1

LP IMUNOLOGIE REACTII Ag-Ac DE PRECIPITARE

Principiu: precipitarea implica interactiunea intre Ag si Ac in proportii de echivalenta, rezultand un precipitat vizibil. Ag folosite in reactii de precipitare = Ag solubile; trebuie sa aiba minim 2 determinanti antigeni (identici sau diferiti) astfel incat sa aiba posibilitatea sa lege macar 2 molecule de Ac. Ac folositi = seruri monoclonale/policlonale. Au 2 situsuri de legare ( forme monomerice, IgG); mai multe in cazul formelor pentamerice de IgM. Proportii echivalente = concentratii optime de Ac si Ag pentru formarea unei matrici(retele), formata din legaturi intre 1 Ag si mai multi (minim 2 molecule de) Ac si respectiv intre 1 Ac si 2/> molecule de Ag care determina formarea unei retele mari si mai insolubile si deci a unui precipitat vizibil. In cazul unui exces de Ac ( efect prozone) probabilitatea ca 1 molecula de Ac sa aiba ocupata mai mult de un situs de legare ocupat este mult mai mica astfel incat formarea unei retelei mari scade. In cazul unei cantitati prea mici de Ac/ excesive de Ag, chiar daca Ac leaga la ambele situsuri cate un epitop, numarul de molecule de Ag legate este prea mic; in plus, probabilitatea ca un Ag sa lege mai mult de o molecula de Ac este scazuta. Astfel, ca si in cazul excesului de Ac scade formarea de retele mari. ZONA DE ECHIVALENTA EXCES DE Ac EXCES DE Ag

Reactiile de precipitare se pot realiza in mediu lichid sau semisolid (gel de agar). Reactii de precipitare in mediu lichid In trecut se folosea o metode de determinare cantitativa prin masurarea cantitatii de precipitat. Se folosesc mai multe eprubete in care se pune serul pacientului o cantitate fixa si necunoscuta de Ac si apoi cantitati de Ag cunoscute, variabile, din ce in ce mai mari. Dupa formarea precipitatului eprubetele se centrifugheaza, si concentratul obtinut din precipitat (supernatantul este scos) este masurat. Se face o curba cantitate de precipitat functie de cantitate de Ag = curba de precipitare.

Curba de precipitare:

(Imuno)Nefelometrie = o reactie de precipitare in mediu lichid in care se masoara numarul de complexe Ag-Ac prin evaluarea luminii dispersate de acestea. In practica se foloseste in general pentru evaluarea cantitativa unui Ag din serul pacientului prin folosirea unor seruri specifice anti-Ag standardizate. Peste serul pacientului in care se gaseste proteina de dozat se adauga serul specific antiAg; se formeaza complexe imune. Prin cuva in care se desfasoara reactia trece o raza laser cu lungime de unda cunoscuta; lumina este dispersata de complexele imune formate; aceasta dispersie este citita de un nefelometru si, prin comparatie cu valori ale unor probe standard, se cuantifica cantitatea de Ag din proba de ser. Proba se efectueaza in dinamica? Prin acest tip de reacti se pot doza Ig (inclusiv FR), componente ale complementului, complexe imune s.a. tipuri de protine serice ( ceruloplasmina, 1 anti-tripsina, CRP). Reactii de precipitare in gel Sistem de difuzie: proteinele difuzeaza in lichid/semisolid (gel) in functie de marime si concentratie (cantitate). Moleculele mari, ex. Ac, difuzeza mai greu. Imunodifuzia simpla = Ac este incorporat in gel iar Ag de determinat este lasat sa difuzeze in mediu Imunodifuzia simpla radiara (Mancini) Gelul in care se incorporeaza Ac specific este pus intr-o cutie Petri; apoi se fac mici gauri in gelul respectiv in care se pun probele biologice in care se gaseste Ag de determinat. Ag din proba incepe sa difuzeze in mediu. Acolo unde concentratia Ag in mediu atinge nivelul de echivalenta cu Ac se formeaza un inel de precipitare. Distanta parcursa de Ag depinde de timp, concentratie, marimea moleculei si concentratia Ac in agar. Aria inelului de precipitatie este direct proportionala cu concentratia Ag. Concentratia Ag se calculeaza in functie de aria inelului de precipitare si se evalueaza comparativ cu standardul pentru Ag respectiv. Este o metoda cantitativa. Se foloseste pentru dozarea IgG, IgA?, IgM; ( ? CRP, C3, transferina, FP ) Dubla difuzie (metoda Ouchterlony)

1. Pe o placa de mediu de gel se stanteaza 2 gauri in care se pun intr-o parte Ag si in cealalta Ac specific. Se standardizeaza marimea gaurilor, distanta intre ele, timpul si temperatura de incubatie. Cele 2 proteine, Ac si Ag incep sa difuzeze in mediu. Daca in proba de evaluat exista Ag specific Ac, la locul de intalnire si in zona de echivalenta se va forma un arc de precipitare, ~ perpendicular pe axa dintre cele 2 gauri. Arcul se evalueaza comparativ cu un arc de precipitare standard (in care s-a folosit o cantitate cunoscuta de Ag). Aceasta metoda a fost prima care a evaluat AgHBs in hepatita virala B. Metoda Ouchterlony pentru 1 Ag

2. Prin aceeasi metoda se pot evalua in paralel 2 Ag pntru a evalua daca sunt similari sau nu? Ag 1 si Ag 2 sunt identice (dpv al determinantilor Ag) Non-identitate Identitate partiala = Ag 1 si Ag2 nu sunt identice dar au determinanti Ag comuni

Este o metoda calitativa ( eventual semicantitativa, grosimea bandei de precipitare putand sugera concetratia de Ag). Poate fi folosita pentru a diagnostica prezenta in serul pacientului a unor autoAc asocieti cu : PR, sd. Sjorgen, LES, sclerodermie, vasculite. Imunoelectroforeza

Combina electroforeza cu dubla difuzie; metoda calitativa. Initial serul de evaluat se supune unui procedeu de electroforeza in gel, care separa proteinele in functie de incarcatura electrica si marimea moleculei. Apoi se face un sant in gel, paralel cu directia de migrare electroforetica, in care se pune Ac. Ag si Ac migreaza in gel (dubla difuzie) si la locul de intalnire + echivalenta se formeaza un arc de precipitare. Acest arc de precipitare se poate compara cu un arc de precipitare normal ( sau investigatorul experimentat poate evalua daca arcul este corespunzator sau nu ). In functie de aspectul arcului de precipitare se evalueaza proteina de investigat: Proteina poate fi deficitara sau absenta: ex. deficit de 1 anti-tripsina Proteina anormala/in exces: lanturi usoare libere sau ; exces de IgG de ex intrun mielom multiplu Contracurent imunoelectroforeza Este o dubla difuzie accelerata de punerea placii cu mediul de difuzie si a reactivilor intrun camp electric care accelereaza difuzia; metoda calitativa. In functie de Ag analizat se ajusteaza pH-ul mediului ( de obicei > 8?). Ag migreaza spre anod (A+) si Ac spre catod (C-). In zona de echivalenta se formeaza un arc de precipitare. Se poate folosi pentru detectia unor autoAc ( impotriva ENA = extractable nuclear antigens; Ac anti-RNP [ribonucleoprotein], Ac anti Sm [Smith] apar in LES), Ac impotriva unor Ag bacteriene, unor Ag bacteriene, fetoproteina? Electrforeza-rocket Combina migrarea in camp electric cu imunodifuzia simpla. Metoda cantitativa, pentru Ag incarcate negativ. Mediul contine (pe langa gerul de agar ) Ac specifici pentru Ag de dozat. Se pune proba biologica de evaluat intr-o gaura standard care se face in gel. Se pune apoi in camp electric. Ag difuzeaza in gel, difuzie care e accelerata de campul electric. La locul de echivalenta se formeaza un arc de precipitare in forma de racheta. Inaltimea maxima a acestei rachete este proportionala cu concentratia Ag in proba de evaluat. Limitele probei: nu poate fi folosita pentru dozarea imunoglobulinelor; nu poate fi masurat decat un singur Ag/proba.