Tehnica culturii imbogatite Etapele principale ale unei bioremedieri sunt urmatoarele: 1- Definirea situatiei poluante (poluantul, cantitatea

de poluant, periculozitatea acestuia, capacitatea acestuia de a se raspandi); 2- Gasirea si punerea la punct a unei metode de degradare microbiana a poluantului; 3- Izolarea si stimularea unei populatii microbiene care in mod natural poate metaboliza acel poluant; Aceasta faza este considerata ca find cruciala in strategia adoptata. Realizarea ei are la baza tehnica culturii imbogatite care presupune urmatoarele: intr-un mediu nutritiv de baza, poluantul este adugat ca unica sursa de carbon sau de energie; mediul va fi inoculat cu sol (care contine o mare diversitate de m.o.); cultura va fi incubata, de obicei in conditii aerobe, pe o anumita perioada de timp, la anumite temperaturi; pe parcursul incubarii cantitatea de poluant va fi monitorizata; daca in solul folosit ca inocul se intampla sa exista acel microorganism ce poate degrada poluantul, el va supravietui si se va dezvolta; daca poluantul a disparut, se va preleva inocul din proba biodegradata si se va insamanta din nou pe mediu cu poluant pana cand se va obtine o cultura in care predomina microorganismul ce poate metaboliza poluantul; din aceasta cultura microorganismul va fi izolat si studiat in vederea utilizarii sale la scara industriala. 4- Cultivarea in cantitati mari a microorganismului implicat in bioremediere sau crearea de conditii optime de dezvoltare chiar in mediul poluat; 5- Adaugarea culturii de microorganism in mediul poluat si asigurarea unui mediu nutritiv optim si conditii de mediu care sa le permita metabolizarea poluantului.

Izolarea si purificarea de microorganisme din diferite surse contaminate cu derivati nitrofenolici Material si metoda Ridicarea probelor de sol Probele au fost ridicate prin metodologia clasica de ridicare a probelor de sol cu ajutorul sondelor, de la diferite adancimi. Prin amestecul probelor ridicate din diferite puncte s-au obtinut probe medii reprezentative care a fost mai apoi preluate in vederea izolarii microorganismelor de interes. Tulpini de microorganisme i medii de cultur In vederea izolarii de tulpini microbiene se pot folosi medii speciale de crestere specifice fiecarui tip de microorganism. Izolarea tulpinilor bacteriene din sol poluat cu compusi organici de tipul dinitrofenol-derivatilor, se efectuateaza prin adugarea n 100ml mediu MSM lichid (Mediu Mineral Salin) a unui g de sol, fr suplimentare de vitamine. Dup 24h de incubare la 28OC i 120 rpm, 10 ml au fost transferai n 90 ml mediu MSM, i incubai n acelai condiii. Dup 48 h, 0,1ml de cultur se nsmneaza prin lutare pe plci Petri cu mediu LuriaBertani (LB). Se pot izolata tulpini bacteriene pure att prin diluii zecimale ct i prin tehnica epuizrii ansei, pe plci cu mediu LB, realizandu-se astfel si screeningul calitativ al bacteriilor prezente in probele de sol. Izolarea tulpinilor de drojdii din sol poluat s-a efectuat similar cu metoda folosita la tulpinile bacteriene, cu deosebirea ca cei 0,1ml de cultura obtinuti prin pasaje succesive au fost insamantati pe placi cu mediu YPG ( Yeast Peptone Glucose). Si in acest caz pentru obtinerea de tulpini pure s-au folosit metoda dilutiilor seriale si epuizarea ansei pe mediu solid (placi cu YPG). Medii de cultura: MSM (Mediu Mineral Salin)-1g K2HPO4, 0,5g KH2PO4,

0,2g MgSO4x7H2O, 1g NaCl, 1g (NH4)2SO4 per litru LuriaBertani (LB-10g extract de drojdie, 10g peptona,

20g glucoza, 20g agar per litru) Yeast Peptone Glucose-5g extract de drojdie, 10g

peptona, 10g clorura de sodiu, 20g agar, pH 7-7,5).