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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGA MDICA

DOCENTE:
Lic. LUIS CALDERON CUMPA
ALUMNOS: LIRA CALAMPA, NORMA R. SILVA AQUIO JENNY TARAZONA LOPEZ JOHN

DEDICATORIA
El trabajo investigacin monogrfico de lo

dedicamos a nuestros padres. A Dios, ya que gracias a l tengo esos padres maravillosos, los cuales nos apoyan en nuestras derrotas y celebran nuestros triunfos.

INDICE
1. DEDICATORIA 2 2. AUTOMATIZACION EN HEMATOLOGIA . 4 3. HEMATOLOGIA MANUAL 5 4. SISTEMAAUTOMATIZADO .. 9 5. RESEA HISTORICA .. 10 6. GENERACION EN AUTOMATIZACION .. 14 7. RECUENTOS AUTOMATIZADO CELULAS SANGUINEAS . 15 8. PRINCIPIOS FUNDAMENTALES EN AUTOMATIZACION ... 17 8.1. IMPEDANCIA ELECTRICA .. 17 8.2. CITOMETRIA DE FLUJO .. 18 9. METODOLOGIA EMPLEADA Y DETERMINACION DE UN HEMOGRAMA .. 19

9.1. CONCENTRACION DE HEMOGLOBINA . 21 9.2. ERITROCITOS . 22 9.3. INDICES ERITROCITARIOS . .. 22 9.4. RETICULOCITOS .. 23 9.5. PLAQUETAS ... 24 9.6. RECUENTO TOTAL Y DIFERENCIAL DE GLOBULOS BLANCOS .24 10. ALARMAS E INDICACIONES PARA EXAMINAR UN EXTENDIDO .. 26 11. EQUIPOS AUTOMATIZADOS .. 27 11.1. POR IMPEDANCIA 11.2. POR DISPERSION OPTICA 12. MARCAS Y MODELOS . 29 13. INSTRUMENTOS AUTOMATIZADOS PARA COAGULACION .. 31 14. INTERPRETACION DE RESULTADOS .. 32 15. CONCLUCION .. 34 16. ANEXO .. 35 17. BIBLIOGRAFIA .. 41

AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA

INTRODUCCION
Gran parte de la prctica Del laboratorio hematolgico se relaciona con observaciones que incluyen la identificacin de tipos de clulas y la interpretacin de la composicin de las poblaciones celulares sanguneas. Esta revisin describe la metodologa empleada en los instrumentos automatizados para el estudio hematolgico convencional, incluyendo la medicin de Hb, recuento de glbulos rojos e ndices eritrocitarios, el recuento de plaquetas, el recuento total y diferencial de glbulos blancos y reticulocitos. Se describen las diversas tecnologas utilizadas para realizar las mediciones, ejemplificando su uso en los contadores hematolgicos automatizados modernos disponibles comercialmente.

HEMATOLOGIA MANUAL
Para definir como es una automatizacin de los procedimientos hematolgicos primero debemos diferenciar como es un proceso manual para eso debemos diferenciar las clulas que estn presentes en hematologa o para ser mas especficos los hemogramas estas clulas son:

ERITROCITOS Eritrocitos normales donde se ve el color rojo que adquieren por la presencia de la hemoglobina. Aumento: 400 veces Coloracin: May Grunwald - Giemsa

Los eritrocitos son las clulas sanguneas que contienen en su interior la hemoglobina. Esta molcula es una protena que contiene tomos de hierro que le otorgan el color rojo a la sangre, de all su nombre: eritro (rojo) citos (clulas). Dado la forma bicncava del eritrocito se observa

en la foto un disminucin del color en el centro. Cuando este dismunucin no se observa puede deberse a una alteracin de la la forma del glbulo rojo.

LEUCOCITOS O GLBULOS BLANCOS


Los glbulos blancos son los encargados de la defensa del organismo. Reciben el nombre de leucocitos por la etimologa: Leuco (blanco) - cito (clula) dado el color que presentan. Existen distintos tipos de leucocitos segn su morfologa y funcin: Neutrfilos - Linfocitos - Eosinfilos - Basfilos - Monocitos NEUTRFILOS Leucocitos normales Referencias: 1-neutrfilo en banda 2-neutrfilos segmentados 3-eritrocito 4neutrfilo en segmentacin Aumento: 400 veces Coloracin: May Grunwald - Giemsa Los neutrfilos son importantes para la defensa del organismo de bacterias y otros microorganismos. Segn la forma de su ncleo se los puede clasificar en neutrfilos en banda o cayados y en neutrfilos segmentados. Presentan divisiones de sus ncleos en lbulos en un nmero que va de 3 a 5. Si es mayor el nmero de divisiones nucleares se habla de neutrfilos hipersegmentados. LINFOCITOS

Linfocitos normales. El ncleo es redondo y no tan comprimido se observa un reborde basfilo (azulado) en el borde del citoplasma celular. Aumento: 400 veces Coloracin: May Grunwald Giemsa -

Los Linfocitos son clulas esfricas o ligeramente ovoides con un dimetro de 8 a 12 micrones. El ncleo (azul oscuro) ocupa el 90% de la clula. El citoplasma es muy delgado y se tie de color azul claro formando un anillo alrededor del ncleo. El linfocito bajo ciertos estmulos qumicos endgenos puede dividirse y crear muchas clulas hijas para defender al cuerpo liberando anticuerpos.

EOSINFILOS
Eosinfilo normal. Obsrvese el ncleo en forma de anteojo y los grnulos gruesos del citoplasma. Aumento: 400 veces Coloracin: May Grunwald Giemsa Los Eosinfilos tienen actividad fagoctica, es decir que "se comen" a los agentes extraos al organismo. Sus grnulos tienen sustancias para degradar aquello que incorporan. Tienen un papel muy importante en las parasitosis donde con sus grnulos degradan las larvas para que puedan ser ingeridas por los neutrfilos y los macrfagos. El eosinfilo modula y regula las reacciones alrgicas. -

BASFILOS

Basfilo normal. Posee un ncleo en forma de lbulos que muchas veces cuesta verlo por los grnulos gruesos del citoplasma. Aumento: 400 veces Coloracin: May Grunwald - Giemsa

Los Basfilos poseen grnulos de heparina e histamina. Estas sustancias son mediadores qumicos que modulan la inflamacin. Tienen funcin en los estados alrgicos en la hipersensibilidad retardada. La liberacin masiva del contenido de sus grnulos puede causar un shock anafilctico que puede llegar hasta la muerte si no es controlado.

MONOCITOS
Monocito normal. Aumento: 400 veces Coloracin: May Grunwald Giemsa -

Los Monocitos son clulas fagocticas con gran capacidad bactericida. Ante estmulos de sustancias qumicas siguen a los neutrfilos en la reaccin inflamatoria. Por la fagocitosis aumentan de tamao y pueden fijarse a los tejidos del baza, hgado y pulmn, dando lugar a los macrfagos tisulares que forman el sistema retculo endotelial encargado de remover el material extrao que circula en la sangre.

SISTEMA AUTOMATIZADO
Palabras claves: Automatizacin, analticos, Tecnologas. Hematologa, Sistemas

Muchas de las mediciones en el campo de la Hematologa conciernen a variables continuas. Algunos ejemplos de este tipo de variables son la medicin de concentraciones de hemoglobina (Hb) en la sangre y el hierro, as como su capacidad total de unin en suero. Por otra parte, gran parte de la prctica de la Hematologa se relaciona con observaciones que incluyen la identificacin de tipos de clulas y la interpretacin de la composicin de las poblaciones celulares sanguneas. Los temas centrales que se abordarn a continuacin se centrarn principalmente sobre estas determinaciones discontinuas. En relacin con el recuento de clulas sanguneas, los mtodos manuales son la base de algunos mtodos de referencia en el laboratorio hematolgico, a los que an es necesario recurrir cuando hay discrepancia con los mtodos automatizados. Suelen tambin ser mtodos de rutina en laboratorios pequeos de algunos pases, pero dada la enorme cantidad de informacin disponible sobre los mismos2, en este trabajo slo nos referiremos a los mtodos automatizados.

RESESEA HISTRICA
El desarrollo automatizado del recuento y la medicin del tamao de las clulas sanguneas parte de tcnicas de recuento simple, que fueron descriptas en la segunda mitad del siglo XIX y que fueron usadas en Recuento de clulas sanguneas en los primeros instrumentos CARACTERSTICAS Descripcin del prototipo APERTURAIMPEDANCIA Coulter, 1956 DISPERSIN DE LUZ Crosland-Taylor, 1953

Ingreso de las clulas a la Pasaje por una corriente Pasaje a travs de zona estrecha por flujo un orificio estrecho sensora hidrodinmico Medicin de impedancia a travs del Orificio Impulsos usados para contar las clulas que atraviesan la zona sensora Cambios en la impedancia contados electrnicamente

Definicin de la zona sensora

Haz de luz que atraviesa la corriente de clulas Cambios en la salida de un fotmetro, contados electrnicamente

Se hicieron intentos inciales y complejos para automatizar el recuento de clulas en cmaras cuenta glbulos, pero an con tcnicas que fueron perfeccionadas, todava era difcil automatizar la dilucin de la sangre y la carga de la cmara. Tambin resultaba imposible contar las clulas con exactitud mediante los mtodos de estudio de las propiedades elctricas u pticas de las clulas en suspensin. Para permitir que el recuento celular fuera automatizado, tuvieron que disearse mtodos de dilucin de la sangre e ingresar cantidades relativamente pequeas de clulas dentro y fuera de una zona conocida como zona sensora. As, las clulas podan ser contadas con exactitud a medida que pasaban a travs de esa zona sensible, siempre y cuando la misma fuera lo suficientemente pequea como para hacer factible el recuento.

Los primeros contadores hematolgicos fueron semi automatizados; esto era as porque la preparacin de una dilucin adecuada era una operacin manual y el instrumento entonces, aspiraba la dilucin ya preparada. Sin embargo, a fines de la dcada del 60 se dispuso de instrumentos totalmente auto- matizados, que aspiraban muestras de sangre entera y llevaban a cabo los pasos necesarios para diluir y aislar las clulas a ser contadas. Nos ocuparemos en el presente trabajo slo de los instrumentos totalmente automatizados. Los instrumentos semi automatizados, si bien se fabrican todava, se utilizan casi con exclusividad en laboratorios pequeos porque la preparacin de diluciones manuales a partir de una gran cantidad de muestras sanguneas, demanda mucho tiempo adems de ser poco precisa. Los primeros contadores fueron descriptos por Coulter7 y CroslandTaylor8, quienes adoptaron diferentes enfoques para limitar el volumen en la zona sensora y realizar el recuento (Tabla 2). Fig. 2: Contadores de aperturaimpedancia. La impedancia se mide entre un electrodo negativo dentro del tubo con orificio y el electrodo positivo en la dilucin de las clulas de la sangre. El rea delimitada por lnea de puntos muestra la zona sensora por donde pasan las clulas.

En el instrumento descripto por Coulter7, las clulas son conducidas a travs de un estrecho orificio, detectndose los cambios de impedancia. La impedancia es efectivamente medida en la zona sensora situada entre los electrodos colocados a ambos lados del orificio. As, las clulas funcionan como aislantes frente a los diluyentes salinos, de modo que la impedancia aumenta transitoriamente a medida que las clulas pasan a travs de la zona sensora. Los cambios de impedancia transitorios producen impulsos elctricos que pueden ser contados. Estos instrumentos han sido llamados contadores de aperturaimpedancia. El instrumento descripto por Crosland-Taylor8 se basaba en hacer que las clulas pasen a travs de un delgado haz de luz . La zona sensora estaba restringida parcialmente por la estrechez del

haz de luz y por el pasaje de clulas en una corriente de lquido muy delgada. A medida que las clulas pasan a travs de la zona sensora, interceptan el haz de luz que se dispersa, pudiendo ser colecta da por un sistema ptico adecuado y medida por un fotmetro (Fig. 3). Fig. 3: Contadores por dispersin de luz. La luz de la fuente lser se di- rige hacia un foco y luego se dispersa. Una barrera impide la llegada de luz al fotodetector. Cuando una clula entra en el foco, dispersa la luz, que as pasa por fuera de la barrera, e impacta en el detector. Los aumentos transitorios en la luz dispersada crean impulsos desde el fotmetro, que luego pueden ser contados electrnicamente, por ello estos sistemas son llamados contadores de dispersin de luz. Los impulsos contados en los primeros instrumentos de aperturaimpedancia y de dispersin de luz tambin se utilizaron para determinar el tamao celular, dado que el tamao del impulso es aproximadamente proporcional al tamao de la clula. Por lo tanto, el tamao del impulso puede usarse para discriminar entre la clula de inters y otras clulas, res- tos o ruido electrnico. Este proceso lleva a la definicin de un umbral (Fig. 4).

Fig. 4: Diagrama de volmenes en el recuento de plaquetas . A: Sirve para discriminar plaquetas pequeas de ruido B: Plaquetas grandes de glbulos rojos pequeos C: Representa el rea bajo la curva usada para la estimacin terica del nmero de plaquetas.

Adems de las diferentes tecnologas de deteccin, haba importantes diferencias en cmo las clulas ingresan a la zona sensible en los dos tipos de instrumentos. Debido a que la geometra tiene que ser perfecta, en los sistemas de dispersin de luz, las clulas tienen que estar en una corriente muy estrecha que interacte perfectamente con el haz de luz. Esa corriente se logra por una tcnica donde se emplea un flujo laminar envolvente. El flujo del lquido se ajusta a travs de un capilar delgado para crear un efecto de enfoque hidrodinmico que fuerza a la suspensin celular a permanecer en la corriente estrecha a medida que pasa por el centro de la zona sensible. Aunque este sistema fue descripto originalmente para sistemas de dispersin de luz, tambin se puede aplicar a los sistemas de aperturaimpedancia y tiene particular valor al potenciar la capacidad de los sistemas de apertura-impedancia para medir el tamao celular, as como para mejorar el recuento celular.

Las mejoras en la capacidad de medir el tamao tambin significan que es ms fcil discriminar entre diferentes tipos de clulas, por ejemplo las plaquetas grandes pueden ser discriminadas ms fcilmente de los eritrocitos pequeos. En la prctica, para hacer el recuento celular tanto los sistemas de apertura-impedancia como los de dispersin de luz son adecuados para contar eritrocitos, plaquetas o leucocitos totales. Sin embargo, es necesario tener en cuenta cules son los requerimientos bsicos para un recuento exacto de cualquier tipo de clula: La sangre entera debe ser homogeneizada, medida y diluida con exactitud. Debe pasarse un volumen conocido de esa dilucin a travs de la zona sensora. Las clulas de inters deben contarse una vez y slo una vez y ninguna otra clula, resto celular o ruido electrnico debe contribuir al recuento. El primer requisito es fcil de alcanzar, procurando que la sangre est bien mezclada antes del anlisis. En la actualidad, la mayora de los instrumentos hacen esto en forma automtica y luego hacen las diluciones con exactitud, generalmente por medio de sistemas basados en jeringas calibradas. El segundo requerimiento es ms difcil de lograr en un instrumento automatizado. La mayora de los fabricantes han elegido medir los recuentos por unidad de tiempo en lugar de la unidad de volumen de dilucin. Por lo tanto, tales sistemas tienen que ser calibrados para convertir los recuentos por unidad de tiempo a recuentos por unidad de volumen. El tercer requerimiento es de dificultad intermedia. Puede parecer excesivo afirmar que las clulas deben ser contadas una vez, pero el problema es que en el recuento pueden subestimarse si van a travs de la zona sensora, dos clulas que se alinean y pasan al mismo tiempo. Este problema, se denomina coincidencia, surge del tiempo muerto en la electrnica del instrumento y por lo general puede ser corregido con un algoritmo matemtico adecuado, construido dentro del microprocesador del contador hematolgico.

Fig. 5. Relacin entre el recuento celular y la concentracin de clulas. A concentraciones altas comienza a producirse un plateau como consecuencia del fenmeno de coincidencia.

GENERACIONES EN AUTOMATIZACION
Segn el desarrollo tecnolgico y el grado de automatizacin mejorando la eficiencia, exactitud y precisin de ah que se emplea el termino generacin el cual nos indica el grado de avance tecnolgico as: 1ra Generacin: cuadro hemtico manual.

2da Generacin: semiautomatizado. 3ra Generacin: automatizado con representacin grafica de histogramas de los glbulos rojos y plaquetas y recuento diferencial de glbulos blancos. 4ta Generacin: automatizado con perforacin de tapa, graficas de histogramas para glbulos rojos y plaquetas y un informe de dispersogramas para glbulos blancos agrupados en 5 tipos celulares.

SISTEMAS ANALTICOS EN EL RECUENTO AUTOMATIZADO DE CLULAS SANGUNEAS La metodologa empleada en los instrumentos automatizados para el estudio hematolgico convencional, incluyendo el recuento de plaquetas y el recuento diferencial de glbulos blancos. El recuento de reticulocitos tambin ser considerado porque en la actualidad puede realizarse tanto en contadores automatizados que incluyen el recuento en forma directa, o mediante un procedimiento especial previo en otros tipos de contadores (semi-automatizados). En primer lugar, se describirn las diversas tecnologas utilizadas para realizar las mediciones, ejemplificando su uso en los contadores hematolgicos automatizados disponibles comercialmente. Alguno de estos ejemplos ha sido tomado de los fabricantes que abarcan los principales segmentos del mercado de laboratorio clnico, dato obtenido a partir de la estadstica de los participantes en programas de evaluacin externa de calidad. Los fabricantes por lo general ofrecen un amplio rango de instrumentos, pero las descripciones sern limitadas, por razones de espacio, a los modelos ms difundidos (Tabla 1). TABLA 1 Algunas caractersticas de auto analizadores hematolgicos modernos*
Tipo Fabricante Instrumento Ao de aparicin Instalados al en US 2000 en US 1995 2800

de leucocitos de

Cell-Dyn 1700 y 1700CS

Roche De alto volumen Abbott

Coulter Ac-T diff y diff 2 Coulter Onyx/Onyx AL KX21 Cell-Dyn 3200 Cell-Dyn 3700 Cell-Dyn 4000 Pentra 60c+

1999 1994 1999 1997 1999 1997 2000

800 1300 100 >700 >300 >350 0

ABX

Bayer Beckman-Coulter

ADVIA 120 Coulter GEN-S

1998 1996

500 >1100

Sysmex SF3000-Alpha Sysmex SE9500/SE Sysmex SE9500 Alpha 2 Sysmex XE2180/XL

1997 1994 nd 2000

nd 350 nd nd

La mayora de estos instrumentos son totalmente automatizados, es decir las mediciones se realizan a partir de sangre entera sin necesidad de que el operador la diluya en forma manual. En efecto, con el fin de garantizar un manejo seguro, la mayora de los instrumentos cuenta con dispositivos que atraviesan la tapa del tubo de colecta de sangre, de modo que el operador no tiene que quitarla. Tambin es comn que los instrumentos mezclen las muestras de sangre antes de que las mismas sean incluidas en el anlisis. Un esquema que resume las distintas etapas de estos sistemas se presenta en la siguiente figura

Los contadores de sangre automatizados, como cualquier otro instrumental de laboratorio, deben ser manejados de manera apropiada. Esto requiere que sean totalmente calibrados y que el desempeo sea monitoreado tanto por el control de calidad interno como por los PEEC. Por ltimo, debido a que el mercado evoluciona muy rpido, es necesario entender cmo se evalan los nuevos instrumentos o, al menos, entender crticamente las evaluaciones emprendidas por otros usuarios.

PRINCIPIOS FUNDAMENTALES DE LA AUTOMATIZACION IMPEDANCIA ELECTRICA Los impulsos generados son directamente proporcionales al tamao de la clula y el nmero de partculas que atraviesa el orificio de apertura por unidad de tiempo es proporcional a su concentracin en el medio electrolito. Para el recuento correcto necesitamos corriente directa y que las clulas sigan una trayectoria uniforme por el detector.

VARIACIN DE IMPEDANCIA El contador de impedancia elctrica trabaja mediante la suspensin de las clulas sanguneas en un lquido electrnicamente conductor. Cada partcula es forzada a atravesar un par de electrodos produciendo un cambio en la resistencia elctrica entre los electrodos. Cada clula produce un pulso elctrico especfico que permite su clasificacin y conteo.

Diluyente: Conductor electricidad GR :Isotonico GB: Hipotonico Pq: Extrae GRsedimentacion

Puente: Aislado Flujo: Velocidadconstante Volumen MP : 100 ul

CITOMETRA DE FLUJO
Fue introducida en el laboratorio clnico en el decenio de 1980. La informacin obtenida a travs del anlisis citomtria de flujo ha mejorado la capacidad para el diagnostico de ciertos estados patolgicos para el establecimiento de sus etapas, y para vigilar sus intervenciones teraputicas. * Principios Bsicos La citometra de flujo es el anlisis de las caractersticas de las clulas que pasan una a una en una suspensin liquida a travs de un haz de luz. La luz esparcida y la intensidad de la fluorescencia se miden por un conjunto de fotodiodos, los datos coleccionados por los fotodiodos se transmiten a la computadora para su procesamiento subsecuente y la produccin de datos. Los componentes bsicos de un citmetro de flujo con el sistema lquido, el sistema ptico, el sistema detector de seal y el sistema de manejo de los datos. El sistema lquido tiene la responsabilidad del movimiento de la muestra a travs de la cmara de flujo desde su aparicin hasta su descarte como desecho. Mediante enfoque hidrodinmica se crea una suspensin de clulas simples dentro de la vaina liquida, al aspirarse la muestra, una presin diferencial entre el flujo de la muestra y el flujo de la vaina liquida crea una corriente central con la muestra rodeada por la vaina liquida y evita la mezcla de la muestra con el liquido de la vaina. Las clulas pasan a travs del haz laser en fila nica a una velocidad de 5,000 clulas por segundo. En el laboratorio clnico la fuente se luz comnmente usada para citometra de flujo es el laser de ion de argn. Las caractersticas importantes de la luz laser son su alta radiacin, estabilidad y pureza

espectral. La ventaja de la luz laser es la capacidad de enfocar el haz de luz monocromtica en un rea igual a las dimensiones de la clula. En enfoque del laser se logra por una serie de lentes que dan forma de haz. Al pasar la clula a travs del haz laser, dispersa la luz y los fluorocromos la absorben y la emiten nuevamente a una longitud de onda distinta. La luz se esparce en ngulos diferentes; la dispersin hacia delante (ngulo bajo) define el tamao de la clula, y la lateral (ngulo de 90) la granularidad o estructura nuclear. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de fluorocromo presente sobre o dentro de ella. La coleccin de la luz dispersa y de la emisin fluorescente se logra a travs de un conjunto de filtros de interferencia o de espejos bicrticos, o de ambos que dirigen la luz a los fotodiodos y a los tubos fotomultiplicadores (TFM) son tiles en la coleccin y amplificacin de la luz dispersa y de las emisiones fluorescentes laterales mas dbiles. El citmetro de flujo tiene un detector de dispersin lateral y un detector de fluorescencia. El nmero de detectores de fluorescencia depende del nmero de longitudes de onda distinta por detectarse. La mayor parte de los citmetros de flujo usados en el laboratorio tienen la capacidad de realizar anlisis ya sea de dos o tres colores. El procesamiento de la seal del componente electrnico convierte a las seales electrnicas en pulso de voltaje y los procesa para eliminar ruidos de fondo o dispersos. Los voltajes mximos para cada clula analizada se envan al sistema de manejo de datos. Los datos se pueden almacenar por la computadora o analizarse a travs del uso de histograma. Puede obtenerse informacin especfica sobre una poblacin celular por medio del uso de un histograma de dos variables o diagrama de puntos. * Aplicaciones Clnicas * En hematologa: Contaje celular, frmula reticulocitario, anlisis de mdula sea. leucocitaria, contaje

* En farmacologa: Estudios de cintica celular. * En inmunologa: Subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulacin linfocitaria. * En oncologa: Diagnstico/pronstico, monitorizar tratamiento.

* En microbiologa: Diagnstico bacteriano y vrico, sensibilidad a antibiticos. VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Anlisis de un nmero estadsticamente significativo de clulas ( 1000 a ms de 100.000 clulas). Mltiples marcajes de una sola clula. Anlisis de alto nmero de partculas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ). Alta sensibilidad y objetividad. Medidas separadas de cada clula (no slo el promedio). Medidas cuantitativas: discriminacin de las clulas segn la cantidad de marcador. Mltiples parmetros: define subpoblaciones complejas. Miles de clulas por segundo. DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Poca informacin morfolgica de la clula No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de clulas / hora) Necesita suspensin de clulas individuales (1). Costos de la tecnologa Mtodo destructivo. Incapacidad de visualizar las clulas que se analizan.

MTODOLOGA EMPLEADA DETERMINACIONES (HEMOGRAMA) DE UN ESTUDIO SANGUNEO BSICO

CONCENTRACIN DE HB Es el mtodo ms uniforme en todos los instrumentos y presenta dos opciones de uso comn (Tabla 3). La primera es convertir la hemoglobina en cianometahemoglobina (HiCN) y luego medir la absorbancia alrededor de 540 nm. En la prctica, sin embargo, el tiempo del ciclo de los instrumentos disponibles en el mercado es tan corto que puede impedir que la conversin total se produzca por completo y que los derivados intermedios sean medidos. TABLA 3

Fundamento de varias determinaciones hematolgicas en autoanalizadores de uso frecuente.

La conversin a HiCN requiere el uso de un reactivo tipo Drabkin, que contiene cianuro de potasio y ferrocianuro de potasio, por lo tanto el efluente residual del instrumento puede no cumplir con los estndares ambientales en algunos pases. Los mtodos alternativos libres de cianuro para la medicin de la Hb, que usan laurilsulfato de sodio (LSS), han sido introducidos en algunos instrumentos. Los resultados parecen compararse bien con los mtodos de HiCN9. Estos mtodos no cianamidas, adems de ser ms seguros, son tambin promisorias en cuanto a futuras mejoras en la calibracin y validacin de nuevas mediciones de Hb. El mtodo de LSS introducido por Sysmex, parece ser de iguales caractersticas a las del mtodo de referencia y es un avance significativo para bajar la turbidez y permitir un rpido anlisis automatizado.

ERITROCITOS

Por lo general, el recuento de eritrocitos se realiza sobre diluciones de sangre entera con un umbral adecuado para discriminar entre grandes plaquetas y pequeos eritrocitos Muchos sistemas no tienen un umbral superior para discriminar grandes eritrocitos de pequeos leucocitos, pero los nmeros relativos de los dos tipos de clulas indican que esto no suele ser un problema.

NDICES ERITROCITARIOS
Aunque todos los contadores hematolgicos automatizados miden el volumen corpuscular medio (VCM), hay otros factores importantes que afectan las mediciones, segn sean hechas por los instrumentos de apertura-impedancia o por los de dispersion de luz. Debido a que ninguna tecnologa es perfecta, varios fabricantes han intentado resolver los problemas, pero lo han hecho, con frecuencia, en diferente forma. La dificultad fundamental, que ya ha sido mencionada, es que el impulso producido por cualquier clula es slo una aproximacin proporcional al volumen de la clula. Los impulsos aberrantes, que no representan verdaderamente el tamao de la clula, pueden ocurrir en cualquier contador, pero con frecuencia estos impulsos tienen una caracterstica inusual que les permite ser identificados por circuitos electrnicos adecuados y procesados de modo que no afecten la magnitud del impulso promedio que se utiliza como medicin de VCM. En los contadores de apertura-impedancia sin flujo laminar, hay una necesidad adicional de tratar los impulsos, ya que en tales instrumentos las clulas pasan por el centro del orificio. Afortunadamente, esas clulas tienen un tiempo de pasaje ms largo a travs del orificio, debido a que el flujo es ms lento en el borde. Los impulsos que ellas producen son por lo tanto tan largos que deben y pueden ser procesados. Dos clulas que atraviesan juntas tambin producen un pulso sobredimensionado, pero de igual modo es tan largo, que puede ser procesado. En relacin a los eritrocitos, el aspecto ms serio, de correccin ms dificultosa, es que el VCM tiende a ser subestimado cuando la concentracin de Hb corpuscular media (CHCM) real, medida manualmente, es reducida. Los fabricantes han adoptado diferentes tcnicas para obviar el problema. Estas han servido para reducir la magnitud del efecto aunque en ninguna instancia ha sido eliminado totalmente. Debido a que los ndices eritrocitarios se relacionan entre s de acuerdo con lo siguiente:

CHCM = HCM VCM


Puede observarse que un VCM subestimado causar una CHCM sobrestimada. Por esto, con los modernos contadores sanguneos, rara vez se observa que la CHCM descienda marcadamente en la deficiencia de hierro severa, como sucede cuando las mediciones de Hb y hematocrito son hechas en forma manual y la CHCM se calcula usando la frmula:

CHCM = Hemoglobina Hematocrito


La dificultad fundamental, que ya ha sido mencionada, es que el impulso producido por cualquier clula es slo una aproximacin proporcional al volumen de la clula. Los impulsos aberrantes, que no representan verdaderamente el tamao de la clula, pueden ocurrir en cualquier contador, pero con frecuencia estos impulsos tienen una caracterstica inusual que les permite ser identificados por circuitos electrnicos adecuados y procesados de modo que no afecten la magnitud del impulso promedio que se utiliza como medicin de VCM.

RETICULOCITOS
Los recuentos de reticulocitos teidos con varios colorantes pueden realizarse en un instrumento automatizado, diseado para ese propsito, tal como el Sysmex R3000, o en un citmetro de flujo convencional. Recientemente otros contadores hematolgicos han incorporado una opcin de recuento de reticulocitos, en los que stos deben ser coloreados de modo independiente y luego son introducidos dentro del contador para su anlisis. Actualmente, se pueden hacer los recuentos sin necesidad de coloracin manual, ya que estn totalmente automatizados. Sysmex fue el primero en introducir un colorante fluorescente (Automune-O) detectado por citometra de flujo, en tanto que otros como Beckman Coulter usan el nuevo azul de metileno.

PLAQUETAS

Estas clulas pueden contarse sobre la misma dilucin de sangre entera usada para el recuento de eritrocitos. Hay, por lo general, un umbral superior para eliminar pequeos eritrocitos y un umbral inferior para discriminar del ruido electrnico y los restos celulares. Estos umbrales simples son adecuados, siempre y cuando el instrumento tenga flujo laminar, y vale tanto si se usa aperturaimpedancia como dispersin de luz para su deteccin. Sin embargo, si no se usa flujo laminar opcional para los contadores de apertura impedancia y obligatorio para contadores de dispersin de luz hay demasiado solapamiento entre las seales de ruido o los residuos y la de los eritrocitos pequeos para que el recuento sea efectivo, entre los umbrales inferior y superior. Bajo estas circunstancias es necesario ajustar una curva de distribucin terica al histograma de volumen de plaquetas y extrapolar el recuento de plaquetas a partir del rea bajo la distribucin terica.

RECUENTO TOTAL Y DIFERENCIAL DE GLBULOS BLANCOS


El examen mediante microscopa ptica de un frotis teido de sangre perifrica para evaluar la morfologa de eritrocitos y trombocitos (plaquetas) y la generacin del recuento diferencial de leucocitos an hoy resultan cruciales para el diagnstico de enfermedades hematolgicas1. Estos procedimientos, adems de la determinacin de recuentos celulares en la sangre, tradicionalmente han sido las funciones principales de un laboratorio de Hematologa. Sin embargo, el recuento diferencial visual se reconoce como una de las tareas de labor ms intensa en el labora- torio. Para lograr buena ejecucin se requiere un personal bien preparado y muy motivado. A pesar de su honroso papel en el diagnstico de enfermedades hematolgicas, estas mediciones estn plagadas de errores. La confiabilidad del procedimiento debe supervisarse regularmente por encargados especializa- dos e intercambiando extendidos con otros laboratorios. Siempre que sea posible se recomienda que los principiantes muestren a los supervisores todas las anomalas importantes, tales como leucocitosis primaria o reactivas, trombocitopenia o cambios notorios en los eritrocitos.

Fig. 6: Recuento diferencial leucocitario, usando dispersin de luz (vertical) y tincin de peroxidasa (horizontal). Los basfilos se estiman independientemente porque se superponen con los monocitos.

Los primeros trabajos fueron hechos con leucocitos teidos por su actividad de peroxidasa y cuando la dispersin y la absorcin de luz se midieron simultneamente clula por clula se hizo posible discriminar con exactitud cuatro clases de leucocitos, es decir neutrfilos, linfocitos, monocitos y eosinfilos junto con una categora conocida como clulas grandes no coloreadas. Las ventajas del mtodo automatizado son: - Disminucin del error aleatorio por el gran nmero de clulas contadas. - Disminucin del tiempo de retorno por la velocidad con que el instrumento hace la Cuantificacin. Para el recuento diferencial de leucocitos automtico, el anlisis de imgenes tiene una aplicacin muy limitada y de comercializacin reducida. En principio, el anlisis de imagen automatiza y reproduce el recuento diferencial visual. Los frotis sanguneos se analizan con ptica de alta velocidad en una plataforma controlada por computadora. Se simulan los criterios del diferencial visual con algoritmos, enumerando las subpoblaciones celulares en forma ms reproducible y cuantitativa. Pero a pesar de estos avances, an hay necesidad de examinar el extendido sanguneo para determinar la naturaleza de un recuento anormal de poblaciones leucocitarias y de la morfologa de plaquetas y de eritrocitos.

ALARMAS E INDICACIONES PARA EXAMINAR UN EXTENDIDO DE SANGRE


Todos los instrumentos producen alarmas diseadas para alertar al operador sobre circunstancias en las cuales las mediciones pueden no ser confiables o en las que puede haber clulas anormales como los blastos o eritrocitos nucleados en sangre perifrica. Las alarmas deben ser consideradas, en conjunto con los nuevos parmetros, con todos los diagramas producidos por el instrumento, con los ltimos resultados del recuento sanguneo, con cualquier cambio de los resultados previos y los detalles clnicos, al considerar si un extendido de sangre debe ser examinado o no. En trminos generales, se espera que los contadores automatizados modernos de clulas sanguneas brinden los siguientes servicios: Identificar la muestra por cdigo de barras. Homogeneizar la muestra. Perforar la tapa del tubo de colecta de sangre y aspirar la muestra. Distribuir la muestra en canales para mediciones separadas, es decir canales de: Recuento y medicin del tamao de eritrocitos y plaquetas. Recuento total y diferencial de leucocitos (puede haber uno o ms canales, dependiendo del instrumento). Recuento de reticulocitos. Hemoglobinometra. Dentro de cada canal, deben hacerse las diluciones relevantes, agregar reactivos y esperar hasta que la dilucin est lista para la medicin. Hacer las mediciones de cada uno de los canales especificados arriba. Alertar sobre cualquier anomala y facilitar la visualizacin en forma adecuada por el operador. Verificar el control de calidad usando controles adecuados o valores medios del paciente. Trasmitir los datos en lnea al sistema de computacin del laboratorio. Ser compatible con sistemas robotizados para la automatizacin total del laboratorio.

Todos los instrumentos de ltima generacin tienen buena conformidad con los requerimientos generales listados arriba y tienen relativamente pocas caractersticas distintivas.

EQUIPOS AUTOMATIZADOS
Existen dos tipos de equipos automatizados segn su funcionamiento; uno por impedancia y el otro por dispersin de luz .Todo equipo automatizado, suministra dos tipos de resultados: un informe numrico y un informe grafico (histogramas), y ambos poseen un software que contiene toda la informacin utilizando abreviaturas en ingles de utilidad en el informe numrico (es recomendable encontrar valores de referencia propios para cada poblacin en estudio). Equipos automatizados por impedancia. Principio. El principio de impedancia en el conteo de clulas sanguneas se basa en el aumento de la resistencia producida cuando una clula sangunea con baja conductividad pasa a travs de un campo elctrico. El nmero de intermitencias indica la cifra de clulas sanguneas y la amplitud de cada intermitencia es proporcional al volumen de la clula. Ejemplos de instrumentos con este principio son el Contador Coulter, los instrumentos TOA Sysmex y los instrumentos Abbot Cell-Dyn.

Equipos automatizados por dispersin ptica. Principio. El principio de la dispersin ptica de la luz en el conteo de clulas sanguneas se basa en las mediciones de la dispersin de la luz obtenidas de una sola clula sangunea que pasa ata travs de un haz de luz (ptico o lser). Estas clulas crean una dispersin hacia delante y lateral las cuales se detectan mediante fotodetectores .El grado de dispersin hacia delante es una mediacin del tamao de la celular mientras que el lateral es una medicin de la granularidad de la clula. Ejemplos de instrumentos que atizan este principio son los Technicon H System.

LAS MARCAS Y MODELO

* Instrumentos de Impedancia El principio de impedancia en el conteo de clulas sanguneas se basa en el aumento de la resistencia producida cuando una clula sangunea con baja conductividad pasa a travs de un campo elctrico. SYSMEX NE-8000 Es un instrumento de hematologa completamente automatizado fabricado por TOA Medical Electronics Company. Es capaz de practicar conteos de clulas sanguneas, determinaciones de hemoglobina y diferenciales de cinco partes. El conteo de las clulas sanguneas se basa en el principio de impedancia con conteos celulares e histogramas obtenidos mediante el anlisis de una dilucin de clulas sanguneas. El diferencial se cinco partes se obtiene a travs de una combinacin de tecnologas: impedancia, radiofrecuencia y lisis de clula diferencial. Los eritrocitos y plaquetas se cuentan a partir de una dilucin y la cifra de los leucocitos y determinacin de la hemoglobina se obtienen de una segunda dilucin que contiene un agente levemente ltico. Adems de los conteos de clulas tambin se generan histogramas para las cifra de eritrocitos y de plaquetas. Al igual que los otros por impedancia, la computadora repasa los datos obtenidos de cada dilucin y deriva o calcula parmetros adicionales de eritrocitos y plaquetas. Los parmetros incluyen: * V-DWER coeficiente de variacin de la amplitud del la distribucin del eritrocito. * SD-DWER la amplitud de la distribucin de la poblacin de eritrocitos. Juntos estos parmetros se usa para la identificacin de anormalidades del eritrocito. La informacin obtenida de los tres bloques de deteccin separados se rene para dar el diferencial de cinco partes. El primer bloque de deteccin usa una combinacin de impedancia y radiofrecuencia para generar un histograma trimodal y dos dispersogramas bidimensionales para representar a las poblaciones de linfocitos, monocitos y granulocitos. La radiofrecuencia da informacin sobre el tamao nuclear y la densidad celular, y la impedancia refleja el tamao de la clula.

Los eosinfilos y basfilos se enumeran en bloques de deteccin separados que usan agentes lticos celulares especficos e impedancia, se generan histogramas para estas dos poblaciones celulares. La cifra de neutrfilos se obtiene restar las cifras de eosinfilos y basfilos de la poblacin de granulocitos.

* INSTRUMENTOS DE DISPERSIN DE LUZ El principio de la dispersin ptica de la luz en el conteo de clulas sanguneas se basa en las mediciones de la dispersin de la luz obtenidas de una sola clula sangunea que pasa ata travs de un haz de luz (ptico o lser). Estas clulas crean una dispersin hacia delante y lateral las cuales se detectan mediante fotodetectores .El grado de dispersin hacia delante es una mediacin del tamao de la celular mientras que el lateral es una medicin de la granularidad de la clula. Ejemplos de instrumentos que atizan este principio son los Technicon H System.

SISTEMA TECHNICON H*1


Aspira una muestra de sangre con EDTA y procesa porciones de esa muestra a travs de cuatro canales separados. El canal de eritrocito/plaqueta determina los conteos de eritrocitos y plaquetas por medio del anlisis de las mediciones de la luz esparcida al pasar las clulas diluidas, una por una, a travs de un rayo laser de helio-nen. El diluyente usado para el conteo de los eritrocitos y plaquetas causa formacin esfrica isovolumtrica de los eritrocitos, la cual elimina errores de volumen celular a causa de variaciones en la forma de esta clula. Los eritrocitos se cuentan y se miden por medio de clculos con dispersin de luz tanto de ngulo alto como de ngulo bajo. La concentracin de la hemoglobina de eritrocitos individuales y el volumen celular se pueden determinar con base en estas mediciones; as como pueden obtenerse el VGM, la CMHG, la ADE y la ADH. Juntas estas mediciones permiten la generacin de un citograma del eritrocito e histogramas del eritrocito, de la concentracin de la hemoglobina y de las plaquetas. Dentro del canal de la hemoglobina se mezcla una porcin de sangre con EDTA con el diluyente de la hemoglobina. Los eritrocitos se lisan y la hemoglobina libre se convierte en cianometahemoglobina. El conteo de los leucocitos y el diferencial de cinco partes se obtienen mediante el uso de dos mtodos distintos y dos canales separados, el canal de peroxidasa y el canal de basfilo/lobularidad

INSTRUMENTOS AUTOMTICOS PARA COAGULACIN Los primeros instrumentos analizaban el sistema de coagulacin a travs de la deteccin de la formacin del cogulo. El coagulo viscmetro, determin los tiempos de coagulacin al medir el cambio en la viscosidad de la sangre conforme se coagulaba. El cambio en la viscosidad se determina mediante el registro del voltaje contra el tiempo. Un segundo mtodo fue el del nefelmetro el cual fue adaptado para las pruebas de coagulacin. En nefelometra el tiempo de coagulacin se determinaba al medir las variaciones en la transiluminacin registrada por un galvanmetro. Los dos principios de coagulacin basados en cogulos usados actualmente por los instrumentos sobre coagulacin son la densidad electromagntica y la ptica. Otros instrumentos disponibles usan una combinacin de estos principios.

ST-4 AMERICAN BIOPRODUCTS


Es un instrumento semiautomtico para pruebas de coagulacin que se basa en el principio de la deteccin electromecnica del cogulo. ste es un instrumento constituido por un incubador de 16 posiciones con cuatro canales de incubacin y contadores de tiempo separados, una pipeta de suministro, pozos de almacenamiento del reactivo con termostato a temperatura ambiente y a 37 C, cuatro celdillas separadas para anlisis de muestra y un sistema de microprocesador. El principio de esta variacin en la deteccin del cogulo se basa en la viscosidad creciente del plasma al formarse el cogulo. La viscosidad creciente se detecta por el movimiento de una bola de hierro situado en el fondo del pocillo de reaccin. Se crea un movimiento pendular de la bola al alterar un campo electromagntico en los lados opuestos del recipiente con el uso de dos impulsores enrollados independientes.

Al comenzar la formacin del cogulo la viscosidad del plasma aumenta y hay una disminucin correspondiente en el movimiento de la bola, el tiempo de coagulacin se determina del algoritmo de las variaciones en la amplitud de la oscilacin. Los resultados del tiempo de coagulacin se muestran en el monitor de cristal lquido y se obtienen resultados impresos en la impresora trmica. * INSTRUMENTOS DE DENSIDAD PTICA

MLA ELECTRA 9000


Es un instrumento para coagulacin automtico con capacidad para practicar mltiples pruebas de anlisis en acceso aleatorio. Es un instrumento separado constituido por un sistema de transporte de recipientes, un sistema de computacin con dispositivos de monitor y teclado, un sistema de almacenamientos de reactivos y un sistema de calentamiento de reactivos. Este instrumento se basa en un muestreo manual del espcimen del paciente, pero con muestreo automtico de los reactivos. El procedimiento de la prueba se programa por el recipiente coloreado de reaccin especfica. El movimiento de un reactivo se logra por la accin de una bomba peristltica. El sistema de transporte del pocillo mueve al recipiente de reaccin a la posicin adecuada para su vigilancia por un fotodetector. La adicin del reactivo precalentado final inicia el conteo del tiempo. Al iniciarse la formacin del cogulo de fibrina, la cantidad de luz detectada por el fotodetector disminuye y da lugar a un cambio en la produccin de la seal elctrica del detector, la cual es analizada por la computadora para determinar el tiempo de coagulacin.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS


La correcta interpretacin de una hematologa automatizada orienta hacia cualquier patologa hematolgica, corroborada por el estudio hemoperifrico, es decir, suministra informacin detallada sobre las tres series hematopoyticas a saber; serie roja, serie blanca y serie plaquetaria y si estos resultados obtenidos son interpretados plenamente constituyen una aproximacin directa al diagnstico definitivo. La presente revisin es para demostrar que su correcta interpretacin constituye una herramienta invaluable en el diagnostico y evolucin de pacientes con enfermedades hematolgicas, correlacionado en el contexto clnico del paciente en estudio y por ende la necesidad o no de solicitar estudios ms especializados o en ltima instancia su referencia a la consulta especializada para corroborar las diversas

impresiones diagnsticas realizadas por el mdico; funcin primordial de un servicio de referencia. En el histograma se utilizan grficas de frecuencias de volmenes celulares representados en el eje X graficado contra un numero relativo representado en el eje Y; por ser relativo, no tiene un equivalente numrico real. El eje X se expresa en femtolitros (fl.). En condiciones normales, en el informe se observan curvas cnicas o cncavas, que en su mayora son modales, excepto la de plaquetas. Ilustracin 1. Reporte numrico y grfico (histograma)

Para lograr una correcta interpretacin del cuadro Hemtico es necesario recordar la definicin de cada uno de los parmetros utilizados, as tenemos: Serie roja Hemoglobina. Se mide en gramos por decilitro (g/dl) y representa la cantidad de esta protena por unidad de volumen. Valores normales: Hombre. 16+- 2g/dl, Mujer: 14 +-2 g/dl. Este parmetro debe ser el nico que se emplee para definir si hay o no anemia, es decir, solo si las cifras de hemoglobina son inferiores a los valores normales se puede asegurar que existe anemia y si estn por encima hablamos de poliglobulia y/o policitemia. Hematcrito. Se mide en porcentaje (%) y representa la proporcin de eritrocitos en el total de la sangre. Valores normales: Hombre: 47+6%, Mujer: 40+-6%.Este parmetro no se mide directamente por los contadores sino que se calcula a partir de la medicin del nmero de eritrocitos y del volumen corpuscular medio. Nmero de glbulos rojos. Se mide en millones por microlitro (millones/L). Valores normales: Hombre: 4.5 a 6.2 millones x mm 3,

Mujer: 4 a 5.5 millones x mm3. Con el uso actual de los contadores permite calcular con gran exactitud este parmetro eritroctico. Cuando no se cuenta con un equipo automatizado es preferible no mencionar este dato, dado el margen de error tan grande en la cuantificacin con mtodos manuales. Volumen corpuscular medio (VCM). Se mide en femtolitros (fl.) o micras cbicas. Valores normales: 83-97fl. Este ndice eritroctico es de gran valor en el diagnostico de las anemias. (Normocticas, macrocticas, microcticas)

CONCLUCION
Metodologia manual: se ve afectada por calidad del frotis (coloracin y grosor del extendido) los monocitos tienden a acumularse en los bordes del preparado (generalmente se mira en la zona central) poco nmero de clulas que se cuentan variabilidad intra e inter individual

Metodologa automatizada se realiza en una dilucin de la muestra con diluyente y reactivo adecuado

la adherencia de los monocitos no tiene importancia miles de clulas son analizadas coeficientes de variacin aceptables

No obstante las alertas de los analizadores (GI, DI, variacin LINFOCITOS, Blastos, etc ) hacen que en estas ocasiones se corroboren los elementos en el frotis. La experiencia del operador, al comienzo de nuestro trabajo automtico, comparando muestras al microscopio y en el equipo; nos mostrara que a medida que contabamos mas clulas en el frotis, nos acercabamos al valor automtico. La combinacin de metodologas en los analizadores proprorciona un alto grado de precisin en los resultados; lo que hace la presencia del operador en este caso los Tecnologos Medicos.

ANEXOS
CITOMETRIA DE FLUJO

MODO DE LECTURA: asi se aprecia el dispersograma

AUTOAMTIZACION HEMATOLOGIA 1RA GENERACION: Se caracterizaba por ser manual

AUTOANALIZADORES DE 2DA, 3RA Y 4TA GENERACION

AUTOANALIZADORES PARA COAGULACION

Sysmex CA 1500

Immulite 1000

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimic a/libros/celular/citometria.htm

2. http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2007/myl01112b.pdf 3. http://es.scribd.com/doc/2634668/HEMOGRAMAAUTOMATIZADO-DANIEL-SUAREZ-2006 4. https://www.sysmex.com/la/es/Products/Documents/XT-4000iEspa%C3%B1ol.pdf 5. http://www.ibcrosario.com.ar/articulos/HemogramaAutomatizado ValoresDeReferencia.html