Sunteți pe pagina 1din 41

UNIVERSITATEA BABE BOLYAI CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE FIZIC



SILVIA NEAMU


REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT


Funcionalitatea celulelor vii n cmpuri
electrice i magnetice



CONDUCTOR TIINIFIC:
C.S. I Dr. VASILE V. MORARIU



CLUJ-NAPOCA
2010
1
CUPRINS
INTRODUCERE........................ 1
PARTEA I
INFLUENTA CMPURILOR MAGNETICE SLABE ASUPRA
DEZVOLTRII PLANTELOR I BACTERIILOR
CAPITOLUL I
1. Percepia cmpurilor magnetice slabe la nivel celular............................................ 6
2. Mecanisme de interacie ale cmpurilor magnetice slabe cu structurile celulare.. 9
2.1. Mecanisme de rezonan............................................................................ 10
2.2. Stri metastabile ale apei.......................................................................... 14
2.3. Efectul cmpului magnetic asupra fluxului de electroni......................... 14
2.4. Modelul recombinrii perechilor de radicali (RP)................................... 15
3. Rezumat.......................... 17
CAPITOLUL II
CMP GEOMAGNETIC VARIAII MAGNETICE NATURALE.............................. 19
1. Fluctuaii naturale ale cmpului geomagnetic......................................................... 21
1.1. Noiuni generale........................................................................................ 21
1.2. Influena activitii geomagnetice asupra procese biologice.............. 23
2. Semnificaia cmpului geomagnetic pentru organismele vii.................................. 27
CAPITOLUL III
EFECTUL CAMPURILOR MAGNETICE SLABE ASUPRA CRESTERII VEGETATIVE A
PLANTELOR
1. Dezvoltarea vegetativ a plantelor. Noiuni generale.............................................. 30
1.1. Germinarea seminelor..................... 30
1.2. Dezvoltarea postembrional a plantelor................................................... 33
1.2.1. Diviziunea celular n meristemele apicale ale radiculei embrionale.. 33
1.2.2. Extensia celular......................................................................... 34
1.3. Dezvoltarea organelor laterale ale plantei................................................. 35
2. Bioefecte ale cmpurilor magnetice slabe n etapa vegetativ de cretere a plantelor 37
2.1. Influena cmpurilor magnetice slabe n faza de germinare a seminelor.. 37
2.2. Efectul cmpurilor magnetice a.c/d.c combinate.................. 39
2.3. Efectul cmpurilor magnetice alternative..................... 40
2.3.1. Efectul cmpurilor magnetice AC slabe potenat de factori de stress 41
2.4. Efecte biologice n cmp magnetic zero 42
3. Dezvoltarea vegetativ a plantelor n cmp magnetic zero Rezultate experimentale 44
3.1. Cmp magnetic zero compensare i monitorizare................................. 45
3.2. Pregtirea i expunerea probelor n CMZ 46
3.3. Germinarea seminelor n CMZ.. 49
3.4. Efectul CMZ n faza postembrional de cretere a plantulelor. 54
3.5. Efectul CMZ asupra dezvoltrii organelor laterale ale plantelor. 65
3.5.1. Analiza modificrilor morfologice ale plantelor 65
2
3.5.1.1-6. Tagetes Patula L., Tagetes erecta L, Calendula
officinalis L., Triticum aestivum L., Secale cereale
Lycopersicum esculentum L., Capsicum anuum L.. 65
3.5.2. Analiza modificrilor ultrastructurale ale frunzelor. 76
3.6. Concluzii............. 85
CAPITOLUL IV
INTERACIA CAMPURILOR MAGNETICE SLABE CU BACTERIILE I
CIANOBACTERIILE
1. Bioefecte n cmp magnetic static i oscilant........................................................... 94
1.1. Cmpuri magnetice intense....................................................................... 95
1.2. Cmpuri magnetice moderate................................................................... 96
1.3. Cmpuri magnetice slabe.......................................................................... 97
1.3.1. Efecte la nivelul structurilor celulare......................................... 98
1.3.1.1. Transpoziia i expresia genelor.................................. 98
1.3.1.2. Modificri conformaionale ale cromatinei n genomul
bacterian...................................................................... 99
1.3.2. Creterea bacteriilor n cmpuri magnetice slabe..................... 101
1.4. Influena activitii geomagnetice asupra dezvoltrii bacteriilor............ 102
2. Efecte ale cmpului magnetic zero asupra dezvoltrii bacteriilor.......................... 107
2.1. Date din literatur...................... 107
2.2. Curba de cretere n sisteme nchise de cultivare bacterian............... 108
2.3. Rezultate experimentale........................................................................... 110
2.3.1. Expunerea culturilor de bacterii n CMZ................................... 110
2.3.2. Evaluarea creterii bacteriene n CMZ...................................... 111
2.3.3. Multiplicarea bacterian i activitatea metabolic n culturi de
Listeria monocitogenes, E. coli i Salmonella expuse n CMZ 114
2.3.4. Creterea i activitatea metabolic a unor germeni microbieni pe
substrat de albumin............................................................... 117
2.4. Discuii...................................................................................................... 120
3. Dezvoltarea cianobacteriilor n cmp magnetic zero. Influena activitii geomagnetice
3.1. Pregtirea i expunerea culturilor de cianobacterii n CMZ.................... 122
3.2. Evaluarea vitezei de cretere a cianobacteriilor n CMZ.......................... 123
3.3. Rezultate experimentale........................................................................... 123
CAPITOLUL V
MOTILITATEA LISTERIEI MONOCITOGENES I A SPERMATOZOIZILOR IN CAMP
MAGNETIC ZERO - DATE PRELIMINARII
1. Motilitatea celular................................................................................................... 128
1.1. Motoare moleculare................................................................................... 128
2. Efecte ale cmpurilor electromagnetice asupra motilitii celulare....................... 132
3. Rezultate experimentale .............................. 134
3.1. Expunerea culturilor de Listeria monocitogenes n CMZ............ 134
3.2. Analiza motilitii spermatozoizilor umani n lichid seminal.................. 134
3.3. Motilitatea Listeriei monocitogenes in CMZ............................................ 135
3.4. Motilitatea spermatozoizilor n CMZ....................................................... 136
3
CAPITOLUL VI - CONCLUZII FINALE...................................................................... 139
BIBLIOGRAFIE........................ 142
PARTEA II
EFECTE ALE CMPURILOR ELECTRICE INTENSE, DE SCURT DURAT
ASUPRA CELULELOR VII: ELECTROPERMEABILIZAREA BIOMEMBRANELOR
CAPITOLUL I
1. Introducere........................ 157
2. Procese primare n biomembrane expuse unui cmp electric pulsat..................... 159
2.1. Potenialul de membran indus sub aciunea pulsurilor de cmp electric 161
3. Caracteristici ale procesului de electropermeabilizare membranar............... 164
3.1. Dependena potenialului transmembranar de intensitatea cmpului electric
extern......................................................................................................... 164
3.2. Caracterul vectorial al cmpului electric pulsat permeabilizarea asimetric 165
3.3. Interdependena parametrilor electrici................ 167
4. Transport molecular prin membrane electropermeabilizate................ 168
5. Cinetica procesului de electropermeabilizare membranar................. 170
6. Modele teoretice ale procesului de electropermeabilizare membranar................ 177
7. Electroporarea biomembanelor metod utilizat n biotehnologie............... 177
CAPITOLUL II REZULTATE EXPERIMENTALE
1. Tehnica electropermeabilizrii biomembranelor Instalaia experimental........ 180
1.1. Parametrii electrici......................... 181
1.2. Procedeul de electroporare n flux..................... 182
1.3. Blocul de termostatare..................... 183
2. Contribuia parametrilor de puls electric in procesul de electropermeablizare a
membranei eritrocitare.......................................................... 184
1. Experiment........................ 184
2.2. Rezultate ........................ 185
3. Inactivarea procesului de reinchidere a electroporilor in membrane eritrocitare
iradiate cu electroni.................................................................................................. 190
3.1. Analiza int............................................................................................... 191
3.2. Iradiere cu electroni.................................................................................. 192
3.3 Electroporare............................................................................................. 192
3.4. Rezultate experimentale........................................................................... 193
4. Determinarea distribuiei dimensionale a celulelor pe baza experimentelor de
electropermeabilizare membranar......................... 196
4.1. Electrohemoliza eritrocitara.............................. 198
4.2. Rezultate experimentale.................. 199
5. Electropermeabilizarea membranar n patologia diabetic i leucemic............. 201
5.1. Rezultate experimentale............................................................................ 202
CAPITOLUL III CONCLUZII.................... 207
BIBLIOGRAFIE................................. 210
4




Cuvinte cheie:
- cmpuri magnetice slabe, cmp geomagnetic, cmp magnetic zero, activitate
geomagnetic, indice Ap, mecanisme de rezonan magnetic, modelul transferului de
electroni, recombinarea perechilor de electroni,
- plante, cretere vegetativ a plantelor, germinare, lucerna - Medicago sativum L., gru -
Triticum aestivum L., secar - Secale cereale L., roii- Lycopresicum esculentum L., ardei
- Capsicum annuum L., crai - Tagetes erecta L., Tagetes patula L., glbenele -
Calendula oficinalis L., analiza ultrastructural, analiza fractal,
- bacterii, multiplicare bacterian, Listeria monocitogenes, Salmonella, Escherichia coli,
mprtierea luminii laser la unghiuri mici, electroforez n gel de poliacrilamid,
electroforez n gel de agaroz, cianobacterii, Synechocystis, motilitate celular, motoare
moleculare, spematozoizi umani,
- electropermeabilizare membranar, electroporare, potenial critic transmembranar, cmp
electric pulsat, transport molecular, transfer de ADN, teoria porilor apoi, simularea
dinamicii moleculare (MD), electroincorporare, electroinserie, electrofuziune,
electrochemoterapie, electrotransfer transdermic,
- electrohemoliz, refacerea membranei electropermeabilizate, iradiere cu electroni,
analiza int, citoschelet eritrocitar, spectrin, distribuie dimensional,
- glicozilare proteic, diabet zaharat tip I, diabet zaharat tip II, leucemie limfatic cronic,
limfom Hodykin, insuficien medular, hemoglobina glicozilat.










5
INTRODUCERE

Teza are drept obiectiv investigarea efectelor morfologice i funcionale induse de
interaciunea sistemelor vii cu cmpurile electrice i magnetice.
Natura nonmagnetic a membranelor, celulelor i a esuturilor permite penetrarea
cmpurilor magnetice cu o atenuare neglijabil i aciunea direct la diferite nivele ale
structurilor i proceselor celulare. Problema actual a interaciei structurilor celulare cu
cmpurile magnetice slabe (T) este dat de pragul de percepie i rspuns celular. Cmpul
geomagnetic ca factor de mediu a organismelor vii cuprinde o component static (principal)
cu originea n nucleul Pmntului (~50 T) peste care se suprapune o component
alternativ generat de surse naturale de origine interplanetar modulate de activitatea solar
i surse electromagnetice de natur tehnologic. Cmpurile magnetice ambientale sunt
cmpuri slabe (1-100 T) de joas frecven (0-300Hz) cu o component major de 50- 60Hz
generat de liniile de transmisie i distribuie electric. La nivel celular, energia produs n
acest interval al parametrilor de cmp se afl sub pragul de percepie celular definit de
energia indus de zgomotul termic membranar i nu justific existena unui rspuns biologic
semnificativ. Rspunsul biologic n prezena cmpurilor magnetice slabe este susinut ns de
o larg baz de date experimentale i epidemiologice i este caracterizat prin curbe nelineare
doz-rspuns, cu eficien semnificativ n intervale de amplitudine i/sau frecven, definite
prin ferestre de amplitudine i ferestre de frecvene. Ferestrele biologice pentru
cmpurile magnetice slabe sunt puse n eviden la diferite nivele de organizare structural,
sau la nivel funcional.
Un numr mare de publicaii atest existena unor corelaii semnificative ntre datele
clinice, epidemiologice, diferite procese biologice i fluctuaiile naturale ale componentei
alternative a cmpului geomagnetic. Perturbrile geomagnetice sunt considerate un factor de
risc ecologic care pot desincroniza ritmurile biologice i alte procese n organism sau pot
modifica starea funcional a creierului. In mod similar, reducerea componentei statice a
cmpului geomagnetic poate constitui un factor de risc pentru sntate, genernd perturbri
funcionale ale diferitelor sisteme ale organismului [Pokhodzey 1998]. La nivel celular,
ecranarea cmpurilor magnetice induce o diminuare a proliferrii celulare, procese de
accelerare a sintezei proteinelor, modificri la nivelul ultrastructurii celulare, etc [Belyavskaia
2004]. Compensarea componentei statice a cmpului geomagnetic este perceput ca un
element de stres la nivelul proceselor de transport membranar [Morariu i colab. 1999,
Ciorba i Morariu 2001, Ciortea i colab 2001]. Variabilitatea rspunsului biologic pare s
constituie o caracteristic general a interaciei organismelor simple (plante, procariote) cu
cmpurile magnetice slabe.
Studiul sistematic al proceselor de cretere a plantelor i a bacteriilor n absena
componentei principale a cmpului geomagnetic (cmp magnetic zero) prezentat n prima
parte a tezei, completeaz tabloul de ansamblu al semnificaiei cmpului geomagetic n
dezvoltarea acestor organisme i al influenei fluctuaiilor magnetice naturale (furtuni
magnetice).

Membrana celular prezint pe de alt parte un important cmp electric intrinsec
meninut prin distrubuia dipolilor i prin deplasrile permanente de ioni ntre mediile intra-
respectiv extra-celular. Aceast component intrinsec de cmp electric intens prezent la
nivelul membranelor celulare reprezint o barier esenial pentru aciunea cmpurilor
6
electrice externe. Un important aspect de interes biotehnologic al interaciei celulelor cu
cmpurile electrice este modularea potenialului membranar intrinsec prin intermediul unui
cmp electric pulsat intens (kV/cm) i de scurt durat (s). Peste o valoare de prag a
potenialului transmembranar indus are loc o restructurare a bistratului lipidic nsoit de
permeabilizarea membranei i transportul molecular intra i extracelular.
Electropermeabilizarea membranar este un proces neinvaziv care poate fi controlat i
modulat de parametrii electrici. Succesele care nsoesc utilizarea acestui proces n scopuri
aplicative au dat natere unei noi biotehnologii bazat pe tehnica electroporrii
biomembranelor. In timp ce din punct de vedere experimental literatura este impresionant
i dovedete importana practic a tehnicii de electroporare, procesele moleculare care stau la
baza electropermeabilizrii membranare reprezint un subiect mult dezbtut i n prezent.
Studiile prezentate n a doua parte a tezei cuprind contribuii originale legate att de
aspectele fundamentale ale procesului de electropermeabilizare membranar ct i de
aplicaii ale tehnicii de electroporare ca metod alternativ de investigare a modificrilor la
nivel celular n diverse patologii.


PARTEA I
INFLUENA CMPURILOR MAGNETICE SLABE ASUPRA
DEZVOLTRII PLANTELOR I BACTERIILOR

Scopul primei pri al tezei const n ilustrarea influenei cmpurilor magnetice
naturale n procese bazate pe creterea i multiplicarea celular a unor organisme unicelulare
cum sunt bacteriile i cianobacteriile i n dezvoltarea vegetativ a plantelor. Semnificaia
cmpului geomagnetic n aceste procese a fost pus n eviden n condiii de compensare a
componentei statice a cmpului geomagnetic (cmp magnetic zero). Cercetarea este motivat
n primul rnd de numrul extrem de redus de studii privind rspunsul acestor organisme n
cmp geomagnetic compensat. S-a avut n vedere realizarea unor investigaii complete, care
n cazul evoluiei plantelor au cuprins toate etapele de cretere vegetativ, experimentele
fiind realizate pe un numr semnificativ de specii, n diferite perioade ale anului.
Studiile de multiplicare bacterian au cuprins cel puin dou metode de analiz pe
diferite tulpini bacteriene. Rezultatele preliminare legate de motilitatea celular n cmp
magnetic zero ncheie prima parte a acestei teze.
Datele experimentale sunt precedate de o sistematizare a bioefectelor cmpurilor
magnetice slabe pentru fiecare sistem biologic investigat.


III. EFECTUL CAMPURILOR MAGNETICE SLABE ASUPRA
CRESTERII VEGETATIVE A PLANTELOR
1. DEZVOLTAREA VEGETATIV A PLANTELOR. NOIUNI GENERALE
Din punct de vedere ontologic, dezvoltarea temporal a plantelor pe durata unui ciclu
de via este definit prin patru stadii [Pankaj i colab. 2005]: 1. etapa vegetativ care
cuprinde faza de: i) germinare a seminelor, ii) dezvoltare a plantulei marcat prin formarea
frunzelor i elongarea tulpinii, iii) ramificarea; 2. etapa reproductiv definit prin fazele de
7
inflorescen, nflorire, formarea fructului i maturizarea plantei; 3. senescena cuprinde
procesele care au loc pn la finalizarea vieii active a plantei; 4. perioada de laten const n
suspendarea activitilor fiziologice care pot fi ns reactivate.
Spre deosebire de regnul animal la care tiparul structural de baz a corpului i a
organelor este conturat nc din faza de dezvoltare embrionar, evoluia plantelor presupune
formarea i dezvoltarea continu de noi esuturi i organe.
Germinarea seminelor, respectiv trecerea de la starea de repaus vegetativ la cea de
via activ, const ntr-o succesiune de faze iniiate prin preluarea apei prin pereii celulari
(faza de mbibare) i activarea hormonilor de semnalizare. Din punct de vedere fiziologic,
procesul de germinare este finalizat odat ce radicula embional strpunge esuturile care
nconjoar embrionul (embriogeneza). Balansul ntre capacitatea de expansiune a
embrionului (potenialul de cretere) i restricia impus de esutul nconjurtor
(endospermul) reprezint factorul determinant al duratei procesului de germinare
Procesul fiziologic de cretere post embrional a plantulei are la baz procesul de
diviziune i extensie celular la nivelul unor esuturi specializate numite meristeme care se
formeaz n timpul embriogenezei la polii opui ai seminei (meristeme apicale) i care
iniiaz dezvoltarea rdcinii i a axulului principal al plantulei. Creterea plantelor depinde
de continua funcionare a meristemelor n care balansul ntre proliferarea i diferenierea
celular este riguros controlat.
Iniierea organelor laterale ale plantelor cum sunt formarea frunzelor, florilor,
fructelor implic o cretere a vitezei de diviziune celular n partea lateral a meristemului
apical al tulpinii. Proliferarea celular localizat n aceast zon duce la formarea primordiilor
organului lateral i iniierea diviziunii celulare n primordiile nou formate. Activitatea
hormonal i expresia genetic reprezint principalul motor al procesului de dezvoltare al
plantelor tinere i mature.

3. DEZVOLTAREA VEGETATIV A PLANTELOR N CMP MAGNETIC ZERO
REZULTATE EXPERIMENTALE
Interesul pentru germinarea i creterea plantelor n lipsa cmpului geomagnetic
(CMZ) este legat n primul rnd de cercetrile spaiale. In acest sens sunt relevante primele
cercetri revizuite de Conley n 1969. O important contribuie n perioada 1978-2000 au
adus-o grupurile de cercetare din Federatia Rusa, a cror publicaii (n limba rus)
greu accesibile pn de curnd, au fost mediatizate de Belyavskaya [2004]. Principala
problem a acestor cercetri rmne marea diversitate a rezultatelor publicate.
Influena cmpului geomagnetic compensat asupra creterii plantelor a fost
predominant investigat n condiii de ecranare magnetic pe perioade de cretere relativ
scurte. Datele publicate n literatura de specialitate ilustreaz doar aspecte pariale ale
evoluiei unei specii n astfel de condiii. Cercetrile noastre au avut ca scop principal
extinderea investigaiilor la analiza ntregului interval de cretere vegetativ. Alte aspecte noi
cuprind:
1) monitorizarea procesului de cretere n diferite perioade ale anului pe
acelai material i n aceleai condiii experimentale
2) testarea comparativ a unor specii de plante care nu au mai fost analizate
Selecia plantelor a avut n vedere o varietate a speciilor de plante care s cuprind att
plante de cultur cu importan economic (lucerna - Medicago sativum L. var. Luzerne
8
Euver , gru - Triticum aestivum, fam Gramineae, secar - Secale cereale, fam Gramineae,
hric - Fagopyrum esculentum, fam Polygonaceae, roii- Lycopresicum esculentum, fam
Solanaceae, ardei - Capsicum annuum, fam Solanaceae) ct i plante din flora spontan
(crai - Tagetes erecta, Tagetes patula, fam Asteraceae, glbenele - Calendula oficinalis,
fam Asteraceae). Cu excepia seminelor de gru, speciile selectate nu au mai fost investigate.
3) decelarea influenei fluctuaiilor magnetice naturale n diferite stadii de
dezvoltare ale plantelor n condiii de cmp magnetic zero (CMZ). Cmpul magnetic zero
trebuie neles ca o reducere a componentei statice a cmpului geomagnetic, variaiile diurne
i fluctuaiile magnetice generate de apariia furtunilor magnetice rmn operative.
Rspunsul plantelor n cmp cmp magnetic zero a fost evaluat sub dou aspecte:
1. morfologic n urmtoarele stadii de dezvoltare: i) germinarea seminelor, ii)
faza post embrional de cretere definit prin apariia i dezvoltarea radiculei embrionale n
interval de 4-5 zile, iii) dezvoltare a plantulelor tinere n interval de o lun, iv) stadiul de
plant matur pn n faza de nflorire i apariie a rodului.
2. ultrastructural prin analiza electronomicroscopic a frunzelor n ultimele
dou stadii de dezvoltare ale plantei.
3.1. Cmp magnetic zero compensare i monitorizare
Metoda de compensare a componentei continue a cmpului geomagnetic utilizeaz o
bobin de tip Helmholtz cu diametru de 1.2m, montate pe un schelet de lemn, orientat n
direcia N-S, la un unghi pe vertical apropiat de nclinarea vectorului de cmp geomagnetic
(Fig. 3.1).

Fig.3.1.
Sistem de compensare a componentei
statice a cmpului geomagnetic
Bobina Helmholtz
In spaiul delimitat de bobine, componenta static a cmpului geomagnetic este
redus cu un factor de ~100. Pentru monitorizarea variaiilor cmpului magnetic pe
suprafaa selectat n vederea expunerii probelor a fost utilizat un magnetometru
FLUXMASTER cu o precizie de 1 nT. In diferite poziii cmpul variaz n intervalul 0-
500nT. Aceste valori includ variaii diurne ale cmpului geomagnetic. Prin acest dispozitiv a
fost compensat numai componenta static, fluctuaiile magnetice naturale rmn operative.
Acest fapt ne permite evaluarea suplimentar a influenei fluctuaiilor magnetice induse n
timpul furtunilor magnetice. Pentru fiecare experiment datele au fost analizate n relaie cu
variaia zilnic a activiii geomagnetice (GMA) reprezentat prin indicele Ap. Acesta este un
indice mediu al activitii zilnice nregistrat de anumite observatoare pe suprafaa
pmntului i este furnizat de site-ul National Geographic Data Center, USA. Ca msur a
variaiei activitii geomagnetice am utilizat deviaia standard a valorilor indicelui Ap (sd
9
Apindex) n intervalul desfurrii experimentului. Prezena unei furtuni magnetice a fost
notat prin valoarea Ap i ziua n care aceasta a fost nregistrat.
3.3. Germinarea seminelor n cmp magnetic zero
Germinarea unei populaii de semine urmrete o curb sigmoidal a crei pant
caracterizeaz viteza de germinare. Aceast curb a fost determinat pentru fiecare specie
testat pe baza procentului de semine germinate stabilit la fiecare 3 ore n intervalul de
expunere a lotului experimental (cmp magnetic zero - CMZ) i a lotului martor (cmp
geomagnetic - CGM). Efectul CMZ a fost estimat prin diferena normalizat a vitezei de
germinare n cmp geomagnetic compensat i n cmp magnetic natural, reprezentat de
parametrul x0 a curbei de fitare Boltzman a datelor experimentale: ((xCMZ-xCGM)/ xCGM)*100.
Dup cum se observ din rezultatele prezentate n Tabelul 1, n perioade cu activitate
geomagnetic sczut, viteza de germinare a seminelor a fost nesemnificativ modificat n
CMZ la toate speciile de plante selectate [Neamtu i Morariu 2005]. Conform acestor date
absena componentei statice a cmpului geomagnetic nu reprezint un stres n aceast faz
de dezvoltare a plantelor.
Tabel 1.
Viteza de germinare a seminelor n CGM (M) i CMZ (P), efectul CMZ i
variaia GMA n intervalul de expunere a seminelor
Specia plantei
x0 (%/or)
M CGM; P- CMZ
Efect CMZ
((xCMZ-xCGM)/
xCGM)*100 [%]
GMA
(sd Apindex)
Medicago sativa M 30.49 0.87; P 29.67 0.98 2.6 210
Tagetes patula M 26.5 1.50; P 26.92 1.09 1.5 28
Calendula
oficinalis
M 26.06 0.13; P 26.03 0.64 0.11 28
Triticum
aestivum
M 9.09 0.16; P 8.79 0.12 3.3 211
Secale cereale M 8.93 0.31; P 9.11 0.11 2 211

Diferene semnificative au fost observate n perioade perturbate magnetic n setul de
experimente efectuat pe semine de lucern [Neamtu i Morariu 2005]. Viteza de germinare
a seminelor este reprezentat n Fig.3.2.a. pentru nou experimente (a) n paralel cu
activitatea geomagnetic corespunztoare perioadei de incubare a seminelor (b). Efecte
semnificative a CMZ sunt marcate pe grafic cu asterix (*).
In perioade cu activitate geomagnetic sczut au fost nregistrate efecte statistic
nesemnificative. Prezena unei furtuni majore (Ap=53) n faza de mbibare a seminelor
(prima zi de expunere) (Exp 2) i a unei furtuni minore (Ap=41) n a doua zi de incubare (Exp
9) a fost corelat cu o vitez de germinare semnificativ stimulat (p<0.05) n CMZ. Perioada
de germinare a seminelor a fost redus cu 10% n primul caz i cu 6% n Exp. 9. In Fig. 3.2.b
sunt detaliate curbele de germinare a seminelor expuse n CMZ i CGM pentru cele dou
perioade experimentale.
Rezultatele obinute susin ipoteza unei influene favorabile a fluctuaiilor magnetice
naturale induse de furtuni magnetice majore n fazele iniiale ale procesului de germinare i
sunt n acord cu rezultatele publicate de Alexander i Doijde [1995] i Pazur i Scheer [1992]
care semnaleaz efecte semnificative de stimulare a germinrii seminelor [1.5 T, 5 Hz] i a
10
diviziunii celulare la alge [20-200 T, 7.5 Hz] n cmpuri magnetice alternative slabe cu
frecvene apropiate de frecvenele oscilaiilor rezonante Schuman

15I/98 10III/98 24III/98 2XII/98 20XII/98 16II/99 10III/99 12III/99 22IX/01
0
10
20
30
40
50
(b)
Ap=21 zi-1
Ap=34 zi-2
Ap=41 zi-2
Ap=80 zi-3
Ap=53 zi-1
Ap=28 zi-2
A
c
t
i
v
i
t
a
t
e

g
e
o
m
a
g
n
e
t
i
c
a

(
S
d

A
p
)
sdAp
Exp.9 Exp.8 Exp.7 Exp.6 Exp.5 Exp.4 Exp.3 Exp.2 Exp.1
15I/98 10III/98 24III/98 2XII/98 20XII/98 16II/99 10III/99 12III/99 22IX/01
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10 *
Data experimentului
[
(
x
C
M
Z
-
x
C
G
M
)
/

x
C
G
M
]
*
1
0
0

[
%
]
Efect CMZ
*
(a)

5 10 15 20 25 30 35 40 45
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
(a)
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero
G
e
r
m
i
n
a
r
e

s
e
m
i
n
t
e

[
%
]
Timp de incubare [ore]

5 10 15 20 25 30 35 40 45
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
(b)
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero
G
e
r
m
i
n
a
r
e

s
e
m
i
n
t
e

[
%
]
Timp de incubare [ore]

Fig.3.2.a
Efectul CMZ asupra germinrii seminelor de lucern
(a) i variaia activiti geomagnetice asociate
perioadelor de incubare (b)
Fig.3.2.b.
Stimularea germinrii seminelor de
lucern n cmp magnetic zero; (a) Exp 2,
(b) Exp 9

3.4. Efectul cmpului magnetic zero n faza postembrional de cretere
Influena CMZ n stadiul postembrional de cretere a fost evaluat prin parametrii de
lungime a rdcinii i a tulpinii primare, dup patru zile de incubare la ntuneric a seminelor.
Analiza statistic (testul ANOVA, program Origin 7.5) a diferenelor de cretere a plantulelor
expuse n CMZ fa de lotul martor (CGM) a cuprins 80-120 plantule. Semnificaia datelor a
fost estimat pentru p = 0.5. Efectul CMZ a fost evaluat prin diferena normalizat a
parametrilor de cretere: ((LCMZ-LCGM)/ LCGM)*100 unde L reprezint lungimea rdcinii sau a
tulpinii n cmp magnetic zero i cmp geomagnetic. Fiecare experiment/specie a fost repetat
de 6-8 ori n diferite perioade ale anului i fiecare perioad a constat n incubarea simultan a
dou sau trei specii de plante.
Rezultatele obinute indic o specificitate de rspuns a plantelor n funcie de specie
[Neamu i colab. 2009, Neamu i Morariu 2010]. In perioade cu activitate geomagnetic
sczut (Fig.3.3), efectul dominant asupra creterii plantelor din sp. T. erecta L. a fost dat de
stimularea creterii rdcinilor n CMZ (p<0.05) (Fig. 3.4.), cu diferene de cretere cuprinse
ntre 19% - 32,9%. Notm c acest efect a fost evideniat n perioadele de primvar i var.
O situaie particular a fost dat de lipsa unui efect semnificativ n perioadele de
toamn i iarn (octombrie 2005, februarie i septembrie 2006). Acest fapt poate fi asociat cu
descreterea sensibilitii plantelor n afara perioadelor naturale de vegetaie. In prezena
unei furtuni magnetice minore (Ap=48) n prima zi de incubare a seminelor (iunie 2005)
creterea rdcinilor nu a fost afectat, efect care poate fi privit i ca o mascare a efectului de
stimulare a CMZ pus n eviden n perioade cu activitate geomagnetic sczut.
11
0
10
20
30
40
50
Furtuni majore

Data experimentului [an 2005]
10 nov 29 iulie 18 oct 1 iulie 23 iunie 10 iunie 14 aprilie
A
c
t
i
v
i
t
a
t
e

g
e
o
m
a
g
n
e
t
i
c
a

[
i
n
d
e
x

A
p
]
Furtuni minore
GMA activa

Fig.3.3.
Variaia zilnic a activitii geomagnetice n
diferite perioade experimentale pe parcursul
anului 2005. Valorile aparinnd unui
experiment sunt conectate prin linie dreapt.
Data iniierii experimentului este notat pe
abscis.

0
1
2
3
4
5
(
(
L
C
M
Z
-

L
C
G
M
)

/

L
C
G
M
)

*

1
0
0

[
%
]
1 iulie
2005
18 oct
2006
camp geomagnetic
camp magnetic zero


*
*
15 apr
2005
11 sept
2006
20 martie
2006
09 feb
2006
29 iulie
2005
23 iunie
2005
0
1
2
3
4
5
camp geomagnetic
camp magnetic zero
Ap=48 zi 1
l
u
n
g
i
m
e

t
u
l
p
i
n
a

[
c
m
]
A
l
u
n
g
i
m
e

r
a
d
a
c
i
n
a

[
c
m
]
Tagetes erecta L.


*
*
*

-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40

lungime radacina
lungime tulpina
(
(
L
C
M
Z
-

L
C
G
M
)
/

L
C
G
M
)
*

1
0
0

[
%
]
)
*
*
*
*
*

Ap=48
zi 1
Data experimentului
1
5

a
p
r

2
0
0
5
1
1

s
e
p
t

2
0
0
6
2
0

m
a
r
t
i
e

2
0
0
6
0
9

f
e
b

2
0
0
6
1
8

o
c
t

2
0
0
5
2
9

i
u
l
i
e

2
0
0
5
1

i
u
l
i
e

2
0
0
5
2
3

i
u
n
i
e

2
0
0
5
B

Fig 3.4.
Valorile parametrilor de cretere n lungime a plantulelor din sp. Tagetes erecta n CMZ i CGM n
diferite perioade ale anului 2005 i 2006 (A) i efectul CMZ corespunztor (B). Valorile statistic
semnificative sunt marcate printr-un asterix (*) n dreptul parametrilor de cretere
corespunztori.

Spre deosebire de speciile aparinnd genului Tagetes, dezvoltarea postembrional a
sp. Triticum aestivum L i sp Secale cerevisiae L. este cu predomina inhibat n CMZ.
Capacitatea seminelor de gru de a genera rdcini a fost redus n ase din opt perioade
experimentale (Fig.3.5.). Remarcm reactivitatea ridicat a plantulelor de secar n condiii
de CMZ (Fig.3.5.). Fiecare expunere a seminelor a fost urmat de o reducere n medie cu
10% 0.60 (p<0.5) a parametrilor de cretere n CMZ, efectul maxim fiind nregistrat n
februarie i septembrie 2006 (~18%).
Dezvoltarea sp. Tagetes patula L. ilustreaz un rspuns inconstant n diferite
experimente, care alterneaz ntre stimularea semnificativ a creterii rdcinii i inhibarea
dezvoltrii tulpinii n CMZ.
Creterea postembrional a Calendula oficinalis L. nu a fost afectat, indicnd o
sensibilitate sczut la modificarea mediului magnetic. In acelai timp, o cretere a activitii
magnetice n prezen unor furtuni magnetice minore (Ap=35; Ap=33) a fost asociat cu un
efect biologic nesemnificativ.
12
0
1
2
3
4
5
l
u
n
g
i
m
e

t
u
l
p
i
n
a

[
c
m
]
camp geomagnetic
camp magnetic zero
*
*
*
0
10
20
30
l
u
n
g
i
m
e

r
a
d
a
c
i
n
a

[
c
m
]
camp geomagnetic
camp magnetic zero
Ap=35 zi 3
Ap=33 zi 4
*
*
*
*
Triticum aestivum L.
Ap=35 zi 3
Ap=33 zi 4
A

0
2
4
6
8
camp geomagnetic
camp magnetic zero
l
u
n
g
i
m
e

r
a
d
a
c
i
n
a

[
c
m
]
*

*
*
0
10
20
30
camp geomagnetic
camp magnetic zero
l
u
n
g
i
m
e

t
u
l
p
i
n
a

[
c
m
]
*
Ap=35 zi 3
Ap=33 zi 4
*

*
*
Ap=35 zi 3
Ap=33 zi 4
Secale cereale L.
A

-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
Data experimentului
lungime radacina
lungime tulpina
2
1

s
e
p
t

2
0
0
6
2
0

m
a
r
t
i
e

2
0
0
6
1
2

i
a
n

2
0
0
6
1
0

n
o
v

2
0
0
5
1
0

i
u
n
i
e

2
0
0
5
2
9

m
a
r
t
i
e

2
0
0
5
1
6

n
o
v

2
0
0
2
1
5

o
c
t

2
0
0
2
(
L
C
M
Z
-

L
C
G
M
)
/

L
C
G
M

*

1
0
0

[
%
]
B
*
*
Ap=47 zi 3
Ap=40 zi 4
Ap=35 zi 3
Ap=33 zi 4
*
*
*
*
*



-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
lungime radacina
lungime tulpina
(
L
C
M
Z
-

L
C
G
M
)
/

L
C
G
M

*

1
0
0

[
%
]
Data experimentului

2
1

o
c
t

2
0
0
2
2
1

s
e
p
t

2
0
0
6
2
9

m
a
r
t
i
e

2
0
0
5
2
3

m
a
r
t
i
e

2
0
0
6
1
3

f
e
b

2
0
0
6
1
0

i
u
n
i
e

2
0
0
5
1
6

n
o
v

2
0
0
2
*
*
*
*
*
*
*
Ap=47 zi 3
Ap=40 zi 4
Ap=35 zi 3
Ap=33 zi 4


B

Fig. 3.5.
Valorile parametrilor de cretere n lungime a plantulelor din sp. Triticum estivum (gru)
i Secale cereale (secar) n CMZ i CGM n diferite perioade ale anului (A)
i efectul CMZ corespunztor (B).

Efectele de stimulare sau inhibare a creterii unor specii de plante n primele patru
zile de expunere n cmp magnetic zero, ar putea fi explicate prin potenarea sensibilitii
plantelor n cursul fazelor de cretere intens cum este stadiul postembrional de cretere la
fel cum efectele cmpurilor alternative slabe sunt potenate de factorii de stres [Ruzic i
colab. 1998, 2000] sau de starea fiziologic a seminelor [Aksyonov i colab. 2001, Alexander
i Doijode 1995].
Sub acest aspect putem explica rspunsul semnificativ a sp. Tagetes erecta i Tagetes
patula n perioadele de primvar i var cnd viteza de cretere a plantelor este potenat,
fa perioadele de toamn i var, cnd o evoluie mai lent a creterii este nsoit de
diferene nesemnificative n dezvoltarea postembrional a plantelor n CMZ i CGM.




13
3.5. Efectul CMZ asupra dezvoltrii organelor laterale ale plantelor
Influena CMZ n stadiul de formare i dezvoltare a organelor laterale ale plantelor a
fost urmrit sub aspect morfologic i ultrastructural.
Analiza morfologic a constat n monitorizarea diferenelor nregistrate n faza de
apariie a plantelor i a frunzelor i prin evaluarea statistic a diferenelor de lungime a
tulpinii, a frunzelor, lungimea total a plantei i greutatea acesteia, numrul de boboci, flori
i rod. Semnificaia statistic a datelor experimentale i evaluarea efectului cmpului
magnetic zero a fost determinat n mod similar dezvoltrii post embrionale.
Influena CMZ pus n eviden n faza postembrional de cretere este mult
diminuat n faza de dezvoltare a plantelor tinere i a plantelor mature [Neamtu i colab.
2009, Neamtu i Morariu 2010]. Analiza statistic a parametrilor de cretere arat pentru
aceeai specie expus n CMZ, efecte semnificative dar i diferene de cretere
nesemnificative n diferite perioade ale anului dup cum se poate observa n Fig.3.6
exemplificat pentru Calendula oficinalis.




Fig.3.6.
Variaia activitii
geomagnetice (A) i efectul
CMZ asupra
creterii sp. Calendula
oficinalis dup o lun de
incubare







In absena cmpului geomagnetic, dezvoltarea T. erecta L., Calendula oficinalis L.,
Triticum aestivum L. i Capsicum anuum L. a fost cu preponderen ncetinit, evoluie
ilustrat prin apariia ntrziat i dimensiunea redus a frunzelor tinere n curs de cretere
(Fig. 3.7.). Aspectul plantelor este mai puin viguros dup o lun de expunere n CMZ iar
greutatea medie a masei verzi mai mic fa de plantele din lotul martor.
Rezultate similare au fost semnalate de Lebedev n cazul plantulelor de orz expuse
ntr-un interval de trei saptmni n cmpuri magnetice ecranate la 10 nT [Lebedev 1977].
Dezvoltarea plantulelor tinere aparinnd sp Lycopersicum esculentum i sp Tagetes
patula nu este influenat n CMZ n prima lun de via. Expunerea prelungit a plantelor la
cinci- apte luni evideniaz un efect negativ a CMZ asupra dezvoltrii masei verzi a plantelor
mature aparinnd sp. Tagetes patula L. i confirm influena negativ n dezvoltarea sp.
Capsicum anuum L. sau rspunsul nesemnificativ al sp. Lycopersicum esculentum L
15 20 25 30 4 9 14
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Februarie - Martie 2005
A
c
t
i
v
i
t
a
t
e

g
e
o
m
a
g
n
e
t
i
c
a

[
A
p

i
n
d
e
x
]
Data experimentului
5 8 11 14 17 20 23 26 1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Februarie - Martie 2006
Data experimentului
Furtuni majore
Furtuni minore
GMA activa
3 8 13 18 23 28
0
10
20
30
40
50
60
70
80

Martie- Aprilie 2006
G Pl T p Fr1 p Fr2 p Rr
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50 B
G = greutate planta
Pl= lungime planta
T = lungime tulpina
F = llungime frunza

L
C
M
Z
-

L
C
G
M
/

L
C
G
M

*

1
0
0

[
%
]
G T Pl p F1 p F2 p F3 pF4
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
G = greutate planta
Pl= lungime planta
T = lungime tulpina
F = llungime frunza
*
*
G Pl T pFr1 pFr2 pFr3 pFr4
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50 Data experimentului
G = greutate planta
Pl= lungime planta
T = lungime tulpina
F = llungime frunza
*
*
A
14





Fig.3.7.
Efectul CMZ asupra parametrilor de
cretere (greutate, lungime frunze tinere)
a plantelor din sp. Tagetes patula,
Calendula oficinalis Triticum estivum,
Lycopersicum esculentum dup o lun de
incubare.
(pentru fiecare specie este reprezentat
valoarea medie a mai multor
experimente)




La majoritatea speciilor etapa reproductiv de cretere a fost nesemnificativ
influenat n CMZ. Se poate vorbi ns de o potenare a creterii n nlime a plantelor
tinere (Tagetes erecta, Tagetes patula, Capsicum anuum) i de un proces mai rapid
(Lycopersicum aesculentum) sau mai lent (Tagetes patula) n faza de apariie a bobocilor i a
florilor. In aceast etap de cretere, evoluia plantelor de ardei a fost ntrziat iar rezistena
la boli mult diminuat.
Efectul CMZ bine conturat la unele specii n primele stadii de cretere este
semnificativ diminuat prin expunerea plantelor pe termen lung, sugernd o capacitate
crescut de adaptare temporal a plantelor n absena cmpului geomagnetic.
Analiza modificrilor ultrastructurale ale frunzelor a fost realizat pe baza
imaginilor obinute prin microscopie electronic, urmrindu-se n primul rnd ultrastructura
cloroplastului, organitul principal al procesului de fotosintez [Neamu i colab 2009].
Tabloul de ansamblu al acestei analize arat c anularea cmpului geomagnetic a indus
modificri negative semnificative la acest nivel, n primul rnd asupra cloroplastelor i
nucleilor celulelor foliare ale plantelor luate n studiu, concretizate prin diminuarea
activitilor lor metabolice. Cu toate acestea, exist o anumit difereniere a rspunsului
fiecrei plante ca reacie la lipsa cmpului magnetic, rspuns care se datoreaz
particularitilor lor somatice, filogenetice i genetice. Plantele tinere manifest o
sensibilitate mai mare dect cele mature sau pe cale de mbtrnire. De asemenea, plantele
de cultur resimt mai mult lipsa cmpului magnetic dect plantele provenite din flora
spontan (plante slbaice).
Utilizarea unor metode de analiz cantitativ a imaginilor electronomicroscopice,
cum este analiza fractal de imagine pentru determinarea dimensiunii fractale de mas i
analiza proprietilor de corelare pe distan lung (FFT i DFA), aduc informaii
complementare privind modificrile ultrastructurale ale frunzelor la plantele expuse n CMZ
[Morariu i colab 2006, Buimaga-Iarinca i colab 2007, Neamu i colab 2009].
Dimensiunea fractal a unei imagini este perceput ca o proprietate local a imaginii.
Pentru aflarea dimensiunii fractale de mas a nucleelor (incluznd nucleoli, eucromatina si
heterocromatina) si a cloroplastelor, s-au folosit imaginile de microscopie electronica ale
acestora. A fost utiliat programul de calcul ImageJ, cu plugins-ul FracLac. Conturul
-50
-40
-30
-20
-10
0
+ 10
+ 20
+ 30
Lungime frunze tinere
(
L
C
M
Z
-

L
C
G
M
)

/

L
C
G
M

*

1
0
0

[
%
]
Tagetes erecta
Calendula oficinalis
Triticum estivum
Lycopersicum esculentum
Greutate planta
15
nucleilor si al cloroplastelor a fost selectat din cadrul imaginii generale, apoi analizate prin
metoda Box Counting.
Corelarea pe distan lung reprezint o proprietate global a sistemului i poate s
aduc informaii legate de structura eucromatinei n cazul nucleilor i de structura general a
cloroplastelor. Aceast proprietate a fost determinat utiliznd metodele FFT (transformata
Fourier rapid) i DFA (detrended fluctuation analysis) pentru care am folosit un soft
dezvoltat in cadrul grupului nostru de cercetare. Din analiza spectral a rezultat exponentul
spectral de corelare, , care reprezint panta reprezentrii dublu-logaritmice a spectrului..
Exponentul spectral de corelare (coeficient ) s-a dovedit a fi un parametru cantitativ eficient
de caracterizare a modificrilor ultrastructurale ale frunzelor. Modificri ultrastructurale
semnificative au fost puse n eviden att n structura cloroplastelor ct i a nucleilor. La
toate speciile de plante analizate au fost determinate diferene semnificative ale coeficientului
la plantele expuse n CMZ fa de martor n prima lun de incubare. Diferenele devin
nesemnificative n cazul cloroplastelor la plantele de roii i ardei n vrst de 66 zile. La
cri diferenele se menin i la aceast vrst dar devin nesemnificative n etapa
reproductiv a dezvoltrii plantei, dup 180 zile de incubare.
Aceste rezultate arat o sensibilitate mai mare plantelor tinere n absena cmpului
geomagnetic i pe de alt parte sugereaz c n timp are loc un proces de adaptare a plantelor
la modificrile condiiilor de mediu magnetic, cu restabilirea funcionalitii normale a
plantei corespunztoare procesului natural de mbtrnire. Prin analiza proprietilor de
corelare au fost determinate modificri persistente n structura nucleilor la plantele expuse n
cmp magnetic zero. La ardei, cri i glbenele, modificrile structurale ale nucleilor
ilustrate prin diferene semnificative ale exponentului spectral de corelare se menin att la
plantele n vrst de 66 zile ct i dup 180 zile. Aceste observaii sugereaz c procesul de
adaptare a plantelor este doar parial i vizeaz n primul rnd funcionalitatea cloroplastelor.
Rezultatele obinute confirm n cea mai mare parte observaiile ultrastructurale.


IV. INTERACIA CMPURILOR MAGNETICE SLABE CU
BACTERIILE I CIANOBACTERIILE
2. EFECTE ALE CAMPULUI MAGNETIC ZERO ASUPRA DEZVOLTRII BACTERIILOR
Literatura ofer date sporadice n ce privete rspunsul bacteriilor n absena
cmpului geomagnetic. In condiii de ecranare a cmpului geomagnetic cu un factor de 10,
Becker determin o reducere de 15 ori n numrul i dimensiunea coloniilor de
Staphyloccocus aureus fa de culturile martor la o expunere timp de 72 de ore [Becker
1963]. Achkasova constat de asemenea o deprimare a funciilor vitale a bacteriilor n cmp
geomagnetic ecranat [1973]. Studiul descris n continuare a avut ca scop observarea
rspunsului bacterian n procesul de multiplicare celular n cmp magnetic zero realizat prin
compensarea cmpului geomagnetic cu un factor de 100. Au fost testate tulpini de bacterii
gram pozitive (Listeria monocitogenes), gram negative (Salmonella i Escherichia coli) i
microrganisme nespecifice dezvoltate pe substrat nutritiv proteic (albumina) n sisteme de
cultivare nchise (culturi batch) [Neamu i colab. 2003]. Multiplicarea celuar a fost
evaluat prin metode directe de apreciere a numrului de germeni/ml suspensie celular n
paralel cu metode indirecte de monitorizare a rezervei nutritive din mediu. Acelai sistem de
16
cultivare a fost utilizat pentru analiza creterii culturilor de cianobacterii din sp
Synechocystis n mediu nutritiv Zarrouch. Paralel a fost investigat sensibilitatea bacteriilor
n cmp magnetic 3 Gauss (300T).
2.3. Rezultate experimentale
2.3.2. Evaluarea creterii bacteriene n CMZ
Modificarea densitii de germeni/ml suspensie bacterian a fost estimat prin :
- transmisie optic a suspensiei celulare determinat spectrofotometric n
domeniul spectral vizibil (520 nm - 700 nm) Salmonella i Listeria pe baza unei curbe de
etalonare (Fig.4.1.)
- scala de etalonare Mc Farland stabilit prin metoda mprtierii luminii laser
utilizat n scopul extrapolrii densitii de germeni dezvoltai n soluie de albumin 5%
(Fig.4.2.).
0 5 10 15 20 25 30
30
40
50
60
70
80
90
100
30.05.2000
Scala nefelometrica Mc Farland
Transmisie -spectrofotometrul UV-Vis
citire -400 nm
T

(
%
)
numar germeni/ml suspensie (x10
8
)

0.0
1.0x10
-4
2.0x10
-4
3.0x10
-4
4.0x10
-4
5.0x10
-4
6.0x10
-4
7.0x10
-4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
A
m
p
l
i
t
u
d
i
n
e

s
e
m
n
a
l

[
u
.
a
.
]
Concentratie BaSO
4
[g/ml]
0.0
4.0x10
8
8.0x10
8
1.2x10
9
1.6x10
9
2.0x10
9
Nr. de germeni / cm
3

Fig.4.1.
Scala de etalonare transmitan - concentraie
germeni bacterieni /ml suspensie germeni de
Salmonella. = 400nm
Fig.4.2.
Scala de etalonare Mc Farland pentru un
domeniu de concentraii 10
-5
-10
-3
BaSO4
determinat prin detecia mprtierii radiaiei
laser

Activitatea biochimic a fost monitorizat prin degradarea substratului energetic
(glucoz, lactoz) si variaia pH-ului n mediul de suspensie datorit activitii specifice a
unor tulpini bacteriene: Salmonella, E. Coli, Listeria monocitogenes i degradarea
substratului de albumin n prezena unor germeni nespecifici gram (-).
Degradarea substratului de albumin ca urmare a dezvoltrii germenilor microbieni a
fost pus n eviden prin tehnici de electroforez n gel de agaroz i electroforez n gel de
poliacrilamid n prezen de SDS (dodecilsulfat de sodiu) ntr-un interval de 5 zile de
incubare n CMZ i CGM.

2.3.3. Multiplicarea bacterian i activitatea metabolic n culturi de Listeria, E. coli i
Salmonella expuse n CMZ
Pentru toate tulpinile bacteriene testate rezultatele obinute pun n eviden o
rezisten crescut n cmp magnetic 3 Gauss. In cmp magnetic zero rspunsul bacterian
arat o dependen n funcie de specie. Culturile de Salmonella rspund pozitiv n aceste
17
condiii, stimularea dezvoltrii celulare fiind semnificativ n faza de cretere exponenial
(Fig4.3). Rezultatele obinute indic condiii favorabile dezvoltrii enterobacteriilor din sp.
Salmonella n absena cmpului geomagnetic.
4 7 10 26 50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
d
e
n
s
i
t
a
t
e

g
e
r
m
e
n
i
/
m
l

(
x
1
0
8
)
Timp incubare [ore]
camp geomagnetic
camp magnetic compensat
incubare la 37
0
C

Fig.4.3.
Multiplicarea celular n culturi de
Salmonella incubate n CGM, CMZ, CM
3Gauss, la 24
0
C i n CGM la 37
0
C
Rezultate similare au fost obinute n testele de metabolizare a substratului de
glucoz. In primele patru ore coninutul de glucoz a fost semnificativ redus (49,5%), nsoit
de o scdere a pH-ului (6,8%) n mediu de suspensie (Fig 4.4.a, b) ceea ce confirm
sensibilitarea crescut a culturilor de Salmonella n CMZ.
0 4 7 10
0
20
40
60
80
100
G
l
u
c
o
z
a

(
%
)
Timp incubare [ore]
camp geomagnetic
camp magnetic zero
camp magnetic 3 Gauss
37
0
C


0 2 4 6 8 10
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
camp geomagnetic
camp magnetic compensat
incubare la 37
0
C
p
H
Timp incubare [ore]

Fig.4.4.a
Metabolizarea glucozei n prezena de Salmonella n
CGM i CMZ la 24
0
C i n CGM la 37
0
C
Fig. 4.4.b.
Variaia pH-ului n mediul de suspensie a
culturilorde Salmonella n CGM, CMZ la 24
0
C i n
CGM la 37
0
C

Alte dou tulpini au prezentat rezisten (Listeria monocitogenes) sau o diminuarea a
activitii metabolice (E. Coli) n CMZ.

2.3.4. Creterea i activitatea metabolic a unor germeni microbieni pe substrat de
albumin
In soluii apoase, albumina constituie un mediu nutritiv proteic favorabil dezvoltrii
bacteriene. Rezultatele obinute indic o contaminarea bacterian favorizat n absena
cmpului geomagnetic. Dup dou zile de expunere se nregistreaz o dublare a numrului de
18
germeni/ml suspensie (Fig. 4.5.). Diferena de cretere este meninut la 37% n a treia zi de
incubare n favoarea culturilor expuse n CMZ.
0
4
8
12
16
20
3
2
n
u
m
a
r

g
e
r
m
e
n
i
/
m
l

*

1
0 8
Timp incubare [zile]
camp geomagnetic + tiomersal
camp magnetic zero + tiomersal
camp geomagnetic
camp magnetic zero

Fig.4.5.
Multiplicarea microorganismelor n
prezena albuminei ca substrat
nutritiv n cmp geomagnetic i cmp
magnetic compensat cu i fr agent
de inhibare (tiomersal).
Rezultate similare au fost obinute prin analiza degradrii substratului nutritiv (Fig.
4.6.). In electroforeza n gel de poliacrilamida apariia unor noi benzi de migrare pune n
eviden prezena unor fragmente proteice cu greutate molecular mai mic dect a
albuminei (Fig. 4.6.).
Albumin CGM CMZ CGM CMZ CGM CMZ Etalon
Iniial (A) (A) (A) (A)+ T (A) + (A) (A)
Zi 3 Zi 5
Greutate
moleculara
(etalon)



92,5 KDa

67 KDa


45 KDa
Fig. 4.6.
Electroforeza albuminei n gel de poliacrilamid n prezen de SDS n prezen i n absen de
agent bactericid (tiomersal) dup 3 i 5 zile de incubare n CGM i CMZ

Diferene importante a integritii moleculare a albuminei se disting dup trei zile de
expunere. Separarea unei benzi distincte sub spotul iniial al albuminei indic un proces de
degradare mai accentuat in CMZ fa de probele expuse n CGM, efect persistent dup cinci
zile de incubare.
In gel de agaroz modificrile electroforetice devin evidente dup 5 zile de expunere
i constau n lrgirea ariei spotului de migrare, respectiv n scderea vitezei de migrare a unei
fraciuni proteice. Procentul fraciunii electroforetice cu migrare lent crete cu 20-45% n
CMZ raportat la probele expuse n cmp geomagnetic. Aceste modificri reflect un proces de
degradare mai accentuat n CMZ i sunt n acord cu rezultatele obinute prin electroforeza n
gel de poliacrilamid.
19

Investigaiile noastre completeaz studiile de toleran a bacteriilor (Pseudomonas,
Enterobacter, E. coli) fa de antibiotice [Creang i colab 2004, Poiat i colab 2003] i
evideniaz un rspuns bacterian dependent de specie n condiii de compensare avansat a
cmpului geomagnetic. Rezultatele acestor studii arat c dezvoltarea bacterian n culturi de
Salmonella i virulena unor tulpini de Pseudomonas este potenat n cmp magnetic zero,
n timp ce reactivitatea unor tulpini de Enterobacter i E. coli este deprimat sau nu este
influenat. Cu alte cuvinte, prezena unui cmp magnetic de 25-75 T, echivalent valorii
cmpului geomagnetic, reprezint un mediu protector fa de contaminarea cu germeni de
Salmonella i fa de virulena unor tulpini de Pseudomonas. Dezvoltarea microorganismelor
pe substrat de albumin ilustreaz de asemenea un efect protector al cmpului geomagnetic.
Pe de alt parte mediul magnetic natural creeaz condiii favorabile contaminrii cu tulpini
de enterobacterii prin creterea rezistenei acestora la unele antibiotice.
3. DEZVOLTAREA CIANOBACTERIILOR N CMP MAGNETIC ZERO.
INFLUENA ACTIVITII GEOMAGNETICE
Cianobacterile sunt organisme care au capacitatea de cretere att n prezena luminii
(prin fotosintez pe baza de oxigen) ct i la ntuneric pe baza glicolizei i a fosforilrii
oxidative. Caracteristicile structurale i biochimice sunt similare bacteriilor, fiind lipsite de
nucleu i cloroplaste. Cianobacteriile sunt microorganisme model pentru studiul fotosinezei,
asimilare de azot i adaptare la stresul de mediu. Cu excepia unui studiu realizat cu scopul
de a examina posibilitatea de stimulare a biomesei algelor n cmpuri electromagnetice la
frecvene de 50-60Hz [Serafin i colab 1995], nu cunoatem alte referine privind influena
cmpurilor magnetice slabe asupra dezvoltrii cianobacteriilor.
Cianobacteriile aparinnd sp Synechocystis sunt organisme unicelulare care n medii
lichide se disperseaz uniform, oferind un sistem biologic avantajos pentru studiile de
multiplicare celular. Modificarea dezvoltarii cianobacteriilor n condiii de compensare a
componentei statice a cmpului geomagnetic, i n prezena fluctuaiilor naturale a cmpului
magnetic, a fost urmrit pe suspensii de Synechocystis aparinnd liniei celulare AICB 51,
furnizate de Institutul de Cercetri Biologice din Cluj-Napoca din colecia proprie de alge.

3.2. Evaluarea vitezei de cretere a cianobacteriilor n CMZ
Curba de cretere n suspensii de Synechocystis a fost estimat spectrofotometric prin
determinarea zilnic timp de 8-12 zile a absorbanei suspensiei la valoarea de maxim specific
spectrului de absorbie a clorofilei a ( = 670 nm), pigmentul predominant n celula
cianobacteriilor din sp. Synechocystis. Viteza de cretere celular a fost cuantificat prin
parametrul de fit x0 obinut prin fitarea Boltzmann a curbei de cretere celular. Efectul
CMZ a fost estimat prin diferena normalizat a vitezei de crestere x0 n probele expuse n
CMZ i CGM.
3.3. Rezultate experimentale
In perioade cu activitate geomagnetic sczut, viteza de multiplicarea celular n
CMZ variaz fa de probele martor sub pragul de semnificaie statistic (p>0.5). Efecte
semnificative au fost n schimb observate n condiii de perturbare a activitii geomagnetice.
Intr-un set de 9 experimente, viteza de cretere a cianobacteriilor a fost stimulat n condiii
20
de expunere n CMZ n toate perioadele n care a fost nregistrat prezena unei furtuni
magnetice. Rezultatele obinute n aceste cazuri sunt detaliate n Fig. 4.7. prin reprezentarea
curbelor de cretere celular (dreapta i-iii)) n paralel cu variaia zilnic a activitii
geomagnetice (stnga).
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
A
c
t
i
v
i
t
a
t
e

g
e
o
m
a
g
n
e
t
i
c
a

[
i
n
d
i
c
e

A
p
]
Perioada de incubare [zile]
(i)
Furtuna minora
GMA activa

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
1
2
3
4
5
A
b
s

[
u
.
a
.
]
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero
Perioada de incubare [zile]
(b)

0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
A
c
t
i
v
i
t
a
t
e

g
e
o
m
a
g
n
e
t
i
c
a

[
i
n
d
i
c
e

A
p
]
Perioada de incubare [zile]
(ii)
Furtuna minora
GMA activa

0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
1
2
3
4
5
6
Perioada de incubare [zile]
(c)
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero
A
b
s

[
u
.
a
.
]

0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Perioada de incubare [zile]
(iii)
A
c
t
i
v
i
t
a
t
e

g
e
o
m
a
g
n
e
t
i
c
a

[
i
n
d
i
c
e

A
p
]
Furtuna minora
GMA activa

0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
1
2
3
4
5
6
7
8
A
b
s

[
u
.
a
.
]
Perioada de incubare [zile]
(d)
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero

Fig. 4.7. Variaia activitii geomagnetice
n perioade de linite magnetic (v) i
n prezena de furtuni magnetice(i,ii,iii)
Dezvoltarea cianobacterilor n CMZ i n CGM n
perioade de linite magnetic (a) i n prezen de
furtuni magnetice (b,c,d)
21

Relaia GMA - efect CMZ arat urmtoarele asocieri
- Prezena unei furtuni minore (Ap = 35) la nceputul perioadei de incubare este
asociat cu o stimulare semnificativ a vitezei de multiplicare celular n cmp magnetic zero
(15%, p<0.05) (Fig.4.7, caz i).
- Furtuni mgnetice succesive (Ap =35; 30) n prima parte a perioadei de incubare
celular, nsoite de o perioad activ a GMA (Ap =26) sunt asociate cu o stimulare
semnificativ a vitezei de cretere (10%, Fig. 4.7, caz iii).
- Prezena unei furtuni minore (Ap=35) la mijlocul fazei exponeniale de cretere este
corelat cu un rspuns diminuat (Fig. 4.7, caz ii), efectul de stimulare (7%) fiind similar cu cel
nregistrat n perioade cu variaie moderat a GMA.
Datele prezentate n acest capitol indic un rspuns nespecific n ce privete viteza de
multiplicare a cianobacteriilor unicelulare n medii lipsite de componenta static a cmpului
geomagnetic (CGM) i un rspuns biologic sensibil modulat de modificarea componentei
variabile. Rezultatele obinute sugereaz o condiionare a rspunsului biologic de apariia
furtunii magnetice n primele faze ale multiplicrii celulare sau de durata perturbrii
magnetice n timpul fazei exponeniale de cretere.


V. MOTILITATEA LISTERIEI MONOCITOGENES I A
SPERMATOZOIZILOR IN CAMP MAGNETIC ZERO
- date preliminarii -

1. MOTILITATEA CELULAR
Motilitatea este un proces dinamic care joac un rol fundamental n funcionalitatea
celular cum este transportul organitelor celulare, segregarea cromozomial n mitoz,
modificri ale formei celulei sau n locomoia celulelor i a organismelor simple (prokariote,
eukarioate) ca rspuns la stimulii externi. Motilitatea celular se bazeaz pe procese
complexe de autoorganizare mecanochimic susinute de aa numitele motoare moleculare
[Fletcher i Theriot 2004]. Acestea sunt constituite dintr-un ansamblu de proteine i
complexe moleculare care furnizeaz energia necesar micrii prin conversia energiei
chimice eliberat prin hidroliza legturilor macroergice ale moleculei de ATP sau a energiei
stocate n potenialul transmembranar. Motoarele moleculare cunoscute pot fi grupate n 5
categorii dintre care cele mai bine caracterizate sunt motorul rotor specific micrii
bacteriilor i motoarele lineare care reprezint una din cele mai comune forme de micare
ntlnit la nivelul celulei eukariote precum i pentru deplasarea spermatozoizilor i a unor
tipuri de protozoare. O categorie aparte o formeaz motoarele bazate pe asamblarea i
dezasamblarea actinei, pe care se bazez motilitatea unor bacterii patogene: Listeria
monocitogens, Shigella, i Rickettia.
3. REZULTATE EXPERIMENTALE
Studiile prezentate n acest capitol au avut ca obiectiv monitorizarea n cmp
geomagnetic compensat a motilitii unor organisme prokariote (bacterii) i celule eukariote
bazat pe mecanisme moleculare diferite. Au fost testate: (i) tulpini bacteriene aparinnd sp
Listeria monocitogenes a cror deplasare are la baz mecanismul asamblrii i dezasamblrii
22
actinei i (ii) spermatozoizi umani n lichid seminal a cror motilitate este generat de
motoare lineare avnd ca promotor moleculele de dinein. [Boldiszar i colab. 2001, Neamu
i colab. 2005, Tru i colab 2005,]
3.1. Expunerea culturilor de Listeria monocitogenes n CMZ
Culturile de Listeria monocitogenes au fost furnizate de laboratorul de miocrobiologie
a USAMV Cluj-Napoca. Aceast bacterie prezint particularitatea de a sintetiza cili la
temperatura camerei (21-22
0
C) care la 37
0
C sunt imobili.
Motilitatea bacteriei inoculate n tuburi pe medii semisolide de geloz a fost
determinat dup 48 ore de incubare prin deplasarea inelului format de cultura bacterian
dezvoltat n mediu. Paralel au fost expuse tuburi inoculate cu germeni n cmp magnetic de
intensitate 3Gauss fa de un martor corespunztor. Analiza motilitii celulare a fost
repetat dup o sptmn de la scoaterea probelor din mediul magnetic modificat i
pstrate la temperatura camerei.
3.3. Motilitatea Listeriei monocitogenes n CMZ
Diferene de motilitate a bacteriilor au fost detectate dup 24 ore de incubare a
celulelor n CGM i CMZ [Neamtu i colab 2005]. Examenul direct la microscop pe preparate
native a artat o mobilitate redus a bacteriilor incubate n CMZ, observaie confirmat
ulterior prin cultivare n geloz moale dup o inoculare de 48 ore (Fig. 5.1).
.

Fig. 5.1.a
Migrarea Listeriei monocitogens
dup 48 ore incubare la 21
0
C.
Martor CM 3G, prob CM 3G,martor CMZ,
prob CMZ
Fig. 5.1.b.
Migrarea Listeriei monocitogens dup 6 zile de
incubare la temperatura camerei
rob CMZ, martor CMZ, martor CM 3G, prob
CM 3G,

In aceste probe se observ o zon de opalescen discret spre suprafaa mediului n
timp ce la culturile incubate n cmp geomagnetic i n cmp 3Gauss zona de opalescen a
fost mai exprimat ca intensitate i ca grosime (>0.5 cm). Inelul format de cultura bacterian
s-a deplasat n lungul coloanei similar n CGM i cmp magnetic 3G ns a rmas la linia de
start n proba expus n CMZ. Aceste rezultate arat c n absena cmpului geomagnetic
motilitatea Listeriei este inhibat, dar nu este afectat n cmpuri magnetice mai intense
(3Gauss). Prezena cmpului geomagnetic pare s fie o cerin esenial pentru locomoia
acestei bacterii.
Motilitatea celular nu a fost restabilit dup expunerea n CMZ ceea ce sugereaz un
efect de lung durat. Cu excepia probelor incubate n CMZ, n toate tuburile pstrate la
23
temperatura camerei, a mai aprut la interval de o sptamn un disc opalescent n
profunzimea mediului, cu o lime apropiat de primul inel, ca o consecin a continurii
procesului de migrare i multiplicare bacterian (Fig. 5.1.b).
Sandodze i colab [1995] semnaleaz un efect similar n cazul celulelor ependimale.
Motilitatea aparatului ciliar al acestor celule a fost practic stopat n cmp magnetic
compensat (x100). Aceste date arat c producerea micrii cililor i flagelilor generat de
mecanisme moleculare diferite (asamblarea i dezasamblarea actinei n cazul bacteriei i
motor linear n cazul celulelor ependimale) este afectat n acelai sens n CMZ. Punctul
comun n cele dou tipuri de mecanisme const n sursa energetic necesar motilitii,
bazat pe hidroliza ATP. Efecte de inhibare a unor procese celulare bazate pe procese
energetice n care este implicat hidroliza ATP (ex. transportul ionic transmembranar) au
fost puse n eviden n studii anterioare privind procesul de mbtrnire a eritrocitelor
umane n CMZ [Morariu i colab 1999].
3.2. Analiza motilitii spermatozoizilor umani n lichid seminal
Viteza de deplasare a spermatozoizilor reprezint o modalitate de apreciere a
capacitii de fertilizare a celulelor. Capacitatea de fertilizare este atribuit grupului de celule
rapide care se mic cu o vitez > 16 um/s. Sub aceast valoare se ncadreaz celulele lente i
celulele imobile considerate celule moarte.
Viteza de deplasare a celulelor a fost urmrit pe o perioad de 30 ore la diferite
temperaturi de incubare (17 -22
0
C) i a fost determinat printr-o metod de analiz de
imagine [Neamtu i colab 2005] prin intermediul unei camere CCD cuplat la microscop. Au
fost analizate statistic 15-30 traiectorii ale celulelor/2 probe la interval de 3 ore, fiecare
traiectorie fiind compus din 6-10 lungimi/sec. Motilitatea celular n CGM i CMZ a fost
caracterizat prin raportul procentual al vitezei de deplasare a spermatozoizilor rapizi fa de
numrul total de celule. Efectul CMZ a fost determinat prin diferena normalizat a
procentului de celule rapide n CMZ i CGM luat ca martor.
3.4. Motilitatea spermatozoizilor umani n cmp magnetic zero
In CMZ remarcm o cretere semnificativ a vitezei de deplasare a spermatozoizilor n
primele ore de incubare (Fig.2.).
Stimularea motilitii spermatozoizilor rapizi atinge un maxim care fluctueaz ntre
17-20% la temperaturi cuprinse n intervalul 17
0
C -20
0
C. Viteza celulelor revine la valoarea
iniial, n timp ce motilitatea celulelor n CGM scade sub aceast valoare. Diferena de
motilitate se menine ntre 5-10% pentru toat perioada n care categoria spermatozoizilor
rapizi este viabil.
La 22
0
C viteza celulelor nu este influenat de modificarea mediului magnetic.
Spermatozoizii rapizi viabili se deplaseaz cu viteze similare att n CGM ct i n CMZ.
Putem considera aceste condiii de temperatur ca fiind un prag al sensibilitii celulelor la
modificri ale cmpului magnetic. Curba de viabilitate a spermatozoizilor rapizi este
deplasat spre valori semnificativ mai mari n CMZ, ns viteza acestora nu este stimulat.
Stimularea vitezei de deplasare a celulelor n primele ore de incubare in CMZ la
temperaturi mai sczute de 22
0
C (17-20
0
C) pare s fie o reacie de adaptare la condiiile
nefiziologice din mediu prin activarea motilitii spermatozoizilor leni care trec astfel n
categoria celor rapizi. Mrimea efectului nu depinde de temperatur i este reversibil,
24
revenind la valoarea iniial, dup care viteza medie de deplasare a celulelor fluctueaz n
jurul acestei valori.
0 2 4 6 8 10 12 14
12
14
16
18
20
22
24
26
28
V
i
t
e
z
a

[
u
m
/
s
]
Timp de expunere [ore]
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero
17
0
C
a)

0 5 10 15 20 25 30
10
15
20
25
30
35
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero
V
i
t
e
z
a

[
u
m
/
s
]
Timp expunere [ore]
b)
19
0
C

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
10
15
20
25
30
35
20
0
C
c)
V
i
t
e
z
a

[
u
m
/
s
]
Timp expunere [ore]
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0
5
10
15
20
25
30
35
22
0
C
V
i
t
e
z
a

[
u
m
/
s
]
Timp expunere[ore]
Camp geomagnetic
Camp magnetic zero
d)

Fig.2.
Viteza de deplasare a spermatozoizilor rapizi la diferite temperaturi de incubare

In CGM, viteza de deplasare celular variaz n jurul valorii iniiale n primele ore de
incubare fr a fi stimulat, dup care scade pn la valoarea minim care delimiteaz
categoria spermatozoizilor rapizi de cei leni.


VI. CONCLUZII GENERALE
Prima parte a tezei cuprinde o analiz a influenei mediului lipsit de componenta
static a cmpului geomagnetic (cmp magnetic zero) (I) n etapa vegetative de cretere a
unor specii de plante i (II) n procesul de multiplicare bacterian. In capitolul final sunt
prezentate rezultate preliminarii privind motilitatea unor organisme unicelulare (bacterii,
spermatozoizi) n cmp magnetic zero.
Rezultatele originale cuprind urmtoarele aspecte:
25
I. DEZVOLTAREA PLANTELOR N ETAPA VEGETATIV DE CRETERE
A fost realizat un studiu sistematic a dezvoltrii plantelor n absena cmpului
geomagnetic pe ntregul interval de cretere vegetativ. Au fost investigate opt specii de
plante: Medicago sativum, Tagetes patula L., Tagetes erecta L Calendula oficinalis L.,
Triticum aestivum, Secale cereale L., Lycopersicum esculentum L. i Capsicum annuum L.
n urmtoarele stadii de dezvoltare: i) germinarea seminelor, ii) faza post embrional de
cretere definit prin apariia i dezvoltarea radiculei embrionale pe o perioad de 4-5 zile,
iii) dezvoltarea plantulelor tinere n interval de o lun, iv) stadiul de plant matur pn n
faza de nflorire i apariie a rodului.
Aspectele originale constau n: 1) extinderea studiului de la aspectele pariale ale
evoluiei plantelor n cmp magnetic zero la analiza ntregului interval de cretere vegetativ;
2) monitorizarea procesului de cretere n diferite perioade ale anului pe aceeai specie i n
aceleai condiii experimentale 3) testarea comparativ a unor specii de plante care nu au mai
fost analizate 4) decelarea influenei fluctuaiilor magnetice naturale n condiii de cmp
magnetic zero n diferite stadii de dezvoltare ale plantelor.
1. Germinarea seminelor
Absena componentei statice a cmpului geomagnetic nu reprezint un factor de stres
n faza de germinare a seminelor. Procesul este favorabil influenat n prezena furtunilor
magnetice majore, n cazul n care perturbarea magnetic este prezent n faza iniial a
procesului de germinare (faza de mbibare). In acest sens au fost obinute rezultate n
germinarea seminelor de Medicago sativa L i Secale cereale L.
2. Faza post embrional de cretere
In aceast faz de cretere, rezultatele obinute indic o specificitate de rspuns a
plantelor n funcie de specie. In perioade cu activitate geomagnetic sczut creterea plantei
este cu preponderen i) stimulat pentru sp. Medicago sativa L. i Tagetes erecta L., ii)
inhibat n cazul Triticum aestivum L. i Secale cereale L. iii) Calendula oficinalis L. prezint
o senzitivitate sczut.
Rspunsul semnificativ nregistrat poate fi privit ca o potenare a sensibilitii
plantelor n cursul unor faze n care procesul de cretere este intens, cum este stadiul
postembrional de cretere.
Variaii crescute ale activitii geomagnetice echivalente apariiei furtunilor magnetice
nu influeneaz faza de cretere postembrional. O sensibilitate mrit este sugerat de
rspunsul sp. Tagetes erecta n prezena unei furtuni minore n faza de mbibare a
seminelor.
3. Dezvoltarea plantulelor tinere n interval de o lun
valuarea statistic a parametrilor de cretere arat pentru aceeai specie, n diferite
perioade ale anului, att efecte semnificative n CMZ ct i efecte la limita pragului de
semnificaie statistic. In absena cmpului geomagnetic, dezvoltarea T. erecta L., Calendula
oficinalis L., Triticum aestivum L. i Capsicum anuum L. a fost cu preponderen ncetinit,
evoluie ilustrat prin apariia ntrziat i dimensiunea redus a frunzelor tinere n curs de
cretere. Dup o lun de expunere n CMZ aspectul plantelor este mai puin viguros iar
greutatea medie a masei verzi mai mic fa de plantele din lotul martor.
26
4. Plante mature expunere cinci - apte luni n CMZ
Etapa reproductiv de cretere nu este semnificativ influenat n CMZ. Se poate vorbi
ns de o potenare a creterii n nlime a plantelor tinere (Tagetes erecta, Tagetes patula,
Capsicum anuum) i de un proces mai rapid (Lycopersicum aesculentum) sau mai lent
(Tagetes patula) n faza de apariie a bobocilor i a florilor.
5. Analiza ultrastructural a frunzelor
Analiza ultrastructural a frunzelor prin pune n eviden modificri negative n
structura cloroplastelor i nucleilor celulelor foliare ale plantelor luate n studiu, concretizate
prin diminuarea activitilor lor metabolice. Exist o anumit difereniere a rspunsului
fiecarei plante: plantele tinere manifest o sensibilitate mai mare dect cele mature sau pe
cale de mbtrnire. De asemenea, plantele de cultur (Lycopersicum aesculentum,
Capsicum anuum L) resimt mai mult lipsa cmpului magnetic dect plantele provenite din
flora spontan (Tagetes patula L.).
In concluzie, efectul CMZ bine conturat la unele specii n primele stadii de cretere
este semnificativ diminuat prin expunerea plantelor pe termen lung, sugernd o capacitate
crescut de adaptare temporal a plantelor n absena cmpului geomagnetic.
II. MULTIPLICAREA BACTERIILOR
Rezultatele noastre completeaz studiile de toleran fa de antibiotice [Creang i
colab 2004, Poiat i colab. 2003] i evideniaz un rspuns bacterian dependent de specie n
condiii de compensare x100 a cmpului geomagnetic. Culturile de Salmonella rspund
pozitiv n aceste condiii, dezvoltarea celular fiind semnificativ stimulat. Reactivitatea
culturilor de Listeria monocitogenes indic o bun adaptare a acestei specii n timp ce
multiplicarea celular n culturi de E. coli nu este afectat sau este nesemnificatv deprimat.
Dezvoltarea microorganismelor pe substrat de albumin este semnificativ stimulat n CMZ.
Aceste rezultate arat c prezena cmpului geomagnetic reprezint un mediu protector fa
de contaminarea unor microorganisme i a unor germeni bacterieni patogeni cum este
Salmonella, fr a influena semnificativ dezvoltarea altor germeni (Listeria monocitogenes,
E. coli).
La valori relativ crescute ale cmpului magnetic (300T) dezvoltarea bacterian nu
este afectat.
Multiplicarea cianobacteriilor
Viteza de multiplicare a cianobacteriilor nu este influenat n cmp magnetic zero n
perioade cu activitate geomagnetic redus. Corelarea semnificativ (p<0.05) ntre viteza de
cretere a populaiei celulare i variaia activitii geomagnetice sugereaz o sensibilitate
crescut a multiplicrii cianobacteriilor n prezena furtunilor magnetice minore. Rspunsul
biologic este condiionat de apariia furtunii magnetice n primele faze ale multiplicrii
celulare sau de durata perturbrii n timpul fazei exponeniale de cretere.

III. MOTILITATE CELULAR date preliminarii
Influena mediului magnetic lipsit de componenta static asupra motilitii celulare a
fost urmrit n cazul unor organisme unicelulare procariote (tulpini bacteriene din sp.
27
Listeria monocitogenes) i celule eukariote (spermatozoizi umani) lipsite de proprieti
magnetotactice, a cror deplasare este generat de motoare moleculare diferite.
Rezultatele obinute au evideniat o dependen a motilitii Listeriei monocitogenes
de prezena cmpului geomagnetic. In cmp magnetic zero migrarea bacterian este inhibat,
efect persistent la expunerea ulterioar n cmp geomagnetic, sugernd un efect de lung
durat. Motilitatea bacterian nu este afectat n cmpuri magnetice crescute (300 T).
Un rspuns diferit este dat de motilitatea spermatozoizilor umani. Studiul vitezei de
deplasare celular n intervalul de temperatur 17-22
0
C indic un efect de stimulare a
motilitii n primele ore de expunere n CMZ la temperaturi mai sczute de 22
0
C. Acest
rspuns pare s fie o reacie de adaptare la condiiile nefiziologice din mediu prin activarea
motilitii spermatozoizilor leni care trec n categoria celor rapizi.

BIBLIOGRAFIE
1. Aksyonov S.I., Bulychev A.A., Grunina T.Yu., Goryachev S.N., Turovetsky V.B., 2001,
Effects of ELF-EMF treatment on wheat seeds at different stages of germination anf
possible mechanisms of their origin, Electro and Magnetobiol. 20 (2) 231-253,
2. Alexander M.P, Doijde SD, 1995, Electromagnetic field, a novel tool to increase
germination and seedling.vigour of conserved onion (Allium cepa L) and rice (Oryza
sativa L) seeds with low viability, Plant Genet Resources Newslett, 104, 1-5
3. Belyaev I.Ya., Alipov Y. D., Ringdahl. M.H., 1997, Effects of zero magnetic field on the
conformation of chromatin in human cells. Biochem. Biophys. Acta 1336, 465-473.
4. Belyaev I.Y., Alipov D.Ye., 2001, Frequency-dependent effects of ELF magnetic field on
chromatin conformation in Escherichia coli cells and human lymphocytes, Biochim.
Biophys. Acta, 1526, 269276.
5. Belyavskaya NA. 2004. Biological effects due to a weak magnetic field on plants. Adv.
Space Res. 34: 1566-1574
6. Blank M., Goodman R., 1999, Electromagnetic field may act directly on DNA, Cell
Biochem., 75, 369-374.
7. Blank M. and Goodman R., 2000, Stimulation of the Cellular Stress Response by Low
Frequency Electromagnetic Fields: Possibility of Direct Interaction with DNA. IEEE
Trans Plasma Sci 28:168-172.
8. Binhi V.N., 1997a, Interference of ion quantum states within a protein explains weak
magnetic fields effect on biosystems. Electro-and Magnetobiology 16:203-214
9. Binhi V.N., 1998, Interference mechanism for some biological effects of pulsed magnetic
fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 45, 7381
10. Binhi V.N., Alipov Ye.D. and Belyaev I.Ya., 2001, Effect of static magnetic field on E. coli
cells and individual rotations of ion-protein complexes." Bioelectromagnetics, 22(2):79-
86
11. Boldiszar E., Rapuntean Gh., Neamtu S., Near-null magnetic field effects upon mobility of
some Listeria monocytogenes strains, International Symposium: Prospects for the
Agriculture of the 3
rd
Millenium, 25-27 october, 2001, Cluj-Napoca.
12. Buimaga-Iarinca L., Morariu V.V., Neamu S., Craciun C., Ultrastructural changes of
leaves in zero magnetic field. A quantitative images analysis, 5
th
Conference on Isotopic
and Molecular Processes, Cluj-Napoca, September 20-22, 2007
13. Ciorba D. and Morariu V.V., 2001, Life in zero magnetic field. III. Activity of aspartate
aminotransferase and alanine aminotransferase during in vitro aging of human blood,
Electro and Magnetobiology, 20 (3), 313-321
28
14. Ciortea L.I., Morariu V.V., Todoran A., Popescu S., 2001, Life in zero magnetic field. II,
The effect on Zinc and cooper in the human blood serum during in vitro aging. Electro
and Magnetobiology, 20(2), 151-163.
15. Conley C.C., Effects of near-zero magnetic fields upon biological systems, in Biological
effecs of magnetic fieldz, Vol 2, ed. Barnothy M.F., Plenum Press, New York , 29-52, 1969
16. Corneanu G.C., Crciun C., Corneanu M., Morariu V.V., Nuti M.P., Crciun V., Bica D.,
2000, The reaction of two Escherichia coli strains at different values of the geomagnetic
and geoelectric field. Evolution and adaptation, 177-191.
17. Creang D.E., Poiat A., Morariu V.V. and Tupu P.: 2004, Zero-magnetic field effect in
pathogen bacteria, J. Magnet. Magnetic Mat., 272276, 24422444.
18. Fletcher D.A., Theriot J.A., 2004, An introduction to cell motility for the physical
scientist, Phys. Biol. 1, T1-T10.
19. Lebedev S.I., Baranskiy P.I, Litvinenko L.G, Shiyan L.T., 1977, Barley growth in
superweak magnetic field. Electronic Treatment of Materials 3: 71-73.
20. Liboff A.R., 2005. The charge-to-mass ICR signature in weak ELF bioelectromagnetic
effects. In Lin C (ed). Advances in electromagnetic fields in living systems Vol.4, Springer
Verlag, 189218.
21. Liboff A.R., 1985. Geomagnetic cyclotron resonance in living cells. Biol Phys 9:99102.
22. Maeda K, Henbest K.B., Cintolesi F., Kuprov I., Rodgers C.T., Liddell P.A., Gust D.,
Timmel C.R., Hore P.J., 2008, Chemical compass model of avian magnetoreception.
Nature 453:387390
23. Morariu V.V., Ciorba D, Neamtu S., Life In Zero Magnetic Field Part II. In Vitro Human
Blood Aging. Electro and Magnetobiology, 19 (3) (1999) 271-278
24. Morariu V.V., Craciun C., Neamtu S., Iarinca L., 2006, A fractal long-range correlation
analysis of vegetal nucleus ultrastructure, Romanian Journal of Biophysics, 16(4);243-
252
25. Neamu Silvia, Craciun C., Morariu V.V., 2009, Zero magnetic field influence on Tagetes
sp. and Calendula L growth. Morfological and ultrasctructural analysis, Processes in
Isotopes and Molecules, September 24-26, Cluj-Napoca, Romania
26. Neamu S., Boldiszar E., Morariu V.V., 2003, Metabolic activity of bacteria in zero
magnetic field, Studia Universitatis Babe-Bolyai, Physica, Special Issue 2, XLVIII, 544-
547
27. Neamtu S. and Morariu V.V., 2005, Plant growth in experimental space flight field
conditions, Romanian Journal of Biophysics, 15 (14): 4146
28. Neamtu S., Truta Z., Boldizsar E., Pop C.V.L., Morariu V.V., 2005, Cell motility in zero
magnetic field, Studia Universitatis Babe-Bolyai, Physica, L(4b): 697-700
29. Neamu S. and Morariu V.V., 2010, Zero magnetic field effect on the vegetative growth of
wheat, rye and decorative plant species, Bioelectromagnetics, trimis spre publicare
30. Pazur A, Scheer H., 1992, The growth of freshwater green algae in weak alternating
magnetic fields of 7.8 hz frequency. Z Naturforsch. 47:690694.
31. Pilla A.A. 2003, Weak time-varying and static magnetic fields: from mechanisms to
therapeutic applications. In: Stavroulakis P, editor. Biological effects of electromagnetic
fields: mechanisms, modeling, biological effects, therapeutic effects, international
standards, exposure criteria. Berlin: Springer;
32. Pokhodzey L.V., 1998, Electromagnetic fields: Biological effects and hygienic
standardization, Proceedings of the International Meetings 18-22 May, M.H.Repacholi,
M.B. Rubtsova, A.M. Muc, World Health Organisation, Geneva, Switzerland.
33. Poiata A., Creanga D.E. and Morariu V.V. 2003, Life in zero magnetic field. V. E. coli
resistance to antibiotics, Electromagnet. Biol. Med., 22, 171182.
29
34. Rui R.; Jerman, I.; Gogala, N., 1998b, Effects of weak low-frequency magnetic fields on
spruce seed germination under acid conditions. Can.J.For, Res. 28, 609 616.
35. Rui R.; Jerman, I.; Gogala, N., 1998a, Water stress reveals effects of ELF magnetic
fields on the growth of seeldings. Electro-Magnetobiol., 17(1), 17- 30.
36. Rui R.; Vodnik, D.; Jerman, I., 2000, Influence of aluminium in biological effects of
ELF magnetic field stimulation. . Electro-Magnetobiol. 19 (1), 57 68.
37. Serafin D.J., Dupouy D.P., Bolomey J.C., 1995, Electromagnetic Environment and
Consequences, International Symposium on Electromagnetic Environment and
Consequences, EUROEM Gramat France, (2), 1914.
38. Truta Z., Neamtu S., Morariu V.V., 2005, Zero magnetic field influence on in vitro human
spermatozoa cells behavior, Romanian Journal of Biophysics, 15, (1-4), 73-79


PARTEA II
EFECTE ALE CMPURILOR ELECTRICE INTENSE, DE SCURT DURAT
ASUPRA CELULELOR VII:
ELECTROPERMEABILIZAREA BIOMEMBRANELOR
1. INTRODUCERE
Procesul de electropermeabilizare, cunoscut i sub denumirea de electroporare, este
un fenomen de membran iniiat prin aplicarea unor pulsuri de cmp electric de form
exponenial sau dreptunghiular, intense (kV/cm) i de scurt durat (s-ms) unor
suspensii, culturi celulare sau esuturi vii i const n ndeprtarea temporar a barierei
membranare pentru moleculele din mediul intra i extracelular, la atingerea unui potenial
transmembranar critic. Peste aceast valoare are loc strpungerea dielectric a membranei i
transportul transmembanar consecutiv de ioni i molecule [Neumann and Rosenheck, 1972;
Zimmermann i colab. 1974; Kinosita i Tsong, 1977] prin aa numiii pori apoi.. Ca proces
molecular, este acceptat ideea electropermeabilizrii ca proces reversibil de restructurare a
bistratului lipidic.
Electropermeabilizarea membranar este un proces controlat i modulat de
parametrii electrici ai cmpului aplicat i este influenat de o serie de factori chimici, fizici i
biologici. Ca biotehnologie, electroporarea membranelor ofer soluii optime pentru
rezolvarea unor scopuri aplicative, fiind utilizat cu success n toate domeniile care presupun
manipularea celulelor vii. Dei nelegerea mecanismelor moleculare ale procesului de
permeabilizare membranare continu sa rmn un subiect de studiu deschis, motivat de
nelegerea limitat a bazelor teoretice a fenomenului [Teissie si colab. 2005, Weaver 2003,
Weaver si Chizmadzev 1996] metoda electroporrii este astzi larg utilizat pentru
incorporarea celular a unei mari diversiti de molecule, cum sunt substanele farmacologic
active, antibiotice, oligonucleotide, ARN, ADN [Favard 2007, Gehl, 2003, Rolls 2006, Golzio
i colab. 2002], eliberarea transdermic a substanelor active [Prausnitz 1996, Denet i colab.
2004, Pavselj i colab 2005b], fuziunea celular [Zimmermann 1982], electroinsertia
membranar a proteinelor [Teissie i Ramon 1998], sterilizare [Rowan i colab. 2000, Teissie
i colab. 2002], ablaia esuturilor [Davalos i colab. 2005, Lavee i colab. 2007].
Importana practic a procesului de electropermeabilizare membranar cuprinde
urmtoarele aspecte:
30
este un proces fizic, neinvaziv si reversibil n intervale cunoscute a
parametrilor electrici
este influenat de factori care pot fi controlai i utilizai n scopul modulrii
procesului n sensul dorit
sistemele celulare obinute sunt compatibile cu organismul
este creat o cale de acces direct la locul de aciune a substanei active i este
evitat astfel biodegradarea acesteia
Manipularea celular prin tehnica electroporrii a facilitat dezvoltarea unor noi ci de
terapie medical.

II REZULTATE EXPERIMENTALE
1. TEHNICA ELECTROPERMEABILIZRII BIOMEMBRANELOR - INSTALAIA
EXPERIMENTAL
In scopul abordarii tematicii de cercetare privind electropermeabilizarea
biomembranelor a fost proiectat i construit un aparat complex avnd n component un
generator de pulsuri electrice dreptunghiulare i cu descrcare exponenial [Fig.2.1]
proiectat pentru generarea unor pulsuri de tensiune de form dreptunghiular sau
exponenial avnd durata i amplitudinea programabile n intervale definite n Tab 2.1.
Tabel 1.1 Intervale de valori a parametrilor de
puls amplitudine i durat, pentru pulsuri
dreptughiulare i pulsuri exponeniale

Instalaia este prevzut cu o celul de electroporare funcionnd n flux cu o
capacitate de procesare de 2 ml prob biologic. Cuva de lucru este plasat ntr-un bloc
termostatat cu precizie de 0,5C n domeniul 2-40
0
C.

2. CONTRIBUIA PARAMETRILOR DE PULS ELECTRIC IN PROCESUL DE
ELECTROPERMEABLIZARE A MEMBRANEI ERITROCITARE
Intervalul de valori ai parametrilor de puls electric utilizat pentru permeabilizarea
reversibil a membranei celulare este cuprins ntre 1-20 kV/cm pentru amplitudine i 10s
10 ms pentru durata pulsului. Valori sczute ale amplitudinii pulsului pot genera cmpuri
sub valoarea critic necesar permeabilizrii membranare. In schimb intensiti de cmp
Puls dreptunghiular Puls exponenial
Durata
s-ms
Intensitat
e
KV/cm
Durata
s-ms
Intensitat
e
KV/cm
20s -50s 0-12 10-800s 0-12
50s -100s 0-8 0,8-8ms 0-4
100s -
400s
0-4 8-20ms 0-2
0.4s -
1.5ms
0-2 20-50ms 0-1
1.5s -5ms 0-1
31
prea mari determin strpungerea dielectric ireversibil a membranei, urmat de un eflux
masiv a componenilor intracelulari.
Investigaiile noastre au avut ca scop determinarea ponderii parametrilor de puls
electric - amplitudinea i durata - n electropermebilizarea reversibil a eritrocitelor umane
[Neamu i colab 2000]. Au fost urmrite dou procese diferite: cinetica de eflux a
macromoleculelor de hemoglobin (65 000 Da) (Fig 2.1.) i influxul unor particule de
dimensiune mic cum sunt ioni de mangan (55 Da) normal impermeabili prin membrana
eritrocitar, pentru patru combinaii a parametrilor de puls electric:
a) E = 4kV/cm, t = 40 s; c) E = 4kV/cm, t = 100 s;
b) E = 5 kV/cm, t = 40 s; d) E = 5 kV/cm, t = 100 s
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
E=5kV/cm-t=40s
E=4kV/cm-t=100s
E=5kV/cm-t=100s
E=4kV/cm-t=40s
H
e
m
o
l
i
z
a

[
%
]
Timp incubare [min]

Fig.2.1
Cinetica de eflux a hemoglobinei prin membrana
eritrocitar electroporat, pentru diferite
combinaii ale parametrilor de puls electric.
Temperatura de incubare - 4
0
C
Efluxul moleculelor de hemoglobin urmrete o curb ascendent care atinge o
valoare de platou dup 30 min corespunztoare echilibrrii concentraiei moleculelor de
hemoglobin n compartimentele intra i extracelulare.
Prin expunerea suspensiilor celulare la oricare din combinaiile de parametrii de
cmp electric se obin n proporii diferite dou populaii celulare distincte
a) fantome eritrocitare cu coninut redus de hemoglobin
b) eritrocite cu coninut integral de hemoglobin i membrana parial
permeabil la ionii de mangan.
Permeabilitatea la ionii de mangan a membranelor celor dou populaii de celule
difer foarte mult. Distribuia ionilor de mangan n compartimentele intracelulare este
puternic asimetric fiind incorporat aproape exclusiv n fantomele eritrocitare.
Rezultatele pun n eviden complexitatea fenomenului de electropermeabilizare. Diferite
domenii de valori ai parametrilor pulsurilor de cmp electric induc o permeabilizare selectiv
pentru diverse specii moleculare. Cele dou specii testate: hemoglobina i ionii Mn
2+
sunt
considerai reprezentativi pentru capetele unui spectru larg de specii moleculare discriminate
prin mas molar i implicit dimensiune.
Refacerea integritii i a impermeabilitii membranare a celulelor fantom obinute a
fost testat prin determninarea permeabilitii la mangan a celulelor electroporate i incubate
la 37
0
C (Fig. 2.2).
32
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
M
n
2
+
[

g
/
m
l

m
e
d
i
u

i
n
t
r
a
c
e
l
u
l
a
r

]
Fantome incubate 30 min la 0
0
C
Fantome incubate 30 min la 37
0
C
Fantome incubate 60 min la 37
0
C
E=4kV/cm E=5kV/cm E=4kV/cm E=5kV/cm
t =40s t = 40s t = 100s t = 100s

Fig.2.2
Concentraia intracelular a ionilor de
mangan n fantome celulare obinute
prin expunerea eritrocitelor la diferii
parametrii ai pulsurilor de cmp
electric
Dei permeabilizarea membranar indus de pusuri la E = 4kV/cm, t = 100 s pus n
eviden att prin efluxul molecular de hemoglobin ct i prin influxul ionilor de mangan
este similar cu permeabilizarea nregistrat prin electroporarea cu pulsuri la E = 5 kV/cm, t
= 40 s, refacerea integritii membranare este diferit i este dependent de durata pulsului
aplicat. Aceste date confirm faptul c parametrul durat de puls este factorul care
controleaz procesul de renchidere a porilor apoi indui n membranele electroporate.


3. INACTIVAREA PROCESULUI DE REINCHIDERE A ELECTROPORILOR IN
MEMBRANE ERITROCITARE IRADIATE CU ELECTRONI
Mecanismele moleculare ale fenomenului de permeabilizare membranar continu s
rmn unul din aspectele mult dezbtute n literatura de specialitate. Este acceptat faptul c
inducerea permeabilizarii membranare este un proces atribuit domeniului lipidic, ns
stabilitatea strii permeabile dup electroporare sugereaz c alte structuri moleculare, cum
sunt proteinele membranare i citoscheletul ar putea fi implicate n procesul de renchidere a
porilor [Teissie i Rols 1994, Rols i Teissie 1992, Chang i Reese 1990]. Membrana i reeaua
proteic citoscheletal sunt privite ca un sistem complex, asocierea lor fiind localizat la
nivelul proteinelor integrale a bistratului lipidic printr-o protein de legtura, ankirina.
Ipoteza implicrii citoscheletului n procesul de electropermeabilizare este susinut de mai
multe grupuri de cercetare [Rols i Teissie 1992, Chang i Reese 1990].
Cercetrile noastre au avut ca scop identificarea componentei proteice cu contribuia
dominant ntre diferiii componeni care ar putea fi implicai n etapa de refacere a
membranei eritrocitare electroporate [Neamu i colab. 1999]. In acest sens a fost exploatat
avantajul oferit de metoda analizei int aplicat n urma inactivrii funciei unei proteine
cauzat prin iradierea cu un fascicul de electroni de energie nalt. S-a artat c metoda ofer
posibilitatea de a evalua greutatea molecular a unei proteine. [Kempner i Macey 1989].
3.1. Analiza int
Ipoteza de baz a metodei se refer la faptul c fiecare ciocnire ntre electronii cu
energie nalt i molecula int afecteaz puternic complexul molecular, care i pierde astfel
funcia biologic. Fraciunea rmas nealterat descrete exponenial cu media ciocnirilor:
N/N0 = e
-KD
(3.1)
33
Media intelor este proporional cu doza D, iar constanta K conine informaii
directe legate de masa sistemului molecular int.
Parametrul accesibil experimental este panta curbei numite curb de inactivare
obinut prin reprezentarea logaritmic a dependenei fraciunii proteice active de doza
radiaiei. Greutatea molecular a sistemului este calculat prin relaia:
9
10 4 , 6 = K M
m
(3.2)
determinat empiric de Kepner i Marcey [1968] i teoretic de Kepner i Haigler [1985].
3.2. Iradiere cu electroni i electroporare
Suspensii eritrocitare au fost iradiate la temperatura azotului lichid (270
0
K) cu
fascicul de electroni cu energie 5 MeV, generat de un accelerator linear. La aceast
temperatur este exclus formarea radicalilor liberi ai apei (efect secundar dominant care
ecraneaz efectul primar al radiaiilor).
Procesul de electropermeabilizare a fost cuantificat prin gradul de hemoliz a
eritrocitelor electroporate cu pulsuri electrice rectangulare 40s i amplitudine variabil n
intervalul 2-6 kV cm
-1
, sau la o valoare fix de 4 kV cm
-1
la temperatur joas (0-4
0
C.)
Concentraia de hemoglobin extracelular a fost determinat spectrofotometric la = 410
nm iar gradul de hemoliz a fost stabilit prin raportul normalizat a absorbanei n probele
electroporate i n hemolizatul suspensiei iniiale
3.2. Rezultate experimentale
Efectul direct al radiaiilor cu electroni asupra membranei eritrocitare, a fost urmrit
pentru doze de iradiere cuprinse ntre 1-6 kGy, n ambele faze ale procesului de
electropermeabilizare membranar:
1) inducerea permeabilizrii monitorizat prin efluxul moleculelor de
hemoglobin la temperatur sczut (4
0
C).
2) refacerea impermeabilitii membranei pentru aceste molecule prin
incubarea suspensiei electroporate la temperaturi cuprinse ntre 0-37
0
C .
In timp ce pentru prima faz a procesului de electropermeabilizare aciunea direct a
radiaiilor ionizante pare s fie irelevant, procesul de refacere termic a impermeabilitii
membranare este puternic afectat. Timpul de via a strii permeabile a membranei
eritrocitare este redus la creterea temperaturii, cu descreterea simultan a permeabilitii
membranei pentru hemoglobin. Acest proces a fost investigat pentru eritrocite iradiate la
patru doze de iradiere: 1, 2, 4 i 6 kGy, electroporate la E=4kV cm
-1
i incubate 1h la
temperaturi crescnde (Fig 3.3.).
Prezena moleculelor de hemoglobin n mediul extracelular a fost folosit pentru
cuantificarea strii de permeabilizare a membranei celulare. In acelai mod a fost testat o
prob neiradiat (martor).
Pentru a estima prin metoda analizei target greutatea molecular a structurilor
afectate prin iradiere au fost luate n calcul rezultatele obinute la 37
0
C. In cazul de fa,
curba de inactivare este dat de logaritmul variaiei hemoglobinei intracelulare ln(1-H/H0)
fa de doza de iradiere (Fig 3.4). Prin creterea dozei de iradiere, capacitatea de a refacere a
funciei membranare de barier pentru moleculele de hemoglobin este progresiv alterat.

34
0 10 20 30 40
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 kGy
1kGy
2kGy
4kGy
6kGy
H
e
m
o
l
z
a

[
%
]
Temperatura de incubare [
0
C]

Fig 3.3.
Dependena electrohemolizei eritrocitelor
iradiate de temperatura de incubare.
Iradiere cu fascicul de electroni 5 MeV, la
doze de 0-6 Gy. E=4kV/cm, =40 s,
temperatura 4
0
C
0 1 2 3 4 5 6 7
-1.0
-0.9
-0.8
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
l
n

(
1
-
H
/
H
0
)
doza de iradiere [kGy]

Fig 3.4
Curba de inactivare a refacerii
membranare (T=37
0
C) pentru diferite doze
de iradiere.
Graficul prezint o pant K=0,145 (kGy)
-1
. Aplicnd aceast valoare n relaia (3.2)
obinem o mas molecular M~ 930kDa, valoare foarte apropiat sistemului molecular
spectrin sub form de tetramer. Toate celelalte structuri proteice membranare au o mas
molecular sub 400 kDa. Spectrina este componentul proteic de baz ce formeaz reeaua
citoscheletului eritrocitar. Rezultatele noastre confirm implicarea reelei de spectrin n
procesul de refacere a membranei electroporate.


4. DETERMINAREA DISTRIBUIEI DIMENSIONALE A CELULELOR PE BAZA
EXPERIMENTELOR DE ELECTROPERMEABILIZARE MEMBRANARA

Pentru orice specie celular dat se poate defini o valoare critic a diferenei de
potenial transmembranar efectiv
ef
c
. Dac intensitatea cmpului electric extern este
suficient de mare vor fi electropermeabilizate toate celulele a cror raz ndeplinete condiia
limit:
ER
ef
c
2
3
= (4.1)
35
Procesul de electropermeabilizare devine astfel dependent doar de dimensiunea
celulei. Intr-o populaie celular care n mod obinuit este neomogen ca dimensiune,
potenialul critic indus sub aciunea cmpului electric este atins iniial de celulele cu
dimensiunea cea mai mare. La creterea intensitii cmpului, procentul celulelor ce ating
condiia critic favorabil electroporrii crete la rndul ei. Intr-un domeniu de valori a
intensitii de cmp, toate celulele sunt permeabilizate. Astfel, pentru o populaie de celule
normal distribuit, curba de electropermeabilizare prezint o dependen sigmoidal (Fig 2.5).
In cazul electroporrii eritrocitelor, curba de electrohemoliz este caracterizat prin
parametrii: E1/2 reprezint intensitatea cmpului electric care determin hemoliza a 50% din
populaia eritrocitar i R atribuit razei celulare medii. Pe baza eficienei procesului de
electropermeabilizare (q) definit de raportul ntre numrul de celule permeabilizate i
numrul total de celule am propus o relaie care definete distribuia dimensional a unei
populaii celulare.
}
=
x(y)
0
' '
)dx f(x 1 ) ( y q (4.2)
unde f(x) este funcia distribuiei dimensionale normalizate, x i y fiind variabilele
adimensionale: x = R/R1/2 ; y = E/E1/2. Condiia critic dat de ecuaia (4.1) devine cu noile
variabile:
xy = 1 (4.3)
Prin derivarea ecuaiei (4.2) in raport cu x, funcia de distribuie dimensional normalizat
f(x), devine:
dy
d
x
x f
q
2
1
) ( =
(4.4)
Aceast formul poate fi utilizat pentru caracterizarea funciei de distribuie
dimensionale n condiiile n care eficiena procesului este determinat experimental.
Avantajul net al acestui mod de abordare const n faptul c utilizarea variabilelor
normalizate au o validitate universal, fiind independente de valorile specifice ale
conductivitii membranare, dimensiunea celulei, i proprietile electrice ale mediilor
interne i externe celulare.
Funcia de distribuie dimensional a fost verificat n experimente de
electrohemoliz eritrocitar realizate n dou condiii experimentale diferite. Curbele de
electrohemoliz au fost obinute prin metoda unicelular respectiv metoda multicelular.
1. metoda unicelular utilizeaz diluii mari de suspensie celular
(0.01%) care permite (i) electroporarea unei singure celule adus ntre electrozi i (ii)
determinarea valorii de prag a intensitii de cmp electric care produce hemoliza celular.
2. metoda multicelular expunerea unor suspensii celulare cu
hematocrit 1% pulsurilor electrice presupune electroporarea a 60-80% celule. Eficiena
electrohemolizei este calculat prin raportul: numrul de celule lizate / numrul total de
celule.
Dependena normalizat a procentului de celule electropermeabilizate n funcie de
intensitatea cmpului electric aplicat este reprezentat n Fig.2.5. pentru dou valori ale
duratei de puls: 1 ms (A) i 50 s (B).
In Fig 2.6 sunt redate histogramele funciilor de distribuie dimensional normalizate
obinute prin derivatizarea numeric a dependenei eficienei electroporrii.
36
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0


q
E [KV/cm]
A B

Fig 2.5.
Dependena sigmoidal a eficienei
electrohemolizei de intensitatea pulsului
electric. Durata de puls; A 1 ms, B 50 s

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0


f

(

x

)
X
A

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
f

(
x
)
x
B

Fig. 2.6.
Funcia de distribuie dimensional normalizat. Durata de puls; A 1 ms, B 50 s

Pentru condiii experimentale ce difer prin durata pulsului electric aplicat,
distribuia dimensional calculat este similar i anume prezint un singur pic relativ ngust
centrat la R1/2 i o form similar. Lrgimea ambelor distribuii este ~ 0,3R1/2 ceea ce
corespunde unei valori de aproximativ 1 m.


3.5. ELECTROPERMEABILIZAREA MEMBRANAR N PATOLOGIA DIABETIC I
LEUCEMIC
In condiiile unei hiperglicemii cornice se produc modificri chimice, structurale i
funcionale ale proteinelor din esuturile permeabile pentru glucoz, ceea ce determin
instalarea unor complicaii cunoscute n patologia diabetic cum sunt: afeciuni renale,
oculare, nervoase, vasculare. Mecanismele prin care excesul de glucoz poate afecta
structurile proteice sunt atribuite intensificrii (i) glicozilrii enzimatice a poteinelor, (ii) a
glicozilrii neenzimatice a poteinelor, (iii) cii poliol, (iv) depleiei mioinozitolului
intracelular. Glicozilarea hemoglobinei conduce la formarea unor hemoglobine anormale
HbA1a, HbA1b, HbA1c cu consecine n funcionalitatea eritrocitului: flexibilitate redus a
celulei, vscozitate intrinsec crescut care se presupune c contribuie la reducerea
deformabilitii eritrocitelor diabetice. Modificri n permeabilitatea membranei eritrocitare
37
au fost puse n eviden i n patologii maligne [Moore i colab. 1979]. Studii RMN au artat
un influx mult mai lent a ionilor de mangan n celulele roii i limfocite n cazurile de
leucemie cronic.
In acest context am utilizat tehnica electroporrii pentru a analiza modificarea
permeabilitii membranare a eritrocitelor umane n patologia diabetic tip I i tip II i
patologia leucemic: leucemie limfatic cronic, limfom Hodgkin (Fig 2.7, Fig. 2.8).
2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100
caz normal
diabet tip I
diabet tip II
h
e
m
o
l
i
z
a

[
%
]
camp electric [kV/cm]

Fig.2.7.
Electrohemoliza n suspensii eritrocitare
1% provenite de la subieci sntoi i n
patologia diabetic - diabet zaharat tip I
i tip II
2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100


caz normal
leucemie limfatica cronica
fitare Boltmann
fitare Boltmann
h
e
m
o
l
i
z
a

[
%
]
camp electric [ kV / cm ]

a.
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
caz normal
fitare Boltman
fitare Boltman
insuficienta medulara
h
e
m
o
l
i
z
a

%
camp electric [kV/cm ]

b.
2 4 6 8 10
0
20
40
60
80
100


caz normal
limfom Hodgkin

h
e
m
o
l
i
z
a

[
%
]
camp electric [kV/cm ]

c.
Fig 2.8.
Electrohemoliza unei suspensii eritrocitare 1%
n cazuri normale i n patologia malign:
a. leucemie limfatic cronic,
b. insuficien medular
c. limfom Hodgkin,
38
Electropermeabilizarea membranei eritrocitare a fost caracterizat prin
electrohemoliza unei suspensii eritrocitare 1%, expus unor pulsuri electrice dreptunghiulare
de scurt durat (100/s) i amplitudine variabil n intervalul 3-7 KV/cm. Curba de
electrohemoliz obinut, are ca parametru caracteristic valoarea E1/2 a intensitii cmpului
electric care determin hemoliza a 50% din populaia eritrocitar. Acest parametru a fost
utilizat pentru a caracteriza modificrile de permeabilitate a celulelor patologice fa de cele
normale. In cele dou tipuri de patologie, curbele de hemoliz reprezint media
experimental a cazurilor luate n studiu.
Se observ o deplasare similar a curbelor de electrohemoliz n diabet zaharat tip I i
tip II fa de curba martor n sensul creterii amplitudinii pulsului electric necesar
permeabilzrii celulare (Fig 2.7). Deplasarea relativ E
0
este +7% i indic o rezisten
membranar crescut a eritrocitelor afectate de excesul glicemic n snge.
Electropermeabilizarea membranar este nesemnificativ modificat fa de normal n
leucemie limfatic cronic (Fig.2.8.a), insuficien medular (Fig.2.8.b) i limfom Hodykin
(Fig.2.8.c).
Rezultatele obinute au pus n eviden urmtoarele aspecte:
- diminuarea permeabilitii membranare n patologia diabetic cu EE=+7%, este
corelat cu o cretere a glicozilrii hemoglobinei intraeritrocitare;
- permeabilitatea membranei eritrocitare electroporate este similar n cazuri de
diabet zaharat tip I i tip II;
- permeabilitatea nomal n leucemie limfatic cronic, insuficien medular, limfom
Hodgkin este corelat cu valori normale ale hemoglobinei glicozilate.
Scderea permeabilitii membranei eritrocitare la hemoglobin n diabet zaharat,
respectiv creterea rezistenei membranare la electrohemoliz poate fi explicat prin
glicozilarea hemoglobinei i formarea unei hemoglobine anormale. Vscozitatea acestei
hemoglobine este crescut iar volumul mrit. Ca urmare viteza de difuzie n mediul
extracelular este diminuat n comparaie cu hemoglobina normal. Efluxul diferit pentru
cele dou tipuri de hemoglobin determin pentru un anumit grad de hemoliz, o valoare a
E1/2 deplasat fa de normal n sensul creterii intensitii pulsului de cmp electric necesar
permeabilizrii membranare.

III CONCLUZII
Cercetrile prezentate n aceast parte a tezei cuprind urmtoarele rezultate originale:
A fost conceput i realizat un aparat de electroporare complex cu posibilitate de generare
a dou tipuri de pulsuri electrice: dreptunghiulare i cu descrcare exponenial.
Amplitudinea i durata pulsurilor sunt programabile, msurate i afiate. Aparatul are
posibilitatea de aplicare programat a unui numr de 1-10 pulsuri succesive pe aceeai
fraciune de prob la o singur trecere printre electrozi. Celula de electropermeabilizare
ataat aparatului, este termostatat cu precizie de 0,5
0
C n domeniul 2-40
0
C, i
funcioneaz n flux cu o capacitate de procesare a 2ml prob biologic.
Ponderea amplitudinii i duratei de puls electric n procesul de permeabilizare
membanar a fost determinat prin electroporarea eritrocitelor umane utiliznd diferite
combinaii a parametrilor de puls. Procesul a fost urmrit prin cinetica de eflux a
39
macromoleculelor de hemoglobin (65 000 Da) i influxul ionilor de mangan (55 Da)
normal impermeabili prin membrana eritrocitar.
a fost dovedit posibilitatea de control a permeabilizrii membranare prin ajustarea
amplitudinii i a duratei pulsului electric aplicat.
a fost pus n eviden existena unor pori de dimensiuni diferite n membrana
eritrocitar electropermeabilizat
procesul de renchidere a porilor membranari indui sub aciunea pulsului de cmp
electric este controlat n mare msur de durata pulsului aplicat. La acelai grad de
permeabilizare refacerea integritii i a impermeabilitii membranare se
realizeaz n intervale de timp mai lungi prin creterea duratei de puls.
Pe baza dependenei potenialului transmembranar de dimensiunea celulei, am propus o
relaie care definete distibuia dimensional a unei populaii eritrocitare. Funcia de
distribuie dimensional a fost verificat n dou condiii diferite de electroporare:
A fost identificat componentei proteic cu implicare major n procesul de refacere
membranar. In acest sens a fost exploatat avantajul oferit de metoda analizei int care
ofer posibilitatea de a evalua greutatea molecular a unei proteine a crei funcie este
inactivat prin iradierea cu un fascicul de electroni de energie nalt.
Metoda de analiz int a fost aplicat rezultatelor obinute n faza de refacere a
membranelor eritrocitelor electroporate, expuse iniial iradierii cu electroni la diferite
doze. Inactivarea acestei fazei a permis identificarea proteinei implicat n procesul de
renchidere a porilor membranari ca fiind spectrina sub form de tetramer. Spectrina
reprezint unitatea structural de baz a reelei citoscheletale. Rezultatele noastre
confirm i aduc dovada concret a participrii citoscheletului eritrocitar n procesul de
electropremeabilizare membranar.
Am utilizat tehnica de electropermeabilizare membranar ca modalitate alternativ de
identificare a modificrilor celulare n patologia diabetic (tip I i tip II) i n patologia
malign (leucemie limfatic cronic, insuficien medular, limfom Hodgkin). Prin
aceast tehnic au fost puse n eviden modificri la nivel celular n patologia diabetic.
Modificarea cineticii de eflux a hemoglobinei prin membrana eritrocitar electroporat a
fost corelat cu creterea glicozilrii hemoglobinei intraeritrocitare i a fost explicat prin
creterea constantei de timp a difuziei transmembranare a moleculelor de hemoglobin
anormale cu vscozitate i volum crescut.

BIBLIOGRAFIE
1. Chang D.C., Reese T.S. Changes in membrane structure induced by electroporation as
revealed by rapid-freezing electron microscopy, Biophys. J., 58 (1990) 1-12
2. Davalos R. V., Mir L. M. And B. Rubinsky, Tissue ablation with irreversible
electroporation, annals of biomedical engineering, 33 (2005) 2, 223231
3. Denet, A. R., R. Vanbever, and V. Preat. Skin electroporation for transdermal and
topical delivery. Adv. Drug. Deliv. Rev. 56 (2004):659674.
4. Favard C., Dean D.S., Rols M.P. Electrotransfer as a non viral method of gene delivery.
Curr Gene Ther 7 (2007) 6777
5. Gehl J, Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene
therapy and research. Acta Physiol Scand, 177 (2003) 437-447
6. Golzio M., Justin Teissie, and Marie-Pierre Rols, Direct visualization at the single-cell
level of electrically mediated gene delivery, PNAS, 99 (2002), 3
40
7. Kinosita K., Tsong T.Y., Voltage-induced pore formation and hemolysis of human
erythrocytes, Biochim. Biophys. Acta 471 (1977) 227242.
8. Lavee J., Onik G. Mikus P., Rubinsky B., A Novel Nonthermal Energy Source for
Ablation: Irreversible Electroporation, Forum Multimedia Publishing, LLC, 10 (2007)
(2), 96-101
9. Neamtu S., Morariu V.V, Turcu I., Hategan Popescu A, Copescu I.L., Pore resealing
inactivation in electroporated erythrocyte membrane irradiated with electrons
Bioelectrochem. Bioenerg 48 (1999) 441-445
10. Neamtu S., Turcu I., Dragu C., Bindea C., The role of the electric field pulse strength
and duration in the biomembrane electropermeabilization processes, Studia
Universitatis Babe-Bolyai, Physica, Special Issue (2000) 303-309
11. Moore R., Mlekoday J.H., Jin D., The Asiatic filateration coefficient of human
erytrocytes drom normal subjects and leucemic patients. Stud. Biophys. 76 (1979) 115-
120
12. Morariu V.V. and Petrov L., Nuclear magnetic resonance investigation of erythrocyte
membranes in chronic myeloproliferative disorders Cancer Biochemistry Biophysics.
(1986), 8(3) 203-9.
13. Neumann E., Rosenheck K., Permeability changes induced by electric impulses in
vesicular membranes, J. Membrane Biol, 10: (1972) 279
14. Prausnitz M. R, The effects of electric current applied to skin; a review for transdermal
drug delivery, Adv. Drug Del. Rev, 18 (1996) 395-425
15. Pavselj, N., Bregar, Z., Cukjati, D., Batiuskaite, D., Mir, L.M. and Miklavcic, D. The
course of tissue permeabilization studied on a mathematical model of subcutaneous
tumor in small animals. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 52 (2005b)
13731381.
16. Rols, M.P. Electropermeabilization, a physical method for the delivery of therapeutic
molecules into cells. Biochimica et Biophysica Acta 1758 (2006) 423428.
17. Teissie J., Rols M.P., Manipulation of cell cytoskeleton affects the lifetime of cell
membrane electropermeabilization, Ann. N.Y.Acad. Sci. 720 (1994) 98-110
18. Teissie J., Golzio M., Rols M.P. Mechanisms of cell membrane electropermeabilization:
a minireview of our present (lack of ?) knowledge. Biochim Biophys Acta, 1724 (2005)
270280.
19. Turcu I. and Neamtu S., Dimensional distribution of human erythrocytes obtained from
electropermeabilization experiments, Biochim. Biophys. Acta. 1238 (1995) 81- 85
20. Weaver J.C., Electroporation of Biological Membranes from Multicellular to Nano
Scales, IEEE Transactions on Dielectrics and Electrical Insulation 10 (2003) 5,754-768
21. Zimmermann, U., G. Pilwat and F. Rienmann, Reversibler dielektrischer Durchbruch
von Zellmembranen in electrostatischen Feldern, Z. Naturforsch. 29c (1974) 304305.