los componentes subcelulares se separan a diferentes velocidades en funcin de su tamao y se forma en capas sobre una solucin diluida que contiene sacarosa.

Para estabilizar las bandas sedimentadas el tubo contiene un gradiente continuo de sacarosa poco profundas que los aumentan en concentracin hacia la parte inferior del tubo (normalmente del 5% al 20% de sacarosa).
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 Despus de la centrifugacin, los diferentes componentes se pueden recoger de forma individual, la mayora con slo pinchar el tubo de centrfuga de plstico y recoger las gotas de la parte inferior.
En la sedimentacin de equilibrio los componentes subcelulares se desplazan hacia arriba o hacia abajo cuando se centrifuga en un gradiente hasta alcanzar una posicin en la que su densidad es igual con su entorno. Los gradientes ms densos, que son tiles para la separacin de protena y cidos nucleicos, se puede formar a partir de cloruro de cesio.
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En las preparaciones tpicas de las clulas animales

El RER (densidad = 1,20 g /cm 3) se separa de las vesculas de Golgi (densidad = 1,14 g /cm 3) y de la membrana plasmtica (densidad = 1,12 g /cm 3). La densidad ms alta del RER se debe en gran medida a los ribosomas unidos a l.

Este mtodo tambin funciona bien para la separacin de los lisosomas, las mitocondrias y peroxisomas en la fraccin inicial mixta obtenida por centrifugacin diferencial.
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La separacin de las molculas por cromatografa de columna

La muestra, una mezcla de molculas diferentes, se aplica a la parte superior de una columna llena de una matriz slida permeable, como la celulosa, inmerso en el disolvente.

Gran cantidad de solvente es bombeada lentamente a travs de la columna y se recoge en tubos separados. Debido a los diversos componentes del recorrido de la muestra a diferentes velocidades a travs de la columna, se fraccionan en diferentes tubos.
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 Las protenas son a menudo fraccionados por cromatografa en columna, en la que se pasa una mezcla de protenas en solucin a travs de una columna que contiene una matriz slida y porosa.

Las protenas son retrasados, por su interaccin con la matriz, y pueden ser recogidos por separado.
Dependiendo de la matriz, las protenas se pueden separar en funcin de su carga (cromatografa de intercambio inico), su hidrofobicidad (cromatografa hidrofbica), su tamao (cromatografa de gel filtracin), o su capacidad de ligarse a determinadas molculas pequeas o con otros macromolculas (cromatografa de afinidad), HPLC.
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La separacin de las molculas por cromatografa de columna

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Electroforesis de poliacrilamida SDS-PAGE

El tamao y la Subunidad de una protena puede ser determinada por electroforesis de poliacrilamida SDS-gel. Las protenas poseen una carga neta positiva o negativa, dependiendo aminocidos cargados que contienen. Cuando un campo elctrico se aplica a una solucin que contiene una molcula de protena, la protena migra a una velocidad que depende de su carga neta y en su tamao y forma.
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Respuesta de las clulas animales a la fuerza osmtica

Cuando las clulas se colocan en una solucin hipotnica (concentracin de sal ms bajo que el del interior de la clula), el agua fluye en las clulas.

Este flujo osmtico causa que las clulas se hinchen y se rompen con facilidad.
En una solucin hipertnica (concentracin de sal mayor que la de interior de la clula), el agua fluye fuera de las clulas, causando que se encojan.
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 Cuando las clulas se colocan en una solucin isotnica (concentracin de sal igual a la del interior de la clula), no hay movimiento neto de agua dentro o fuera de las clulas. Por esta razn, una solucin isotnica es lo mejor para preservar la estructura de la clula normal.

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